Submitted by Lúcia Bonci Cavalca (l.bonci@hotmail.com) on 2018-04-26T18:08:18Z No. of bitstreams: 1 CAVALCA, LB versão repositorio.pdf: 11866412 bytes, checksum: 0a27e5a7f7f756cb88de16361ad78a27 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Santulo Custódio de Medeiros null (asantulo@rc.unesp.br) on 2018-04-26T19:16:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cavalca_lb_me_rcla.pdf: 11841916 bytes, checksum: 0d52662f4653c6d3695e6b3ab334549d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-26T19:16:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cavalca_lb_me_rcla.pdf: 11841916 bytes, checksum: 0d52662f4653c6d3695e6b3ab334549d (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A cultura de citros é uma das mais importantes do Brasil, sendo a citricultura brasileira a maior do mundo; ainda assim, a produção nacional sofre com pragas e doenças, como cancro cítrico, que afetam sua produtividade. O cancro cítrico é causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) e tem sido controlado com o uso de estratégias integradas como a eliminação de plantas contaminadas e pulverização de bactericidas cúpricos. O uso de compostos à base de cobre, porém, representa um risco ambiental devido à sua toxicidade e efeito cumulativo, fazendo necessária a investigação de outros compostos com potencial no tratamento fitossanitário contra a doença. Neste estudo avaliamos a atividade bactericida do galato de hexila contra Xac, seu potencial protetivo e curativo no combate ao cancro cítrico, sua fitotoxicidade e predisposição em induzir resistência bacteriana. O composto provocou retardo e diminuição no crescimento populacional de Xac e inibição de seu crescimento in vitro, levando à morte total da população na concentração de 100μg⋅mL-1. A bactéria não foi capaz de desenvolver resistência a Gal-6 ao longo de 31 dias e exibiu taxa de mutantes naturalmente resistentes ao composto menor que 1⋅10-6 para a concentração de 50μg⋅mL-1. A capacidade de germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de rúcula e tomate não foi alterada por Gal-6. A aspersão de galato de hexila em plantas de laranja doce inoculadas com Xac reduziu em até 35% a incidência de sintomas de cancro cítrico, e em até 80% sua severidade. O composto também alterou o comprimento celular de Xac e permeabilidade de membrana. Galato de hexila mostrou-se um bactericida eficaz contra Xanthomonas citri subsp. citri tanto in vitro quanto in planta, além de apresentar baixa fitotoxicidade e baixa probabilidade de indução de resistência em Xac, visto que o composto parece atuar tanto sobre a estrutura física da membrana, quanto sobre o processo de segregação cromossômica/divisão celular bacteriana. / Citrus culture is one of the most important agricultural activities in Brazil, being the country also the biggest producer in the world; nevertheless, this business struggles with pests and diseases, as citrus canker, that affects its profitability. Citrus canker is caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) and is controlled by using integrated strategies such as elimination of contaminated plants and spraying of cupric bactericides. Using products with copper, however, brings an environmental risk, given 8 its toxicity and cumulative effect, making necessary the research of other compounds with potential to be used as a resource in the phytosanitary treatment against the disease. We evaluated hexyl galate's (Gal-6) bactericidal activity versus Xac and its potential in the preventive and curative treatments against the disease, also Gal-6 phytotoxicity and likeliness to induce bacterial resistance. The compound caused delay and decrease in Xac population growth and in vitro growth inhibition, leading to the total death of the population when at 100 μg⋅mL-1. The bacterium was not able to develop resistance to Gal-6 over 31 days and exhibited a rate of naturally-resistant mutants to the compound of less than 1⋅10-6 at the concentration of 50μg⋅mL-1. Seed germination and seedling development of arugula and tomato were not altered by Gal- 6. Spraying orange plants infected by Xac with hexyl gallate reduced the incidence of citrus canker symptoms by up to 35% and their severity by up to 80%. The compound also altered Xac cell length and membrane permeability. Hexyl gallate proved to be an effective bactericide against Xanthomonas citri subsp. citri both in vitro and in plant, exhibiting low phytotoxicity and low inclination to induce resistance in Xac, given that the compound appears to act on both the physical structure of the membrane and the process of chromosomal segregation/ bacterial cell division.

