Submitted by FLÁVIA CAMPOS FREITAS VIEIRA (flavia.camposfv@yahoo.com.br) on 2018-06-28T14:09:18Z No. of bitstreams: 1 Tese_Flávia_Vieira_2018.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-29T18:42:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_fcf_dr_jabo.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-29T18:42:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_fcf_dr_jabo.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) Previous issue date: 2018-06-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os citros são um grupo de espécies vegetais, com alto potencial produtivo, porém, acometido por várias doenças. Do gênero de bactérias Xanthomonas, três espécies são patogênicas a citros: Xanthomonas citri subsp. citri, agente causal do cancro cítrico, uma das doenças de maior preocupação da citricultura; X. fuscans subsp. aurantifolii tipos B e C, que causam a cancrose; e X. alfalfae subsp. citrumelonis, responsável por causar a mancha bacteriana dos citros. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi a análise e descrição, em nível anatômico e ultraestrutural, dos processos de infecção de bactérias do gênero Xanthomonas, causadoras de doenças em citros, a correlação do fenótipo da interação XfaC-citros com o transcriptoma e a análise dos fatores de virulência das estirpes estudadas. O processo de infecção das estirpes Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 e XfaC1630 em lima ácida ‘Galego’ e/ou laranja doce ‘Hamlin’, foi avaliado em diferentes períodos de infecção, pelas técnicas de microscopia de luz e eletrônicas de varredura e transmissão. As seguintes características relacionadas a virulência das estirpes foram avaliadas: formação in vitro de biofilme, produção de goma, motilidade “swimming” e auto agregação celular. Os resultados mostraram que Xac306 é a estirpe mais agressiva dentre as demais, visto pelos sintomas e pela intensidade das alterações anatômicas no tecido de ‘Hamlin’ e ‘Galego’. O processo de infecção em lima ácida ‘Galego’ foi semelhante em todas as estirpes de Xanthomonas estudadas, pois induziram hiperplasia e hipertrofia, porém, em diferentes intensidades, sendo que as alterações provocadas pelas estirpes Xac828 e Xacm1510 não resultaram no rompimento da epiderme; todas as estirpes produziram goma, envolvendo as bactérias e favorecendo a colonização no ambiente intercelular. A microscopia de luz permitiu identificar alterações na anatomia de lima ácida ‘Galego’ infectada e a diferença de susceptibilidade entre as variedades de citros inoculadas com Xac306 e estirpes de XfaC. As microscopias eletrônicas de varredura e transmissão permitiram a identificação de aspectos em comum às estirpes, independente da variedade cítrica. A HR induzida por estirpes de XfaC foi caracterizada pela microscopia eletrônica de transmissão. Com a análise de microscopia, não foi possível estabelecer uma relação direta entre os testes de formação in vitro de biofilme, produção de goma e motilidade “swimming” das estirpes. A análise dos dados de transcriptoma revelou que a resposta de defesa de laranja ‘Hamlin’ contra XfaC foi uma resposta rápida e eficiente que levou a indução de HR, que em última instância, conteve a infecção pela morte celular programada no local da infecção. Esse trabalho ampliou o conhecimento da área sobre o comportamento de diferentes estirpes de Xanthomonas causadoras de doenças em citros, fornecendo informações sobre sua interação com o hospedeiro suscetível e a resposta de defesa de XfaC em interação incompatível. / Citrus are a diverse group of plant species, with high yield potential, but affected by several diseases. The bacteria genus Xanthomonas has three species pathogenic to citrus: Xanthomonas citri subsp. citri, causal agent of citrus canker, one of the most important diseases of citrus crop; X. fuscans subsp. aurantifolii types B and C, causing citrus cancrosis; and X. alfalfae subsp. citrumelonis, which causes citrus bacterial spot. Therefore, the goal of this work was to analyze and describe, at the anatomical and ultrastructural level the infectious processes of Xanthomonas causing diseases in citrus, the correlation of the XfaC-citrus interaction phenotype with the transcriptome and the comparative analysis of virulence related factors, in order to elucidate morphophysiological traits of host-pathogen interaction. The infection process of Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 and XfaC1630 strains in 'Galego' Mexican lime and 'Hamlin' sweet orange were evaluated at different points of infection by light microscopy and scanning and transmission electron microscopy. The following virulence related