Vinte e um isolados de Xanthomonas campestris pv. citri (Xcc), provenientes de cinco municípios do RS, foram cultivados em meio de cultura CYE (casitone, 1; extrato de levedura, 0,35; glicerol, 2; ágar, 15 g/1), com zero, 16, 32, 40, 48 , 64 , 80 , 96 , 112 e 128x10-2 nM de CuS04. A concentração mínima inibitória (CMI) de CuS04 foi de 40x10-2 nM para todos os isolados. O clone pCuR2.A de X. campestris pv. vesicatoria, associado com resistência ao cobre, foi utilizado como sonda para detecção de homologia com o ADN total de Xcc. Não houve hibridização com o ADN total de nenhum dos 21 isolados. Quando o ADN plasmidial de 16 isolados foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI, fragmentos, variando de 9 a 10 kb e 4 a 5 kb, respectivamente, foram detectados com maior frequência. Os plasmídeos apresentaram grande polimorfismo, porém a análise de grupos hierárquicos indicou a formação de pelo menos três grupos distintos. O uso de perfis de restrição para identificação de Xcc dependerá da escolha de perfis realmente representativos de cada grupo para viabilizar comparações. A relação entre a virulência de Xcc com o perfil de restrição plasmidial não foi confirmada. / Twenty one isolates of Xanthomonas campestris pv. citri (Xcc ), from five counties of RS, were grown on CYE (casitone, 1; yeast extract, 0. 35; glycerol, 2; agar 15 g per liter ) culture amended with zero, 16, 32, 40, 48, 64, 80, 96, 112 and 128x10-2 mM CuS04. The CuS04 minimum inhibitory concentration (CMI) was 40x10-2 mM to all isolates . The pCuR2.A clone of X. campestris pv. vesicatoria, associated with copper resistance, was used as a probe to detect homology with total DNA of Xcc. No hibridization with DNA of the 21 isolates was found. When hybridization with total DNA of 16 isolates was digested with Hind III and Bam HI restriction enzymes, fragments, ranging from 9 to 10 kb and 4 to 5 kb, respectively, were detected more frequently. There was great polymorphism among plasmids, and the a nalysis of hierarquical groups showed at least three distinct groups. The use of DNA restriction profile to ide ntify Xcc depends on a representative profile of each group to allow comparinsons. The relationship betweem virulence of Xcc and the plasmid DNA restriction profile was not confirmed.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5298.pdf: 2436195 bytes, checksum: 47a2b6b8993059d60e028c4518c3ca75 (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / Universidade Federal de Sao Carlos / The citrus canker is an economically important disease for citrus crop. At the moment, there is no effective means of prevention or cure for this disease, which has contributed to citrus canker wide distribution around the world. The etiologic agents are bacteria of the genus Xanthomonas classified into two species, X. citri and X. fuscans. This study aimed to perform the differential proteomic analysis of cell surface proteins of Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), the more virulent specie, between infectious (in vivo) and non-infectious (in vitro) conditions of growth. Additionally, the same analysis was performed by shotgun for XAC against the Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii type B (XauB), less virulent specie, both after growth in vivo. Initially, we performed growth curves of both bacteria on leaves of a common citrus host (Citrus aurantifolia) in order to investigate the dynamics of population growth in vivo and the efficiency of cell recovery by two different methods. For proteomic analysis, intact bacterial cells had their surface proteins labeled with fluorescence (DIGE CyDye Fluor minimal dyes), were then lysed and the total protein extract analyzed by differential gel electrophoresis (2D-DIGE), as standardized in this study. Protein profiles were analyzed by DeCyder 7.0 software and spots differentially expressed (ANOVA p <0.05) were isolated from gels, identified by mass spectrometry and search in protein databases of the annotated genome sequence of the bacteria. Seventy-nine spots from XAC were analyzed and thirty different proteins were identified, of which 10 correspond to known membrane or cell surface proteins: Ton-B dependent receptors and OmpA-related proteins exhibited lower expression in infectious condition, differently of Ferric enterobactin receptors, 60 kDa chaperonin (GroEL) and DnaK which showed higher expression after host interaction. XAC and XauB total extraction analysis by shotgun identified just two XAC proteins. Cell surface proteins with increased in vivo expression in virulent strain (XAC) could provide future targets of biotechnological interest for fighting citrus canker for being possibly related to phytopathogenicity and/or host spectrum. / O cancro cítrico é uma doença economicamente importante para a citricultura. Devido à inexistência