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Contribution à létude fonctionnelle des dipeptidyl peptidases et de la métalloprotéase MEP3 sécrétées par Microsporum canis »Vermout, Sandy 19 September 2007 (has links)
Thèse de Doctorat en Sciences Vétérinaires
Résumé
Orientation: Médecine Vétérinaire
Titre de la thèse en français: Contribution à létude fonctionnelle des dipeptidyl peptidases et de la métalloprotéase MEP3 sécrétées par Microsporum canis »
Titre de la thèse en anglais: Contribution to the functional study of dipeptidyl peptidases and MEP3 metalloprotease secreted by Microsporum canis
Candidat: Sandy Vermout
Promoteur: Dr Bernard Mignon
Co-promoteur: Prof. Bertrand Losson
Département et Service: Département des Maladies Infectieuses et Parasitaires, service de Parasitologie et de Pathologie des Maladies Parasitaires
Date de la défense publique:
Composition du Jury:
Description du sujet de recherche abordé:
Les dermatophytes sont des champignons filamenteux responsables de mycoses superficielles contagieuses, souvent appelées « teignes », et couramment rencontrées tant en dermatologie humaine que vétérinaire. Parmi eux, Microsporum canis est lagent isolé dans la majorité des cas de dermatophytose chez le chat et le chien. Le chat peut être considéré comme le réservoir de cette infection, quil transmet à différentes espèces animales mais aussi à lhomme.
La relation hôte-parasite caractérisant les dermatophytoses est particulière. Les dermatophytes se nourrissent aux dépens même de la barrière kératinisée destinée à la protection de lorganisme contre les agressions extérieures. Ils y restent confinés et sont généralement incapables de provoquer des infections profondes. Les dermatophytes sont des parasites obligatoires, qui affectent des hôtes immunocompétents. Par ailleurs, lexpression clinique des dermatophytoses est très variable selon lhôte et lespèce fongique impliqués : linfection peut être aiguë et rapidement éliminée, ou au contraire persistante et accompagnée de symptômes ténus. Par exemple, les lésions causées par M. canis sont généralement plus inflammatoires chez lhomme que chez le chat, son hôte naturel, et certains chats développent des teignes chroniques peu apparentes, jouant un rôle important dans la transmission de linfection.
Les mécanismes qui président à ces divers aspects de la pathogenèse des dermatophytoses, et en particulier de linfection par M. canis, restent très mal connus. La majeure partie des recherches effectuées jusquà ce jour concernent les nombreuses protéases sécrétées par les dermatophytes et potentiellement impliquées dans le dégradation de la kératine, si bien quun grand nombre dentre elles ont été caractérisées dun point de vue moléculaire et enzymatique. Chez M. canis, deux familles de gènes, codant respectivement pour des subtilases (SUBs) et des métalloprotéases (MEPs), ont été isolées (Brouta et al., 2002 ; Descamps et al., 2002 ; Jousson et al., 2004). Parmi leurs membres, SUB3 et MEP3 sont considérées comme de probables facteurs de virulence ; en effet, elles sont induites sur un milieu à base de poils de chats, exprimées in vivo, fortement kératinolytiques, et également immunogènes (Descamps et al., 2003a ; Brouta et al., 2003).
Le premier objectif de ce travail est dévaluer limmunogénicité et le pouvoir protecteur de MEP3 sous forme recombinante, dans le cadre dun essai de vaccination chez le cobaye. Le second est didentifier et de caractériser chez M. canis une autre classe de protéases, les dipeptidyl peptidases (DPPs). Les gènes correspondants seront isolés et séquencés, ce qui permettra létude de leur expression in vivo et sur différents milieux in vitro. Les protéines encodées seront produites sous forme recombinante, afin de pouvoir entamer lanalyse de leurs propriétés enzymatiques et immunologiques. Enfin, étant donné que chaque facteur étudié ne peut être formellement impliqué dans la virulence du champignon quen passant par la construction de souches déficientes, le troisième but de ce doctorat est de mettre au point chez M. canis une technique dinactivation génique par lintermédiaire dARNs en épingle à cheveux, en utilisant comme cibles des gènes codant pour des protéases sécrétées.
Résultats:
Un vaccin expérimental anti-M. canis a été préparé en associant MEP3, obtenue sous forme recombinante dans la levure Pichia pastoris (rMEP3), à ladjuvant de Freund. Le vaccin a été administré à des cobayes, par voie sous-cutanée, trois fois à 15 jours dintervalle. La vaccination a induit une forte réponse en anticorps spécifiques, ainsi quune réponse lymphoproliférative envers MEP3. Toutefois, cette dernière est apparue comme transitoire, puisquelle nétait plus significative au moment de lépreuve dinfection. Celle-ci a eu lieu 7 semaines après la dernière vaccination. Lévolution clinique de linfection, ainsi que la persistance du champignon, ont été suivies de façon régulière et exprimées sous forme de scores clinique et mycologique attribués à chaque animal. Aucune différence significative na pu être mise en évidence entre les scores des animaux vaccinés et non vaccinés. La réponse en anticorps induite par linfection chez les animaux non vaccinés sest révélée nettement plus faible que celle induite par la vaccination ; la réponse lymphoproliférative observée après linfection était dintensité comparable entre animaux vaccinés et non vaccinés. Le vaccin à base de rMEP3 na donc pas été protecteur, malgré linduction dune importante réponse humorale et le recrutement de cellules T spécifiques.