characteristics of the strains were evaluated: in vitro biofilm formation, gum production, swimming motility and cellular auto aggregation. The results showed that Xac306 is the most aggressive strain among the others, due to the intensity of the symptoms and anatomical alterations in 'Hamlin' and 'Galego' tissue. The infection process in the susceptible host ('Galego' Mexican lime) was similar for all Xanthomonas strains studied, since they induced hyperplasia and hypertrophy, however in different intensities, and the alterations caused by Xac828 and Xacm1510 strains did not result in epidermis rupture; all strains produce gum, involving bacteria and assisting colonization in the intercellular environment. Light microscopy was able to identify anatomical alterations in 'Galego' Mexican lime infected tissue and the susceptibility differences between citrus varieties inoculated with Xac306 and XfaC strains. The scanning and transmission electron microscopies was able to identify common traits to the strains, regardless of the citrus variety. The HR induced by XfaC strains was characterized by transmission electron microscopy. We could not stablish a direct relation between the in vitro biofilm formation, gum production and "swimming" motility of the strains with the microscopy analysis. The transcriptome analysis revealed that 'Hamlin' defense response against XfaC is a quick and effective response that led to an HR induction, which ultimately contained the infection, by programmed cell death at the site of infection. This work expanded our knowledge about the behavior of different Xanthomonas strains causing citrus diseases, providing information on its interaction with the susceptible host and the defense response of XfaC in an incompatible interaction.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-01Bitstream added on 2014-06-13T18:54:08Z : No. of bitstreams: 1 tezza_rid_me_jabo.pdf: 2155126 bytes, checksum: 33a07381689b0811f980f19b4c0fc487 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Com o seqüenciamento completo do genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), em 2002, inúmeras possibilidades de estudo foram viabilizadas, dando margem à busca de novas formas de controle do cancro cítrico, baseadas em alvos moleculares. Estudos dessa natureza têm mostrado a existência de genes que somente são expressos quando a bactéria está se desenvolvendo in planta. Sabe-se que essa regulação é dependente da região promotora e sua identificação pode possibilitar avanços significativos na busca do controle dessa doença. Apesar do crescente avanço das técnicas experimentais in vitro em biologia molecular, identificar um número significante de promotores ainda é uma tarefa difícil e dispendiosa. Os métodos computacionais existentes enfrentam a falta de um número adequado de promotores conhecidos para identificar padrões conservados entre as espécies. Logo, um método para predizê-Ios em qualquer organismo procariótico ainda é um desafio. O Modelo Oculto de Markov é um modelo estatístico aplicável a muitas tarefas em biologia molecular. Entre elas, predição e mapeamento de seqüências promotoras no genoma de um procarioto. Neste trabalho, estudou-se o mapeamento in silico de promotores gênicos de todo o genoma da Xac e em 68% dos genes a localização de um promotor foi indicada. A análise comparativa com dados experimentais de proteômica mostrou que 72% das proteínas expressas identificaram-se com elementos desta lista de promotores, o que corresponde a 27% do total de genes do genoma. À partir destes dados foi possível levantar um rol de informações sobre estes candidatos a promotores incitando a novos estudos moleculares. / With the complete genome sequencing of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac), in 2002, several study possibilities were made practical and then creating the search of new citrus canker control ways, based in molecular aims. This kind of studies has shown the genes existences that are only expressed when the bacteria are developing itself in plant. It has been known that this regulation is promoter region dependent and its identification can allow significant advances in the search of this disease control. Although increasing advance of in vitro experimental techniques in molecular biology, identifying a meaningful number of promoters is still a hard and expensive task. The existents computer science methods face the need of a proper number of known promoters to identify conserved patterns among the species. Therefore, a method to predict them in any prokaryote organism is still a challenge. The Hidden Markov Model (HMM) is a statistic model applicable