A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

Resumo: O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade (genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no 02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em Xanthomonas campestris / Abstract: Citrus canker is among the major diseases which affect citrus production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02, of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14 proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria, showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed that several type II secretion system's secreted proteins showed an active role in host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system's proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the inactivation of the type three secretion system's pilus, showing the relationship of this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris / Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Maria Teresa Marques Novo / Banca: Leandro Márcio Moreira / Mestre

Submitted by ALINE CRISTINA LOPES null (line.cl@hotmail.com) on 2016-05-02T12:42:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Aline_Cristina_Lopes.pdf: 1995885 bytes, checksum: 09268565881925cc85d0cdbe17aa6d6c (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T14:14:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lopes_ac_me_jabo.pdf: 1995885 bytes, checksum: 09268565881925cc85d0cdbe17aa6d6c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T14:14:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lopes_ac_me_jabo.pdf: 1995885 bytes, checksum: 09268565881925cc85d0cdbe17aa6d6c (MD5) Previous issue date: 2016-04-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A citricultura é uma das principais atividades do agronegócio brasileiro. Entretanto, inúmeras pragas e doenças atacam os citros, causando grandes prejuízos econômicos. O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é um grave problema para o setor, não havendo ainda um método eficaz para o seu controle. Neste estudo, utilizando RNASeq, foram analisados os perfis transcricionais de Xac inoculada em duas espécies de citros contrastantes à doença: laranja doce ‘Pêra Rio’ (Citrus sinensis L. Osbeck), menos suscetível e lima ácida ‘Galego’ (Citrus aurantifolia Swingle), altamente suscetível, às 48 e 72 horas após a infecção (hai), com o objetivo de identificar genes de Xac envolvidos no processo de infecção. Foram identificados 80 genes de Xac diferencialmente expressos (GDEs) no hospedeiro laranja doce ‘Pêra Rio’, sendo 41 e 39 nos tempos de 48 e 72 hai, respectivamente. Em lima ácida ‘Galego’ foram identificados 82 GDEs, sendo 40 no tempo de 48 hai e 42 em 72 hai. Alguns destes genes diferencialmente expressos foram avaliados pela técnica de PCR quantitativa em tempo real, sendo estes hpa1, hrpE, hrpW, virK, ahpC, katE, katG, cydA e cydB, os quais estão envolvidos na patogenicidade e virulência, na defesa ao estresse oxidativo e na fosforilação oxidativa. Os genes de patogenicidade e virulência foram induzidos em Xac em ambos os hospedeiros, enquanto que os genes relacionados à cadeia respiratória foram inibidos em ambos os hospedeiros, com maior inibição em lima ácida ‘Galego’. No entanto, os genes relacionados ao estresse oxidativo apresentaram um perfil de expressão maior em Xac na interação com laranja doce ‘Pêra Rio’ do que em lima ácida ‘Galego’, principalmente ahpC e katG. A determinação da concentração de H2O2 nas folhas revelou que laranja doce ‘Pêra Rio’, espécie menos suscetível ao cancro cítrico, possui maior quantidade de H2O2 do que lima ácida ‘Galego’, espécie altamente suscetível. Isso sugere que a menor susceptibilidade ao cancro cítrico da laranja ‘Pêra Rio’ pode estar relacionada com a maior quantidade de H2O2 presente nesta espécie, o que leva a bactéria a ativar seu arsenal de enzimas para combater o estresse oxidativo do meio, retardando a infecção. / The citrus industry is one of the main activities of Brazilian agribusiness. However, many pests and diseases attack citrus, causing great economic losses. The citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is a major problem for the sector, there is not yet an effective method for its control. In this study, the transcriptional profiles of Xac inoculated in two species of contrasting citrus disease were analyzed using RNA-Seq : sweet orange 'Pêra Rio' (Citrus sinensis L. Osbeck), moderately tolerant and Mexican Lime 'Galego' (Citrus aurantifolia Swingle) highly susceptible at 48 and 72 hours after infection (hai) aiming to identify Xac genes involved in the infection process. We identified 80 Xac differentially expressed genes (DGE) in sweet orange 'Pera Rio', 41 and 39 at 48 and 72 hai, respectively. In Mexican Lime 'Galego' 82 DGE were identified, 40 at 48 and 42 at 72 hai. Some of these differentially expressed genes were evaluated by real time quantitative PCR : hpa1, hrpE, hrpW, Virk, ahpC, KatE, katG, cyda and cydB, which are involved in pathogenicity and virulence, oxidative stress defense and oxidative