<p><h2> </h2></p> <p>Telomeres are protein-DNA complexes found at the ends of human chromosomes. The function of telomeres is to protect chromosome ends from being recognized as damaged DNA. This protection is essential in preventing the erosion of telomeres, which has been shown to lead to genomic instability, a hallmark of cancer and aged cells. Precise regulation of telomere length and function is crucial to cell survival, and defects in this regulation are related to tumorigenesis and aging related disorders. The proteins that bind telomere DNA play an indispensable role in telomere maintenance. TRF1, <em>t</em>elomere <em>r</em>epeat binding <em>f</em>actor 1, is a protein that directly binds to mammalian telomeric DNA and participates in regulating telomere length. Post-translational modifications, such as phosphorylation, have been shown to modulate TRF1 function. The results presented here demonstrate that two phosphorylation sites on TRF1, S367 and T371, are involved in regulating the function and localization of TRF1. TRF1 S367 is phosphorylated by ATM, and this phosphorylation removes TRF1 from telomere DNA and directs TRF1 to sites of proteasome degradation. On the other hand, the phosphorylation of TRF1 at T371 prevents the association of TRF1 with telomere DNA but also protects TRF1 from degradation. We have demonstrated that the phosphorylation of T371 by CDK1 is important for the resolution of sister chromatids in mitosis. In interphase cells, in response to the induction of DNA damage, TRF1 phosphorylated at T371 is recruited to sites of damage and is involved in promoting efficient homologous recombination and in conferring checkpoint activation and cell survival. The work presented within this thesis sheds light on the regulation of TRF1 function by phosphorylation events and reveals novel functions of TRF1.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

L’inhibition, par p16INK4a, de la progression du cycle cellulaire est considérée comme liée à un arrêt de la progression en phase G1 du à l’inhibition de l’activité de CDK4/6. Nous montrons que l’expression ectopique de p16INK4a dans trois lignées cellulaires malignes, p16-/- et pRb+/+, issues de tissus différents, provoque un allongement de la durée de la phase S et du cycle cellulaire total. L’ensemble de nos travaux sur p16INK4a sauvage et son mutant p16G101W indique que p16INK4a induit un allongement de la phase S i) indépendamment de l’origine tissulaire des cellules analysées et ii) en partie lié aux conséquences de l’inhibition de l’activité de CDK4/6 et peut-être des MAP-kinases. Dans sa localisation nucléaire, p16INK4a interviendrait dans la régulation du cycle cellulaire indépendamment de sa liaison à CDK4. L’expression de CDK1 est inhibée par p16INK4a dans les trois lignées analysées. Dans les cellules MCF7 et U87, cette inhibition est post-transcriptionnelle, médiée par la région 3’non traduite de l’ARNm de CDK1, et est associée à une modification de l’équilibre d’expression, tissu-spécifique, des microARN régulant potentiellement CDK1. Nous démontrons que CDK1 est une cible de miR- 410 et miR-650 induits par p16INK4a et le rôle de l’inhibition de la voie pRb/E2F par p16INK4a dans l’induction de miR-410. Ainsi, p16INK4a régule l’expression des gènes à différents niveaux en modifiant l’équilibre fonctionnel des facteurs de transcription et, en conséquence, des miARN. / The inhibition of cell cycle progression by p16INK4a, have been considered to result from arrest in G1 phase due to inhibition of CDK4/6 activity. We show that ectopic expression of p16INK4a in three human malignant cell lines, p16-/- and pRb +/ +, derived from different tissues, led to an increase in the length of S phase and of the entire cell cycle. Our studies using wild-type p16INK4a and p16G101W mutant indicated that p16INK4a induces a lengthening of S phase i) independently of tissue origins and ii) partly linked to the inhibition of CDK4/6 activity and possibly MAP-kinases. In the nucleus, p16INK4a may intervene in regulating the cell cycle independently of binding to CDK4. The expression of CDK1 is inhibited by p16INK4a in three cell lines analyzed. In MCF7 and U87cells, this inhibition is post-transcriptional, mediated by the 3' non translated region of CDK1 mRNA, and is associated with changes in the balance of the expression of microRNAs, which regulate potentially CDK1. We demonstrate that CDK1 is a target of miR-410 and miR-650, both induced by p16INK4a and the role of the inhibition of pRb/E2F pathway by p16INK4a in the induction of miR-410. Thus, p16INK4a regulates gene expression at different levels by modifying the functional balance of transcription factors and, consequently, the microRNAs