in many tasks in molecular biology. Among them, prediction and mapping of the promoters sequences in prokaryotic genome. In this work, which has studied the genic promoters in silico mapping of the whole Xac genome, in 68% of the genes the promoter localization was indicated. The proteomic experimental data comparative analysis showed that 72% of the expressed proteins identified with elements from the promoters list, which corresponds 27% of the genome genes total. According to these data it was possible to generate an information roll about these promoters candidates inciting new molecular studies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-23Bitstream added on 2014-06-13T19:23:56Z : No. of bitstreams: 1 rosa_j_dr_jabo.pdf: 2608907 bytes, checksum: b7b01ebc553dff94742210a39847a17e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundecitrus / A distribuição espacial do cancro cítrico em talhões com laranjeira ‘Natal’ enxertada em limoeiro ‘Cravo’ com 3 anos de idade foi estudada utilizando a geoestatística. Foram utilizados 13 talhões mapeados pelo Fundecitrus (Fundo de Defesa da Citricultura), com 595 ou 1080 plantas cada, infectados naturalmente com Xanthomonas citri subsp. citri, em uma única propriedade, no Estado de São Paulo. A severidade da doença em cada planta foi avaliada por meio de uma escala com os seguintes níveis: 0 - sem folhas com sintomas; 1 - de 1 a 5 folhas com sintomas; 2 - de 6 a 10 folhas com sintomas; 3 - de 11 a 20 folhas com sintomas; 4 - de 21 a 50 folhas com sintomas e 5 - > 50 folhas com sintomas. Nestes talhões, as coordenadas correspondentes à posição das plantas contaminadas foram obtidas com um GPS, permitindo mapear a doença no talhão. A distribuição espacial foi avaliada por ajuste de semivariogramas e interpolação dos dados por krigagem. A distribuição de plantas com cancro cítrico no talhão mostrou-se agregada, com raio de agregação de 30 a 45 m. Os mapas de krigagem mostraram que os focos da doença ocorreram mais frequentemente nos limites dos talhões. Quando a nota média de severidade da doença foi menor que 0,04, o semivariograma apresentou efeito pepita puro, indicando que não houve dependência espacial / The spatial distribution of citrus canker in areas with orange 'Natal' grafted on ‘Rangpur’ lime with three years of age were studied using geostatistics. We used 13 plots mapped by Fundecitrus (Citrus Defense Fund), with 595 or 1080 individual plants, naturally infected with Xanthomonas citri subsp. citri that were on the same property in the State of São Paulo. Disease severity in each plant was assessed using a scale with the following levels: 0 - no leaf with symptoms, 1 – 1 - 5 leaves with symptoms; 2 – 6 -10 leaves with symptoms; 3 – 11 - 20 leaves with symptoms; 4 – 21 - 50 leaves with symptoms and 5 - > 50 leaves with symptoms. In these plots, the coordinates corresponding to the position of symptomatic of infected plants was obtained with a GPS, allowing mapping the symptomatic plants in the block. The spatial distribution was evaluated by fitting of semivariograms and kriging interpolation of the data. The distribution of plants with citrus canker in the block was aggregated, with aggregate radius of 30 - 45 meters. Kriging maps showed that the foci of diseased plants stood on the edge of the blocks. When the average grade of severity was less than 0.04, the semivariogram showed pure nugget effect, indicating that no spatial dependence

Submitted by JELENA PURIC (jelena0puric@gmail.com) on 2018-04-16T12:39:06Z No. of bitstreams: 1 Jelena Puric Dissertação de Mestrado.pdf: 2830343 bytes, checksum: 555cfd034f96e02e12c50107d2077d5f (MD5) / Rejected by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br), reason: Prezada Jelena, Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: 1) A folha de aprovação está em local errado. No arquivo enviado, está em primeiro lugar, antes da capa. O correto de acordo com as normas vigentes é que a folha de aprovação venha após a ficha catalográfica (que o seu arquivo também não tem) e venha antes do Resumo. 