de medidas eficazes de prevenção e combate, o cancro cítrico ainda é uma doença de ampla distribuição. Os agentes etiológicos são bactérias do gênero Xanthomonas, sendo classificadas em duas espécies, X. citri e X. fuscans, as quais diferem em virulência e espectro de hospedeiros cítricos. Este trabalho teve como objetivo a análise diferencial do subproteoma da superfície celular de Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), espécie mais virulenta e causadora da cancrose A, entre duas condições de crescimento, infectante (in vivo) e não infectante (in vitro). Adicionalmente, a análise proteômica total por shotgun (LC-MS/MS) foi realizada para comparação de XAC com Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipo B (XauB), espécie menos virulenta, ambas após crescimento in vivo. Inicialmente, foram realizadas curvas de crescimento de ambas as bactérias em folhas de um hospedeiro cítrico comum (Citrus aurantifolia) a fim de se conhecer a dinâmica de crescimento populacional in vivo e a eficiência da recuperação bacteriana por dois diferentes métodos. Para as análises proteômicas, células bacterianas intactas tiveram suas proteínas de superfície marcadas com fluorescência (CyDye DIGE Fluor minimal dyes) e em seguida foram lisadas, sendo o extrato proteico total analisado por eletroforese diferencial em gel bidimensional (2D-DIGE), técnica padronizada neste trabalho. Os perfis proteicos de XAC foram analisados pelo software DeCyder 7.0 (GE Healthcare) e spots com expressão diferencial (ANOVA p<0,05) foram isolados dos géis e identificados por espectrometria de massas seguida de busca pela ferramenta Mascot em bancos de proteínas anotadas a partir da sequência genômica. Dos 79 spots de XAC analisados foram identificadas 30 diferentes proteínas, sendo que 10 correspondem a proteínas reconhecidamente de membrana e/ou superfície celular: receptores dependentes de Ton-B e proteínas relacionadas a OmpA foram encontradas com menor expressão na condição in vivo, enquanto que receptor de enterobactina, chaperonina 60 kDa (GroEL) e DnaK apresentaram maior expressão após interação com hospedeiro cítrico. Em relação à comparação do extrato total de XAC e XauB por shotgun foi possível identificar apenas duas proteínas de XAC. Proteínas da superfície celular com maior expressão na linhagem virulenta (XAC) na condição in vivo poderão ser futuros alvos de interesse biotecnológico para combate ao cancro cítrico por estarem possivelmente relacionadas com a fitopatogenicidade e/ou maior espectro de hospedeiros cítricos.

Vinte e um isolados de Xanthomonas campestris pv. citri (Xcc), provenientes de cinco municípios do RS, foram cultivados em meio de cultura CYE (casitone, 1; extrato de levedura, 0,35; glicerol, 2; ágar, 15 g/1), com zero, 16, 32, 40, 48 , 64 , 80 , 96 , 112 e 128x10-2 nM de CuS04. A concentração mínima inibitória (CMI) de CuS04 foi de 40x10-2 nM para todos os isolados. O clone pCuR2.A de X. campestris pv. vesicatoria, associado com resistência ao cobre, foi utilizado como sonda para detecção de homologia com o ADN total de Xcc. Não houve hibridização com o ADN total de nenhum dos 21 isolados. Quando o ADN plasmidial de 16 isolados foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI, fragmentos, variando de 9 a 10 kb e 4 a 5 kb, respectivamente, foram detectados com maior frequência. Os plasmídeos apresentaram grande polimorfismo, porém a análise de grupos hierárquicos indicou a formação de pelo menos três grupos distintos. O uso de perfis de restrição para identificação de Xcc dependerá da escolha de perfis realmente representativos de cada grupo para viabilizar comparações. A relação entre a virulência de Xcc com o perfil de restrição plasmidial não foi confirmada. / Twenty one isolates of Xanthomonas campestris pv. citri (Xcc ), from five counties of RS, were grown on CYE (casitone, 1; yeast extract, 0. 35; glycerol, 2; agar 15 g per liter ) culture amended with zero, 16, 32, 40, 48, 64, 80, 96, 112 and 128x10-2 mM CuS04. The CuS04 minimum inhibitory concentration (CMI) was 40x10-2 mM to all isolates . The pCuR2.A clone of X. campestris pv. vesicatoria, associated with copper resistance, was used as a probe to detect homology with total DNA of Xcc. No hibridization with DNA of the 21 isolates was found. When hybridization with total DNA of 16 isolates was digested with Hind III and Bam HI restriction enzymes, fragments, ranging from 9 to 10 kb and 4 to 5 kb, respectively, were detected more frequently. There was great polymorphism among plasmids, and the a nalysis of hierarquical groups showed at least three distinct groups. The use of DNA restriction profile to ide ntify Xcc depends on a representative profile of each group to allow comparinsons. The relationship betweem virulence of Xcc and the plasmid DNA restriction profile was not confirmed.