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Development of bovine embryos produced by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is low compared to fertilized embryos. Deficient oocyte activation, inappropriate sperm capacitation, and lack of sperm decondensation are thought to be the main constrains affecting ICSI success in cattle. In the present study, activation compounds were tested to establish an effective protocol for activation of bovine oocytes, and then used for oocyte activation after ICSI. The activation approach consisted of exposing in vitro matured oocytes to Ionomycin (ION) following by a specific CDK1 inhibitor (RO-3306), a specific PKC activator (OAG) or both RO+OAG. In the first experiment, the rate of activation (pronuclear (PN) formation), cleavage, development to the blastocyst stage, and number of cells per blastocyst were evaluated after oocyte treatment. The PN rates were higher (P≤0.01) in the groups activated with ION+RO (48.5 %) and ION+RO+OAG (65.6 %) compared to ION (12.3 %) and ION+OAG (9.2 %). There was no significant effect between the RO concentrations tested (5, 7.5 and 10 μM) on oocyte activation. The PN rate was significantly higher (P≤0.01) when oocytes were exposed to RO for 240 min (84.6 %) compared to 60 (53.6 %) and 120 min (60.0 %). However, there was no difference between groups when treatment with RO started at 0, 30 or 60 min after on ION exposure. Cleavage rate was higher in ION+RO (70.2 %) and ION+RO+OAG (62.4 %) groups compared to ION (11.8 %) and ION+OAG (22.8 %). Blastocyst rate was also higher in the ION+RO+OAG (24.1 %) group, but not statistically different between ION+RO (19.7 %) and ION+OAG (9.5 %) groups. There was no development to the blastocyst stage after treatment with ION alone. The average cell number in blastocysts was not statistically different among treatments. In the second experiment, the effect of activation with ION+RO (10 μM for 240 min) was tested after ICSI using control (ICSI-Cont) or treated by electroporation (ICSI-El) sperm. Most oocytes presented a well-developed female PN (66.4%). Male PN formation was higher (P≤0.05) in the ICSI-El (33.3%) compared to the ICSI-Cont (9.4%) group. In conclusion, this study revealed that the specific inhibition of CDK1 after ION treatment is an effective approach to activate bovine oocytes. Male pronuclear formation after ICSI is increased by sperm electroporation, but is lower than female pronuclear formation. This indicates that deficient sperm decondensation and male PN formation rather than deficient oocyte activation is likely the main problem to develop an effective protocol for bovine ICSI. / O desenvolvimento de embriões bovinos produzidos por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) é baixo em relação aos embriões fertilizados. Deficiência na ativação de oócitos, capacitação inadequada de espermatozóides e falta de descondensação de espermatozóides são os principais transtornos que afetam o sucesso de ICSI em bovinos. No presente trabalho, foram testados métodos de ativação com o intuito de estabelecer um protocolo efetivo para a ativação de oócitos bovinos após a ICSI. Para isso, um inibidor específico de CDK1 (RO-3306) e um ativador específico de PKC (OAG) foram utilizados após a incubação com Ionomicina (ION) para avaliar a retomada da meiose em oócitos bovinos. Além disso, a incubação em meio Fert durante 6 h e a eletroporação (El) de espermatozoides previamente a ICSI foram testadas para verificar o efeito sobre a descondensação do espermatozoide e formação do pró-núcleo (PN) masculino. Inicialmente oócitos bovinos foram incubados, com diferentes concentrações e períodos de exposição aos tratamentos. Foram avaliados conforme a taxa de ativação oocitária (formação de PN), clivagem, desenvolvimento a blastocisto e número de células nos embriões que se desenvolveram a blastocisto. As taxas de PN foram maiores (P≤0,01) nos grupos ativados com ION+RO (48,5 %) e ION+RO+OAG (65,6 %) comparado com ION (12,3 %) e ION+OAG (9,2 %). Não houve efeito significativo entre as concentrações 5,0, 7,5 e 10,0 μM de RO sobre a taxa de ativação. A taxa de ativação foi significativamente maior (P≤0,01) em oócitos tratados com RO por 240 min (84,6 %) comparado a 60 (53,6 %) e 120 min (60,0%). No entanto, não houve diferença significativa na taxa de ativação quando o tratamento com RO foi iniciado a 0, 30 ou 60 minutos