Orientador: Edson Luiz Furtado / Banca: Marli Teixeira de Almeida Minhoni / Banca: Claudio Angeli Sansígolo / Banca: Waldir Cintra de Jesus Junior / Banca: Celso Garcia Auer / Resumo: Em três povoamentos de Eucalyptus grandis na região norte do Estado de São Paulo, foi realizado um estudo com objetivo de conhecer a dinâmica espaço-temporal do cancro basal, quantificar os danos no volume e efeito na qualidade da madeira. Foram instaladas nove parcelas de 7500 m², com 1000 árvores de E. grandis, procedência Santa Rita do P. Quatro-SP, origem Coffs Harbour, dos plantios seminais em solos de areia franca AQ1, AQ3 (10 a 15% de argila) e textura franco-argila-arenosa LEm2 (26 a 35% de argila). As avaliações foram realizadas em nove mil árvores com idade de dois anos. A incidência foi monitorada individualmente de acordo com a presença ou ausência da doença e a severidade, mediante o uso de uma escala diagramática de notas. Foram feitas avaliações nos anos 2000, 2001 e 2002, o que gerou 26 mapas de evolução da doença. Os resultados permitiram concluir que: (1) A incidência média do cancro basal foi influenciado pelo tipo de solo AQ3 (0,25%), AQ1 (0,21%) e LEm2 (0,09%); (2) Os valores do índice de dispersão (ID) foram > 1, para os tamanhos de quadrat 2x4, 5x2, 5x4 e 5x10; os valores de log (A) = log (Vobs) e log de (b) = log (Vbin) foram maiores que 1 e diferentes de zero, sugerindo uma tendência à agregação independente do tipo de solo; (3) 54,6% dos focos foram unitários, indicando que o cancro basal inicia-se com focos de apenas uma árvore; 80,8% dos focos apresentam maior comprimento na direção entre as linhas de plantio do que na direção da linha; focos maiores ocorreram no solo AQ3, que apresentaram-se menos compactos; a disseminação do cancro nesses povoamentos parece ter sido via sementes através das mudas; 89,1% dos mapas apresentaram focos com tamanho médio inferior a 10 árvores, no solo AQ3 em 10,9% dos focos o tamanho variou entre 11 a 30 árvores e nenhum foco foi formado acima de 30 árvores;...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: A study was carried out in three Eucalyptus grandis stands in the northern region of the State of São Paulo, in order to provide information on the spatio-temporal dynamics of eucalyptus canker, evaluate volume losses, and determine the effect of the disease on wood quality. Nine 7500 m² plots (10×100) containing 1000 E. grandis trees from Santa Rita do P. Quatro-SP (origin: Coffs Harbour), in seed plantations on soils classified as loamy sands, AQ1 and AQ3 (10 to 15% clay), and on a silty-clay-loam-textured soil, LEm2 (26 - 35% clay). Evaluations were made in nine thousand two-year-old trees. Incidence was monitored individually according to the presence or absence of the disease. Severity was evaluated through the use of a diagrammatic rating scale. Evaluations were made in 2000, 2001, and 2002, and 26 disease progress maps were generated. The results allowed us to conclude that: (1) The mean incidence of eucalyptus canker followed a trend that matched the soil types:AQ3 (0.25%), AQ1(0.21.%), and LEm2 (0.09%); (2) The ID values were > 1 for quadrat sizes equal to 2×4, 5×2, 5×4, and 5×10; The log (A) = log (Vobs) and log (b) = log (Vbin) values were higher than 1 and different from zero, suggesting a tendency for aggregation, regardless of soil type; (3) 54.6% of the foci were single-unit, indicating that eucalyptus canker starts with single-tree foci; 80.8% of the foci had greater lengths between planting rows than along the rows; larger foci occurred in the AQ3 soil, which were less compact; canker dissemination in those stands seemed to have occurred via seeds through the seedlings; 89.1% of the maps had foci with mean sizes smaller than 10 trees in the AQ3 soil; in 10.9% of the foci the size ranged between 11 and 30 trees, and no focus formed at sizes above 30 trees; the ICF and ICFNU values were not close nor very far from ...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Roberto Hirochi Herai / Coorientador: Juliana da Silva Vantini / Banca: José Belasque Júnior / Banca: Priscila Lupino gatão / Resumo: A citricultura é uma das principais atividades do agronegócio brasileiro. Entretanto, inúmeras pragas e doenças atacam os citros, causando grandes prejuízos econômicos. O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é um grave problema para o setor, não havendo ainda um método eficaz para o seu controle. Neste estudo, utilizando RNASeq, foram analisados os perfis transcricionais de Xac inoculada em duas espécies de citros contrastantes à doença: laranja doce 'Pêra Rio' (Citrus sinensis L. Osbeck), menos suscetível e lima ácida 'Galego' (Citrus aurantifolia Swingle), altamente suscetível, às 48 e 72 horas após a infecção (hai), com o objetivo de identificar genes de Xac envolvidos no processo de infecção. Foram identificados 80 genes de Xac diferencialmente expressos (GDEs) no hospedeiro laranja doce 'Pêra Rio', sendo 41 e 39 nos tempos de 48 e 72 hai, respectivamente. Em lima ácida 'Galego' foram identificados 82 GDEs, sendo 40 no tempo de 48 hai e 42 em 72 hai. Alguns destes genes diferencialmente expressos foram avaliados pela técnica de PCR quantitativa em tempo real, sendo estes hpa1, hrpE, hrpW, virK, ahpC, katE, katG, cydA e cydB, os quais estão envolvidos na patogenicidade e virulência, na defesa ao estresse oxidativo e na fosforilação oxidativa. Os genes de patogenicidade e virulência foram induzidos em Xac em ambos os hospedeiros, enquanto que os genes relacionados à cadeia respiratória foram inibidos em ambos os hospedeiros, com maior ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The citrus industry is one of the main activities of Brazilian agribusiness. However, many pests and diseases attack citrus, causing great economic losses. The citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is a major problem for the sector, there is not yet an effective method for its control. In this study, the transcriptional profiles of Xac inoculated in two species of contrasting citrus disease were analyzed using RNA-Seq : sweet orange 'Pêra Rio' (Citrus sinensis L. Osbeck), moderately tolerant and Mexican Lime 'Galego' (Citrus aurantifolia Swingle) highly susceptible at 48 and 72 hours after infection (hai) aiming to identify Xac genes involved in the infection process. We identified 80 Xac differentially expressed genes (DGE) in sweet orange 'Pera Rio', 41 and 39 at 48 and 72 hai, respectively. In Mexican Lime 'Galego' 82 DGE were identified, 40 at 48 and 42 at 72 hai. Some of these differentially expressed genes were evaluated by real time quantitative PCR : hpa1, hrpE, hrpW, Virk, ahpC, KatE, katG, cyda and cydB, which are involved in pathogenicity and virulence, oxidative stress defense and oxidative phosphorylation. The pathogenicity and virulence genes were induced in Xac in both hosts, whereas the respiratory chain-related genes were inhibited in both hosts with greater inhibition in Mexican lime 'Galego'. However, genes related to oxidative stress showed a higher expression profile in Xac interaction with sweet orange 'Pera Rio' than with Mexica... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: Com o seqüenciamento completo do genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), em 2002, inúmeras possibilidades de estudo foram viabilizadas, dando margem à busca de novas formas de controle do cancro cítrico, baseadas em alvos moleculares. Estudos dessa natureza têm mostrado a existência de genes que somente são expressos quando a bactéria está se desenvolvendo in planta. Sabe-se que essa regulação é dependente da região promotora e sua identificação pode possibilitar avanços significativos na busca do controle dessa doença. Apesar do crescente avanço das técnicas experimentais in vitro em biologia molecular, identificar um número significante de promotores ainda é uma tarefa difícil e dispendiosa. Os métodos computacionais existentes enfrentam a falta de um número adequado de promotores conhecidos para identificar padrões conservados entre as espécies. Logo, um método para predizê-Ios em qualquer organismo procariótico ainda é um desafio. O Modelo Oculto de Markov é um modelo estatístico aplicável a muitas tarefas em biologia molecular. Entre elas, predição e mapeamento de seqüências promotoras no genoma de um procarioto. Neste trabalho, estudou-se o mapeamento in silico de promotores gênicos de todo o genoma da Xac e em 68% dos genes a localização de um promotor foi indicada. A análise comparativa com dados experimentais de proteômica mostrou que 72% das proteínas expressas identificaram-se com elementos desta lista de promotores, o que corresponde a 27% do total de genes do genoma. À partir destes dados foi possível levantar um rol de informações sobre estes candidatos a promotores incitando a novos estudos moleculares. / Abstract: With the complete genome sequencing of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac), in 2002, several study possibilities were made practical and then creating the search of new citrus canker control ways, based in molecular aims. This kind of studies has shown the genes existences that are only expressed when the bacteria are developing itself in plant. It has been known that this regulation is promoter region dependent and its identification can allow significant advances in the search of this disease control. Although increasing advance of in vitro experimental techniques in molecular biology, identifying a meaningful number of promoters is still a hard and expensive task. The existents computer science methods face the need of a proper number of known promoters to identify conserved patterns among the species. Therefore, a method to predict them in any prokaryote organism is still a challenge. The Hidden Markov Model (HMM) is a statistic model applicable in many tasks in molecular biology. Among them, prediction and mapping of the promoters sequences in prokaryotic genome. In this work, which has studied the genic promoters in silico mapping of the whole Xac genome, in 68% of the genes the promoter localization was indicated. The proteomic experimental data comparative analysis showed that 72% of the expressed proteins identified with elements from the promoters list, which corresponds 27% of the genome genes total. According to these data it was possible to generate an information roll about these promoters candidates inciting new molecular studies. / Orientadora: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Poliana Fernanda Giachetto / Mestre

O cancro cítrico é uma das doenças mais temidas da citricultura devido ao seu poder de proli-feração nas fazendas, aos danos causados às plantas e aos frutos e à forma de combate adota-da pelos órgãos responsáveis através da erradicação das plantas contaminadas e de outras em sua vizinhança. No Brasil, um dos principais motivos que minimiza a eficiência da erradicação do cancro cítrico é a confirmação do diagnóstico, que necessita ser realizada em alguns laboratórios credenciados. A análise de muitas amostras em conjunto com o tempo gasto com o transporte aumenta a chance de proliferação da doença no campo. Neste trabalho aplicamos técnicas de espectroscopia da fluorescência em folhas de culturas cítricas na intenção de pro-por um método de diagnóstico do cancro cítrico a ser realizado na fazenda e com resposta em tempo real. As amostras experimentais são folhas de variedades cítricas sadias e contaminadas com cancro ou outras doenças. Iniciamos o trabalho aplicando espectroscopia da fluorescência no laboratório. Os resultados provaram a viabilidade do método, mas revelou uma enorme sobreposição de dados ao tentar discriminar o cancro de outra doença. Análises com-plementares nos revelaram que os experimentos deveriam ser feitos no campo, identificando plantas contaminadas e tomando a fluorescência de folhas sadias como referência. A espec-troscopia da fluorescência no campo foi feita com um espectrômetro portátil. O resultado nos possibilitou propor critérios de discriminação do cancro baseado em figuras de mérito. O melhor critério apresentou 79% de acertos, com 88% de sensibilidade e 68% de especificidade. Concluímos que os valores poderiam ser melhores se a espectroscopia fosse realizada com imagens, pois as variações do espectro ocorrem devido ao posicionamento da fibra na lesão do cancro. Passamos a estudar a espectroscopia das imagens da fluorescência com um sistema baseado em um espectrógrafo. Os resultados provaram a viabilidade do estudo e revelaram particularidades espaciais e espectrais das doenças. Infelizmente essa