Dans le but didentifier de nouveaux immunogènes potentiels, et de compléter dans le même temps les connaissances relatives aux protéases sécrétées par M. canis, les gènes codant pour des dipeptidyl peptidases ont été isolés. Il sagit dexoprotéases libérant des dipeptides au niveau de lextrémité N-terminale des protéines et réparties en différentes classes suivant la nature de ce dipeptide et suivant leur localisation cellulaire. Deux gènes uniques, codant respectivement pour une DPPIV et une DPPV, ont pu être isolés, séquencés et caractérisés. Ils encodent des protéases de la famille S9 de protéases à sérine, possédant un peptide signal de sécrétion mais pas de séquence pro-, et possédant des sites de glycosylation. Les deux protéases sont à 90% identiques à leurs paralogues isolés chez Trichophyton rubrum (Monod et al., 2005), un dermatophyte fréquemment isolé lors de dermatophytose humaine. Elles sont également homologues aux DPPs dAspergillus fumigatus, qui ont été proposées comme facteurs de virulence potentiels (Beauvais et al., 1997a,b). La DPPIV de M. canis présente également un degré dhomologie élevé avec la DPPIV de la bactérie pathogène Porphyromonas gingivalis, qui est un facteur de virulence avéré (Kumagai et al., 2003), ainsi quavec le marqueur mammalien CD26, qui est une molécule multifonctionnelle participant à de nombreux processus biologiques et immunologiques (Boonacker et Van Noorden, 2003). Grâce à une technique de RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) en temps réel, une importante augmentation de lexpression des deux DPPs de M. canis a été mise en évidence lorsque le champignon est cultivé sur des milieux constitués de protéines de matrice extracellulaire, parmi lesquelles la kératine. Lexpression des DPPs a également été détectée in vivo, chez le chat et le cobaye, par RT-PCR nichée. Les deux protéases ont été produites sous forme recombinante dans la levure P. pastoris, et y sont enzymatiquement actives. Les DPPs recombinantes apparaissent sous forme dune bande à 83 kDa (DPPV) et dun doublet à 95 et 98 kDa (DPPIV), dont respectivement 5 kDa et 9 ou 12 kDa de glycosylation. Elles clivent les substrats préférentiels de leurs sous-familles enzymatiques, ce qui correspond dans le cas de la DPPIV aux liens de type Proline-X ; cette spécificité est très rarement rencontrée parmi les protéases. Alors quaucune des deux DPPs de M. canis nest à elle seule kératinolytique, limplication de la DPPIV dans la digestion du réseau de kératine a été testée en utilisant le substrat Keratin Azure (Sigma) et des surnageants de cultures de M. canis montrant une forte activité kératinolytique. La préincubation de ces surnageants avec un inhibiteur spécifique de DPPIV na eu aucun effet sur le niveau de solubilisation du substrat kératinisé. Ce résultat indique que lintervention potentielle de la DPPIV dans cette digestion a lieu uniquement en aval de la digestion par les endoprotéases. Ensuite, dans le but dévaluer la capacité de la DPPV dinduire une réponse cutanée de type DTH (Delayed Type Hypersensitivity), sa forme recombinante a été utilisée dans le cadre de tests dintradermoréaction chez des cobayes précédemment infectés par M. canis. La réaction sest avérée négative, contrairement à ce qui a été observé dans le cas de la DPPV de Trichophyton tonsurans chez lhomme. Toutefois, cette dernière a été utilisée sous sa forme native.
Enfin, une technique dinactivation génique via lARN a été mise au point chez M. canis, en utilisant comme cibles les gènes codant pour SUB3 et DPPIV. Il sagit de la première mise en uvre de cette méthodologie chez les dermatophytes. La technique employée dérive du phénomène d « interférence à lARN » (RNA interference, RNAi), qui a lieu à proprement parler dans les cellules animales, mais équivaut à des voies similaires chez les autres types dorganismes, y compris les champignons (Nakayashiki, 2005). Linterférence à lARN a pour élément déclencheur un ARN double brin, qui entraîne la destruction enzymatique des ARN messagers de séquence identique. Chez les champignons filamenteux, cette voie est activée efficacement par un ARN en épingle à cheveux dune taille de 500 à 1000 bp. Nous avons donc conçu deux constructions codant pour de telles épingles à cheveux, dont les séquences correspondent respectivement à un fragment des gènes SUB3 et DPPIV. M. canis a ensuite été transformé, séparément, par chacune de ces constructions. Pour chaque gène cible, les souches fongiques générées ont présenté des degrés dinhibition variables, évalués par RT-PCR en temps réel et par mesure de lactivité enzymatique des protéines cibles dans les surnageants de culture des transformants. Les taux dactivité enzymatique résiduelle et dARN messager obtenus étaient respectivement de 3,3% et 2% pour SUB3, et de 45,6% et 1,5% pour DPPIV. La distribution des taux dinhibition génique entre 0% et plus de 95% est compatible avec les résultats détudes similaires chez dautres champignons filamenteux. En outre, dans le cas de latténuation de lexpression de SUB3, une analyse par électrophorèse SDS-PAGE du surnageant de culture dune souche fortement inhibée montre la disparition de la bande correspondant à SUB3, mais aussi de celle correspondant à SUB4, ce qui indique que le seul fragment interférant utilisé est potentiellement capable dinhiber plusieurs gènes de la même famille.