após a incubação com ION. A taxa de clivagem foi inferior nos grupos ION (11,8 %) e ION+OAG (22,8 %) comparada aos grupos ION+RO (70,2 %) e ION+RO+OAG (62,4 %). A taxa de blastocistos também foi maior no grupo ION+RO+OAG (24,1 %), mas não houve diferença estatística entre os grupos ION+RO (19,7 %) e ION+OAG (9,5 %). Não houve desenvolvimento a blastocisto quando os oócitos foram tratados somente com ION. Não foi detectada diferença estatística entre os tratamentos sobre o número médio de células por blastocistos. No segundo experimento, espermatozoides não tratados (ICSI-Cont) ou tratados por electroporação (ICSI-El) foram microinjetados em oócitos, os quais foram ativados com ION+RO por 240 min e fixados cerca de 15 h após a injeção para determinar a taxa de formação de PNs masculino e feminino (2PN). A maioria dos oócitos apresentaram o PN feminino bem desenvolvido (66,4 %). A formação de 2PN (masculino e feminino) foi maior no grupo ICSI-El (33,3 %) comparado ao grupo ICSI-Cont (9,4 %). Em conclusão, esse estudo demonstrou que a inibição específica da CDK1 após o tratamento com ION promove a ativação de oócitos bovinos. O tratamento de espermatozoides com eletroporação melhora a formação do PN masculino após ICSI, mas a taxa é inferior a formação do PN feminino. Esses resultados indicam que a deficiente descondensação do espermatozoide é o principal limitante para estabelecer um protocolo eficaz para ICSI em bovinos.

L’équipe a identifié une nouvelle GAP de RhoA, ARHGAP19, majoritairement exprimée dans le système hématopoïétique. Le projet a consisté à étudier la régulation de cette protéine dans des lymphocytes T humains. Pour cela, les analyses se sont portées sur la phosphorylation d’ARHGAP19 et sur sa localisation au cours de la division des lymphocytes T. ARHGAP19 est phosphorylée par l’effecteur de RhoA, la protéine kinase ROCK, sur la Sérine 422 et par la protéine kinase mitotique CDK1 sur les Thréonines 404 et 476. La phosphorylation par ROCK permet à ARHGAP19 d’interagir avec la famille de protéines 14-3-3 qui la protège des déphosphorylations pouvant avoir lieu au cours de la division cellulaire. L'ensemble des phosphorylations est primordial pour la régulation de la localisation cellulaire d'ARHGAP19 et contribue à une division cellulaire correcte. En effet, en absence de phosphorylation, on observe des défauts lors de la cytodiérèse entrainant la formation de cellules multinucléées. De plus, des dérégulations de RhoGTPases comme l’absence de GAP, sont aujourd’hui mises en évidence dans les cancers. C’est pourquoi nous avons généré des souris arhgap19 KO pour étudier les conséquences de l’absence du gène codant pour ARHGAP19, dans le système hématopoïétique murin. L’ensemble des cellules progénitrices et matures intervenant dans l’hématopoïèse murine a été analysé. Par ce modèle d’invalidation conditionnelle d’arhgap19, aucun rôle majeur de la protéine n'a été mis en évidence mais les résultats suggèrent une implication aux différents stades de la différenciation hématopoïétique et un impact sur l'ensemble des populations de ce système. / The team identified a new GAP of RhoA, ARHGAP19, mostly expressed in the hematopoietic system. The project consisted in studying the regulation of this protein in human T lymphocytes. For this, the analyzes focused on the phosphorylation of ARHGAP19 and on its localization during the division of the T lymphocytes. ARHGAP19 is phosphorylated by the effector of RhoA, the protein kinase ROCK, on the Serine 422 and by the protein CDK1 mitotic kinase on Threonines 404 and 476. ROCK phosphorylation allows ARHGAP19 to interact with the 14-3-3 family of proteins that protects it from dephosphorylation that occur during cell division. All phosphorylations are essential for regulating the cellular localization of ARHGAP19 and contribute to correct cell division. Indeed, in the absence of phosphorylation, defects are observed during cytodiérèse resulting in the formation of multinucleate cells. In addition, deregulation of RhoGTPases, such as the absence of GAP, are now highlighted in cancers. This is why we generated arhgap19 KO mice to study the consequences of the absence of the gene coding for ARHGAP19, in the murine hematopoietic system. All progenitor and mature cells involved in murine hematopoiesis were analyzed. By this model of conditional invalidation of arhgap19, no major role of the protein has been demonstrated but the results suggest an involvement at different stages of hematopoietic differentiation and an impact on all populations of this system.

Le cycle cellulaire est hautement régulé par la phosphorylation réversible de plusieurs effecteurs. La kinase dépendante des cyclines Cdk1 déclenche la mitose en induisant le bris de l’enveloppe nucléaire, la condensation des chromosomes et la formation du fuseau mitotique. Chez les animaux métazoaires, ces évènements sont contrés par la protéine phosphatase PP2A-B55, qui déphosphoryle plusieurs substrats de Cdk1. La kinase Greatwall (Gwl) est activée par le complexe cycline B-Cdk1 en début de mitose et induit ensuite l’inhibition de PP2A-B55 via Endos/Arpp19. Toutefois, les mécanismes moléculaires qui régulent Gwl sont encore peu connus. Nous avons montré que Gwl a une activité s’opposant à PP2A-B55, qui collabore avec la kinase Polo pour assurer l’attachement du centrosome au noyau et la progression du cycle cellulaire dans le syncytium de l’embryon de la drosophile. Ensuite, nous avons trouvé dans des cellules de drosophile que Gwl est localisée au noyau pendant l’interphase, mais qu’elle se relocalise au cytoplasme dès la prophase, avant le bris de l’enveloppe nucléaire. Nous avons montré que cette translocation de Gwl est cruciale pour sa fonction et qu’elle dépend de la phosphorylation de plusieurs résidus de la région centrale de Gwl par les kinases Polo et Cdk1. Cette région centrale contient également deux séquences de localisation nucléaire (respectivement NLS1 et NLS2). De plus, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de Gwl par la kinase Polo promeut sa liaison avec la protéine 14-3-3ε, ce qui favorise la rétention cytoplasmique de Gwl. Le rôle de Cdk1 dans cette translocation reste quant à lui inconnu. De plus, nous avons montré que le complexe cycline B-Cdk1 entre dans le noyau avant que Gwl ne soit transportée dans le cytoplasme. Cdk1 pourrait donc activer Gwl et phosphoryler ses substrats nucléaires, à l’abri de PP2A-B55 qui est largement cytoplasmique. Gwl est ensuite exclue du noyau et relocalisée dans le cytoplasme afin d’induire l’inhibition de PP2A-B55. Cela permet de synchroniser les événements de phosphorylation se produisant dans le noyau et dans le cytoplasme. Fait intéressant, un mécanisme de régulation de la localisation de Gwl similaire à cela a été découvert chez l’humain et chez la levure, suggérant que ce mécanisme est conservé entre différentes espèces. / Reversible phosphorylation of proteins, triggered by cyclically activated kinases and phosphatases, is a key mechanism to control cell cycle progression. CyclinB-Cdk1 is a crucial kinase phosphorylating a large number of substrates to trigger mitotic entry. However, in metazoans, it is counteracted mainly by a Protein Phosphatase 2A carrying the B55 regulatory subunit (PP2A-B55). On the other hand, the Greatwall (Gwl) kinase is activated by CyclinB-Cdk1 upon mitotic entry and subsequently induces the inhibition of PP2A-B55 by Endos/Arpp19, thus promoting mitotic entry and maintenance. Nonetheless, the regulatory mechanisms of Gwl are less clear. We demonstrated that in Drosophila syncytial embryos, PP2A-B55 is negatively regulated by Gwl, but collaborates with Polo kinase to ensure both nucleus attachment of centrosome and faithful cell cycle progression. Later, we discovered that in Drosophila, the subcellular localization of Gwl changes dramatically throughout the cell cycle. Gwl is nuclear in interphase but suddenly becomes mostly cytoplasmic in prophase before nuclear envelope breakdown. Such translocation is important for Gwl’s function and requires the phosphorylation of Gwl by both Polo kinase and Cdk1 in the region containing two Nuclear Localization Signals (NLSs). Phosphorylation of Gwl by Polo likely promotes its association with14-3-3ε thereby promoting Gwl cytoplasmic retention, whereas Cdk1’s role in this translocation remains elusive. Moreover, I found that most cyclin B is imported into the nucleus before Gwl translocates to the cytoplasm. Therefore, Cdk1 can activate Gwl and phosphorylate its nuclear substrates without the perturbation of PP2A-B55 which is largely cytoplasmic. Subsequently, Gwl translocates into cytoplasm to mediate the inhibition of PP2A-B55 so that the phosphorylation events can be synchronized between the nucleus and the cytoplasm. Interestingly, similar spatial regulation of Gwl was also uncovered in mammal cells and in yeast, implying a conserved regulatory mechanism across species.

La mitose est une phase importante du cycle cellulaire. Les mécanismes de surveillance s'assurent de l'ordre et de l'exécution correcte des événements du cycle cellulaire dont les erreurs peuvent conduire à l'aneuploïdie. Pendant la mitose, la séparation des chromatides sœurs est régulée par le point de contrôle du fuseau mitotique qui s'assure que tous les chromosomes sont correctement alignés sur la plaque métaphasique. L'entrée et la sortie de mitose sont régulées par l'activation et l'inactivation du complexe cycline B/Cdk1. Cette fine régulation fait intervenir de nombreuses kinases et phosphatases. Dans ce projet nous nous sommes intéressés plus particulièrement à deux AGC kinases : RSK2 et Greatwall (Gwl).Au cours de cette étude nous nous sommes proposés d'analyser l'implication de RSK2, substrat majeur de la MAPK, dans le point de contrôle du fuseau mitotique. Nos résultats montrent que RSK2 est essentielle pour l'activité du point de contrôle du fuseau mitotique dans les extraits d'œufs de xénope ainsi que pour la localisation des autres protéines de ce mécanisme de surveillance localisées aux kinétochores. Nous montrons également que RSK2 participe au point de contrôle dans les cellules humaines. En effet, RSK2 est nécessaire à la localisation aux kinétochores de Mad1, Mad2 et Cenp-E, protéines essentielles à l'activité de ce checkpoint. L'entrée et la sortie de mitose sont régulées par le complexe cycline B/Cdk1 et des phosphatases. Gwl est une nouvelle kinase essentielle à l'entrée en mitose et au maintien de l'état mitotique dans les extraits d'œufs de xénope. En effet, nos résultats montrent que Gwl maintient l'état mitotique indépendamment du complexe cycline B/Cdk1, en régulant négativement PP2A, une phosphatase responsable de la déphoshorylation des substrats mitotiques. / Mitosis is an important phase of cell cycle. The Spindle Assembly Checkpoint (SAC) verifies the orders and the events correct execution of the cell cycle, as errors may lead to aneuploidy. During the mitosis, the checkpoint delays the anaphase onset until all chromosomes are correctly attached to the spindle‘s microtubules. Entry and Exit of mitosis are regulated by the activation and inactivation of cyclin B/Cdk1. A lot of kinases and phosphatases are involved in this fine regulation. In this project, we are particularly focusing on two AGC kinases: RSK2 and Greatwall (Gwl).In this study, we analyzed RSK2, a major substrates of MAPK, involvement in SAC. Our results show that RSK2 is essential to the activation of SAC in xenopus egg extracts and for the localization at the kinétochores of the others SAC components. We also show that RSK2 participate in the maintenance of the SAC in human cells. Indeed, RSK2 is necessary for Mad1, Mad2 and Cenp-E localization, essential proteins for SAC activation.Entry and exit of mitosis are regulated by cyclin B/Cdk1 complex and phosphatases. Gwl is a new kinase essential to the entry into mitosis and maintenance of the mitotic state in xenopus egg extracts. Indeed, our results showed that Gwl maintains the mitotic state independently of cyclin B/Cdk1 but with the negative regulation of PP2A, which dephosphorylate the mitotic substrates

La progression mitotique est principalement régulée par la phosphorylation et la déphosphorylation des protéines. La kinase dépendante des cyclines liée à la cycline B (Cdk1 - cycline B) et d'autres kinases phosphorylent une myriade de protéines pour promouvoir l’entrée à la mitose. Ces phosphorylations sont réversées par les phosphatases lors de la sortie mitotique. La protéine phosphatase 2A avec sa sous-unité régulatrice B55 (PP2A-B55) est une des principales phosphatases neutralisant les phosphorylations par Cdk1. Dans ce projet, nous avons vu que Ankle2 participe à la sortie de la mitose. En utilisant D. melanogaster comme modèle puissant, nous avons observé que Ankle2 est important pour le recrutement des protéines BAF et Lamin associées à l'enveloppe nucléaire (NE) à la télophase, assurant la formation d'un seul noyau. In vivo, nos résultats indiquent que Ankle2 est crucial pour le développement de l'embryon de drosophile, car les embryons ARNi Ankle2 sont arrêtés lors de la première mitose. Pour amorcer l’étude des mécanismes moléculaires par lesquels Ankle2 remplit ces foncions, nous avons identifié ses partenaires d’interactions. Nous avons constaté que Ankle2 est associé à une forme active de PP2A, suggérant Ankle2 comme une sous-unité régulatrice potentielle de PP2A. De plus, Ankle2 forme un complexe avec la cycline B et les Cdks mitotiques, et nos résultats génétiques suggèrent que les deux protéines peuvent avoir des rôles opposés. Nous avons également découvert que Ankle2 interagit avec la protéine du réticulum endoplasmique (ER) Vap33 à travers son motif FFAT. Dans ce projet, nous avons constaté que Ankle2 est une protéine associée au ER chez la drosophile qui est cruciale pour la complétion de la mitose, et que pourrait réguler l'activité des kinases et phosphatases mitotiques. Cette étude servira de base pour déchiffrer les mécanismes moléculaires précis par lesquels Ankle2 favorise la sortie de la mitose. / Protein phosphorylation and dephosphorylation is one of the mechanisms that regulates mitotic progression. Cyclin dependent kinase 1 bound to cyclin B (Cdk1 – cyclin B) and other kinases phosphorylate a myriad of proteins to promote early mitotic events. These phosphorylations are reversed by phosphatases during mitotic exit. The Protein Phosphatase 2A with its regulatory subunit B55 (PP2A-B55) is the major phosphatase counteracting Cdk1 phosphorylations. In this project, we have found that Ankle2 participates in mitotic exit. Using D. melanogaster as a model, we have found that Ankle2 is important for the Nuclear Envelope (NE)-associated proteins BAF and Lamin recruitment at telophase, ensuring the formation of a single nucleus. In vivo, we have found that Ankle2 is crucial for Drosophila embryo development, as RNAi Ankle2 embryos are arrested in the first mitosis. To study the molecular mechanisms by which Ankle2 promotes mitotic exit, we identified its interacting partners. We found that Ankle2 is associated with an active form of PP2A, suggesting Ankle2 as a potential regulatory subunit of PP2A. Moreover, Ankle2 engages in a complex with cyclin B and mitotic Cdks, and our genetic results suggest that Ankle2 and mitotic cyclin – Cdk complex may have opposite roles. We have also found that Ankle2 interacts with the Endoplasmic-Reticulum (ER) protein Vap33 through its FFAT motif. In this project, we have found that Ankle2 is an ER-associated protein in Drosophila that is crucial for completion of mitosis, probably regulating the activity of mitotic kinases and phosphatases. This study will serve as a basis to decipher the precise molecular mechanisms by which Ankle2 promotes mitotic exit.

Les Sites Fragiles Communs (SFC) sont des loci incluant des grands gènes où des cassures chromosomiques apparaissent chez des cellules soumises à un stress réplicatif. Il est couramment admis que ces sites sont des régions dont la réplication n’est pas terminée lorsque les cellules entrent en mitose mais le mécanisme sous-jacent restait mal compris. Notre laboratoire a montré par la technique du peignage moléculaire que l’instabilité du site FRA3B chez les lymphocytes est due à la présence d’une grande région pauvre en origines de réplication actives (cœur) dont la réplication ne peut pas se terminer en cas de stress réplicatif. Dans le but de généraliser ces conclusions, j’ai étudié par la technique du « Répli-Seq », le timing de réplication à l’échelle du génome entier chez des cellules lymphoblastoïdes humaines traitées ou non à l’aphidicoline. Les résultats confirment clairement que les SFC connus dans ce type cellulaire correspondent à des régions incluant un grand gène et qui sont déficitaires en réplication sous un stress réplicatif. D’autre part, j’ai montré que retarder l’entrée des cellules en mitose par l’utilisation du RO-3306, un inhibiteur de CDK1, abolit complètement la fragilité des SFC induite par l’aphidicoline chez des lymphocytes et des fibroblastes humains. De plus, j’ai montré que cette suppression des cassures au niveau de FRA3B et FRA16D chez les lymphocytes et de FRA1L chez les fibroblastes ne s’accompagne pas d’une diminution de la transcription de FHIT, WWOX et NEGR1, les trois grands gènes contenus respectivement dans ces trois SFC. Par ailleurs, j’ai corrélé l’expression des gènes FHIT, WWOX, NEGR1 et LSAMP à la fragilité des sites FRA3B, FRA16D, FRA1L et FRA3L dans 7 lignées de fibroblastes et 7 lignées de lymphocytes. J’ai aussi mis en évidence une expression atypique de ces gènes dans certaines de ces lignées et montré que cette expression atypique s’accompagne d’une fragilité atypique du SFC correspondant. Cependant, j’ai montré que l’inhibition de la transcription par deux inhibiteurs différents, le triptolide et l’α-amanitine, ne diminue pas la fragilité induite par l’aphidicoline. Je propose un modèle pour expliquer ces résultats apparemment contradictoires. Enfin, j’ai corrélé la disparition des cassures au niveau de FRA3B dans les cellules traitées à l’aphidicoline et au RO-3306 à une augmentation des événements d’initiation dans la région cœur. J’ai montré que l’inhibition de CDK1 par le RO-3306 permet l’accumulation à la chromatine des facteurs CDC6, CDT1, ORC1 et MCM7 dans les cellules bloquées en phase G2 et que l’accumulation de CDT1 et de CDC6 est indispensable à la diminution de la fragilité sous RO-3306. Je propose un modèle permettant de rendre compte de ces observations qui postule l’existence d’origines de réplication latentes partiellement chargées en complexes de pré-réplication. / Common Fragile Sites (CFS) are loci harboring large genes where chromosome breaks occur in cells under replication stress. It is widely accepted that these sites are regions whose replication is incomplete when cells enter mitosis, but the underlying mechanism remains poorly understood. Our laboratory has shown by the technique of molecular combing, that the instability of FRA3B in lymphocytes is due to the presence of a large region poor in active replication origins (core) whose replication can not be completed under replicative stress. In order to generalize these findings, I studied by the technique of "Repli-Seq", the replication timing across the entire genome in human lymphoblastoid cells treated or not with aphidicolin. The results clearly confirm that CFS known in this cell type correspond to regions including large genes and which are underreplicated under replication stress conditions. Moreover, I have shown that delaying entry of cells into mitosis by using RO-3306, an inhibitor of CDK1, completely abolishes the fragility of SFC induced by aphidicolin in human lymphocytes and fibroblasts. I also have shown that abolition of the breaks at FRA3B and FRA16D in lymphocytes and at FRA1L in fibroblasts is not accompanied by a decreased transcription of FHIT, WWOX and NEGR1, respectively, the three large genes including these three SFC. Moreover, I have correlated the expression of FHIT, WWOX, NEGR1 and LSAMP genes to the fragility of FRA3B, FRA16D, FRA1L and FRA3L sites in 7 lines of fibroblasts and 7 lines of lymphocytes. I also highlighted an atypical expression of these genes in some of these lines and showed that this atypical expression is accompanied by an unusual fragility of the corresponding CFS. However, I have also shown that inhibition of transcription by two different inhibitors, triptolide and α-amanitine, does not diminish the fragility induced by aphidicolin. I propose a model to explain these apparently contradictory results.Finally, I have correlated the disappearance of breaks at FRA3B in cells treated with aphidicolin and RO-3306 with an increase in initiation events in the core region. I have shown that inhibition of CDK1 by the RO-3306 allows the accumulation of factors CDC6 CDT1, ORC1 and MCM7 on the chromatin in cells blocked in G2 phase, and that the accumulation of CDT1 and CDC6 is essential to reducing fragility under RO-3306. I propose a model to explain these observations that postulates the existence of latent replication origins partially loaded with the pre-replication complex.

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