phosphorylation. The pathogenicity and virulence genes were induced in Xac in both hosts, whereas the respiratory chain-related genes were inhibited in both hosts with greater inhibition in Mexican lime 'Galego'. However, genes related to oxidative stress showed a higher expression profile in Xac interaction with sweet orange 'Pera Rio' than with Mexican lime 'Galego', mainly ahpC and katG. The determination of H2O2 concentration in leaves revealed a higher amount of H2O2 in sweet orange 'Pêra Rio' moderately tolerant to citrus canker, than in Mexican Lime 'Galego' highly susceptible to citrus canker. The results suggests that the lower susceptibility to citrus canker orange 'Pera Rio' may be related to the greater amount of H2O2 present in this specie, which leads the bacteria to activate their arsenal of enzymes to fight oxidative stress environment, slowing the infection.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-05Bitstream added on 2014-06-13T20:33:53Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_rm_me_jabo.pdf: 510263 bytes, checksum: 543073ee3d6f55d77bb1607889dc966f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade (genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no 02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em Xanthomonas campestris / Citrus canker is among the major diseases which affect citrus production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02, of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14 proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria, showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed that several type II secretion system’s secreted proteins showed an active role in host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system’s proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the inactivation of the type three secretion system’s pilus, showing the relationship of this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3253.pdf: 2155477 bytes, checksum: 03c92d367d865f20f90059d887400f1f (MD5) Previous issue date: 2010-08-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / Citrus canker is an economically important disease that affects many citrus growing areas around the world, and there is no effective control or cure. The causative agents are bacteria from the genus Xanthomonas, recently classified as two novel species, X. citri e X. fuscans. The most virulent strain is X. citri subsp. citri (Xac). In this study, we did a differential proteomic analysis of a periplasmatic proteins enriched fraction from Xac, by comparison of the protein profiles after cellular growth in pathogenicity inducing medium (XAM1) or non-inducing medium (Nutrient Broth). We performed Bidimensional Electrophoresis (2D-PAGE) in triplicate and statistical analyses were done with the software Image Master Platinum (GE). At least 80 spots showed significant differences on protein expression (p<0.05) between the two conditions tested (induction/ non-induction) and had their proteins digested by trypsin. The peptides were analyzed by mass spectrometry (LCESI- Q-Tof) and the results were compared with proteins from genome databases using the Mascot tool. Among Xac proteins identified with higher expression in in vitro pathogenicity inducing situation, two are classified as proteins involved with Pathogenicity, Virulence, and Adaptation (in according to the genome annotation): superoxidase dismutase (XAC2386) e phosphoglucomutase (XAC3579). A highly differential spot (46), increased in the inducing condition, had their proteins identified as lytic murein transglycosilase (XACb0007) and/or transglycosylase (XAC3225), oxidoreductase (XAC1160) and DNA polymerase III subunit beta (XAC0002). The spot 46 was isolated from several 2D gels and used to produce antibody in mouse. The expressions of these proteins were analyzed by Western blot in others citrus canker genome strains, which differ from Xac in the virulence and host types. This analysis showed that proteins from the spot 46 had different expression pattern among these strains, with higher expression in Xac growing in inducing condition. We conclude that the proteomic study of proteins from periplasmic fraction is an important strategy to detect Xac proteins involved with pathogenicity and virulence, even including proteins transported outside the cell. Proteins found in this fraction could be used as biomarkers, however more experiments are still necessary. / O cancro cítrico é uma doença economicamente importante para a citricultura, não existindo atualmente medidas preventivas e curativas eficazes para combatê-la. Os agentes etiológicos são bactérias do gênero Xanthomonas, classificadas em duas espécies, X. citri e X. fuscans. A variedade mais agressiva aos citros é a bactéria X. citri subsp. citri (Xac). Pelo presente trabalho, realizamos a análise proteômica diferencial de uma fração celular de Xac enriquecida em proteínas periplasmáticas, após indução in vitro da sua patogenicidade, comparativamente à condição de não indução de patogenicidade (controle). As proteínas dessa fração foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), sendo a análise estatística das intensidades dos spots realizada por meio do software Image Master Platinum (GE). Aproximadamente 80 spots apresentaram expressão diferencial significativa (p<0,05) entre as duas condições estudadas, os quais foram isolados do gel e sua(s) proteína(s) constituinte(s) digerida(s) com tripsina. Os peptídeos resultantes da digestão foram analisados por espectrometria de massas (LC-ESI-QTof) e os dados obtidos utilizados na identificação da proteína por pesquisa em bancos de Xac e/ou de outros organismos com o software Mascot. Dentre as proteínas de Xac identificadas como mais expressas após indução de patogenicidade in vitro duas estão classificadas como proteínas relacionadas com Patogenicidade, Virulência e Adaptação (segundo anotação do genoma de Xac), sendo elas: superoxidase dismutase (XAC2386) e fosfoglicomutase (XAC3579). Proteínas pertencentes a um spot com notável aumento de expressão em situação de indução de patogenicidade (spot 46) foram identificadas por espectrometria de massas, sendo elas: proteína lytic murein transglycosilase (XACb0007) e/ou transglycosylase (XAC3225), oxidoredutase (XAC1160) e subunidade beta da DNA polimerase III (XAC0002). O spot 46 foi isolado a partir de vários géis 2D e utilizado para produção de anticorpos em camundongos. A análise da expressão da(s) proteína(s) pertencente(s) ao spot 46 foi realizada por meio de Western blot nas linhagens-genoma B e C do cancro cítrico, as quais diferem de Xac na virulência e tipo de citros- hospedeiro. Por esta análise foi verificado que proteínas do spot 46 possuem expressão muito distinta entre as linhagens genoma do cancro cítrico, sendo sua expressão preponderante em Xac, especialmente em situação de indução de patogenicidade. Concluímos que o estudo das proteínas utilizando a fração periplasmática como objeto de estudo é de grande interesse para investigação de proteínas envolvidas com patogenicidade e virulência em Xac, e que tenham passagem pelo periplasma, inclusive de proteínas transportadas para o meio extracelular. Além disso, algumas proteínas desta fração possuem potencial para serem utilizadas como biomarcadores ou como possível alvo de combate ao cancro cítrico.

Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-09-22T12:11:52Z No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:38:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:38:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T14:38:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) Previous issue date: 2015-03-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Citrus canker imposes damages to citriculture by causing drop in productivity and fruit quality and the absence of effective control and cure. Thus, the economic potential of citrus is limited in part by this disease mainly caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (XAC) that presents the greatest virulence and broad spectrum of citrus hosts, compared to bacteria Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii types B (XauB) and C (XauC). In a proteomic analysis previously performed by our research group, periplasmic trehalase was identified as a protein which expression differed between XAC e XauC in an in vitro induction of pathogenicity. Trehalase is an enzyme that catalyzes hydrolysis reaction of trehalose, a disaccharide composed of two glucose units, which role in the plant-pathogen interaction is poorly understood. One of the objectives of the study was to obtain this enzyme in purified form using an IPTG-inducible heterologous expression system in E. coli, for purposes of partial characterization of its structure and activity. The recombinant XAC periplasmic trehalase is a monomer bearing wide pH stability and showed Michaelian kinetics. The Michaelis-Menten constant (Km) for trehalose was 0,124 ± 0,015 mM and Vmax 17,319 ± 0,035 μMol glucose.min-1.mg protein-1 . Circular dichroism spectroscopy indicated the following composition of secondary structures: 42.7% α-helices and 13% β-sheets. A gene knockout method based on double homologous recombination between the genomic DNA and suicide vector pNPTS138 has made possible to obtain a strain deleted in the gene encoding the periplasmic trehalase (XACΔ0604), which enabled to evaluate the relationship between this gene and the XAC pathogenicity in Citrus aurantifolia. Infiltrated leaves with XACΔ0604 showed drenching and necrosis of plant tissue and intense brownish pustules compared with wild XAC, suggesting greater virulence of the mutant strain. The periplasmic trehalase activity was compared in XAC and XauC cell extracts from two culture mediums, non-pathogenicity-inducing (CN) and pathogenicity-inducing (XAM-M). Interestingly, XauC has showed higher enzyme activity compared to XAC in XAM-M. Thus, the noticeable higher XACΔ0604 pathogenicity and the greater activity of XauC periplasmic trehalase compared to XAC are indicatives that trehalose may promote pathogenicity. / O cancro cítrico impõe prejuízos ao setor citricultor por ocasionar