Diss. (sammanfattning) Linköping : Univ., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Les cavéoles sont des invaginations en forme de coupelle à la membrane plasmique. Ces organelles multifonctionnelles jouent entre autres, un rôle clé dans la mécano-protection et la signalisation cellulaire. En effet, les cavéoles ont la faculté de s’aplanir en réponse à l’augmentation de la tension membranaire, afin de protéger la cellule des contraintes mécaniques. Les cavéoles jouant un rôle clé dans la signalisation cellulaire, nous avions émis l’hypothèse que le cycle mécano-dépendent de désassemblage/réassemblage des cavéoles constitue un interrupteur mécanique de certaines voies de signalisation. Ce projet consiste à élucider le mécanisme moléculaire responsable du contrôle de la voie de signalisation JAK-STAT par la mécanique des cavéoles. Dans ces travaux, nous avons pu démontré que la cavéoline-1 (Cav1), un constitutant essentiel des cavéoles est libérée et devient hautement mobile au niveau de la membrane plasmique. Considérant les propriétés de signalisation de Cav1, Nous avons testé l’effet du désassemblage des cavéoles sur la signalisation cellulaire. Un criblage à haut débit, nous a permis identifié la voie de signalisation JAK- STAT stimulée par l’IFN-α comme voie modèle pour cette étude. En effet, la transduction du signal JAK-STAT induit par l’IFN-α est modulée par la mécanique des cavéoles. Afin de disséquer le mécanisme moléculaire responsable du contrôle de la signalisation JAK-STAT par la mécanique des cavéoles, nous avons déterminé le rôle de Cav1 dans ce contrôle. Nous avons observé que Cav1 est un régulateur négatif de la phosphorylation de STAT3 dépendante de la kinase JAK1. De plus, nous avons démontré que Cav1 interagit avec JAK1 en fonction de la tension membranaire. Nous avons également démontré que cette interaction Cav1-JAK1 fait intervenir le « scaffolding domain » de Cav1 (CSD), et que celui-ci est responsable de l’abolition de l’activité kinase de JAK1. Par conséquent, l’interaction de Cav1 avec JAK1 empêche l’activation de STAT3 par la kinase JAK1. Ces résultats démontrent que les cavéoles sont des organelles de mécano-signalisation, qui, lors d’un stress mécanique, libèrent de la Cav1 non cavéolaire capable d’inactiver la kinase JAK1, empêchant ainsi, la transduction du signal JAK-STAT. / Caveolae are small cup-shaped plasma membrane invaginations. These multifunctional organelles play a key role in cell mechanoprotection and cell signaling. Indeed our laboratory reported that caveolae have the ability to flatten out upon membrane tension increase, protecting cells from mechanical strains. Since caveolae play a key role in cell signaling we hypothesized that the mechano-dependent cycle of caveolae disassembly/reassembly may constitute a mechanical switch for signaling pathways. In this project, we elucidated the molecular mechanism underlying the control of JAK-STAT signaling by caveolae mechanics. We showed that caveolin-1 (Cav1), an essential caveolar component is released and become highly mobile at the plasma membrane under mechanical stress. Considering that caveolae are important signaling hubs at the plasma membrane, we addressed the effects of the mechanical release of Cav1 on cell signaling. Using high throughput screening, we identified the JAK-STAT signaling pathway as a candidate. To further dissect the molecular mechanism underlying the control of JAK-STAT signaling by caveolae mechanics, we addressed the role of Cav1 in the control of JAK-STAT signaling stimulated by IFN-α. We found that Cav1 was a specific negative regulator of the JAK1 dependent STAT3 phosphorylation. Furthermore, the level of Cav1 interaction with JAK1 depended on mechanical stress. We could show that Cav1-JAK1 interaction was mediated by the caveolin scaffolding domain (CSD), abolishing JAK1 kinase activity, hence, interfering with STAT3 activation upon IFN-α stimulation. Altogether our results show that caveolae are mechanosignaling organelles that disassemble under mechanical stress, releasing non-caveolar Cav1, which binds to the JAK1 kinase and inhibits its catalytic activity, preventing thereby JAK-STAT signal transduction.