Com clima diversificado e terras férteis, o Brasil tem vocação natural para o desenvolvimento agropecuário e todas as suas vertentes. Assim, o agronegócio é hoje a principal locomotiva da economia brasileira, representando cerca de um terço do nosso Produto Interno Bruto (PIB). Nesse contexto, o Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do planeta, com destaque para a produção de laranjas. Particularmente, o país lidera a produção mundial de suco de laranja e conta com uma participação de 85% nas exportações deste produto. Porém, um dos principais fatores atuais que restringem os lucros e a expansão da citricultura é o controle fitossanitário. Atualmente, dentre as principais doenças podemos destacar o HLB e o cancro cítrico. Ambas, doenças bacterianas que não têm cura comprometem a produção e desenvolvimento da fruta e levam à morte da árvore. Dessa maneira, o monitoramento destas é fundamental para evitar danos aos frutos e a necessidade da erradicação de plantações inteiras. O presente trabalho avaliou o emprego das técnicas de Espectroscopia de Fluorescência Induzida por Laser (LIFS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Induzido por Laser (LIBS) como forma de diagnóstico destas doenças, se apresentando como uma alternativa às inspeções visuais e ao PCR utilizados atualmente. Para isso, folhas de citros in natura provenientes de plantas sadias, com HLB ou com cancro foram amostradas e medidas com ambos os sistemas. Através do sistema LIFS foi realizado um estudo de precocidade no diagnóstico do HLB. Este sistema fotônico pôde detectar a doença até 21 meses antes do aparecimento dos primeiros sintomas visuais. Foram utilizados classificadores sazonais, criados a partir de Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) e conjuntos de calibração previamente avaliados. Quanto ao cancro cítrico e o sistema LIFS, taxas de acerto superiores a 90% foram alcançadas nos melhores casos de validação cruzada dos dados. A diferenciação do cancro e do HLB também foi possível pela mesma técnica ao avaliar um conjunto pequeno de dados, que atingiu uma taxa de acerto de 82%. Através dos espectros obtidos pelo sistema LIBS, avaliou-se as variações nutricionais causadas na planta devido à doença. Por meio de tais variações e métodos de PLSR foi construído um modelo para o diagnóstico de HLB alcançando taxas de acerto da ordem de 75%. Em relação ao cancro cítrico e o sistema LIBS, um estudo preliminar foi realizado, e uma taxa de acerto superior a 90% foi atingida. Por fim, os resultados corroboraram com a ideia inicial de se realizar o diagnóstico do HLB e do cancro cítrico através de técnicas fotônicas. Dentre outras vantagens estas permitem uma análise rápida, in loco, sem a necessidade de preparo de amostra. Além disso, para o HLB, as técnicas fotônicas demonstraram menor sensibilidade à distribuição não homogênea da doença, quando comparada com a técnica de referência (qPCR). / The diverse climate and fertile soils make Brazil a country with a natural vocation for agricultural development. Thus, agribusiness is now the main locomotive of the Brazilian economy, accounting for about one-third of our Gross Domestic Product (GDP). In this context, Brazil is the third largest fruit producer in the world, with emphasis on the orange production. Particularly, the country leads the world production of orange juice, and with a stake of 85% in exports of this product. However, one of the main factors that restrict current profits and the expansion of citrus production is phytosanitary control. Currently, among the major diseases we highlight the HLB (Greening) and Citrus Canker, two bacterial diseases that have no cure and affect production and fruit development. Therefore, monitoring is essential to prevent damage to the fruits and the complete eradication of infected orchards. The present study evaluated the use of Laser-Induced Fluorescence Spectroscopy (LIFS) and Laser-Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) techniques as alternative diagnostic methods to visual inspection and PCR technique, currently used. For that, citrus leaves from healthy, HLB or citrus canker infected plants, were sampled and measured with both systems. Through LIFS system, a study of the HLB early diagnosis was done. This photonic system could detect the disease up to 21 months before the tree show the visual symptoms. Seasonal classifiers were used, which were designed from Partial Least Square Regression (PLSR) methods and calibration database previously acquired. Regarding citrus canker and LIFS system, success rates higher than 90% were achieved in the best cases. The differentiation between citrus canker and HLB was also possible using the same technique reaching a success rate around 82%. Through the spectrum obtained by LIBS system, it was evaluated the nutritional variations caused in the plant due to HLB, and based on these data, the diagnosis was done. The average success rate was 75%, which was achieved by PLSR model. Regarding on citrus canker and LIBS system, a preliminary study was carried out and a success rate greater than 90% was achieved. Finally, the results corroborated with the use of photonic techniques for the HLB and citrus canker diagnosis. Among other advantages, they allow rapid analysis, in loco and without the need of sample preparation. In addition, for the HLB, photonics techniques showed lower sensitivity to the non-homogeneous distribution of the disease when compared with the reference technique (qPCR).

Vinte e um isolados de Xanthomonas campestris pv. citri (Xcc), provenientes de cinco municípios do RS, foram cultivados em meio de cultura CYE (casitone, 1; extrato de levedura, 0,35; glicerol, 2; ágar, 15 g/1), com zero, 16, 32, 40, 48 , 64 , 80 , 96 , 112 e 128x10-2 nM de CuS04. A concentração mínima inibitória (CMI) de CuS04 foi de 40x10-2 nM para todos os isolados. O clone pCuR2.A de X. campestris pv. vesicatoria, associado com resistência ao cobre, foi utilizado como sonda para detecção de homologia com o ADN total de Xcc. Não houve hibridização com o ADN total de nenhum dos 21 isolados. Quando o ADN plasmidial de 16 isolados foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI, fragmentos, variando de 9 a 10 kb e 4 a 5 kb, respectivamente, foram detectados com maior frequência. Os plasmídeos apresentaram grande polimorfismo, porém a análise de grupos hierárquicos indicou a formação de pelo menos três grupos distintos. O uso de perfis de restrição para identificação de Xcc dependerá da escolha de perfis realmente representativos de cada grupo para viabilizar comparações. A relação entre a virulência de Xcc com o perfil de restrição plasmidial não foi confirmada. / Twenty one isolates of Xanthomonas campestris pv. citri (Xcc ), from five counties of RS, were grown on CYE (casitone, 1; yeast extract, 0. 35; glycerol, 2; agar 15 g per liter ) culture amended with zero, 16, 32, 40, 48, 64, 80, 96, 112 and 128x10-2 mM CuS04. The CuS04 minimum inhibitory concentration (CMI) was 40x10-2 mM to all isolates . The pCuR2.A clone of X. campestris pv. vesicatoria, associated with copper resistance, was used as a probe to detect homology with total DNA of Xcc. No hibridization with DNA of the 21 isolates was found. When hybridization with total DNA of 16 isolates was digested with Hind III and Bam HI restriction enzymes, fragments, ranging from 9 to 10 kb and 4 to 5 kb, respectively, were detected more frequently. There was great polymorphism among plasmids, and the a nalysis of hierarquical groups showed at least three distinct groups. The use of DNA restriction profile to ide ntify Xcc depends on a representative profile of each group to allow comparinsons. The relationship betweem virulence of Xcc and the plasmid DNA restriction profile was not confirmed.