queda na produtividade e qualidade dos frutos e pela ausência de medidas eficazes de controle e cura. Assim, o potencial econômico dos citros é limitado, em parte, por essa doença causada principalmente pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), que apresenta maior virulência e largo espectro de hospedeiros cítricos, comparativamente às bactérias Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipos B (XauB) e C (XauC). Em um trabalho de análise proteômica anteriormente realizado por nosso grupo de pesquisa, a trealase periplasmática foi identificada como uma proteína cuja expressão foi diferencial entre XAC e XauC, em condição de indução da patogenicidade in vitro. A trealase é uma enzima que catalisa a reação de hidrólise da trealose, um dissacarídeo formado por duas unidades de glicose, cujo papel na interação planta-patógeno é ainda pouco compreendido. Um dos objetivos do trabalho foi obter esta enzima purificada, utilizando um sistema de expressão heteróloga induzível por IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) em E. coli, para fins de caracterização parcial da sua estrutura e atividade. A trealase periplasmática de XAC de origem heteróloga apresentou-se como um monômero relativamente estável em relação ao pH, e de cinética Michaeliana,. A constante de Michaelis-Menten (Km) da enzima para a trealose foi de 0,124 ± 0,015 mM e a Vmáx 17,319 ± 0,035 μMol de glicose.min-1.mg de proteína-1. Análise de dicroísmo circular resultou na seguinte composição de estruturas secundárias: 42,7 % de α-hélices e 13 % de folhas-β. Uma metodologia de nocaute gênico baseada na dupla recombinação homóloga entre o DNA genômico e o vetor suicida pNPTS138 viabilizou a obtenção de uma linhagem mutante deletada no gene que codifica a trealase periplasmática (XAC∆0604), o que possibilitou avaliar a relação entre tal gene e a patogenicidade de XAC em Citrus aurantifolia. Folhas infiltradas com a suspensão de XAC∆0604 apresentaram maior encharcamento e necrose do tecido vegetal, além de intensas pústulas acastanhadas quando comparadas com as folhas infiltradas com XAC selvagem, sugerindo maior virulência da linhagem mutante. A atividade da trealase periplasmática foi comparada em extratos celulares brutos provenientes de cultivos de XAC e XauC em dois meios de cultura, não-indutor de patogenicidade (CN) e indutor de patogenicidade (XAM- M). A bactéria XauC apresentou maior atividade enzimática de trealase em relação à XAC em XAM-M. Sendo assim, a acentuada patogenicidade de XAC∆0604 em relação à linhagem selvagem XAC e a maior atividade da trealase periplasmática de XauC em relação à XAC reforçam os recentes trabalhos que indicam a trealose como promotora da patogenicidade em fitopatógenos.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T23:36:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingues_MarianeNoronha_D.pdf: 24489370 bytes, checksum: 8029060db192a79e81b19764465f2ca7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), constitui uma doença que afeta a maioria das espécies do gênero Citrus ocorrendo praticamente em todos os continentes e se destaca como uma ameaça à citricultura brasileira. A bactéria utiliza a proteína efetora do tipo III PthA para modular a transcrição na planta hospedeira e promover o desenvolvimento dos sintomas da doença. PthA pertence a família AvrBs3/PthA e contém um domínio central de repetições de 34 aminoácidos que media interações proteína-proteína e proteína-DNA. Elucidar como a PthA ativa a transcrição é de grande importância para o esclarecimento do seu modo de ação e da patogenicidade de Xac. Este trabalho teve como principal objetivo confirmar in vivo e in vitro interações entre PthA de Xac e proteínas de laranja doce selecionadas num screening de duplo-híbrido em leveduras. Além da interação com a proteína ?-importina, conhecida por mediar a importação nuclear de AvrBs3, são descritas neste trabalho interações de PthA com proteínas de citros envolvidas no enovelamento e ubiquitinação do tipo K63. PthAs 2 e 3 interagem preferencialmente com uma ciclofilina (Cyp) de citros e com TDX, uma proteína que contém um domínio tetratricopeptídeo (TPR) e um domínio tiorredoxina (TRX). Constatou-se que PthAs 2 e 3, e não 1 e 4, interagem com um complexo de conjugação a ubiquitina formado por Ubc13 e uma enzima de conjugação a ubiquitina variante (Uev) requerido para o processo de ubiquitinação K63 e no reparo de DNA lesionado. Cyp, TDX e Uev interagem entre si e as proteínas Cyp e Uev estão localizadas no núcleo de células de planta, assim como as variantes de PthA de Xac. Além disso, Ubc13 e Uev complementam o fenótipo de reparo no DNA de cepas de leveduras mutantes, indicando que estão envolvidas em processos de ubiquitinação K63 e reparo no DNA. Como PthA2 afetou o crescimento de cepas de levedura na presença de um agente alquilante do DNA, sugere-se que PthA2 inibe ubiquitinação K63 requerida em vias de reparo aos danos no DNA, e não é alvo deste processo como acreditava-se inicialmente. A proteína Cyp de citros também foi capaz de complementar o fenótipo de