Conclusions et perspectives:
Aucune atténuation des symptômes de linfection par M. canis, ni de linvasion par le champignon, nest obtenue en vaccinant des cobayes avec rMEP3 associée à ladjuvant de Freund selon le protocole utilisé. Des résultats similaires ont été obtenus avec deux autres protéases recombinantes, SUB3 chez M. canis (Descamps et al., 2003b) et la hsp60 de T. rubrum (Raska et al., 2004). Or, le succès dun vaccin résulte à la fois des propriétés intrinsèques du ou des immunogènes quil contient, et de la stimulation sélective par son adjuvant des acteurs efficaces de la réponse immune. Deux options sont donc offertes pour de nouvelles recherches dans le domaine de la vaccination anti-M. canis et anti-dermatophytes. La première consiste à poursuivre la dissection de la réponse immune spécifique en étudiant les propriétés immunogènes de composants particuliers. Même si lélimination naturelle dune infection fongique relève généralement dune réponse effectrice cellulaire de type Th1, cette perspective va bien au-delà de la recherche dun facteur activant des lymphocytes Th1, ou rappelant une réponse de type DTH au niveau cutané. En effet, il est actuellement démontré que des anticorps de spécificité bien choisie peuvent être totalement protecteurs contre une infection fongique (Casadevall et al., 2002 ; Cassone, 2007). En outre, il ne faut pas perdre de vue que lélément fongique de base déterminant une réponse immune adéquate est lépitope (Woodfolk et al., 2000). Le répertoire dépitopes générés à partir dune protéase recombinante peut dailleurs être modifié par rapport à son homologue native (Engelhard et al., 2006), comme cela est suspecté pour rDPPV chez M. canis. Ce phénomène peut engendrer une altération des propriétés immunogènes natives, mais a contrario, une protéase recombinante ainsi modifiée peut devenir un outil pour identifier des motifs antigéniques dintérêt.
La seconde voie possible vers lélaboration dun vaccin sûr et pleinement efficace est lutilisation de nouveaux adjuvants orientant la réponse immune de la même façon quune infection naturelle protectrice. Chez A. fumigatus, des oligonucléotides CpG associés à une protéine recombinante ont permis de protéger des souris contre une aspergillose invasive, en stimulant plusieurs composants de la réponse cellulaire de type Th1 (Bozza et al., 2002). La vaccination à base de cellules dendritiques polarisées par un contact avec A. fumigatus sest également montrée prometteuse dans un modèle murin daspergillose invasive (Bozza et al., 2004), cette technique pouvant être assimilée à lemploi dun adjuvant de nouvelle génération. Il est bien entendu que ces deux voies de recherche ne sexcluent pas mutuellement, et quun travail mené dans les deux directions sera sans doute nécessaire pour atteindre le but recherché.
Les DPPIV et V de M. canis ont été caractérisées au niveau moléculaire, et exprimées sous forme recombinante active. Leurs propriétés ainsi que celles de différentes protéases homologues laissent supposer quelles jouent un rôle universel dans la digestion de substrats protéiques complexes, y compris les structures kératinisées, mais quelles pourraient en plus avoir acquis une ou plusieurs fonctions spécialisées dans le cadre de la relation hôte-parasite. Lune de ces fonctions pourrait être la modulation de la réponse immune, par exemple via le clivage de cytokines ou de chémokines, étant donné notamment sa similitude avec la DPPIV mammalienne ou CD26. Parallèlement, les DPPs sont peut-être aussi des immunogènes importants. Enfin, la DPPIV sécrétée par M. canis pourrait intervenir dans ladhérence aux protéines de matrice extracellulaire, ou encore dans la dégradation des tissus via lactivation de protéases de lhôte, comme cela a été démontré chez P. gingivalis (Kumagai et al., 2005).