instrumentação só pode ser usada no laboratório, por isso optamos por desenvolver outro sistema mais simples e robusto, a base de uma roda de filtros com filtros passa-banda. Os re-sultados revelaram novas particularidades espaciais e espectrais das amostras, porém nos revelou a necessidade de um processamento de imagem para obter análises quantitativas. O sistema de imagens com filtro ainda foi usado em outro experimento complementar onde as imagens forneceram resultados quantitativos, provando a funcionalidade da técnica. / Citrus canker is one of the most feared diseases of citrus due to its dissemination in the farms, the damage caused to plants and fruits and how to combat adopted by national government through the eradication of infected plants and others in your neighborhood. In Brazil, one of the main reasons that minimizes the effectiveness of citrus canker`s eradication is the confir-mation of the diagnosis by specialized laboratories. The time spent to transport and to analyses many samples increases the chance of canker spreading in the field. In our work we apply spectroscopic techniques of fluorescence in leaves of citrus crops with the aim to propose a method for diagnosis of citrus canker to be held on the farm and real-time response. The expe-rimental samples are leaves of healthy citrus varieties and contaminated with canker or other diseases. We began the work by applying fluorescence spectroscopy in the laboratory. The results proved the feasibility of the method, but showed a huge overlap of data to try to dis-criminate cancer from other diseases. Further analysis revealed that those experiments should be done in the field, focusing to identify infected plants and taking the fluorescence of healthy leaves as a reference. Fluorescence spectroscopy in the field was made with a portable spectrometer. The result allowed us to propose some criteria for canker discrimination based on figures of merit. The best criteria presents 79% correct tests, with 88% sensitivity and 68% specificity. We conclude that these values could be better if the spectroscopy was performed with images, because the variations of the spectrum are due to the positioning of the fiber over the canker lesion. We study the spectroscopy of fluorescence images with a system based on a spectrograph. The results proved its feasibility and revealed spatial and spectral particular features of the diseases. Unfortunately, this instrumentation can only be used in the laborato-ry, so we decided to develop another system more simple and robust. The new system is based on a filter wheel with band-pass filters. The results revealed new spatial and spectral characteristics of the samples, but revealed the need for an image processing for quantitative analysis. This imaging system was still used in another supplementary experiment where the images have provided quantitative results, proving the functionality of the technique.

Buscou-se produzir híbridos somáticos entre laranjas doces (Citrus sinensis) com tangerinas, mexericas (C. reticulata, C. reshni, C. sunki, C. deliciosa), tangores (C reticulata x C. sinensis) ou tangelo ‘Orlando’ (C. reticulata x C. paradisi), além da avaliação da resistência do híbrido somático laranja ‘Hamlin’ (C. sinensis) + mexerica ‘Montenegina’ (C. deliciosa) a Xanthomonas axonopodis cv. citri e Xylella fastidiosa. Foram utilizados como fonte de protoplastos calos embriogênicos e folhas coletadas de plântulas germinadas in vitro e de plantas cultivadas em casa-de-vegetação. Após o isolamento, protoplastos provenientes de calos e/ou suspensões embriogênicas foram fundidos quimicamente por polietilenoglicol (PEG) com protoplastos não embriogênicos oriundos de mesofilo foliar. Os calos provenientes da fusão foram induzidos a formação de embriões somáticos para posterior germinação e regeneração de plantas. As plantas regeneradas foram individualizadas, enraizadas ou microenxertadas e aclimatizadas em casa-de-vegetação. A confirmação da hibridação somática foi feita por análise morfológica, análise do DNA com marcadores moleculares do tipo RAPD, determinação da ploidia com a contagem do número de cromossomos e/ou citometria de fluxo. Foram obtidos dois híbridos somáticos do genitor embriogênico laranja ‘Hamlin’ com os genitores não embriogênicos mexerica ‘Montenegrina’ e tangerina ‘Dancy’. Ambos híbridos somáticos obtidos podem apresentar características complementares dos genitores, podendo ser utilizados diretamente como copa e em programas de melhoramento de copa de citros. O híbrido somático laranja ‘Hamlin’ com mexerica ‘Montenegrina’ foi avaliado mostrando resistência a Xanthomonas axonopodis cv. citri e a Xylella fastidiosa. / This research aimed to produce new somatic hybrid combinations between sweet orange (Citrus sinensis) with mandarins (C. reticulata, C. reshni, C. Sunki, C. deliciosa), tangors (C reticulata x C. sinensis) or ‘Orlando’ tangelo (C. reticulata x C. paradisi), and also evaluate the somatic hybrid ‘Hamlin’ sweet orange (Citrus sinensis) + ‘Montenegrina’ mandarin (Citrus deliciosa) for resistance to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa. Protoplast sources included embryogenic calli or suspension-culture derived calli, and leaves collected from plants cultivated in vitro or in screenhouses. After protoplast isolation, embryogenic protoplasts were chemically fused by polyethylene glycol (PEG) with mesophyll-derived non-embriogenic protoplasts. Fusion-derived calli were further cultured to embryo induction, germination, and plant regeneration. Regenerated plants were individually rooted or micrografted, and further acclimated in screenhouse. Somatic hybridization was confirmed by analysis of leaf morphology, molecular analysis by RAPD markers, ploidy determination by chromosome counting or flow cytometry. The producion of the somatic hybrids ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin and ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Dancy’ mandarin was confirmed. These hybrids may have complementary traits from both progenitor and be used directly as scion cultivars or as parental lines in scion improvement programs. ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin somatic hybrid was resistant to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa.