Devido ao aumento da preocupação com o impacto dos agrotóxicos no meio ambiente e na saúde humana, busca-se uma agricultura sustentável. É no âmbito dessa questão que a resistência induzida torna-se uma ferramenta fundamental no manejo integrado de doenças e indispensável para uma nova agricultura, mais racional e sustentável. Dentre os diversos agentes bióticos e abióticos, utilizados em trabalhos de indução de resistência de plantas a patógenos, os cogumelos Lentinula edodes e Agaricus blazei vem sendo pesquisados. Desse modo, este trabalho teve como objetivos avaliar o efeito de diferentes isolados de L. edodes e A. blazei e do acibenzolar-S-metil (aSm) in vitro contra as bactérias e o controle de doenças de importância econômica para as culturas do tomate e da berinjela, em casa-de-vegetação. Depois de obtida a proteção, estudar os possíveis mecanismos bioquímicos ativados nas plantas através do uso dos extratos dos cogumelos e buscar a purificação parcial destes extratos, a fim de identificar o(s) princípio(s) ativo(s). No patossistema berinjela/Ralstonia, os extratos aquosos dos cogumelos não exerceram nenhum efeito direto sobre o patógeno, sendo que os isolados Abl-11 e Abl-28 de de A. blazei reduziram significativamente a ocorrência de folhas murchas das plantas em casa-devegetação, em relação aos demais tratamentos. Ocorreu um aumento na atividade da peroxidase, fenilalanina amônia-liase e polifenoloxidase nas folhas tratadas. O preciptado 60-80% obtido pela precipitação com sulfato de amônia e a fração 4 da cromatografia de troca aniônica (CTA) de Abl-28 reduziram a ocorrência de folhas murchas, sendo que a separação eletroforética revelou a presença de uma banda no gel com aproximadamente 29 kDa nesta fração. Em tomate, os extratos aquosos dos isolados dos cogumelos e o acibenzolar-S-metil não exerceram nenhum efeito inibitório in vitro no crescimento de Ralstonia solanacearum e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Porém, os isolados Abl-26 de A. blazei, Le-96/17 de L. edodes e aSm foram os que conferiram maior proteção das plantas de tomates contra os patógenos, diminuindo a ocorrência de folhas murchas, proporcionando um aumento na atividade da peroxidase no patossistema tomate/Ralstonia e um aumento na atividade de peroxidase, quitinase, fenilalanina amônia-liase e polifenoloxidase no patossistema tomate/Clavibacter. O preciptado 40-80% de Le-96/17 foi submetido à CTA, obtendo-se seis frações protéicas. As frações 3 e 4, junto com aSm e o extrato aquoso de Le-96/17 reduziram a ocorrência de folhas murchas. A separação eletroforética destas frações da CTA, do preciptado 40-80% e do extrato aquoso de Le-96/17 revelaram a presença de mais de uma banda no gel na fração 3 e 4 da CTA, no preciptado 40-80% e no extrato aquoso bruto de Le-96/17. Com base nos resultados, os cogumelos A. blazei e L. edodes apresentam compostos que induziram resistência em plantas berinjela e tomate, podendo auxiliar no controle de doenças. / Because the increase of the impact of chemical products in the environment and in human health, a search by sustainable agriculture is needed. It is in the scope of this problem that the induced resistance becomes a tool in the integrated management of pests and diseases and indispensable for a new agriculture, more rational and sustainable. Among the biotic and abiotic agents used to induce resistance, the mushrooms Lentinula edodes and Agaricus blazei have being studied. Thus, the objectives of the present work were evaluate the effects of different isolates of L. edodes and A. blazei and of the acibenzolar-S-methyl (aSm) on in vitro bacterial growth and the control of the diseases in tomato and eggplant under greenhouse conditions. The studies also tried to elucidate the mode of action of the extracts from the fruiting bodies and partially purify them. In eggplant plants, the aqueos extracts from the different mushroom isolates did not have any direct effect on the pathogen. The isolates Abl-11 and Abl-28 of A. blazei reduced the wilt in eggplant leaves, under greenhouse conditions, and increased peroxidase, phenylalanine ammonia-lyase and polyphenoloxidase activities in treated leaves. The fraction of aqueous extract of A. blazei (Abl-28) obtained with ammonium sulfhate and fraction 4 from anion exchange chromatography reduced bacterial wilt and a protein fraction exhibiting molecular mass around 29 kDa was obtained. In tomato plants, the aqueos extracts from the different mushrooms and the acibenzolar-S-methyl did not inhibit in vitro growth of Ralstonia solanacearum and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. However, the isolates Abl-26 of A. blazei, Le-96/17 of L. edodes and aSm protected tomato plants against the bacterial pathogens, reducing the wilt and causing an increase in peroxidase activity in the tomato/Ralstonia interaction and an increase in peroxidase, chitinase, phenylalanine ammonialyase and polyphenoloxidase activities in the tomato/Clavibacter interaction. The ammonium sulphate fraction of Le-96/17 was submitted to anion exchange chromatography, and the proteins from fractions 3 and 4, aSm and the aqueous extract of Le-96/17 reduced the occurrence of wilt in the leaves. A protein fraction exhibiting proteins with molecular mass around 29, 37 and 45 kDA was obtained in fractions 3 and 4. Thus, the results showed that the mushrooms A. blazei and L. edodes edodes have substances that induce resistance in eggplant and tomato plants.