2) Falta a ficha catalográfica, que deve ser solicitada pelo site da biblioteca da Unesp de Rio Claro e inserida após a folha de rosto no arquivo pdf e no verso da folha de rosto na versão impressa. O documento enviado não foi excluído. Para revisá-lo e realizar uma nova tentativa de envio, acesse: https://repositorio.unesp.br/mydspace Agradecemos a compreensão e aguardamos o envio do novo arquivo. Atenciosamente, Biblioteca Campus Rio Claro Repositório Institucional UNESP on 2018-04-16T14:20:27Z (GMT) / Submitted by JELENA PURIC (jelena0puric@gmail.com) on 2018-04-16T14:31:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Jelena Puric.pdf: 2938364 bytes, checksum: b7379106bbe1a2cdf5ce930d5337096b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-04-16T18:28:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 puric_j_me_rcla.pdf: 2383486 bytes, checksum: e2cb2e6c5d3d71426040a339c65c55ce (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-16T18:28:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 puric_j_me_rcla.pdf: 2383486 bytes, checksum: e2cb2e6c5d3d71426040a339c65c55ce (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho teve como objetivo obter extratos contendo metabólitos secundários de fungos filamentosos isolados de sedimentos marinhos da Antártica e avaliar sua potencial atividade antibacteriana em Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas euvesicatoria e Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (bactérias fitopatogênicas que causam doenças em cítricos, pimenta e tomate, e maracujá, respectivamente). Entre os 90 extratos brutos intracelulares e extracelulares obtidos a partir de fungos, 19 mostraram a capacidade de impedir o crescimento de X. citri subsp. citri e X. euvesicatoria in vitro e 22 mostraram a capacidade de dificultar o crescimento de X. axonopodis pv. passiflorae in vitro. Os extratos extracelulares inibiram em média 97,12% de X. citri subsp. citri, 95,94% de X. euvesicatoria e 96,58% de X. axonopodis pv. passiflorae a 3,0 mg / mL. / This work aimed to obtain extracts containing secondary metabolites from filamentous fungi isolated from marine sediments from Antarctic and assess their potential antibacterial activity on Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas euvesicatoria and Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (phytopathogenic bacteria causing diseases in citrus, pepper and tomato, and passionfruit, respectively). Among the 90 raw intracellular and extracellular extracts obtained from fungi, 19 showed the ability to hamper the growth of Xanthomonas citri subsp. citri and X. euvesicatoria in vitro and 22 showed the ability to hamper the growth of X. axonopodis pv. passiflorae in vitro. The extracellular extracts inhibited on average 97,12% of Xanthomonas citri subsp, 95,94% of X. euvesicatoria and 96,58% of X. axonopodis pv. passiflorae at 3,0 mg/mL.

Submitted by Lúcia Bonci Cavalca (l.bonci@hotmail.com) on 2018-04-26T18:08:18Z No. of bitstreams: 1 CAVALCA, LB versão repositorio.pdf: 11866412 bytes, checksum: 0a27e5a7f7f756cb88de16361ad78a27 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Santulo Custódio de Medeiros null (asantulo@rc.unesp.br) on 2018-04-26T19:16:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cavalca_lb_me_rcla.pdf: 11841916 bytes, checksum: 0d52662f4653c6d3695e6b3ab334549d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-26T19:16:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cavalca_lb_me_rcla.pdf: 11841916 bytes, checksum: 0d52662f4653c6d3695e6b3ab334549d (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A cultura de citros é uma das mais importantes do Brasil, sendo a citricultura brasileira a maior do mundo; ainda assim, a produção nacional sofre com pragas e doenças, como cancro cítrico, que afetam sua produtividade. O cancro cítrico é causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) e tem sido controlado com o uso de estratégias integradas como a eliminação de plantas contaminadas e pulverização de bactericidas cúpricos. O uso de compostos à base de cobre, porém, representa um risco ambiental devido à sua toxicidade e efeito cumulativo, fazendo necessária a investigação de outros compostos com potencial no tratamento fitossanitário contra a doença. Neste estudo avaliamos a atividade bactericida do galato de hexila contra Xac, seu potencial protetivo e curativo no combate ao cancro cítrico, sua fitotoxicidade e predisposição em induzir resistência bacteriana. O composto provocou retardo e diminuição no crescimento populacional de Xac e inibição de seu crescimento in vitro, levando à morte total da população na concentração de 100μg⋅mL-1. A bactéria não foi capaz de desenvolver resistência a Gal-6 ao longo de 31 dias e exibiu taxa de mutantes naturalmente resistentes ao composto menor que 1⋅10-6 para a concentração de 50μg⋅mL-1. A capacidade de germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de rúcula e tomate não foi alterada por Gal-6. A aspersão de galato de hexila em plantas de laranja doce inoculadas com Xac reduziu em até 35% a incidência de sintomas de cancro cítrico, e em até 80% sua severidade. O composto também alterou o comprimento celular de Xac e permeabilidade de membrana. Galato de hexila mostrou-se um bactericida