O cancro bacteriano, causado por Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), é uma das doenças mais importantes da cultura do tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), especialmente para tomateiros estaqueados. O controle está fundamentado na adoção de um conjunto de medidas preventivas, pois poucas são as informações sobre materiais resistentes à doença e não existe um produto químico que a controle eficientemente. Os objetivos desta tese foram determinar um método de inoculação adequado à seleção de genótipos de tomateiro resistentes ao cancro bacteriano; avaliar a reação de genótipos de tomateiro à inoculação com Cmm; e avaliar o efeito de acibenzolar-S-metil e outros produtos fitossanitários no controle da doença. Para o ensaio de metodologia, foram avaliados quatro métodos de inoculação (aspersão de suspensão bacteriana na face inferior das folhas; aspersão, sob pressão, de suspensão bacteriana na face inferior das folhas; corte do sistema radicular, com tesoura, seguido de imersão na suspensão bacteriana; e ferimento na haste com alfinete entomológico transpassando uma gota de suspensão de inóculo depositada na axila foliar) e três concentrações de inóculo (108 ufc/mL, 107 ufc/mL e 106 ufc/mL). Posteriormente, foi avaliado o efeito da inoculação em plantas com diferentes idades, aos 7, 14, 21 e 28 dias após a emergência. Foram utilizados os genótipos Kadá e Rotam-4 e um isolado bacteriano proveniente de Bragança Paulista, SP. A avaliação foi realizada através de uma escala descritiva, atribuindo-se notas que foram convertidas em índice de murcha bacteriana. A inoculação de Cmm, quatorze dias após a emergência das plantas, através da aspersão de suspensão bacteriana (108 ufc/mL) na face inferior das folhas, com avaliação aos 30 dias após inoculação, foi a metodologia mais apropriada para a avaliar a reação de genótipos de tomateiro. Estabelecida a metodologia, foram avaliados dez genótipos comerciais de tomateiro (Carmen, Débora max, IPA-6, Santa Clara, Alambra, Júpiter, Olimpo, Fanny, Jumbo e Densus) para identificação de materiais resistentes ao cancro bacteriano, tendo-se Kadá e Rotam-4 como controles suscetível e resistente, respectivamente. Alambra e Jumbo apresentaram comportamento semelhante a Rotam-4, sendo materiais promissores para o plantio em áreas com histórico de ocorrência da doença. Para a avaliação de controle do cancro bacteriano foram testados os seguintes produtos: acibenzolar-S-metil (ASM), ASM + mancozeb, ASM + oxicloreto de cobre, mancozeb + oxicloreto de cobre, e oxitetraciclina. Três esquemas de aplicação dos produtos foram adotados: (E1) 4 aplicações (a primeira e a segunda realizadas seis e três dias antes da inoculação; a terceira e a quarta, aos três e seis dias após a inoculação); (E2) apenas as duas aplicações préinoculação; (E3) apenas as duas aplicações pós-inoculação. Esses produtos foram incorporados a meio de cultura para avaliação in vitro de seus efeitos sobre Cmm. Independente da forma de aplicação, o ASM, isolado ou em mistura com fungicidas, proporcionou reduções significativas na severidade da doença e não inibiu o desenvolvimento da bactéria in vitro. / Bacterial canker, caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), is one of the most important diseases of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Its control is based on a set of preventive measures, once there is a few information about resistant materials and the chemical control is not efficient. The objectives of this thesis were to determine a suitable inoculation methodology to bacterial canker resistance studies; to evaluate the reaction of commercial tomato genotypes to the inoculation with Cmm; and to evaluate the acibenzolar-S-methyl and other phytossanitary products effects on the control of that disease. To methodology trial, four inoculation methods were evaluated, including foliar pulverization with bacterial suspension; foliar pulverization under pressure with bacterial suspension; cutting of roots with scissor, followed by their immersion in bacterial suspension; and stem wounding with a pin passing over a drop of inoculum suspension deposited on the insertion point of leaf. Besides the inoculation methods, three inoculum concentrations were investigated: 108 cfu/mL; 107 cfu/mL and 106 cfu/mL. Later, it was evaluated the effect of inoculation on plants with different ages: 7, 14, 21 and 28 days after emergency. To those trials, genotypes Kadá and Rotam-4, and a bacterial isolate from Bragança Paulista, SP, were employed. The evaluation was accomplished through a descriptive scale, being attributed notes that were turned into bacterial wilt index. Inoculation of Cmm, fourteen days after emergency of plants, through aspersion with bacterial suspension (108 cfu/mL) over the inferior face of leaves, and evaluation 30 days after inoculation, was the most appropriated methodology to evaluate resistance to bacterial canker in tomato genotypes. After the establishment of the inoculation methodology, ten commercial tomato genotypes (Carmen, Débora max, IPA-6, Santa Clara, Alambra, Jupiter, Olimpo, Fanny, Jumbo and Densus) were investigated to identify resistant materials to the bacterial canker. Kadá and Rotam-4 were employed as susceptible and resistant controls, respectively. Alambra and Jumbo had a similar behavior to Rotam-4, being the most promising materials for the planting in areas with report of occurrence of bacterial canker. To evaluate the bacterial canker control following products were tested: acibenzolar-S-methyl (ASM), ASM + mancozeb, ASM + copper oxicloride, mancozeb + copper oxicloride, and oxytetracycline. Three schemes of application of the products were adopted: (E1) 4 applications (first and second ones were accomplished six and three days before inoculation; third and fourth ones, three and six days after inoculation); (E2) two applications before inoculation only; (E3) two applications after inoculation only. The effect in vitro of these products on Cmm was also evaluated. ASM, isolated or in mixture with fungicides, provided significant reductions in the disease severity independent of the scheme of application and had no effect on bacterial development in vitro.