O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, é uma das doenças mais importantes da citricultura. O estudo do efeito de medidas alternativas de controle para o manejo desta doença assume grande importância tanto para áreas citrícolas onde a erradicação de plantas não é a principal medida de controle do cancro cítrico, como no Estado do Paraná, como para regiões onde a prática da erradicação vem sendo adotada como principal medida de controle da doença, como no Estado de São Paulo. Instalado em pomar citrícola do município de Ourizona, na região Noroeste do Estado do Paraná, este trabalho buscou estudar o progresso dessa importante doença em campo sob condições de proteção química das plantas, utilizando produto cúprico; e cultural, por meio de quebra-vento. Além disso, importantes informações relacionadas ao efeito de cada tratamento sobre a produção das plantas de laranja ‘Pêra’ também foram obtidas. Enquanto a aplicação de cobre apresentou efeito significativo na redução dos níveis de cancro cítrico, o emprego de quebra-vento pouco ou nada contribuiu para o controle da doença. Após 29 avaliações mensais, plantas submetidas à aplicação de bactericida cúprico apresentaram valores médios de AUDPC* de incidência da doença nas folhas de cerca de 20 %, nível 44 % inferior ao observado para as plantas não protegidas quimicamente. O mesmo comportamento foi observado para a severidade da doença. Após 18 avaliações mensais foi possível observar que plantas submetidas à aplicação de produto cúprico apresentaram em média folhas com níveis de AUDPC* de severidade 37 % menores do que plantas não protegidas quimicamente. Em 2004, quando os níveis da doença foram relativamente elevados, plantas submetidas ao controle químico apresentaram produção 54 % superior àquelas não tratadas. Em 2005, quando os níveis de cancro foram menores, não foi observada diferença na produtividade entre os tratamentos. Nas duas safras, plantas tratadas com bactericida apresentaram menor incidência da doença em frutos e maior proporção de frutos colhidos em relação a carga total da planta (colhidos + caídos). Dos modelos testados, o logístico foi o mais adequado para descrever o progresso temporal do cancro cítrico nos dois anos estudados para todos os tratamentos. Nas duas safras estudadas a proporção de frutos colhidos foi a variável que apresentou função de dano com maior coeficiente de determinação (R2) quando relacionada aos níveis de incidência e severidade de cancro cítrico observados. / Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri, is one of the most important diseases to citrus production. The effect of alternative measures of citrus canker control is very important to areas where plant eradication is the most important measure of control, as in Sao Paulo State, as well as to areas where eradication is not a major component of canker control, as in Parana State. This work aimed to study the progress of citrus canker in field conditions under chemical control, by using copper sprays; and cultural control, by using windbreak. Field plots were installed in a citrus orchard of ‘Pêra’ sweet orange located in Ourizona county, northwest of Parana State, Brazil. Information regarding the effect of each treatment alone or in combination was assessed. Whereas copper sprays showed significant effect on reducing citrus canker levels, windbreak did not contribute significantly to disease control. After 29 monthly assessments, plants submitted to copper sprays showed values of AUDPC* of citrus canker incidence near to 20 %. This disease level was 44 % lower than that observed to plants not protected with copper compound. The same pattern was observed to disease severity. After 18 monthly assessments, plants sprayed with copper showed values of AUDPC* of disease severity 37 % lower than that observed to plants of the check plots. In 2004, when the citrus canker level was higher, plants treated with copper yielded 54 % more than that not sprayed. In 2005, when the citrus canker level was lower, no significant difference was observed between treatments. In both seasons, plants sprayed with copper showed lower citrus canker incidence on fruits and higher rate of harvested fruits. Among the temporal models tested, the logistic was the most appropriate to describe citrus canker incidence over time in both years studied to all treatments. In both harvests the rate of harvested fruits was the variable that showed the higher coefficient of determination (R2) when related to citrus canker incidence and severity levels.