leveduras mutantes na maquinaria transcricional, de tal forma que PthAs poderiam aumentar as taxas de transcrição através da modulação da atividade de um complexo proteico associado com controle da transcrição / Abstract: Citrus canker, caused by the pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is a disease that affect most species of the genus Citrus occurring in virtually every continent, and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The bacterium uses a type III effector protein PthA to modulate transcription in the host plant and promote the development of disease symptoms. PthA proteins belong to the AvrBs3/PthA family and carry a domain comprising tandem repeats of 34 amino acids that mediates protein-protein and protein-DNA interactions. Elucidate how PthA activates transcription is of great importance for the elucidation of its mode of action and pathogenicity of Xac. This study aimed to confirm in vivo and in vitro interactions between Xac protein PthA and sweet orange proteins in a yeast two-hybrid screening. Here, in addition to the interaction with the ?- importin protein, known to mediate the nuclear import of AvrBs3, we described new interactions of PthAs with citrus proteins involved in folding and K63-linked ubiquitination. PthAs 2 and 3 preferentially interact with a citrus cyclophilin (Cyp) and with TDX, a tetratricopeptide domaincontaining thioredoxin. It was found that PthAs 2 and 3, but not 1 and 4, interact with the ubiquitinconjugating enzyme complex formed by Ubc13 and ubiquitin-conjugating enzyme variant (Uev), required for K63-linked ubiquitination and DNA repair. We show that Cyp, TDX and Uev interact with each other, and that Cyp and Uev localize to the nucleus of plant cells. Furthermore, the citrus Ubc13 and Uev proteins complement the DNA repair phenotype of the yeast mutants, strongly indicating that they are also involved in K63-linked ubiquitination and DNA repair. How PthA2 affected the growth of yeast cells in the presence of a DNA damage agent, suggests that PthA2 inhibits K63-linked ubiquitination required for DNA repair, and is not the target of this process as it was believed initially. The citrus protein Cyp was also able to complement the phenotype of yeast mutants in the transcriptional machinery, such that PthAs could increase the rates of transcription by modulating the activity of a protein complex associated with control of transcription / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:02:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camillo_LucianaRodrigues_M.pdf: 5919875 bytes, checksum: 5cf571ac0a143a68d6340c3ad3c97f49 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A doença cancro cítrico, causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), emergiu como uma das principais ameaças à citricultura brasileira pois afeta todas as variedades comerciais de citros, diminuindo a produção e qualidade dos frutos e podendo se dispersar rapidamente em áreas de cultivo de citros. Entre os gêneros de Xanthomonas, foram encontrados muitos genes associados com patogenicidade e virulência, entretanto, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos nas interações entre Xac e laranjeira e os genes envolvidos no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico em folhas de citros (Citrus sinensis) em resposta à infecção por Xac. Neste trabalho, foi analizada a expressão diferencial de genes envolvidos no desenvolvimento do cancro cítrico em folhas de laranja, em resposta à infecção por Xac. Para tanto foram construídas duas bibliotecas de Hibridização Subtrativa Suprimida (SSH) com mRNAs de folhas infiltradas com Xac ou H20 após 10 dias de inoculação. O "screnning" das bibliotecas foi feito por dot blot e 17 genes diferencialmente expressos foram sequenciados e identificados por homologia no banco de dados ncbi-BLAST contra o banco de dados de EST de citros. A expressão gênica diferencial foi analizada por Northern Blot e PCR em tempo real (qPCR). Para complementar nossos dados, a expressão dos 17 genes diferenciais foi aI).alisada a partir de cDNAs de folhas de citros que foram infiltradas com Xac, H20 ou Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa), que não é patogênica à laranja, mas causa cancro no limão galego. Nossos resultados demonstraram que Xac e Xaa induzem e reprimem o mesmo grupo de genes, porém em diferentes níveis. Nós identificamos que ambos patóg;enos alteram as vias de transdução de sinal de auxina, tráfico e fusão de vesículas, resposta de defesa e doença, síntese de proteínas e ciclo celular, metabolismo de carbono-nitrogênio e metabolismo secundário. A análise desses genes poderá ser de grande importância para o entendimento dos eventos que levam ao desenvolvimento dos sintomas do cancro / Abstract: The citrus canker disease, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), has emerged as one of the major threats to the Brazilian citriculture because it affects all commercial citrus varieties, decreases the production and quality of the fruits and can spread rapidly in the citrus growing