O cancro cítrico, considerado uma das mais importantes doenças da cultura dos citros, apresentou um drástico aumento de 607% no índice de talhões contaminados no Estado de São Paulo entre 2009 e 2011, mesmo diante da obrigatoriedade legal da erradicação das plantas sintomáticas. O aumento ocorre logo após mudança na legislação de controle e erradicação da doença, justificando a importância de se avaliar as vantagens econômicas de manter o cancro sob controle no Estado e os impactos potenciais de sua disseminação. O objetivo deste estudo é analisar os benefícios econômicos de manter o cancro cítrico sob controle em São Paulo, e comparar as possíveis alternativas para sua prevenção e controle do ponto de vista da sustentabilidade econômica da produção. A abordagem analítica compreende avaliar os fluxos de custos e de receitas do setor diante de diferentes cenários de prevenção e controle do cancro. Com base em valores presentes líquidos desses fluxos, estimar a relação benefício-custo de prevenir, controlar ou manejar a doença no Estado de São Paulo, em um horizonte de tempo de 20 anos. Foram identificados os custos e benefícios mais expressivos ao produtor rural nos diferentes cenários, comparando-se as diferenças em produção de laranjas e custos de produção em situações de prevenção, controle e expansão da doença. Foram analisados os impactos de redução da produtividade e as variações nos custos de produção em cinco cenários, subdivididos em 12 sub cenários. Consideradas as pressuposições adotadas, os resultados apontam vantagens econômicas em manter o cancro cítrico sob controle em São Paulo, com relações benefício-custo significativamente superiores para cenários de prevenção e de controle comparados aos de expansão da doença. No acumulado de 20 anos, a prevenção ao cancro cítrico evita perdas no valor de R$ 12,82 para cada Real investido. Já no cenário em que 90% dos talhões contaminados não são erradicados, a relação é de apenas R$ 0,35 em perdas evitadas para cada Real investido no manejo, supondo que o preço real da laranja permaneça constante em R$11,00/caixa. Contudo, os resultados demonstram que a prevenção e controle da doença apresentam relação benefíciocusto superior ao manejo da doença no médio e longo prazos. Este resultado é relevante considerando que, atualmente, cerca de 99% dos talhões paulistas estão indenes a doença, embora seriamente ameaçados por crescente taxa de disseminação do cancro. / The citrus canker, one of the most important diseases of citrus, showed a drastic increase of 607% in the index of contaminated plots in São Paulo state, between 2009 and 2011, despite the legal requirement of eradication of symptomatic plants, causing a huge impact for farmers. The boost has occurred just after a change in the regulation on the control and eradication of this disease, which justifies the relevance of assessing the economic advantages of keeping canker under control in the state as well as the potential impacts of its dissemination. The objective of this study is to analyze the economic benefits of keeping the citrus canker under control in São Paulo, and to compare the possible alternatives for its prevention and control in terms of the economic sustainability of citrus production. The analytical approach consists on evaluating the cost and revenue flows of this sector for each different scenario of citrus canker prevention, control or fast dissemination. Based upon the net present values of these flows, the benefit-cost ratios are estimated for scenarios of preventing, controlling or managing the disease in the State of São Paulo, for a 20 years projection. For each scenario, the most important costs and benefits for citrus farmers have been identified and then differences of revenues from orange production and their costs compared for those scenarios. The major impacts analyzed are yield reductions and changes in cost production for five scenarios, divided into 12 sub scenarios. Considering assumptions of this work, results point economic advantages in keeping the citrus canker under control in São Paulo, and benefit-cost ratios significantly higher for scenarios of prevention and control of disease compared to scenarios of disease´s expansion. Considering a 20 years period, the scenario of canker prevention avoids losses amounting to R$ 12.82 for each Real invested. On the other hand, for the scenario where 90% of the contaminated plots are not eradicated, the ratio is only $ 0.35 in avoided losses for each Real invested in management, assuming that real price for orange remains constant at R$ 11.00/box along the whole period. However, results demonstrate that preventing and controlling this disease provide benefit-cost ratios greater than managing it in the medium and long term. This is a very relevant finding considering that about 99% of citrus slots in São Paulo are currently not contaminated yet, although they are seriously threatened by a growing rate of canker dissemination.