A informação sobre a dinâmica espaço-temporal de doenças de plantas é de importância fundamental em estudos epidemiológicos, podendo ser utilizada para descrever e entender o desenvolvimento das doenças, desenvolver planos de amostragem, planejar experimentos controlados e caracterizar perdas na produção ocasionadas pela doença. O estudo de padrões espaciais de doenças de plantas, que são reflexos do processo de dispersão dos patógenos, é importante em estudos epidemiológicos, como o de doenças dos citros, para se definirem estratégias mais adequadas para o controle das doenças, diminuindo os prejuízos causados. A Citricultura é uma das principais atividades agrícolas do Brasil e representa a principal atividade econômica de mais de 400 municípios do Triângulo Mineiro e do Estado de São Paulo, onde se encontra a maior área de citros do país e a maior região produtora de laranjas do mundo. Na avaliação do padrão espacial, diferentes métodos têm sido utilizados, dentre os quais incluem-se o ajuste de distribuições, como, por exemplo, a distribuição beta-binomial, o estudo da relação variância-média, o cálculo de correlação ao intraclasse, a utilização de técnicas de autocorrelação espacial, métodos de classes de distâncias e o ajuste de modelos estocásticos espaço-temporais. Diante da importância de se estudarem padrões espaciais da incidência de doenças em plantas e da necessidade de se conhecer melhor a epidemiologia da morte súbita dos citros e do cancro cítrico, uma técnica baseada em verossimilhança para o ajuste de modelos estocásticos espaço-temporais foi utilizada na caracterização de padrões espaciais. Modificações na metodologia original, buscando uma diminuição do tempo gasto nas análises, foram propostas nesse estudo. Os resultados mostram que as modificações propostas resultaram em uma diminuição significativa no tempo de análise, sem perda de acurácia na estimação dos parâmetros dos modelos considerados. / The information about the spatial-temporal dynamics is of fundamental importance in epidemiological studies for describing and understanding the development of diseases, for developing efficient sampling plans, for planning controlled experiments, for evaluating the effect of different treatments, and for determining crop losses. The Citriculture is the major economic activity of more than 400 municipalities in Minas Gerais and São Paulo States. This is the largest citrus area in Brazil, and the largest sweet orange production area in the world. Therefore, it is very important to study and to characterize spatial patterns of plant diseases, such as citrus canker and citrus sudden death. In the spatial dynamics study, many different methods have been used to characterize the spatial aggregation. These include the fitting of distributions, such as the beta-binomial distribution, the study of variance-mean relationships, the calculation of intraclass correlation, the use of spatial autocorrelation techniques, distance class methods and, the fitting of continuous time spatiotemporal stochastic models. In this work, an improved technique for fitting models to the spatial incidence data by using MCMC methods is proposed. This improved technique, which is used to investigate the spatial patterns of plant disease incidence, is considerably faster than Gibson’s methodology, in terms of computational time, without any loss of accuracy.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T05:36:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soprano_AdrianaSantos_D.pdf: 24018757 bytes, checksum: 29724fbb81a588e3bb656bf4c2df3390 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri (X. citri), afeta a maioria das espécies de Citrus, ocorre praticamente em todos continentes e se destaca como uma séria ameaça à citricultura brasileira. O mecanismo molecular pelo qual X. citri causa cancro não é inteiramente conhecido, entretanto, sabe-se que a bactéria utiliza o sistema secretório tipo III para injetar proteínas de patogenicidade, entre elas, PthAs da família AvrBs3/PthA, também conhecidas como efetores TAL (transcriptional activator-like). Os efetores TAL atuam como fatores de transcrição transativando genes específicos da planta que vão beneficiar a bactéria ou desencadear respostas de defesa. Com o objetivo de entender os mecanismos moleculares pelos quais os efetores TAL atuam, a técnica de duplo híbrido foi usada para identificar proteínas de laranja doce (Citrus sinensis) que interagem com PthA4, um dos efetores TAL de X. citri necessário para o desenvolvimento do cancro cítrico. A maioria das proteínas de laranja identificadas como alvos de PthA4 apresenta domínios de ligação à DNA ou RNA e está envolvida no controle da transcrição, estabilização de mRNAs e tradução. Várias dessas proteínas interagem entre si, sugerindo a presença de um complexo multiproteico como alvo de efetores TAL. Entre as proteínas envolvidas no controle da transcrição, destacamos a CsMAF1, uma proteína homóloga à MAF1 humana que atua como regulador negativo da RNA Polimerase III. Os resultados obtidos nesse trabalho revelam que CsMAF1 complementa o fenótipo do mutante maf1 de levedura, reprimindo a expressão de tRNAHis e que a expressão de PthA4 na cepa complementada restaura a síntese desse tRNA. Portanto, os dados mostram que CsMAF1 atua como um repressor da RNA Pol III em levedura e que PthA4 altera o estado repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III. De forma surpreendente, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsMAF1 apresentaram aumento significativo no número e intensidade de lesões hiperplásticas ou eruptivas quando infiltradas com X. citri, indicando que CsMAF1 desempenha um papel crítico no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. O aumento das lesões do cancro nas plantas silenciadas para CsMAF1 se correlaciona com um aumento expressivo de tRNAs, incluindo o tRNAHis, confirmando assim o papel repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III em citros. Além disso, mostramos nesse trabalho que CsMAF1 é uma fosfoproteína que se encontra na forma dimérica em solução, uma característica singular ainda não descrita para membros dessa família de proteínas. Verificamos que CsMAF1 é fosforilada in vitro pelas quinases PKA e PKC e que apresenta sítios adicionais de fosforilação conservados para a quinase TOR, incluindo o resíduo Thr62. Curiosamente, tais sítios se localizam na interface de dimerização de CsMAF1, sugerindo que a fosforilação desses sítios deve regular a função da proteína e/ou seu estado multimérico. De fato, verificamos que a substituição do resíduo de treonina Thr 62 para ácido aspártico (Asp 62) diminui a proporção dímero:monômero de CsMAF1, indicando que a fosforilação de resíduos na interface do dímero desestabiliza o dímero, e que esse pode ser um mecanismo regulatório novo para essa classe de proteína. Desse modo, esses achados abrem novas perspectivas para o entendimento não só dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação da RNA Pol III pela CsMAF1, como também do papel de PthA4 na interação com CsMAF1 e sua modulação da transcrição / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas citri (X. citri), is a disease that affects most of the Citrus species, occurs in almost all continents and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The molecular mechanism by which X. citri causes canker is poorly understood, however the bacterium injects pathogenicity proteins via the type III secretion system (T3S) including proteins of AvrBs3/PthA family, also known as transcriptional activator-like (TAL) effectors. TAL effectors have been extensively studied and are known to act as transcription factors that transactivate specific plant genes which either benefit the bacteria or trigger defense responses. To gain insights into the molecular mode of action of TAL effectors, a twohybrid screening was performed to identify sweet orange (Citrus sinensis) proteins that interact with PthA4, one of the X. citri TAL effectors required for citrus canker development. Among the proteins identified as PthA4 interactors, most are DNA and/or RNA-binding factors involved in chromatin remodeling and repair, transcriptional control and mRNA stabilization/modification. Several of these proteins interact with each other, suggesting the presence of a multiprotein complex as a target of TAL effectors. Among the proteins involved in transcription control, we selected for further studies the CsMAF1, a homolog of the human MAF1 that acts as a negative regulator of RNA polymerase III. The results presented here reveal that CsMAF1 complements the yeast maf1 mutant phenotype by repressing the tRNAHis transcription, and that PthA4 expression in the complemented strain restores the tRNAHis synthesis. Thus, the data show that CsMAF1 acts as a RNA Pol III repressor in yeast and that PthA4 somehow suppresses the repressor activity of CsMAF1 upon on the RNA Pol III. Surprisingly, we found that citrus plants with reduced levels of CsMAF1 showed a significant increase in the number, morphology and size of eruptive or hyperplastic lesions when infiltrated with X. citri, indicating the CsMAF1 plays a critical role in canker development. Increased canker lesions in CsMAF1 silenced plants correlated with a significant increase of tRNAs expression, including tRNAHis, thus confirming the repressor role of CsMAF1 upon the citrus RNA Pol III. Furthermore, we showed in this work that CsMAF1 is a phosphorylated and a dimer in solution, a feature that so far has not been reported for any member of this protein family. We found that CsMAF1 is phosphorylated in vitro by PKA and PKC, and has additional phosphorylation sites for the TOR kinase, including the Thr 62 residue. Interestingly, these phosphorylation sites are located at the dimerization interface of CsMAF1, suggesting that phosphorylation of such sites might regulate the function of the protein and / or its multimeric state. Indeed, mutation of threonine residue Thr62 to aspartic acid (Asp62) decreases the dimer:monomer CsMAF1 ratio, indicating that phosphorylation of the residues at the interface of the dimer destabilizes the dimer, and this may be a novel regulatory mechanism for this class of protein. Thus, these findings open new perspectives for the understanding of the molecular mechanisms involved in RNA Pol III regulation by CsMAF1, as well as for the role of PthA4 in the modulation of RNA Pol III transcription mediated by CsMAF1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4434.pdf: 2956570 bytes, checksum: f54aa91fcb424a121affb3c9674f546e (MD5) Previous issue date: 2012-08-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / The aim of this work was to perform differential proteomic analysis of the periplasmic protein profiles of the genome strains A, B and C of Xanthomonas spp, which differ in pathogenicity and host range of citrus. The strain Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the most virulent and infects all types of citrus, while the strain B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) is less virulent and the strain C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) has a unique citrus-host. The comparative proteomic analysis of Xau-B and Xau-C in relation to Xac can reveal genes and proteins involved in pathogenicity and host range of citrus, respectively. The strains A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) and C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) were grown in XAM-1, which is known to be a pathogenicity-inducing medium for Xac, and in a non-inducing pathogenicity (Nutrient Broth, NB). Proteins from both types (grown in triplicate using both media), were separated by bidimensional electrophoresis (2DPAGE) and the gels were stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 and documented. A comparative