eficaz contra Xanthomonas citri subsp. citri tanto in vitro quanto in planta, além de apresentar baixa fitotoxicidade e baixa probabilidade de indução de resistência em Xac, visto que o composto parece atuar tanto sobre a estrutura física da membrana, quanto sobre o processo de segregação cromossômica/divisão celular bacteriana. / Citrus culture is one of the most important agricultural activities in Brazil, being the country also the biggest producer in the world; nevertheless, this business struggles with pests and diseases, as citrus canker, that affects its profitability. Citrus canker is caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) and is controlled by using integrated strategies such as elimination of contaminated plants and spraying of cupric bactericides. Using products with copper, however, brings an environmental risk, given 8 its toxicity and cumulative effect, making necessary the research of other compounds with potential to be used as a resource in the phytosanitary treatment against the disease. We evaluated hexyl galate's (Gal-6) bactericidal activity versus Xac and its potential in the preventive and curative treatments against the disease, also Gal-6 phytotoxicity and likeliness to induce bacterial resistance. The compound caused delay and decrease in Xac population growth and in vitro growth inhibition, leading to the total death of the population when at 100 μg⋅mL-1. The bacterium was not able to develop resistance to Gal-6 over 31 days and exhibited a rate of naturally-resistant mutants to the compound of less than 1⋅10-6 at the concentration of 50μg⋅mL-1. Seed germination and seedling development of arugula and tomato were not altered by Gal- 6. Spraying orange plants infected by Xac with hexyl gallate reduced the incidence of citrus canker symptoms by up to 35% and their severity by up to 80%. The compound also altered Xac cell length and membrane permeability. Hexyl gallate proved to be an effective bactericide against Xanthomonas citri subsp. citri both in vitro and in plant, exhibiting low phytotoxicity and low inclination to induce resistance in Xac, given that the compound appears to act on both the physical structure of the membrane and the process of chromosomal segregation/ bacterial cell division.

O cancro cítrico é uma das doenças mais temidas da citricultura devido ao seu poder de proli-feração nas fazendas, aos danos causados às plantas e aos frutos e à forma de combate adota-da pelos órgãos responsáveis através da erradicação das plantas contaminadas e de outras em sua vizinhança. No Brasil, um dos principais motivos que minimiza a eficiência da erradicação do cancro cítrico é a confirmação do diagnóstico, que necessita ser realizada em alguns laboratórios credenciados. A análise de muitas amostras em conjunto com o tempo gasto com o transporte aumenta a chance de proliferação da doença no campo. Neste trabalho aplicamos técnicas de espectroscopia da fluorescência em folhas de culturas cítricas na intenção de pro-por um método de diagnóstico do cancro cítrico a ser realizado na fazenda e com resposta em tempo real. As amostras experimentais são folhas de variedades cítricas sadias e contaminadas com cancro ou outras doenças. Iniciamos o trabalho aplicando espectroscopia da fluorescência no laboratório. Os resultados provaram a viabilidade do método, mas revelou uma enorme sobreposição de dados ao tentar discriminar o cancro de outra doença. Análises com-plementares nos revelaram que os experimentos deveriam ser feitos no campo, identificando plantas contaminadas e tomando a fluorescência de folhas sadias como referência. A espec-troscopia da fluorescência no campo foi feita com um espectrômetro portátil. O resultado nos possibilitou propor critérios de discriminação do cancro baseado em figuras de mérito. O melhor critério apresentou 79% de acertos, com 88% de sensibilidade e 68% de especificidade. Concluímos que os valores poderiam ser melhores se a espectroscopia fosse realizada com imagens, pois as variações do espectro ocorrem devido ao posicionamento da fibra na lesão do cancro. Passamos a estudar a espectroscopia das imagens da fluorescência com um sistema baseado em um espectrógrafo. Os resultados provaram a viabilidade do estudo e revelaram particularidades espaciais e espectrais das doenças. Infelizmente essa instrumentação só pode ser usada no laboratório, por isso optamos por desenvolver outro sistema mais simples e robusto, a base de uma roda de filtros com filtros passa-banda. Os re-sultados revelaram novas particularidades espaciais e espectrais das amostras, porém nos revelou a necessidade de um processamento de imagem para obter análises quantitativas. O sistema de imagens com filtro ainda foi usado em outro experimento complementar onde as imagens forneceram resultados quantitativos, provando a funcionalidade da técnica. / Citrus canker is one of the most feared diseases of citrus due to its dissemination in the farms, the damage caused to plants and fruits and how to combat adopted by national government through the eradication of infected plants and others in your neighborhood. In Brazil, one of the main reasons that minimizes the effectiveness of citrus canker`s eradication is the confir-mation of the diagnosis by specialized laboratories. The time spent to transport and to analyses many samples increases the chance of canker spreading in the field. In our work we apply spectroscopic techniques of fluorescence in leaves of citrus crops with the aim to propose a method for diagnosis of citrus canker to be held on the farm and real-time response. The expe-rimental samples are leaves of healthy citrus varieties and contaminated with canker or other diseases. We began the work by applying fluorescence spectroscopy in the laboratory. The results proved the feasibility of the method, but showed a huge overlap of data to try to dis-criminate cancer from other diseases. Further analysis revealed that those experiments should be done in the field, focusing to identify infected plants and taking the fluorescence of healthy leaves as a reference. Fluorescence spectroscopy in the field was made with a portable spectrometer. The result allowed us to propose some criteria for canker discrimination based on figures of merit. The best criteria presents 79% correct tests, with 88% sensitivity and 68% specificity. We conclude that these values could be better if the spectroscopy was performed with images, because the variations of the spectrum are due to the positioning of the fiber over the canker lesion. We study the spectroscopy of fluorescence images with a system based on a spectrograph. The results proved its feasibility and revealed spatial and spectral particular features of the diseases. Unfortunately, this instrumentation can only be used in the laborato-ry, so we decided to develop another system more simple and robust. The new system is based on a filter wheel with band-pass filters. The results revealed new spatial and spectral characteristics of the samples, but revealed the need for an image processing for quantitative analysis. This imaging system was still used in another supplementary experiment where the images have provided quantitative results, proving the functionality of the technique.

O cancro cítrico, causado pela bactéria Gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é considerado uma das principais doenças da citricultura nacional e mundial, devido à susceptibilidade do hospedeiro e por não existirem métodos de controle eficientes. Dados da literatura relatam que alguns genes de bactérias fitopatogênicas possuem uma seqüência consenso de nucleotídeos (TTCGC...N15...TTCGC) denominada “PIP box” ou “plant-inducible-promoter box”, localizada na região promotora e responsável pela ativação da expressão de fatores de patogenicidade e virulência quando o patógeno entra em contato com a planta hospedeira. O objetivo deste trabalho foi mapear e investigar no genoma da Xac a expressão de genes contendo seqüências do tipo “PIP box”, a 5’ da ORF ou internamente na região codificadora, através da técnica de macroarranjo. Com auxílio de uma ferramenta de bioinformática (script PERL), 208 seqüências consenso para o elemento cis-regulatório “PIP box” foram mapeados no genoma da Xac, e clones contendo seqüências codificadoras associadas aos promotores do tipo “PIP box” foram recuperados do banco de clones gerado pelo projeto de seqüenciamento da bactéria e validados por seqüenciamento. Os DNAs plasmidiais representando cada clone foram preparados e imobilizados em membranas de náilon (macroarranjo), as quais foram hibridadas com sondas de cDNAs marcadas com [a33P] dCTP e obtidas a partir de RNA total extraído da bactéria em estádio não infectante (cultivada em meio de cultura Caldo Nutriente – meio CN) e da bactéria infectante (cultivada por 12 horas ou 20 horas em meio XAM1 indutor de patogenicidade e virulência, ou coletada por exsudação 3 dias ou 5dias após inoculação em folhas de laranjeira). A análise da expressão dos genes contendo promotores “PIP box” putativos revelou 67 genes diferencialmente expressos quando a bactéria teve o seu programa de infecção disparado (indução “in vitro” ou “in vivo”). A validação dos resultados de macroarranjo foi realizada para alguns dos genes por meio de RT-PCR semi-quantitativo e a