O cancro cítrico, causado pela bactéria Gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é considerado uma das principais doenças da citricultura nacional e mundial, devido à susceptibilidade do hospedeiro e por não existirem métodos de controle eficientes. Dados da literatura relatam que alguns genes de bactérias fitopatogênicas possuem uma seqüência consenso de nucleotídeos (TTCGC...N15...TTCGC) denominada “PIP box” ou “plant-inducible-promoter box”, localizada na região promotora e responsável pela ativação da expressão de fatores de patogenicidade e virulência quando o patógeno entra em contato com a planta hospedeira. O objetivo deste trabalho foi mapear e investigar no genoma da Xac a expressão de genes contendo seqüências do tipo “PIP box”, a 5’ da ORF ou internamente na região codificadora, através da técnica de macroarranjo. Com auxílio de uma ferramenta de bioinformática (script PERL), 208 seqüências consenso para o elemento cis-regulatório “PIP box” foram mapeados no genoma da Xac, e clones contendo seqüências codificadoras associadas aos promotores do tipo “PIP box” foram recuperados do banco de clones gerado pelo projeto de seqüenciamento da bactéria e validados por seqüenciamento. Os DNAs plasmidiais representando cada clone foram preparados e imobilizados em membranas de náilon (macroarranjo), as quais foram hibridadas com sondas de cDNAs marcadas com [a33P] dCTP e obtidas a partir de RNA total extraído da bactéria em estádio não infectante (cultivada em meio de cultura Caldo Nutriente – meio CN) e da bactéria infectante (cultivada por 12 horas ou 20 horas em meio XAM1 indutor de patogenicidade e virulência, ou coletada por exsudação 3 dias ou 5dias após inoculação em folhas de laranjeira). A análise da expressão dos genes contendo promotores “PIP box” putativos revelou 67 genes diferencialmente expressos quando a bactéria teve o seu programa de infecção disparado (indução “in vitro” ou “in vivo”). A validação dos resultados de macroarranjo foi realizada para alguns dos genes por meio de RT-PCR semi-quantitativo e a funcionalidade da seqüência “PIP box” para alguns promotores foi demonstrada através do gene repórter GUS. Os genes com expressão diferencial foram classificados segundo a função biológica das respectivas proteínas codificadas e estão envolvidos em processos tão distintos quanto sistema de secreção tipo III, metabolismo de membrana e parede celular, sistema de captação de ferro, metabolismo de açúcares e degradação da parede vegetal, transdução de sinais, metabolismo de flagelo, formação de biofilme e adesividade, metabolismo de ácidos nucléicos, transportadores de membrana, metabolismo energético e resposta a estresse ambiental. O possível papel destas modificações para a interação planta-patógeno e a instalação do cancro cítrico é discutida. / The citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is considered worldwide as one of the most important disease of citrus crop due to the lack of resistance in citrus plants and to the absence of efficient methods to control the disease. It was already shown that several genes involved in virulence and pathogenicity in plant pathogenic bacteria have a consensus nucleotide sequence (TTCGC…N15…TTCGC) named plant-inducible-promoter box or PIP box, located in the promoter region of the genes, which are responsible to activate the expression of genes during the host-bacteria interaction. The aim of this work was to map in Xac genome the genes containing the PIP box sequence in the promoter region, or internal to the ORF sequence, and analyze their expression during plant infection using the macroarray technique. Using a PERL script, 208 PIP box consensus sequence associated to genes were found in the Xac genome and clones containing all these genes and their PIP box sequences were recovered from a Xac genome clone bank and reconfirmed by sequencing. The plasmidial DNA containing the gene and the PIP box from each clone were purified, immobilized onto a nylon membrane (macroarray) and hybridized with [a33P] dCTP-labeled cDNAs synthesized from Xac total RNA isolated from bacteria in non-infecting (grown in NB nutrient medium) and infecting (grown for 12 or 20 hours in XAM1 medium that mimics the environment of the plant intercellular space (“in vitro”) or for 3 or 5 days in orange plant leaves (“in vivo”) conditions. The gene expression profile resulting from the array analysis revealed that 67 genes were differentially expressed during the temporal course of the infection. The results were validated through the analysis of expression profile for some genes using semi-quantitative RT-PCR and the PIP box functionality for some promoters was demonstrated using GUS as reporter gene. The differentially expressed genes were classified regarding the biological function of the encoded protein and related to several relevant processes as type III secretion system, membrane and cellular wall metabolism, iron uptake, sugar metabolism and host cell wall degradation, signal transduction, flagellum metabolism, biofilm formation and adhesiveness, nucleic acid metabolism, membrane transporters, energetic metabolism and stress response. The possible roles of these modifications for the bacteria-plant interaction and disease installation are discussed.