analysis of the protein profiles of Xac and Xau-B, and Xac and Xau-C, grown in the same culture medium, was performed using ImageMaster Platinum software (GE Healthcare). Statistical analysis (ANOVA) revealed a large number of periplasmic proteins that presented type-specific or differential expression between the two bacteria. For the comparison between Xac and Xau-B we used the twodimensional Xau-B gels of periplasmic proteins obtained by Carnielli (2011). The differential spots between Xac and Xau-C, Xac and Xau-B that showed a significant differential expression (p <0.05) were isolated from gels and identified by ESI-QUADTOF mass spectrometry (LNBio, Campinas-SP), employing Xac, Xau-B and Xau-C databases. Several differentially expressed proteins between strains were identified for the different conditions studied, showing that some of them were strain-specific (approximately 10) while others were expressed in all strains, differing only in intensity. Those proteins potentially related to pathogenicity and citrus host were quantified using the software Scaffold v. 3.0, for the mass spectrometry data.The results showed that Xac, Xau-B, and Xau-C had remarkable differences between the periplasm protein profiles for both conditions, even under conditions of no induction of pathogenicity. The proteomics approach showed that even though the strains showed a different pattern of protein expression, the sequences of genes related to the differential proteins are present in all strains. Based on the proteomic analysis, proteins that showed remarkable differential expression between the genome strainswere selected, and its expression was evaluated by Western blot in periplasmic fraction of the bacteria. The data obtained in the the comparative proteomic analysis for the superoxide dismutase corroborated most quantitative results generated by the software Scaffold. This work showed that the proteomic analysis, combined with quantitative analysis tools, is an important tool that comes to complement genomic investigations designed to differentiate the species of Xanthomonas spp. / O presente trabalho teve por objetivo a análise proteômica comparativa da fração periplasmática das estirpes-genoma A, B e C de Xanthomonas spp, as quais diferem em patogenicidade e gama de citros hospedeiros. A estirpe A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) é a mais virulenta e infecta todos os tipos de citros, enquanto que a estirpe B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) é menos virulenta e a estirpe C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) possui um único hospedeiro cítrico. Estas estirpes foram cultivadas em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN). Após a extração de proteínas da fração periplasmática em triplicata, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. A análise proteômica comparativa de Xau-B e Xau-C relativamente à Xac pode nos levar a genes e proteínas envolvidas com patogenicidade e espectro de hospedeiro cítrico, respectivamente. Assim, Xac e Xau-C foram cultivadas em triplicata em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN), sendo as células coletadas ao final da fase exponencial de crescimento, segundo curvas previamente realizadas. Após a extração de proteínas periplasmáticas, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. Uma análise estatística das diferenças observadas nas intensidades dos spots nos géis 2D foi realizada entre Xau-C e Xac e entre Xau-B e Xac (nos mesmos meios de cultura) utilizando o software Image Master 2D-Platinum (GE Healthcare). Para esta última comparação foram utilizados os géis bidimensionais de proteínas periplasmáticas de Xau-B obtidos por Carnielli (2011). As proteínas diferenciais entre Xac e Xau-C e entre Xac e Xau-B que apresentaram uma expressão diferencial significativa (p<0,05) foram isoladas a partir dos géis e identificadas por espectrometria de massas (LNBio, Campinas-SP) após pesquisa em banco de proteínas anotadas a partir do genoma de cada uma das linhagens. Inúmeras proteínas diferencialmente expressas entre as linhagens foram identificadas para as diferentes condições estudadas, demonstrando que algumas foram estirpe-específicas (10 aproximadamente) enquanto outras foram expressas em todas as linhagens, diferindo na sua intensidade. Aquelas proteínas que indicaram alguma potencialidade em relação à patogenicidade e hospedeiro cítrico foram quantificadas com o uso do software Scaffold v. 3,0, a partir de dados provenientes da espectrometria de massas. Os resultados obtidos demonstram que Xac, Xau-B e Xau-C apresentam perfis proteicos marcadamente diferentes na fração de periplasma, mesmo em condições de não indução da patogenicidade. A abordagem proteômica evidenciou que embora as estirpes apresentem um padrão de expressão protéica muito distinto na fração rica em proteínas periplasmáticas, as sequências dos genes relacionados às proteínas diferenciais (superóxido dismutase e fosfoglicomutase) estão presentes em todas as estirpes. Com base na análise proteômica, foram selecionadas proteínas que apresentaram expressão diferencial acentuada entre as linhagens-genomas, nas condições estudadas, sendo sua expressão avaliada por Western blot contra extrato protéico periplasmático das três linhagens- genomas, após cultivo das mesmas em meio CN e XAM-1 Os dados obtidos para a superoxido dismutase corroboraram a maioria dos resultados quantitativos gerados pelo software Scaffold. Este trabalho evidenciou que a análise proteômica, aliada às ferramentas de análises quantitativas, é um recurso que vem complementar as investigações genômicas destinadas a diferenciar as diferentes espécies de Xanthomonas spp. Sob os aspectos biotecnológicos a busca e identificação de proteínas biomarcadoras, em especial aquelas relacionadas com patogenicidade e especificidade à hospedeiro, são importantes alvos para produção de drogas no combate ao cancro cítrico.