O consumo mundial de cocaína vem crescendo e no Brasil já são estimados mais de 2 milhões de usuários, destes 370 mil usam regularmente o crack. A cocaína, em suas diversas formas, é um psicoestimulante com alto potencial de abuso e a forma fumada causa à seus usuários mais complicações de saúde do que as demais formas. Muitas dessas complicações estão relacionadas às funções cognitivas, como comprometimento da atenção e memória. O usuário de crack, no ato de fumar, está sujeito tanto à ação da cocaína volatilizada quanto a dos seus produtos de pirólise, principalmente da anidroecgnonina metil éster (AEME). Considerando que pouco se conhece a respeito da AEME, ou de sua associação com cocaína, que os distúrbios cognitivos podem estar relacionados à morte neuronal e que o hipocampo é uma das principais estruturas encefálicas relacionada com cognição e memória, este trabalho visou investigar as vias de ativação de morte celular decorrente das exposições à 1 mM de AEME, 2 mM de cocaína, bem como da associação de ambas (C + A), por 3, 6 e 12 h. Para tanto, utilizamos neurônios hipocampais de embriões de rato no 18º dia embrionário (E18) que foram mantidos em cultura por até 7 dias (DIV7), quando foram feitas as exposições. Nossos resultados mostraram que em 3 h a cocaína e a AEME promoveram aumento de atividade enzimática (pelo teste de MTT) que se reverteu ao longo de 12 h. Além disso, AEME aumentou na permeabilidade da membrana plasmática em 6 h que se manteve em 12 h. Embora essas alterações tenham ocorrido em 3 h e 6 h, caspase-8 se ativou apenas em 12 h, ativando também a sinalização apoptótica com a externalização de FS. A cocaína ativou o processo autofágico a partir de 3 h aumentando a quantificação de LC3 II, mas apresentou redução de células com vesículas ácidas em 6 h e 12 h, sugerindo que esta promova morte neuronal por causar falha no fluxo autofágico. A AEME apresentou somente aumento de células com vesículas ácidas em 3 h, revertendo-se já em 6 h, indicando que o processo autofágico só se fez presente no primeiro horário, dando vez à programação de apoptose celular, por ativação da via extrínseca. A associação dessas substâncias apresentou-se mais neurotóxica do que as substâncias isoladas, com redução de células íntegras a partir de 3 h de exposição, ativação de caspase-8 e externalização de FS em 6 h, sem envolver o sistema autofágico. Além disso, as características morfológicas observadas em 6 h, como o aumento do tamanho do núcleo e do corpo celular que se tornaram picnóticos em 12 h, podem sugerir que a neurotoxicidade induzida por C + A seja por necroptose, onde a ativação de caspases resulta em um processo tipo necrótico. Assim, concluímos que, embora a literatura mostre morte neuronal por apoptose a partir de 24 h de exposição para cocaína e para AEME, as respostas celulares que levam à este fim iniciam-se já em 12 h, por ativação da via extrínseca e a associação destas substâncias é ainda mais neurotóxica, iniciando a sinalização de morte já em 6 h e induzindo uma morfologia tipo necrótica. / Cocaine market is increasing all around the world. In Brazil it is estimated that almost 2 million people make usage of this substance which 370 thousand people use the crack form. Cocaine is a psychostimulant with large potential for abuse and the smokable form produces more health problems than the other routes of use, mainly in the cognitive field related to compromising attention, memory and decision take. The crack users are exposed to both volatized cocaine and their pyrolysis products, which the main product is the anhydroecgonine methyl ester (AEME). Considering that the cognitive disturbs could be related to neurons death, the memory functions are also related to the hippocampal functions, and little is known about the AEME neurotoxicity or even the combination of cocaine and AEME in cell fate, our study aims to characterize the time and pathways related to the hippocampal neurotoxicity induced by 2 mM of cocaine, 1 mM of AEME and the association (C + A) of both substances during 3 h, 6 h and 12 h of exposure. Our results showed that cocaine and AEME increased enzymatic activity (MTT test) in 3 h but it reversed during 12 h of exposure. Moreover, AEME increased cell permeability in 6 h keeping it until 12 h. Although theses early alterations, both substances activated caspase -8 after 12 h when early apoptosis was also observed by the FS externalization. Cocaine activated the autophagic process at 3 h increasing the LC3 II quantification, but decreased the number of cell with acid vesicle at 6 h and 12 h, suggesting neuronal death due to failure in the autophagic flux. AEME showed increased in cell number with acid vesicle only in 3 h which returned after 6 h suggesting that the autophagic process gave place to the apoptotic program starting from the extrinsic pathway. The association of cocaine and AEME was shown more neurotoxic than them alone, decreasing the number of integral cells after 3 h, activating caspase -8 and promoting FS externalization after 6 h without involving the autophagy. In addition, taking the C + A morphology in 6 h, where it was observed increasing of nucleus and soma size that became pyknotic at 12 h, we suggest that the neuronal death could occur by necroptosis because this composition activated caspase -8 and resulted in necrotic like morphology. Thus, we conclude that cocaine- and AEME-induced apoptosis neuronal death starts in 12 h of exposure by the extrinsic pathway and the association of both substances is more neurotoxic than they alone, starting earlier after 6 h and resulting in a necrotic-like morphology.