Yes / Caveolae are curved lipid raft regions rich in cholesterol and sphingolipids found abundantly in vascular endothelial cells, adipocytes, smooth muscle cells, and fibroblasts. They are multifunctional organelles with roles in clathrin-independent endocytosis, cholesterol transport, mechanosensing, and signal transduction. Caveolae provide an environment where multiple receptor signalling components are sequestered, clustered, and compartmentalised for efficient signal transduction. Many of these receptors, including cytokine signal transducer gp130, are mediators of chronic inflammation during atherogenesis. Subsequently, disruption of these organelles is associated with a broad-range of disease states including cardiovascular disease and cancer. Cavin-1 is an essential peripheral component of caveolae that stabilises caveolin-1, the main structural/integral membrane protein of caveolae. Caveolin-1 is an essential regulator of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and its disruption leads to endothelial dysfunction which initiates a range of cardiovascular and pulmonary disorders. While dysfunctional cytokine signalling is also a hallmark of cardiovascular disease, knowledge of caveolae-dependent cytokine signalling is lacking as is the role of cavin-1 independent of caveolae. This review will introduce caveolae, its structural components, the caveolins and cavins, their regulation by cAMP, and their potential role in cardiovascular disease.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Die P2XR werden durch ATP aktiviert und stellen unselektive Kationenkanäle dar, die auch für Ca2+ durchlässig sind. Beiden P2XR-Subtypen werden in den Alveolarepithel Typ I (AT I)-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanalaktivitäten in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Bei bisherigen Untersuchungen wurde jedoch die mögliche Assoziation und Modulation der P2XR durch Mikrodomänen der Zellmembran außer Acht gelassen. Ein Modell von Garcia-Marcos zeigt, dass P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert ist. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R sind dabei von der Lokalisation in der Zellmembran abhängig (Garcia-Marcos et al., 2006). Die Caveolen sind eine spezielle Form von Mikrodomänen, die in der Zellmembran der AT I-Zellen auftreten. Das Hauptstrukturprotein der Caveolen im Lungenepithel ist Caveolin-1 (Cav-1). Über die Verteilung von P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen war bislang sehr wenig bekannt. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte bei einer Sequenzanalyse potentielle Cav-1-Bindemotive in der Aminosäureabfolge beider P2XR (Couet et al., 1997). Die Assoziation mit den Caveolen würde die P2XR in die räumliche Nähe verschiedener Signalmoleküle bringen und die Beteiligung an downstream Events ermöglichen. Für die folgenden Analysen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, da die E10-Zellen AT I-typische Eigenschaften besitzen und P2X4R, P2X7R sowie die Caveoline Cav-1 und Cav-2 aufweisen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR. Besonders wurde dabei auf die Assoziation der P2XR mit Cav-1 eingegangen. Zusätzlich wurde in vitro die Interaktion der C-terminalen Bereiche der beiden P2XR mit Membranlipiden untersucht. Einige Membranlipide sind eng mit weiteren Signalmolekülen verknüpft. Aus diesem Grund wurde die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca2+-aktivierbaren downstream-Effektoren PKCβI und CaM analysiert. Die Auswertungen der Ergebnisse ergaben Folgendes: P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp-spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der Mikrodomänen moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001). P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen wird in Zusammenhang mit der Assoziation von Proteinen mit Mikrodomänen diskutiert (Zurzolo et al., 2003). Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native- und high resolution clear native-PAGE zeigte, dass beide P2XR mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war zusammen mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind (Weinhold et al., 2010). P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Diese Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Vermutlich führt die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den Mikrodomänen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin. Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phosphoinositiden PI(4)P, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 sowie mit Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin und 3 Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream-Signalen dar. Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream-Effektoren PKCβI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7(-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKCβI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf PKCβI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream-Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca2+-Einstrom aktiviert und reguliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass P2X4R und P2X7R in AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation mit unterschiedlichen Mikrodomänen an verschiedene Signalwege gekoppelt sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit dem P2X4R, wird der P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein. Barth K, Kasper M (2009) Membrane compartments and purinergic signalling: occurrence and function of P2X receptors in lung. FEBS J 276:341-353. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP (1997) Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem 272:6525-6533. Garcia-Marcos M, Perez-Andres E, Tandel S, Fontanils U, Kumps A, Kabre E, Gomez-Munoz A, Marino A, Dehaye JP, Pochet S (2006) Coupling of two pools of P2X7 receptors to distinct intracellular signaling pathways in rat submandibular gland. J Lipid Res 47:705-714. Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276:8409-8414. Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci 67:2631-2642. Zurzolo C, van Meer G, Mayor S (2003) The order of rafts. Conference on microdomains, lipid rafts and caveolae. EMBO Rep 4:1117-1121.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Die P2XR werden durch ATP aktiviert und stellen unselektive Kationenkanäle dar, die auch für Ca2+ durchlässig sind. Beiden P2XR-Subtypen werden in den Alveolarepithel Typ I (AT I)-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanalaktivitäten in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Bei bisherigen Untersuchungen wurde jedoch die mögliche Assoziation und Modulation der P2XR durch Mikrodomänen der Zellmembran außer Acht gelassen. Ein Modell von Garcia-Marcos zeigt, dass P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert ist. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R sind dabei von der Lokalisation in der Zellmembran abhängig (Garcia-Marcos et al., 2006). Die Caveolen sind eine spezielle Form von Mikrodomänen, die in der Zellmembran der AT I-Zellen auftreten. Das Hauptstrukturprotein der Caveolen im Lungenepithel ist Caveolin-1 (Cav-1). Über die Verteilung von P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen war bislang sehr wenig bekannt. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte bei einer Sequenzanalyse potentielle Cav-1-Bindemotive in der Aminosäureabfolge beider P2XR (Couet et al., 1997). Die Assoziation mit den Caveolen würde die P2XR in die räumliche Nähe verschiedener Signalmoleküle bringen und die Beteiligung an downstream Events ermöglichen. Für die folgenden Analysen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, da die E10-Zellen AT I-typische Eigenschaften besitzen und P2X4R, P2X7R sowie die Caveoline Cav-1 und Cav-2 aufweisen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR. Besonders wurde dabei auf die Assoziation der P2XR mit Cav-1 eingegangen. Zusätzlich wurde in vitro die Interaktion der C-terminalen Bereiche der beiden P2XR mit Membranlipiden untersucht. Einige Membranlipide sind eng mit weiteren Signalmolekülen verknüpft. Aus diesem Grund wurde die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca2+-aktivierbaren downstream-Effektoren PKCβI und CaM analysiert. Die Auswertungen der Ergebnisse ergaben Folgendes: P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp-spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der Mikrodomänen moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001). P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen wird in Zusammenhang mit der Assoziation von Proteinen mit Mikrodomänen diskutiert (Zurzolo et al., 2003). Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native- und high resolution clear native-PAGE zeigte, dass beide P2XR mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war zusammen mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind (Weinhold et al., 2010). P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Diese Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Vermutlich führt die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den Mikrodomänen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin. Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phosphoinositiden PI(4)P, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 sowie mit Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin und 3 Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream-Signalen dar. Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream-Effektoren PKCβI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7(-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKCβI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf PKCβI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream-Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca2+-Einstrom aktiviert und reguliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass P2X4R und P2X7R in AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation mit unterschiedlichen Mikrodomänen an verschiedene Signalwege gekoppelt sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit dem P2X4R, wird der P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein. Barth K, Kasper M (2009) Membrane compartments and purinergic signalling: occurrence and function of P2X receptors in lung. FEBS J 276:341-353. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP (1997) Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem 272:6525-6533. Garcia-Marcos M, Perez-Andres E, Tandel S, Fontanils U, Kumps A, Kabre E, Gomez-Munoz A, Marino A, Dehaye JP, Pochet S (2006) Coupling of two pools of P2X7 receptors to distinct intracellular signaling pathways in rat submandibular gland. J Lipid Res 47:705-714. Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276:8409-8414. Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci 67:2631-2642. Zurzolo C, van Meer G, Mayor S (2003) The order of rafts. Conference on microdomains, lipid rafts and caveolae. EMBO Rep 4:1117-1121.