funcionalidade da seqüência “PIP box” para alguns promotores foi demonstrada através do gene repórter GUS. Os genes com expressão diferencial foram classificados segundo a função biológica das respectivas proteínas codificadas e estão envolvidos em processos tão distintos quanto sistema de secreção tipo III, metabolismo de membrana e parede celular, sistema de captação de ferro, metabolismo de açúcares e degradação da parede vegetal, transdução de sinais, metabolismo de flagelo, formação de biofilme e adesividade, metabolismo de ácidos nucléicos, transportadores de membrana, metabolismo energético e resposta a estresse ambiental. O possível papel destas modificações para a interação planta-patógeno e a instalação do cancro cítrico é discutida. / The citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is considered worldwide as one of the most important disease of citrus crop due to the lack of resistance in citrus plants and to the absence of efficient methods to control the disease. It was already shown that several genes involved in virulence and pathogenicity in plant pathogenic bacteria have a consensus nucleotide sequence (TTCGC…N15…TTCGC) named plant-inducible-promoter box or PIP box, located in the promoter region of the genes, which are responsible to activate the expression of genes during the host-bacteria interaction. The aim of this work was to map in Xac genome the genes containing the PIP box sequence in the promoter region, or internal to the ORF sequence, and analyze their expression during plant infection using the macroarray technique. Using a PERL script, 208 PIP box consensus sequence associated to genes were found in the Xac genome and clones containing all these genes and their PIP box sequences were recovered from a Xac genome clone bank and reconfirmed by sequencing. The plasmidial DNA containing the gene and the PIP box from each clone were purified, immobilized onto a nylon membrane (macroarray) and hybridized with [a33P] dCTP-labeled cDNAs synthesized from Xac total RNA isolated from bacteria in non-infecting (grown in NB nutrient medium) and infecting (grown for 12 or 20 hours in XAM1 medium that mimics the environment of the plant intercellular space (“in vitro”) or for 3 or 5 days in orange plant leaves (“in vivo”) conditions. The gene expression profile resulting from the array analysis revealed that 67 genes were differentially expressed during the temporal course of the infection. The results were validated through the analysis of expression profile for some genes using semi-quantitative RT-PCR and the PIP box functionality for some promoters was demonstrated using GUS as reporter gene. The differentially expressed genes were classified regarding the biological function of the encoded protein and related to several relevant processes as type III secretion system, membrane and cellular wall metabolism, iron uptake, sugar metabolism and host cell wall degradation, signal transduction, flagellum metabolism, biofilm formation and adhesiveness, nucleic acid metabolism, membrane transporters, energetic metabolism and stress response. The possible roles of these modifications for the bacteria-plant interaction and disease installation are discussed.

O cancro cítrico, causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), é um dos mais graves problemas fitossanitário da citricultura brasileira. Com a introdução da lagarta minadora dos citros (Phyllocnistis citrella [LMC]), houve um aumento drástico do número de focos do cancro cítrico, além da mudança do padrão espacial de fortemente agregado para moderadamente agregado e ao acaso. Foram avaliados: (1) suscetibilidade de três condições foliares: folha intacta, ferimento mecânico e injúria de LMC nas fases ovo, 1º ínstar, 3º ínstar e pupa, inoculados em diferentes concentrações de Xac (101, 102, 104 e 106 ufc/ml); (2) período de suscetibilidade da folha intacta, do ferimento mecânico e injúria de LMC inoculados a 106 ufc/ml; e (3) efeito da temperatura (12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 e 42°C) e duração do molhamento foliar (0, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 h) em folhas sem ferimento inoculadas a 106 ufc/ml. A concentração mínima de inóculo para causar sintomas da doença em folha intacta, injúria de LMC fase ovo e 1º ínstar foi de 104 ufc/ml; em ferimento mecânico e injúria de LMC fase 3º ínstar e pupa, 102 ufc/ml. Injúria da fase pupa resultou em grande severidade do que nos demais tratamentos a 106 ufc/ml (2 vezes maior do que em folha intacta).O período de suscetibilidade da injúria de LMC foi seis vezes mais longo do que do ferimento mecânico e a máxima suscetibilidade