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:43:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caserta_Raquel_D.pdf: 28122729 bytes, checksum: f611b63be786134a0c9fbad9785006b0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A produção do suco de laranja concentrado é uma das commodities mais importantes para o agronegócio brasileiro, entretanto, os constantes problemas fitossanitários que afetam a citricultura vem aumentando os custos de produção e consequentemente a rentabilidade econômica deste setor. É urgente a busca por alternativas para solucionar os problemas fitossanitários da citricultura, nesse sentido, a utilização de transgenia mostra-se uma ferramenta promissora, pois possibilita a obtenção de plantas com genes exógenos que conferem resistência a doenças. Uma das doenças que afetam a citricultura brasileira é a clorose variegada dos citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa, onde todas as variedades de Citrus sinensis mostram-se suscetíveis a doença. Uma estratégia que vem sendo utilizada para resistência a X. fastidiosa que afeta a cultura de uva na Califórnia-EUA envolve a chamada "confusão do patógeno" onde utiliza-se genes do próprio patógeno visando a alteração da sinalização molecular entre as células bacterianas, interferindo em sua patogenicidade. Neste trabalho foram abordadas as transformações de Nicotiana tabacum e Citrus sinensis com o gene rpfF de X. fastidiosa causadora da CVC, envolvido na síntese de uma molécula sinalizadora que regula a expressão de genes associados a patogenicidade dessa bactéria. Eventos dos cultivares de laranja doce Hamlin e Pineapple transformados com rpfF foram desafiados com X. fastidiosa e, após avaliações nas fases inicial e avançada de sintomas, foi observada uma redução na incidência e na severidade de sintomas de CVC. A movimentação bacteriana ao longo de tais plantas também foi comprometida, sendo que a população bacteriana em pontos distantes do ponto de inoculação foi maior em plantas do tipo selvagem quando comparadas as transgênicas. Esses resultados sugerem que as moléculas produzidas pelas plantas transgênicas foram capazes de alterar o comportamento da bactéria, reduzindo sua patogenicidade. Outro fitopatógeno que ataca pomares brasileiros é Xanthomonas citri subsp. citri, que também apresenta o gene rpfF, e assim como em X. fastidiosa, é responsável pela sinalização molecular. Eventos transgênicos de Carrizo e Pineapple também foram desafiados com X. citri. Nesse patógeno, a interrupção da sinalização mediada por DSF, Diffusible Signal Factor - uma molécula de ácido graxo, reduz sua virulência, e interessantemente, sintomas de cancro cítrico foram reduzidos nas plantas transgênicas. Em folhas transgênicas não foi observado o aparecimento de pústulas, e biofilmes formados na área da inoculação foram alterados. Genes modulados por DSF em bactérias isoladas de plantas transgênicas foram reprimidos, sugerindo que a sinalização foi comprometida. Por fim, seiva das plantas transgênicas não ativou a expressão do promotor engA::GFP em Xanthomonas campestris biosensoras, indicando que a molécula produzida por essas plantas foi capaz de alterar a sinalização. Por outro lado, a seiva das plantas transgênicas ativou a expressão do hxfA::PhoA em X. fastidiosa biosensoras, indicando a funcionalidade dessa molécula para esse fitopatógeno. Portanto, em ensaios com X. citri, o DSF das plantas transgênicas atuou como antagonista, diminuindo a virulência da bactéria através da alteração da sinalização molecular. Esses resultados mostram que as moléculas sinalizadoras produzidas por plantas transformadas com rpfF de X. fastidiosa são promissoras na tentativa de controle de CVC e cancro cítrico / Abstract: The production of concentrate orange juice is one of the most important commodities for Brazilian agribusiness, however, the constant phytosanitary problems affecting the citrus industry is increasing production costs and consequently the economic profitability of this sector. It is urgent to search for alternatives to solve citrus phytosanitary problems, in this sense, the use of transgenesis shows a promising tool because it enables the production of plants with exogenous genes that confer resistance to diseases. One of the diseases that affect Brazilian citrus industry is the citrus variegated chlorosis (CVC), caused by the bacterium Xylella fastidiosa, where all varieties of Citrus sinensis are susceptible to this disease. One strategy that has been used for X. fastidiosa resistance that affects grape cultures in California-USA involves the so-called "pathogen confusion" that is related to the usage of genes of the pathogen itself aiming to change the molecular signaling between bacterial cells by interfering in its pathogenicity. In this work we will discuss the transformation of Nicotiana tabacum and Citrus sinensis with the rpfF gene isolated from X. fastidiosa causing the CVC, involved in the synthesis of a signaling molecule that regulates the expression of genes associated with pathogenicity of these bacteria. Transgenic events of Hamlin and Pineapple transformed with rpfF were inoculated with X. fastidiosa and after evaluations in early and advanced stages of symptoms, a reduction was observed in the incidence and severity of symptoms of CVC. Bacterial movement along these plants was also impaired, and the bacterial population analyzed far from the point of inoculation was higher in wild type plants compared to transgenic ones. These results suggest that the molecules produced by the transgenic plants were able to change the behavior of the bacteria, reducing its pathogenicity. Another pathogen that attacks Brazilian orchards is Xanthomonas citri subsp. citri, which also features rpfF gene, and as in X. fastidiosa is responsible for molecular signaling. Transformed plants of Carrizo and Pineapple were also challenged with X. citri. In this pathogen, the interruption of DSF-mediated signaling reduces its virulence, and interestingly, citrus canker symptoms were reduced in transgenic plants. In transgenic leaves there was no pustules development and alterations in biofilms formed in the area of inoculation were observed. Genes modulated by DSF in bacteria isolated from transgenic plants were repressed, suggesting that signaling was compromised. Finally, sap of transgenic plants did not activate the expression of the promoter engA::GFP in Xanthomonas campestris biosensors, indicating that the molecule produced by these plants was able to change the signaling. On the other hand, the sap of transgenic plants activated the expression of hxfA::PhoA in X. fastidiosa biosensors, indicating the functionality of this molecule for this pathogen. Therefore, in assays with X. citri, the DSF of transgenic plants acted as antagonist, decreasing the virulence of the bacteria by changing the molecular signaling. These results show that the signaling molecules produced by plants transformed with rpfF of X. fastidiosa are promising in the attempt to control CVC and citrus canker / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular