Poly-(ADP-ribsoyl) Polymerases (PARPs) are a superfamily of enzymes comprised of 17 known isoforms. PARP inhibitors (PARPi) have shown success in clinical trials for the treatment of homologous recombination-deficient cancers. Though proven effective initially, tumors treated with PARPi eventually develop resistance. Combinatorial therapeutics targeting PARP and other pathways that may re-sensitize tumors to PARP inhibition, including PI3K/AKT/mTor pathway, and cell-cycle checkpoints (such as CDKs, CHK, and Wee) are being tested. In this context, the synthetic lethality of cyclin-dependent kinase 1 (CDK1) and PARP1 is known. Evaluation of PARP1 and CDK1 pharmacophores led to the development of the tetrahydro-arylazepinone (TAAP) scaffold as a potential dual PARP1/CDK1 inhibitor. We screened a handful of TAAP analogs against PARP1 in a cell-free assay that identified the low micromolar PARP1 inhibitor 1,2,3,4-tetrahydro-5H-benzo[e][1,4]-diazepin-5-one (TBAP), which served as the lead compound. The analogous 1,2,3,4-tetrahydro-5H-pyrido[2,3-e][1,4]-diazepin-5-one (TPAP) series showed a similar bioactivity profile. Satisfyingly, the N1-benzyl TPAP analogue showed activity in the low nanomolar range. The TAAP series (i.e., 6/7-membered scaffold) unfortunately lacked CDK1 inhibitory activity. Finally, many PARPi's show poor isoform-selectivity. The development of isoform-selective PARPi can clarify the specific function of each PARP isoform and may reduce the adverse side effects shown by PARPi. A handful of TAAP analogs were screened against 13 PARP isoforms, where some compounds demonstrated exquisite PARP1/2 selectivity. Concurrently, we discovered an inhibitor for PARP11, an isoform that lacks any known synthetic ligand. Future directions are suggested towards fine-tuning the structure-activity relationship of TAAP-isoform selective PARPi as well as developing a dual PARP1/CDK1 inhibitor. / Master of Science / The aim of this work is to explore the therapeutic potential of poly-(ADP-ribosyl) polymerase inhibitors (PARPi) for the treatment of ovarian and breast cancer, specifically triple negative breast cancer. Poly-(ADP-ribsoyl) Polymerases (PARPs) are a superfamily of enzymes comprised of 17 known isoforms. Currently, there are three FDA approved PARPi - olaparib, isoforms. Further, tumors have been shown to develop resistance to PARPi. Herein, we explored the 1,2,3,4-tetrahydro-5H-aryl[1,4]diazepin-5-one scaffold as a potential PARP1/2-selective rucaparib, and niraparib; however, these PARPi demonstrate non-selectivity amongst the PARP inhibitor and its possibility for targeted pharmacology with other kinases.

No description available.

No description available.

Activation of the MAPK cascade during mitosis is critical for spindle assembly and normal mitotic progression. The underlying regulatory mechanisms that control activation of the MEK/MAPK cascade during mitosis are poorly understood. The goal of my dissertation research is to identify the MEK kinase responsible for activation of the MAPK cascade during mitosis and to elucidate the biochemical mechanisms that regulate its activity. In the described herein work I purified and characterized the MEK kinase activity present in M-phase arrested Xenopus egg extracts. I demonstrate that B-Raf is the critical MEK kinase required for activation of the MAPK pathway at mitosis. Consistent with this, I show that B-Raf is activated in an M-phase dependent manner. Further, I provide data linking Cdk1/cyclin B to mitotic activation of B-Raf. Cdk1/cyclin B associates with and phosphorylates B-Raf in M-phase arrested extracts and directly targets Xenopus B-Raf in vitro at a conserved Ser-144 residue. Phosphorylation at Ser-144 is critical for M-phase dependent activation of B-Raf and for B-Raf's ability to trigger activation of the MAPK cascade at mitosis. Finally, I demonstrate that mitotic B-Raf undergoes feedback phosphorylation by MAPK at its conserved C-terminal SPKTP motif. Mutation of both phosphorylation sites within the SPKTP sequence to alanines increases activity of mitotic B-Raf. Further, inhibition or over-activation of MAPK during mitosis enhances or diminishes B-Raf activity, respectively. These results indicate that MAPK-mediated feedback phosphorylation negatively regulates B-Raf activity. Additionally, I show that active mitotic B-Raf exists in large multi-protein complex(s). By utilizing a proteomics approach I identify a set of proteins, which potentially associate with B-Raf at M-phase. Future studies are necessary to elucidate the involvement of these proteins in regulating B-Raf mitotic functions. In summary, my dissertation studies demonstrate that B-Raf activates MAPK signaling at mitosis and undergoes an M-phase dependent regulation. I propose that B-Raf has important functions at mitosis that contributes to its overall role in promoting cell proliferation.

L'exigence principale du cycle cellulaire est une coordination étroite entre l'achèvement du processus de réplication et l'entrée des cellules en mitose, afin de maintenir l'intégrité génétique, l'identité et à la survie cellulaire. Toutes les cellules somatiques exécutent de manière reproductible une phase G2 intermédiaire, d'une durée constante pendant les divisions cellulaires successives au sein d'un type cellulaire donné. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent précisément sa durée au cours d'un cycle cellulaire non perturbé, restent mal caractérisés. La kinase Cycline B1-Cdk1, facteur universel permettant l'entrée en mitose, est sous le contrôle, chez les mammifères, d'un ensemble de régulateurs directs, les kinases inhibitrices Wee1 et Myt1 et les phosphatases activatrices Cdc25A, B et C. Son activation soudaine, en fin de phase G2, révèle qu'une modification rapide de l'équilibre entre ses régulateurs opposés prend place par des mécanismes moléculaires qui restent à élucider. Dans ce cadre, j'ai étudié le rôle potentiel de la kinase Polo-like kinase 1 (Plk1) pour l'initiation de l'activation de Cycline B1-Cdk1. Bien que les rôles de Plk1 au cours de la mitose soient bien caractérisés, sa contribution dans la régulation de l'entrée des cellules en mitose reste controversée. Au niveau moléculaire, Plk1 phosphoryle au moins in vitro, plusieurs régulateurs de Cycline B1-Cdk1, tels que Cdc25B & C, et Wee1 et Myt1. Cependant, il reste largement inconnu si ces événements de phosphorylation se produisent in vivo et s'ils contribuent de manière significative au processus de l'activation de Cycline B1-Cdk1 permettant l'entrée en mitose. / A main requirement of the cell cycle is a tight coordination between the completion of the replication process and entry into mitosis in order to maintain genetic integrity and the identity and survival of cell progeny. All somatic cells reproducibly execute an intermediate G2 phase of constant duration during successive cell divisions in a given cell type. However the molecular mechanisms controlling precisely its duration during unperturbed cell cycle remains poorly characterized. In this context, the main objective of my PhD project was to decipher signaling pathways controlling entry into mitosis during normal cell cycles as well as their spatiotemporal regulation. CyclinB1-Cdk1, the universal master mitotic driver, is under the control of direct inhibitors (Wee1 and Myt1) and activators (Cdc25A, B and C). Previously, it was determined that CyclinB1-Cdk1 is suddenly activated in very late G2 phase, suggesting that a rapid modification in the equilibrium between its opposite regulators is reproducibly taking place in late G2 by poorly elucidated mechanisms. During my PhD, I investigated the potential role of Polo-like kinase 1 (Plk1) in the initial activation of CyclinB1-Cdk1. Even though its roles during mitosis are well characterized, its contribution for the regulation of entry into mitosis remains controversial. At the molecular level, Plk1 was shown to phosphorylate at least in vitro, several regulators of CyclinB1-Cdk1 including Cdc25B&C, and Wee1 and Myt1. However, it remains largely unknown if these phosphorylation events are taking place in vivo and whether they significantly contribute to the activation process of CyclinB1-Cdk1 leading to mitotic entry.

Le cycle cellulaire eucaryote se divise en une série de phases ordonnées qui ont pour finalité la division cellulaire. Ce processus est primordial dans la prolifération des cellules normales et le développement, mais il est aussi très fortement dérégulé dans les cellules cancéreuses. Les phases de cycle cellulaire sont différenciées par les tâches effectuées au cours de celles-ci et requièrent l’expression de gènes spécifiques à chacune des phases. Chez l’humain, il existe environ 1000 gènes dont l’expression est dépendante de la phase du cycle cellulaire. Les mécanismes impliqués dans le contrôle de l’expression périodique de ces gènes ont principalement été étudié aux niveaux transcriptionnels et post-traductionnels. Cependant, la régulation post-transcriptionnelle demeure encore peu étudiée dans le contexte du cycle cellulaire, malgré son importance dans le contrôle de l’expression génique. Afin d’identifier des régulateurs post-transcriptionnels du cycle cellulaire, nous avons analysé la corrélation existante entre l’expression des gènes périodiques du cycle cellulaire et celle de 687 protéines liant l’ARN (RNA-binding protein; RBP) sur plus de 1000 spécimens de cancer du sein. Cette analyse nous a permis d’identifier 39 RBP dont les protéines Nuclear Factor 45 (NF45) et Nuclear Factor 90 (NF90). NF45 et NF90 forment un hétérodimère qui lie des structures d’ARN double brin et qui contrôle l’expression génique à différents niveaux de l’épissage à la stabilisation des ARNm. La déplétion de NF45 ou NF90 inhibe la prolifération des cellules en induisant de nombreux défauts mitotiques qui résultent d’une baisse d’expression de plusieurs gènes essentiels à la mitose. D’autre part, à l’aide d’une méthode de protéomique nous avons réalisé l’interactome du complexe NF45-NF90 afin de déterminer à quels niveaux ce mécanisme de régulation prend place et avons identifié une interaction avec le complexe Staufen1/2-UPF1 responsable de la dégradation des ARNm. Ainsi, les niveaux d’expression de certains ARNm importants à la mitose sont conditionnés par une compétition entre NF45-NF90 et Staufen1/2 pour la liaison à ces ARNm. Dans une seconde étude, nous avons recherché les régulations potentielles sur NF45 et NF90 au cours du cycle cellulaire et avons i découvert des évènements de phosphorylation sur NF90 prenant place en phase G2/M. Nous avons montré que cette phosphorylation est médiée par CDK1, et l’activation de CDK1 provoque la translocation de NF90 du noyau vers le cytoplasme. Enfin, au vu de l’implication du complexe NF45-NF90 dans la prolifération des cellules cancéreuses, nous avons réalisé un essai de criblage à haut débit de 120 000 molécules sur l’interaction entre NF45 et NF90. Cet essai nous as permis d’identifier plus de plus 1000 molécules pouvant potentiellement interférer avec le complexe NF45-NF90. Parmi celles-ci, nous avons retrouvé 14 molécules de la famille des glycosides cardiaques, qui sont des composés antiarythmiques mais qui par ailleurs possèdent des effets anticancéreux décrits depuis plusieurs décennies. De façon intéressante, le traitement des cellules à ces composés mène à un phénotype mitotique très similaire à la déplétion de NF45 ou NF90, suggérant une implication du complexe NF45-NF90 dans les effets antimitotiques induits par les glycosides cardiaques. En conclusion, ces études nous ont permis d’éclairer le rôle du complexe NF45-NF90 dans la prolifération cellulaire, mais aussi d’approfondir la compréhension des différents mécanismes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. / The eukaryotic cell cycle is divided into a series of ordered phases leading to cell division. This process is essential in normal cell proliferation and development, but it is also largely deregulated in cancer cells. Cell cycle phases are differentiated by the different molecular processes performed and expression of specific genes at each phase is determinant. In humans, there are approximately 1000 genes that are periodically expressed throughout the cell cycle. Control of this periodic expression has been well characterized at the transcriptional and post-translational levels. However, post-transcriptional regulation remains little studied in the context of the cell cycle, despite its importance in the control of gene expression. In order to identify post-transcriptional cell cycle regulators, we have correlated the expression of cell cycle genes with the expression of 687 RNA-binding proteins (RBP) in more than 1000 breast cancer specimens. This analysis allowed us to identify 39 RBPs, including Nuclear Factor 45 (NF45) and Nuclear Factor 90 (NF90). NF45 and NF90 form a heterodimer that binds double-stranded RNA structures and controls gene expression at various levels, from splicing to stabilization of mRNAs. Depletion of NF45 or NF90 inhibits cell proliferation by inducing several mitotic defects resulting from decreased expression of many genes essential for mitosis. In order to determine at which levels this regulatory mechanism takes place, we performed a proteomic method to identifyNF45-NF90 proximal interactors and identified an interaction with the Staufen1/2-UPF1 complex responsible for the degradation of mRNAs. Thus, it appears that the expression of some mitotic mRNAs is controlled by a competition between NF45-NF90 and Staufen1/2 for binding to these mRNAs. In a second study, we looked for potential regulations on NF45 and NF90 during the cell cycle and found phosphorylation events on NF90 taking place in the G2/M phase of the cell cycle. We have shown that this phosphorylation is CDK1-dependent, and that CDK1 activation leads to the translocation of NF90 from the nucleus to the cytoplasm. Finally, based on the involvement of the NF45-NF90 complex in cancer cell proliferation, we carried out a high-throughput screening assay of 120,000 ii. Abstract ii molecules on the interaction between NF45 and NF90. This assay allowed us to identify more than 1000 molecules that could potentially interfere with the NF45-NF90 complex. Amongst them, we found 14 molecules belonging to the cardiac glycoside family, which are antiarrhythmic drugs that also display anticancer effects. Interestingly, treatment with cardiac glycosides leads to a mitotic phenotype very similar to the depletion of NF45 or NF90, suggesting an involvement of the NF45-NF90 complex in the antimitotic effects induced by cardiac glycosides. In conclusion, these studies have shed light on the role of the NF45-NF90 complex in cell proliferation, but also deepened our understanding of the different mechanisms involved in cell cycle control.

No description available.

La ségrégation des chromosomes est un processus complexe permettant la division égale du matériel génétique entre les cellules filles. Contrairement aux cellules somatiques, ce processus est sujet à des erreurs dans les cellules germinales telles que les ovocytes. Lorsque des erreurs surviennent lors de la ségrégation des chromosomes durant la méiose cela peut conduire à une aneuploïdie. L’aneuploïdie est la présence d’un nombre incorrect de chromosomes dans une cellule et est connue pour causer l’infertilité et des arrêts de grossesses chez l’humain. L’incidence de l’aneuploïdie augmente avec l’âge maternel (1). Le kinétochore est une structure cellulaire impliqué dans la ségrégation des chromosomes. Il est composé de plus de 100 protéines et se situe entre les microtubules et les centromères. Les microtubules se lient aux kinétochores, et ces derniers s’attachent sur les centromères afin de séparer les chromosomes homologues durant la méiose et les chromatides des sœurs pendant la mitose (1–3). Dans les cellules somatiques, cette structure est bien connue (2). Pourtant, moins d’informations sont connues à dans l’ovocyte de mammifère en développement au cours de la méiose I (3,4). Ce projet vise à étudier le rôle du kinétochore durant la ségrégation des chromosomes dans l’ovocyte de souris en développement. Plus spécifiquement, l’assemblage, le désassemblage, la dynamique et la tension des protéines du kinétochore seront évalués. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle du kinétochore durant la méiose I, ses implications durant la séparation des chromosomes, et éventuellement ses implications dans l’aneuploïdie. / Chromosome segregation is an intricate process in dividing genetic material equally between daughter cells. This process, unlike in somatic cells, is error prone in germ cells like the oocyte. When errors occur during meiosis in segregating chromosomes, aneuploidy results when the cell has an incorrect number of chromosomes. This can result in infertility and birth defects in human reproduction. The incidences of aneuploidy are also seen to increase with increasing maternal age (1). The kinetochore is a cellular structure at the heart of chromosome segregation. It is composed of more than 100 proteins and is located between the microtubules and the centromeres. The microtubules attach onto the kinetochores, which themselves attach onto the centromeres, in order to pull the homologous chromosomes apart during meiosis and the sister chromatids during mitosis (1–3). Much is known about this multi-protein structure in somatic cells (2). Yet, very little is known about this in the developing mammalian oocyte during Meiosis I (1,3,4). This project aims to investigate the role of the kinetochore in chromosome segregation in a developing mouse oocyte. More specifically, kinetochore protein assembly, disassembly, dynamics and tension will be assessed. This project will achieve a better understanding of the kinetochore’s role in Meiosis I, its implications in chromosome segregation in a developing mouse oocyte, and how it may be involved in aneuploidy.

No description available.

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices. / Proteins are the end-products of gene interpretative machinery. Proteins serve essential roles in defining the structure, integrity and dynamics of the cell and mediate most chemical transformations needed for everything from metabolic catalysis to signal transduction. We know that the central dogma of molecular biology, one gene = one mRNA = one protein is a gross simplification and that a protein may do different things depending on the form in which its mRNA was spliced, how and where it is post-translationally modified, what conformational state it may be in or finally, which other proteins it may interact with. Formation of protein complexes may, themselves, be governed by the states in which proteins are expressed in specific cells, cellular compartments or under specific conditions or dynamic phases such has growth or division. Protein complexes involved in mitotic cell cycle regulation are particularly challenging to dissect since they could only form during specific phases of the cell cycle, are highly regulated by post-translational modifications and can be found in any subcellular compartments. To date, no general methods have been developed to allow fine dissection of these protein complexes. The goal of this thesis was to establish and demonstrate a novel strategy for dissecting protein complexes regulating the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) mitotic cell cycle. In this thesis, I describe my development and optimization of a simple survival-selection Protein-fragment Complementation Assay using the prodrug-converting enzyme, yeast cytosine deaminase as reporter (OyCD PCA). I further describe, in a series of proof of principle studies, applications of the OyCD PCA to dissect the mechanism of transcriptional activation by key mitotic transcription factors and to dissect protein-protein interactions (PPIs) among regulators of the mitotic cell cycle. A key feature of the OyCD PCA is that it can be used to detect both formation and disruption of PPIs by virtue of having positive readouts for both assays. I applied the OyCD PCA in a strategy to dissect interactions between the key transcription factors of the G1/S phase: SBF and MBF. These two heterodimeric transcription factors are composed of, respectively, two distinct DNA-binding subunits named Swi4 and Mbp1 and a common transcription activation subunit called Swi6. I took advantage of the dual selection by OyCD PCA to engineer a specific mutant of Swi6 in order to demonstrate the rewiring of a transcriptional network. We isolated Swi6 with mutations found in its C-terminal domain previously identified for binding Swi4 and Mbp1 and important for SBF and MBF activities. Our results support a model where Swi6 undergoes a conformational change upon binding to Swi4 or Mbp1. In addition, this Swi6 mutant was used to dissect the regulatory mechanism that governs the entry of S. cerevisiae to a new round of cell division also known as START. We found that the SBF and MBF repressor Whi5 directly binds to the C-terminal domain of Swi6. Finally, I applied the OyCD PCA to dissect the yeast cyclin dependent kinase Cdk1-protein complexes. Cdk1 is the essential kinase that regulates cell cycle progression and can phosphorylate a large number of different substrates by teaming up with one of nine cyclin regulatory proteins (Cln1-3, Clb1-6). I describe a strategy to identify interaction partners of Cdk1 that can easily be scaled up for a genome-wide screen and associate the complexes with the appropriate cyclin(s) required for mediating the interaction using the OyCD PCA and deletion of the cyclin genes. My results allow us to postulate which phase(s) of the mitotic cell cycle Cdk1 may phosphorylate proteins and what function potential or known substrates of Cdk1 may take on during that phase(s). For example, we identified the interaction between Cdk1 and the γ-tubulin (Tub4) to be dependent upon Clb3, consistent with its role in mediating nucleation and growth of mitotic microtubule bundles on the spindle pole body. This strategy can also be applied to study other PPIs that are contingent upon accessory subunits.