Plusieurs perspectives sont donc ouvertes quant à linvestigation de la fonction des DPPs des dermatophytes, et certaines pourront êtres rencontrées grâce aux formes recombinantes de ces protéines. Cependant, pour elles comme pour tous les autres facteurs fongiques susceptibles de contribuer à la pathogenèse des dermatophytoses, la construction de souches déficientes est un passage obligé vers la démonstration formelle de cette contribution. Ceci est maintenant réalisable rapidement, au moyen de constructions exprimant des ARN double brin interférants, même si de nombreuses améliorations peuvent sans doute être apportées à cette technique. Les souches déficientes au niveau de SUB3 et potentiellement des autres SUBs, ainsi que celles déficientes au niveau de DPPIV, seront prochainement évaluées quant à leur comportement dans un modèle dépiderme félin reconstitué mis au point dans notre laboratoire (Tabart et al., sous presse).
Références:
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TABART J., BALDO A., VERMOUT S., NUSGENS B., LAPIERE C., LOSSON B., MIGNON B. Reconstructed interfollicular feline epidermis as a model for Microsporum canis dermatophytosis. J. Med. Microbiol., sous presse.
WOODFOLK J.A., SUNG S.S., BENJAMIN D.C., LEE J.K., PLATTS-MILLS T.A.. Distinct human T cell repertoires mediate immediate and delayed-type hypersensitivity to the Trichophyton antigen, Tri r 2. J. Immunol., 2000, 165, 4379-87.
Publications issues du travail de thèse:
VERMOUT S., DENIS M., LOSSON B., MIGNON B. Choix d'un adjuvant lors d'essais de vaccination. Ann. Med. Vet., 2003, 147, 393- 40.
VERMOUT S.M., BROUTA F.D., DESCAMPS F.F., LOSSON B.J., MIGNON B.R. Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of a Microsporum canis metalloprotease subunit vaccine in guinea pigs. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2004, 40, 75-80.
VERMOUT S., TABART J., BALDO A., MONOD M., LOSSON B., MIGNON B. RNA silencing in the dermatophyte Microsporum canis. FEMS Microbiol. Lett., sous presse.
VERMOUT S., TABART J., BALDO A., LOSSON B., MIGNON B. Pathogenesis of dermatophytoses. Mycopathologia, soumis pour publication.
VERMOUT S., BALDO A., TABART J., LOSSON B., MIGNON B. Secreted dipeptidyl peptidases as potential virulence factors for Microsporum canis. Soumis pour publication.
Remerciements:
Fonds pour la formation à la Recherche dans lIndustrie et lAgriculture (F.R.I.A.)
Fonds pour la Recherche Scientifique et Médicale (F.R.S.M.)
Patrimoine de lUniversité de Liège
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Canine babesiasis: occurrence and molecular characterization of Babesia isolatesLehtinen, Lauren Elyse 15 May 2009 (has links)
Canine babesiosis is an important worldwide disease caused by protozoan
hemoparasites of the genus Babesia, which are primarily transmitted to a dog by the bite
of an Ixodid tick, although vertical transmission has recently been reported. The disease
is typically characterized by hemolytic anemia, fever, splenomegaly, and
thrombocytopenia, with clinical signs ranging from clinically normal to acute anemia.
Death may even result in some severe cases. Two species of Babesia, Babesia gibsoni
and Babesia canis, have long been known to cause babesiosis in dogs. To date, almost
all B. gibsoni infections in the United States have been reported in American Pit Bull
Terriers or in dogs associated with the breed through either transfusion or fighting.
Dog blood samples received from kennels, shelters, and veterinary clinics
throughout Texas were tested for the presence of B. gibsoni and B. canis. A total of 254
samples were tested for B. gibsoni and B. canis by light microscopy and polymerase
chain reaction (PCR). Babesia gibsoni was detected in four of the dogs tested and B.
canis was detected in one of the dogs tested. The average packed cell volumes (PCVs)
of infected dogs were compared with those of uninfected dogs, with the infected, on
average, having lower PCVs. Molecular characterization of the small subunit ribosomal RNA gene and the ribosomal RNA internal transcribed spacer regions was performed on
all sequences obtained in this study, and results were consistent with those previously
reported for B. gibsoni and B. canis. Also, positive samples and additional samples
provided by North Carolinia State University were used to initiate in vitro cultures of the
parasites. To date, one isolate of a large unknown Babesia sp. from a North Carolina
dog was successfully established in vitro. The establishment of Babesia spp. parasites in
culture may aid in the development of a vaccine for babesiosis and will also be
beneficial in improving diagnostic tests for the parasite.
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Venison to beef and deviance from truth: biotelemetry for detecting seasonal wolf prey selection in AlbertaMorehouse, Andrea Unknown Date
No description available.