areas. The symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruits and leaves and general tree decline. Within the genus Xanthomonas, several genes have been found associated with pathogenicity and virulence. However, little is known about the mechanisms involved in the Xac- citrus interaction and the development of the canker disease. In this work we analyzed the differential expression of genes involved in the development of the canker disease in sweet orange (Citrus sinensis) leaves in response to Xac infection. Therefore we constructed two Supression Subtracted Hybridization (SSH) libraries with mRNA from leaves infiltrated with Xac or water after 10 days of inoculation. The libraries were screnned by dot blot and the 17 differentially expressed genes were sequenced and identified through BLAST searches against the Citrus EST and protein databases. The differential gene expression was evaluated by Northem blot and Real Time PCR (qPCR). To complement our analysis, the expression of 17 genes was compared in cDNA samples from citrus leaves that had been infilt:r:ated with Xac, water or X axonopodis pv. aurantifolii (Xaa), wich is not pathogenic to orange but causes canker in key lime. Our results show that Xac and Xaa induce and repress a similar set of genes, however at different leveis. We found that both pathogens altered the pathways of auxin transport and signaling, vesicle trafficking and transport, cell cycle and protein synthesis, photorespiration and disease response. Further analysis of these genes will be of great importance to understand the events triggering the development of the canker symptoms / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A indústria dos citros é de grande importância econômica e social para o Brasil, que é considerado o maior produtor e exportador de suco concentrado de laranja do mundo. Porém, sérios problemas relacionados a doenças têm afetado a produção e qualidade dos citros. Com o desenvolvimento da engenharia genética e a clonagem de genes relacionados à resistência a doenças em plantas, a transformação genética têm se mostrado uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento genético de citros. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce das variedades &#145;Hamlin&#146;, &#145;Valência&#14;, &#145;Natal&#146; e &#145;Pêra&#146; expressando o gene hrpN, sob o controle do promotor Pgst1, induzível pelo patógeno. A avaliação da resposta de plantas transgênicas da variedade &#145;Hamlin&#146; contra o agente causal do cancro cítrico, a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, também foi realizada. Segmentos de epicótilo foram transformados via Agrobacterium tumefaciens, e selecionados em meio de cultura suplementado com canamicina ou gentamicina. A transformação genética foi confirmada por PCR e Southern blot. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e a produção da proteína harpina foi analisada por western blot. A eficiência de transformação variou de 2,7 e 6,2% de acordo com a variedade de laranja. Algumas linhagens de plantas transgênicas apresentaram desenvolvimento anormal, não permitindo a realização da análise por Southern blot nem a multiplicação por enxertia. Plantas de laranja &#145;Hamlin&#146; foram propagadas por enxertia e avaliadas para resistência a Xanthomonas axonopodis pv. citri. Todas as linhagens apresentaram redução na severidade dos sintomas causados pela bactéria X. axonopodis pv. citri, avaliados 30 dias após a inoculação. / The citrus industry has a great economic and social importance for Brazil, which is considered largest producer and orange juice exporter in the world. However, serious problems related to pathogens have affected citrus production and quality. With the development of genetic engineering and the characterization of genes related with plant disease resistance, the genetic transformation became an important tool in citrus breeding programs. The objective of this work was the production of transgenic plants of four sweet orange cultivars &#145;Hamlin&#146;, &#145;Valencia&#146;, &#145;Natal&#146; and &#145;Pera&#146; expressing hrpN gene under the control of Pgst1 inducible promoter. The evaluation of &#145;Hamlin&#146; sweet orange transgenic plants infected with the causal agent of citrus canker, Xanthomonas axonopodis pv. citri was carry out. Epicotyl segments were inoculated with Agrobacterium tumefaciens, and selected in a culture medium supplemented with kanamycin or gentamycin. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and the production of harpin protein was detected by western blot. The genetic transformation efficiency varied from 2,7% to 6,2% depending on the cultivar. Some transgenic lines had abnormal development, not allowing performing Southern blot analysis or multiplication by grafting. Plants of &#145;Hamlin&#146 sweet orange were propagated by grafting and evaluated for Xanthomonas axonopodis pv. citri resistance. All tested plants presented reduction in the severity of the symptoms caused by bacterium X. axonopodis pv. citri 30 days after the inoculation.