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Hypothèse : Notre équipe étudie le rôle, mal connu, du trafic membranaire dans le contrôle de l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT par les interférons (IFN), une voie clé du contrôle des processus cancéreux. La liaison de l’IFN-a à son récepteur IFNAR active les kinases JAK1 et TYK2 puis des transducteurs de signal comme STAT1, antiprolifératif, ou STAT3, qui a un pouvoir oncogénique. Le laboratoire a démontré récemment que le trafic membranaire d’IFNAR détermine la spécificité du signal des différents IFNs.L’objet de cette thèse est l’étude du rôle des cavéoles dans ce contrôle. Les cavéoles sont des invaginations membranaires enrichies en cholestérol et glycosphingolipides, formées par l’oligomérisation de la cavéoline1 (Cav1). Les cavéoles ou le gène CAV1 ont souvent été associés à la progression tumorale, notamment des cellules mammaires, mais ce rôle reste énigmatique et controversé. Le fait que IFNAR ait été détecté par biochimie dans des fractions de membrane enrichies en cholestérol et positives pour la cavéoline-1 chez la souris et le fait que l’expression du gène CAV1 ait été corrélée à l’action antitumorale de l’IFNa nous ont conduit à étudier le rôle des cavéoles dans l’action antitumorale des IFNs.Résultats: Le rôle putatif des cavéoles sur le contrôle de la voie JAK/STAT a été étudié dans des cellules murines MLEC n’exprimant pas Cav1 et dans des lignées humaines par interférence ARN contre Cav1. Nous avons pu démontrer que la présence de Cav1 régule de manière opposée deux étapes de la voie de signalisation de STAT3 activée par l’IFN-a. Par contre, ni l’activation de STAT1 par l’IFN-a ni celle de STAT3 par les autres IFNs ne nécessitent Cav1. Parallèlement, le laboratoire a montré que les cavéoles jouent un rôle capital dans la réponse cellulaire aux stress mécaniques en se dépliant lors d’un étirement membranaire, ce qui amortit la tension membranaire. Nous montrons qu’un tel stress mécanique par étirement module spécifiquement la signalisation de STAT3 par l’IFN-a d’une manière dépendante de Cav1 dans les cellules MLEC, suggérant pour la première fois un rôle de STAT3 et de l’IFN-a dans la mécanotransduction dépendante des cavéoles. Ce résultat permet aussi de relier les contraintes mécaniques présentes dans la masse tumorale et leur effet sur la progression tumorale. Perspectives : Les IFNs et la voie JAK/STAT sont bien caractérisés pour leur action antiproliférative, mais si l’IFN-a est utilisé en thérapeutique oncologique, les mécanismes de l’effet antitumoral sont mal connus. Nos résultats impliquent pour la première fois les cavéoles dans l’activation sélective du proto-oncogène STAT3 par l’IFN-a et proposent STAT3 comme un des nouveaux acteurs de la mécanotransduction par les cavéoles. Elucider les mécanismes moléculaires mis en jeu dans ces deux fonctions inédites des cavéoles devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la progression tumorale. / Hypothesis: Our team studies the poorly investigated role of membrane trafficking in the control of the activation of the JAK / STAT signaling pathway by interferons (IFN), a key mechanism in the control of tumorigenesis. The binding of the IFN-a to its receptor IFNAR activates the kinases JAK1 and TYK2 and then, signal transducers and activators of transcription including the antiproliferative STAT1 or the oncogenic STAT3. The laboratory demonstrated recently that the trafficking of IFNAR at the plasma membrane determines the signal specificity of the various IFNs.The goal of this thesis was to study the role of caveolae in this control. Caveolae are specialized membrane invaginations enriched in cholesterol and glycosphingolipids, formed by the oligomerization of their main structural protein, caveolin-1 (Cav1). Caveolae or the CAV1 gene have often been associated with tumorigenesis, in particular in mammary cancer cells, but this role remains enigmatic and controversial. The fact that IFNAR was previously found in Cav1-positive lipid microdomains and the fact that the expression of the CAV1 gene had been functionally linked to the antitumoral function of IFN-a led us to investigate the role of caveolae in the antitumoral function of the IFNs.Results: The putative role of caveolae in the control of the JAK / STAT signaling pathway have been studied in murine lung endothelial MLEC cells that do not express Cav1 and in a human lineage by RNA interference against Cav1. We were able to demonstrate that the presence of Cav1 regulates in an opposite manner two stages of the signaling pathway of STAT3 activated by the IFN-a whereas the activation of STAT1 by IFN-a, or STAT3 by the other type I and II IFNs do not require Cav1.At the same time, the laboratory showed that caveolae play a major role in the cellular answer to mechanical stress by flattening during a membrane stretching, thus buffering the membrane tension. We show that mechanical stress by uniaxial cell stretching modulates specifically the signaling pathway of STAT3 activated by the IFN-a in a Cav1-dependant manner in MLEC cells. This result suggests for the first time a role of STAT3 and of IFN-a in caveolae-driven mechanotransduction. This result also allows us to link the mechanical constraints found in the tumoral mass to their effect on tumorigenesis.Prospects:The IFNs and the JAK / STAT signaling pathway protect the cells from tumorigenesis, but although IFN-a is used in oncology, the mechanisms of its antitumoral effect are poorly known. Our results involve for the first time caveolae in the selective activation of the proto-oncogenic STAT3 by the IFN-a and allow us to propose STAT3 and the IFN-a as new actors of the mechanotransduction by caveolae. Clarifying the molecular mechanisms involved in these two new functions of caveolae should allow us to identify new therapeutic targets in tumorigenesis.

Oxisteróis (por exemplo, 7hidroxicolesterol) são gerados por modificações oxidativas que ocorrem na molécula de colesterol. Podem ser encontrados em elevados níveis plasmáticos em pacientes com aterosclerose e como componentes da placa aterosclerótica. Considerando que o colesterol é o principal componente da cavéola (domínios específicos da membrana plasmática que ancoram diversas proteínas de sinalização) formulamos a hipótese que os oxisteróis podem ser incorporados a estes domínios, interferindo com as vias de sinalização aí localizadas. Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) em cultura foram expostas a 7hidroxicolesterol (10g/mL) por diferentes tempos. Analisamos a incorporação desse oxisterol à cavéola utilizando espectrometria de massa e a atividade das proteínas de sinalização presentes neste domínio: óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), CD40/CD40L, receptor do fator de crescimento de fibroblastos (rFGF), utilizando PCR quantitativo e imunoblots. Inicialmente mostramos que o 7hidroxycholesterol, em concentrações fisiológicas, foi incorporado às cavéolas mais acentuadamente que em outros domínios de membrana. Esse fenômeno impediu o desligamento entre eNOS e caveolina, prejudicando a função dessa enzima. Também mostramos que o receptor CD40 apresentou uma maior incorporação à cavéola e o rFGF manteve uma ativação mais longa quando células foram expostas ao 7hidroxicolesterol. Esses efeitos gerados pelo oxisterol não estavam relacionados à sua ação sobre mediadores inflamatórios ou receptores nucleares, desde que nenhuma diferença foi observada no perfil de citocinas ou na expressão de genes dependentes da ativação de LXR. Assim, concluímos que a incorporação de 7hidroxycholesterol nos domínios de cavéola pode interferir com vias de sinalização sabidamente envolvidas na aterogênese ou na ruptura da placa / Oxysterols (for example, 7hidroxycholesterol) are generated by oxidative modifications to cholesterol molecules. They have been described in high levels in patients with atherosclerosis and as components of the atherosclerotic plaque. Since cholesterol is the main component of caveolae (plasma membrane domains that anchor several signaling proteins), we hypothesized that oxysterol could be incorporated to these domains, interfering with the signaling networks that use this pathway. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in culture were exposed to 7hidroxycholesterol (10g/mL) for different times. We analyzed incorporation of this oxysterol to caveolae using mass spectroscopy and the activity of signaling pathways present in these domains: endothelial nitric oxide synthase (eNOS), CD40/CD40L, fibroblast growth factor receptor (FGFr), using quantitative PCR and immunoblots. Initially we showed that 7hidroxycholesterol, in physiological concentrations, was incorporated to caveolae more prominently than to other plasma membrane domains. This phenomenon caused a difficulty in eNOS release from caveolin, impairing its function. We also showed that the receptor CD40 presented a stronger incorporation to caveolae and FGFr maintained a longer activation when cells were exposed to 7hidroxycholesterol. These oxysterol effects were not related to its action in inflammatory mediators or nuclear receptors, since no difference could be observed in cytokine profiles or in the expression of genes dependent on LXR activation. Therefore we conclude that 7hidroxycholesterol incorporation in caveolae domains may interfere with signaling pathways known to be involved in atherogenesis or in plaque rupture

Recent studies suggest that cardiomyocyte membrane microdomains, caveolae and transverse tubules, play a key role in cardiac arrhythmia. Mutation of caveolin-encoding genes CAV3, co-expressed with genes of caveolae ion channels, leads to a late persistent sodium currents and delayed repolarization stage, called LQT9 disease. A simplified three-current model is created to largely reduce the well-known Pandit rat ventricular myocyte model. The mathematical tractability of the three-current model allows us to conduct asymptotic analysis and efficiently estimate action potential duration. Improvement in the description of the mechanism for caveolae sodium current is incorporated into the three-current model utilizing a probability density approach for the four-state caveolae neck-channel coupling. The prolongation of action potentials and the formation of potential arrhythmia are shown to arise if caveolae neck open probability varies. A minimal model of the Ca2+ spatial distribution of CICR units illustrates the transverse tubule remodeling in failing myocyte causes dysfunction in the Ca2+ profile. With regards to discrimination of protein localization, which is widely used in biological experiments, the bagging pruned decision tree algorithm is tested to be one of the algorithms with best performance on the large data set, and it succeeds in extracting information to be highly predictive on test data. Parallel computation technique is applied to accelerate the speed of implementation in K-nearest neighbor learning algorithms on big data sets.