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Behaviours and experiences as indicators for the result in a behavioural test for dogsBjällerhag, Nathalie January 2013 (has links)
In 2005 Swedish Armed Forces (SAF) started a breeding program of military working dogs. The dogs leave SAF’s kennel at an age of 8 weeks and live with puppy raisers. To evaluate the suitability of dogs for military work the dogs conduct a behavioural test at an age of 15-18 months. An “Index value” is extracted from this behavioural test. The puppy raisers answered a modified version of Canine Behavioral Assessment and Research Questionnaire (C-BARQ) when the dogs were approximately 12 months old. Answered questionnaires and results from the behavioural test were obtained for 59 dogs. Dogs that had passed the behavioural test had tendency for higher scores for “Trainability” (p = 0.078) and “If lived with other animals” (p = 0.066). Failing dogs had significantly higher score for “Stranger Directed Fear” (p = 0.006), ”Non-Social Fear” (p = 0.005), “Dog Directed Fear” (p = 0.021), “Hours of daily activation” (p = 0.001), “Mounting objects” (p = 0.012), and a tendency for higher risk of “Urinating when home alone” (p = 0.058). In a regressions between the “Index value” and the values of the questions from C-BARQ, the “Index value” was negatively correlated to “Stranger Directed Fear” (p = 0.002), “Non-social Fear” (p = 0.003), and “Dog Directed Fear” (p = 0.006). The “Index value” was positively correlated to “Trainability” (p = 0.013), “Hours left home alone” (p=0.043), “Hyperactive” (p = 0.018), “Chases shadows/light spots” (p = 0.043), and a positive tendency for “Chewing on inappropriate objects” (p = 0.075). From a PCA at the categories in C-BARQ, 3 components were extracted. All three components had a correlation to the “Index value”. The results show that the use of C-BARQ can indicate whether the dog will pass the behavioural test or not.
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Conflicts Between Humans And Wolf: A Study In Bozdag, Konya Province, TurkeyTug, Senem 01 October 2005 (has links) (PDF)
Canis lupus is one of the most important but least studied species of Turkish fauna, however, livestock depredation and recently increased number of publications on attacks on humans intensifies human-wildlife conflict. In this study, wolf depredation is studied in Bozdag in the province of Konya where conflicts between wolves and livestock holders are well known.
The study site holds > / 50,000 sheep and covers 9 villages and a small town. A total of 13 shepherds are interviewed in 2004 and 2005 to reveal husbandry methods and vulnerability of livestock to wolf attacks in Bozdag. Each flock is attended by a shepherd and several livestock guarding dogs (LGDs), and experiences 1.96 wolf attacks per year, on average, independent of flock size. The flocks attended by less LGDs experience less attacks and therefore, the quality of the LGDs & / #8211 / not their numbers- are more important. Confining sheep in corrals that are attended by a shepherd and good quality LGDs appears to be the most effective husbandry method to decrease depredation. Human attitude towards wolf is also assessed and the perception of wolf is generally negative / 8 out of 11 shepherds are in favour of the eradication of this carnivore.
Publicized wolf attacks on humans are compiled from 21 news sources on the internet and records of wolf rabies are sought from various sources. There were five publicized cases of attacks on humans, no verified records of human death between 2000 and 2005. Rabies stands out as the primary reason of wolf attacks, but it requires further research because proper records are missing.
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Venison to beef and deviance from truth: biotelemetry for detecting seasonal wolf prey selection in AlbertaMorehouse, Andrea 11 1900 (has links)
An abrupt interface between mountains and prairies in southwestern Alberta means wilderness areas and carnivore populations overlap cattle grazing lands. Consequently, there is concern about the effects of large carnivores, especially wolves, on livestock. I used GPS clusters and scat samples to determine year-round wolf diets in this region. Both methods indicated a significant seasonal shift in wolf diets from wild prey during the non-grazing season to cattle in the grazing season. The GPS cluster method effectively identified wolf kills but this method relies on telemetry with high accuracy and precision. In southwestern Alberta, Argos satellite radicollars have been used extensively by wildlife managers. I compare how differences in precision between GPS and Argos technologies affect the estimation of habitat-selection models. Differences in accuracy and precision can lead to erroneous conclusions about animal selection of habitat. / Ecology
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Avaliação da imunoreatividade de soros caninos a dois extratos solúveis de Brucella canisRibeiro, Marcos Borges 22 December 2003 (has links)
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Dissertação_ICS_ Marcos Borges Ribeiro.pdf: 1012544 bytes, checksum: cd3041816b8e33f18036ad6952db5f5d (MD5) / A brucelose canina é uma infecção bacteriana contagiosa, zoonótica, causada
pela Brucella canis, responsável por aborto e infertilidade. A brucelose é uma
doença de importância mundial pelo prejuízo ocasionado tanto para a saúde
publica como para a economia nacional. O diagnóstico baseia-se principalmente
na sorologia devido a inespecificidade dos sinais clínicos. Vários métodos têm
sido descritos e utilizados para diagnóstico, porém a maioria comercialmente
disponível produz resultados falsos positivos. Neste trabalho foi comparado o
perfil de reconhecimento de Ig G sérica a dois extratos solúveis de Brucella canis,
preparados de diferentes formas. Os soros foram analisados por ELISA Indireto
com os dois extratos solúveis obtidos por calor e Ultra-som. Foram testadas 765
amostras de soros de cães domiciliados da cidade de Salvador e área
metropolitana com sorologia desconhecida, 92 amostras de soros testadas no
Centro de Controle de Zoonoses da cidade de São Paulo (CCZ-SP) pelo método
IDGA com antígeno de Brucella ovis sendo 45 positivas e 47 amostras negativas.