foi três vezes maior que em folha intacta. A LMC está relacionada com o aumento do dano que expõem mesofilo foliar à infecção direta de Xac, aumentando a suscetibilidade da folha por longo período. A faixa de temperatura ótima para o desenvolvimento do cancro cítrico foi de 25-35ºC. Entretanto, a severidade foi mais alta entre 30-35ºC. Sintomas de cancro não desenvolveram a 42ºC e na ausência de molhamento foliar. O efeito da temperatura foi maior do que a duração do molhamento foliar. A mínima duração de molhamento para infecção de Xac foi menor que 4 horas. / Asiatic citrus canker, caused by X. axonopodispv.citri (Xac), is one of the most serious phytosanitary problems in Brazilian citrus crops.The introduction of the citrus leafminer (Phyllocnistis citrella [CLM]), has resulted in an increase in the number of disease foci and has changed the spatial pattern of citrus canker symptomatic trees from strong aggregation to intermediate aggregation and random patterns. We evaluated: (1) susceptibility of three distinct leaf condition: intact leaves, mechanical wounding, and injury caused by CLM at the egg stage, 1st instar, 3rd instar, and pupal stage, inoculated at different concentration of Xac (101, 102, 104, and 106 cfu/ml); (2) susceptibility period of intact leaves, mechanical wounding, and CLM injury inoculated at 106 ufc/ml; and (3) effect of temperature (12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 42°C) and leaf wetness durations (0, 4, 8, 12, 16, 20, and 24 h) on unwounded leaves inoculated at 106 ufc/ml. The minimum inoculum concentration to cause symptom development in intact leaves, CLM injury at the egg stage and 1st instar was 104 cfu/ml; in mechanically wounded leaves and CLM injuries at the 3rd instar and pupa stage, 102 cfu/ml. The injuries from pupa stage resulted in greater disease severity than other treatments at 106 cfu/ml (two times higher than in the intact leaf). Susceptibility period of CLM injury was six time longer than mechanical wounding and maximum observed susceptibility was three times higher than intact leaf. CLM is related to the amount of damage that exposes mesophyll cells to direct Xac infection, increasing the susceptibility of leaf for long period. Optimal temperature for development of citrus canker was 25-35°C. However, disease severity was highest in the range 30-35°C. Symptoms did not develop at 42°C and zero hour of leaf wetness duration. Effect of temperature was .greater than leaf wetness duration. The minimum wetness duration for Xac infection was as short as 4 h.

Molibdênio é um elemento traço envolvido na fixação de nitrogênio, enxofre e carbono. Oligopeptídeos estão envolvidos na nutrição bacteriana e diversos outros processos de sinalização intercelular. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel funcional das proteínas ligadoras dos sistemas de captação de molibdato (ModA) e oligopeptídeo (OppA) em Xanthomonas axonopodis pv. citri em condições in vitro e in vivo. O mutante ModA mostrou uma produção diminuída de goma xantana, alteração do biofilme e adesão prejudicada em condições in vitro. In vivo a interação do mutante modA mostrou alterações nas lesões causadas em folhas de grapefruit possivelmente resultado da baixa expressão do gene gumB. O mutante na proteína OppA apresentou células mais co-agregadas alterando a estrutura do biofilme e consequentemente diminuindo sua capacidade de adesão. In vivo, a linhagem mutante não alterou o fenótipo de patogenicidade, mas a sua capacidade de crescimento foi afetada no início da fase estacionária sugerindo que o sistema Opp desempenha um papel nutricional. / Molybdenum is a trace element involved in nitrogen fixation, sulfur and carbon. Oligopeptides are involved in bacterial nutrition and several other intercellular signaling processes. The aim of this study was to investigate the functional role of binding proteins of molybdate (ModA) and oligopeptide (OppA) uptake systems of Xanthomonas campestris pv. citri in in vitro and in vivo conditions. ModA mutant showed a decreased production of xanthan gum, altered biofilm and adhesion impaired in vitro conditions. In vivo ModA mutant interaction showed changes in injuries on leaves of grapefruit possibly due to low expression of the gumB gene. The OppA mutant showed more cells co-aggregated by changing the structure of the biofilm and consequently reducing their capacity to adhere. In vivo, the mutant strain did not modify the phenotype of pathogenicity, but its ability for growth was affected at the early stationary phase suggesting that the Opp system plays a nutritional role.

A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.