Para o cálculo do valor de corte foram utilizadas 21 amostras de soros de filhotes
de cães saudáveis provenientes do biotério do Centro de Pesquisa Gonçalves
Muniz (CPqGM-Fiocruz) – Salvador –Ba. O perfil eletroforetico foi analisado por
SDS-PAGE em sistema desnaturante e a reatividade dos antígenos solúveis foi
avaliada pelo ELISA e Western Blotting, comparando diferentes grupos de soros.
A comparação entre os ELISAs com ambos antígenos foi feito com todos os 857
soros. O ELISA com extrato solúvel obtido por calor indicou uma positividade de
10% (n=79) com valor de D.O de limite de corte de 0,235, já o ELISA com extrato
solúvel obtido por ultra-som indicou uma positividade de 24% (n=187) com valor
de D.O de limite de corte de 0,350. A análise estatística de correlação dos
resultados encontrados nos estudos dos dois antígenos obtido por calor e ultrasom
foi de 0,68. Os 92 soros do CCZ-SP testados pela IDGA foram utilizados
para avaliar a especificidade, sensibilidade, valores preditivos positivo e negativo
e eficiência dos ELISAs, sendo 51%,94%, 89%, 67% e 73% para o ELISA com
extrato obtido por calor e de 69%, 83%, 80%,74% e 76% para o ELISA com o
extrato obtido por ultra-som, respectivamente. A concordância entre os ELISAs
utilizando os dois extratos solúveis dada pelo índice Kappa foi de κ= 0,38. O Elisa
realizado com extrato solúvel obtido por calor mostrou concordância com a IDGA
de κ=0,45 e o ELISA utilizando extrato solúvel obtido por ultra-som e a IDGA com
κ= 0,52. A imunoreatividade do extrato antigênico solúvel de B. canis obtido por
calor (extrato aquecido), utilizando soros de animais positivos na IDGA e ELISA,
apresentou com maior freqüência as bandas 65 KDa, 58 KDa, 56 KDa, 18 KDa e
12 KDa e o extrato obtido por ultra-som as bandas 68 KDa, 52 KDa, 46 KDa, 38
KDa, 28 KDa, 18 KDa. Os antígenos utilizados para os ELISAs aquecido e
sonicado, mostram diferentes perfis eletroforético em análise pela técnica SDSPAGE,
sugerindo diferentes composições protéicas. Os extratos analisados por ELISA, apesar de apresentarem bons valores de controle de qualidade, sendo o
de ultra-som melhor que os aquecidos, necessitam ser avaliados quanto a sua
reatividade com soros de animais com diagnóstico de brucelose canina
confirmados por isolamento bacteriano ou por PCR.
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Infecção pelo Trypanosoma cruzi em Canis familiares e Triatomíneos (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) na zona rural do Estado do Rio Grande do NorteAraújo Neto, Vicente Toscano de 16 March 2018 (has links)
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Previous issue date: 2018-03-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / A infecção pelo Tripanosoma cruzi em Canis familiaris e triatomíneos foi avaliada nos
ambientes domiciliar e peridomiciliar de localidades rurais de alguns municípios do
Estado do Rio Grande do Norte. Amostras de sangue de 43 cães foram coletadas nos
municípios de Acari, Caicó, Caraúbas e Marcelino Vieira e avaliadas quanto a infecção
pelo T. cruzi por meio de testes sorológicos e pela Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR). Inicialmente, testes sorológicos como o DPP® (Dual Path Platform, BioManguinhos/FIOCRUZ)
e ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) foram
realizados para verificar a presença de anticorpos anti-Leishmania. Para a detecção de
anticorpos anti-T. cruzi foram realizadoso ELISA in house para IgM e IgG e a reação de
Imunofluorescência Indireta (RIFI). As capturas de triatomíneos foram realizadas nas
mesmas localidades em que foram coletadas as amostras de sangue de cão. A infecção foi
avaliada por exame direto e/ou PCR. Na sorologia para T. cruzi, 16,3% dos cães
apresentaram reatividade sugestiva de fase aguda e 11,6% de fase crônica. A sorologia
para Leishmania foi reativa em 9,3% dos animais dos quatro municípios investigados,
sendo mais elevado no município de Acari com 12,5% . A reatividade entre os testes para
Leishmania e T. cruzi foi de 23,2% das amostras, relacionada provavelmente com
sobreposição /de áreas endêmicas. Na detecção do kDNA pela PCR, 41,9% das amostras
apresentam a banda 330pb, as quais 20,9% eram do município de Caraúbas, 9,3% de
Marcelino Vieira, 9,3% de Acari e 2,3% de Caicó. Nesses municípios, ninfas e adultos de
Triatoma brasiliensis, Triatoma pseudomaculata e Rhodnius nasutus foram capturados
em ambientes peridomiciliar e/ou intradomiciliar. As análises do conteúdo intestinal
avaliados pela PCR apontaram 59,5% de positividade. Os resultados apontam elevada
taxa de infecção de cães e triatomíneos pelo T. cruzi em diferentes municípios do Rio
Grande do Norte, o que pode favorecer a infecção em humanos e a manutenção da
infecção ativa pelo T. cruzi no Estado. / The infection by Trypanosoma cruzi in Canis familiaris and Triatomines was evaluated
in the home and peridomiciliary environment of rural communities in the State of Rio
Grande do Norte. Blood samples from 43 dogs from rural areas in the municipalities of
Acari, Caicó, Caraúbas and Marcelino Vieira were evaluated for T. cruzi infection by
serological techniques and by Polymerase Chain Reaction (PCR) to identify T. cruzi
kDNA. Serology was initially performed to identify anti-T.cruzi antibodies by ELISA
(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) for IgM and IgG in house and the Indirect
Immunofluorescence (IFR) reaction. The presence of anti-Leishmania antibodies with
DPP® (Dual Path Platform, Bio-Manguinhos / FIOCRUZ) and ELISA were also used.
The catches of triatomines were carried out in the same locations and in the same period
in which the dog samples were collected and the infection evaluated by direct examination
and/or PCR. The criterion for positivity in T. cruzi serology was the agreement between
two different techniques, which resulted in 16.3% (7/43) of the samples suggestive of
acute phase and 11.6% (5/43) of chronic phase. The reactive serology for Leishmania was
9.3% of the animals in the four municipalities studied, being more reactive in the
municipalities of Acari. These results of reactivity for Leishmania and T. cruzi may be
related to the overlap of endemic areas. In the identification of kDNA by PCR in blood
samples from dogs, 41.9% (18/43) of the samples present the band 330pb, of these 6.8%
(4/43) are in the municipality of Acari, 2.3% (1/43) in Caicó, 20.9% (9/43) in Caraúbas
and 9.3% (4/43) in Marcelino Vieira. The catches of triatomines identified adults and
nymphs of T. brasiliensis, T. pseudomaculata, R. nasutus and adults of P. lutzi in
peridomiciliary and/or intradomiciliary environments of all the studied localities. The
analysis of the intestinal contents evaluated by PCR found positivity of 78.5% (95/121)
of the triatomines that cohabitated these environments with the dogs. The natural T. cruzi
infection was identified in dogs and triatomines in all municipalities studied, probably
helping to maintain active T. cruzi infection in the domiciliary area and increasing the
risk of infection in the human population.
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Detekce polymorfismu v genu MDR1 u ovčáckých a honáckých psůStaroveská, Marieta January 2016 (has links)
This thesis is focused on polymorphism of MDR1 gene and related drug resistance. Resistance is caused by deletion of four nucleotids, that resulting in a frame shift and synthesis of nonfunctional transport of P-glycoprotein. The text describes a polymorphism of MDR1 (ABCB1) gene, which results in reduced resistance to drugs belonging to the group of macrocyclic lactones. It also describes inheritance of this phenomenon and it deals with the detection of mutation using PCR (polymerase chain reaction) and by fragmentation analyses. A review of literature study is a form of research solely from scientific publications. 128 dogs were included into the own analysis. The results confirmed that Collies had the highest presence of deletions (29,73 %) with a high number of carriers in the study population of dogs (54,05 %). The percentage of affected individuals in the breed of Australian Shepherd and Sheltie was significantly lower (7,32 % and 6 %), but the percentage of carriers were also high in both Australian Shepherds (34,14 %) and the breed Sheltie (48 %).
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Uso de sondas fluorescentes e do ensaio de ligação à membrana perivitelina do ovo de galinha (Gallus gallus) para a avaliação de espermatozoides frescos e descongelados de cão (Canis lupus familiares) / Use of fluorescent probes and assay of binding to the perivitelline layer of the chicken egg (Gallus gallus) for evaluate fresh and frozen-thawed dog (Canis lupus familiares) spermVasconcelos, Graziella de Souza Correia 19 November 2015 (has links)
Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-25T09:51:00Z
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Previous issue date: 2015-11-19 / Análises seminais por meio da associação de sondas fluorescentes possibilitam a avaliação dos diversos compartimentos da célula espermática, simultaneamente, oferecendo um prognóstico mais acurado frente ao caráter subjetivo de alguns testes de rotina. Neste estudo foi utilizada a associação de três sondas fluorescentes com objetivo de avaliar a integridade da membrana plasmática (iodeto de propídio e Hoechst 33342) e o potencial de membrana mitocondrial (MitoTracker red), em sêmen fresco e descongelado de cão. Os resultados obtidos foram comparados aos resultados dos testes de rotina. Todos os testes demonstraram capacidade em detectar queda de qualidade seminal pós- descongelamento. A associação das sondas fluorescentes iodeto de propídio (IP), Hoechst 33342 (H33342) e MitoTracker red (CMXRos) mostrou-se eficaz na distinção de diferentes populações de espermatozoides em ejaculados descongelados de cão doméstico. Foram distintas 4 populações: IC (membrana plasmática íntegra e com potencial de membrana mitocondrial), IS (membrana plasmática íntegra e sem potencial de membrana mitocondrial), LC (membrana plasmática lesada e com potencial de membrana mitocondrial) e LS (membrana plasmática lesada e sem potencial de membrana mitocondrial). Esta associação permitiu também quantificar e qualificar as injúrias causadas às membranas plasmáticas das células espermáticas, pelo processo de congelamento/descongelamento, nesta espécie. Foi observada correlação (p<0,05) entre a coloração das sondas fluorescentes e a avaliação da motilidade espermática e teste hiposmótico. Desta forma, sugere-se a inclusão da combinação de sondas fluorescentes nos protocolos de análise de sêmen, como teste complementar aos testes convencionais, tornando mais precisa a avaliação das injúrias à célula espermática desta espécie. Entretanto, nem os testes de rotina e nem as sondas fluorescentes são hábeis em predizer a capacidade do espermatozoide de ligar-se ao ovócito, evento crucial para a fecundação. Assim, faz-se importante a adoção de testes de ligação entre espermatozoides e ovócitos nas pesquisas referentes à avaliação dos protocolos de congelamento/descongelamento do sêmen. Embora o status metabólico dos ovócitos, assim como o efeito fêmea, limitem a exatidão das interpretações, tem-se buscado substratos de ligação mais homogêneos e de mais fácil obtenção. Neste contexto, a membrana perivitelina do ovo de galinha (MPOG) tem se demonstrado eficiente na avaliação da capacidade de ligação do sêmen em diversas espécies. O teste de ligação de espermatozoides à MPOG apresenta comportamento semelhante aos resultados dos testes de rotina da avaliação do sêmen, assim como os testes com as sondas fluorescentes, apresentando diferença quando comparados sêmen fresco e sêmen descongelado (p<0,05). Neste estudo, o teste hiposmótico correlacionou-se positivamente com o número de espermatozoides ligados à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha. O comportamento da MPOG e das sondas, entre os tratamentos, demonstraram sensibilidade da membrana em distinguir sêmens de diferentes potenciais de ligação (p < 0,05) nesta espécie. / Seminal analysis by means of the association of fluorescent probes allows for the simultaneous evaluation of several compartments of the spermatic cell, offering a more accurate prognostic when compared to the subjective character of some routine tests. In this study, the association of three fluorescent probes was used with the goal of evaluating the integrity of plasma membrane (propidium iodide and Hoechst 33342) and mitochondrial membrane potential (Mito Tracker red), in dog semen, both fresh and frozen. The attained results were compared to those of routine tests. All tests showed the capacity of detecting a drop in seminal quality after being unfrozen. The association of the fluorescent probes propidium iodide (IP), Hoechst 33342 (H33342) and Mito Tracker red (CMXRos) showed efficiency when differentiating sperm populations in the frozen semen of domestic dogs. There were four distinct populations: IC (intact plasma membrane and with mitochondrial membrane potential), IS (intact plasma membrane without mitochondrial membrane potential), LC (injured plasmatic membrane with mitochondrial membrane potential) and LS (injured plasmatic membrane without mitochondrial potential). This association also allows the quantification and qualification of the injuries caused on the sperm cell by the freezing/thawing process in this species. A correlation was observed between the coloring of the fluorescent probe and the evaluation of sperm motility and hypo- osmotic swelling test (p<0,05). However, the attained results with the probes showed a higher precision rate when detecting injuries to the spam cells thus suggesting the inclusion of the combination of fluorescent probes in semen analysis protocols, once evidence shows greater efficiency when compared to routine tests. Consequently, the inclusion of the combination of the fluorescent probes in the semen analysis is suggested as a complementary test, making the evaluation of the injuries to the spermatic cell of this species more precise. However, neither the routine tests nor the fluorescent probes are capable of predicting spermatozoon’s capability to bind to the oocyte, an crucial event to fecundation. Therefore, it is important to introduce biding assays between spermatic cells and oocytes in the research that refer to the evaluation of the freezing/ thawing semen protocols. Although the oocytes metabolic status, like the ‘’female effect’’, limit the accuracy of the interpretations, substrate binding that are more homogeneous and easier to obtain are being pursued. In this context, the perivitelline layer of the egg yolk has demonstrated to be efficient in evaluating the binding capacity of sperm in a number of species. The binding tests of sperm to the MPOG shows a behavior that is similar to the results obtained from semen’s routine evaluation tests, as well as the test with the fluorescent probes, presenting a difference when comparing fresh with unfrozen semen (p<0,05). In this study, the hypoosmotic test correlated positively to the number of spermatozoon connected to the perivitelline layer of the egg yolk. The behavior the MPOGs and that of the probes, between other treatments, demonstrated the membrane’s sensibility in distinguishing semen of different potential binding (p<0,05) in this species.
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