A subespécie Caligo illioneus illioneus, conhecida popularmente por Olho-de-coruja é uma Lepdóptera importante da Mata Atlântica no Brasil, possuindo ampla distribuição Neotropical, sendo predadora voraz de diversas culturas agrícolas de importância econômica quando em seus estádios de lagarta. Desde o descobrimento da primeira estabilização por Grace (1962), mais de 500 linhagens celulares de insetos já foram estabelecidas, sendo ferramentas valiosas para o progresso nos estudos fisiológicos, propagação in vitro de patógenos, pesquisas sobre controle de pragas e na produção de proteínas recombinantes. Porém, poucos trabalhos apresentaram resultados positivos com linhagens de células tronco embrionárias, especialmente em Lepidópteras. Este projeto teve como objetivo obter, isolar e caracterizar células tronco indiferenciadas de ovos embrionados de Caligo illioneus illioneusobtidas a partir de culturas primárias sob protocolo de cultivo celular específico para Lepidópteras, armazenamento em nitrogênio líquido, avaliação da manutenção e expansão in vitro. Através de análises anatômicas e taxonômicas, confirmou-se que a subespécie tratava-se de Caligo illioneus illioneus. As análises ultraestruturais do cório do ovo, através de microscopia eletrônica de varredura, demonstraram variação de 32-35 carenas verticais, havendo diferenças taxonômicas no cório do ovo das espécies do gênero Caligo. Após a obtenção das células do embrião, estas foram isoladas e cultivadas em meio de cultura celular DMEM-High suplementado, em temperatura de 22°C sem a adição de CO2. Foram realizadas as análises de aspectos citológicos, morfologia celular, ciclo celular, análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo e potencial elétrico e funcional da membrana mitocondrial. As células apresentaram formato globóide, sem adesão ao substrato, com o núcleo bem delimitado e com baixo volume celular. Os dados obtidos pelas análises do ciclo celular das 4 amostras em diferentes passagens demonstraram que o protocolo estabelecido para a cultura celular foi favorável, com significativo rendimento no número de células, na expansão e criopreservação, confirmado pelo aumento na proporção de células nas fases G2/M e de Síntese, e que as células estavam realizando os processos naturais de interfase e de divisão celular responsável pela embriogênese e crescimento. A análise de imunofenotipagem por citometria de fluxo apresentou marcações positivas com alta expressão para os marcadores de células pluripotentes (Sox2 e Oct 3/4), marcadores de morte celular por apoptose (Caspase 3 e HSP70), marcadores específicos de insetos (Anti Rab-5, Axons BP 102, GM 130 e Dro. FMR1) e marcadores de células de origem mesenquimal (Stro-1, Vimentina), apresentando baixa expressão somente em CD 90. O experimento de potencial elétrico e funcional da membrana mitocondrial apresentou células metabolicamente ativas, não evidenciando diferenças significativas entre as culturas primárias e entre terceira e quinta passagens das 4 amostras. Concluiu-se que foi possível estabelecer um protocolo de cultura celular para Lepidópteras livre de patógenos e que os ovos embrionados de Caligo illioneus illioneus com 3 e 4 dias para a eclosão apresentaram maior duração em cultura celular, possuindo células indiferenciadas, representando, deste modo, uma ferramenta promissora com grande potencial para pesquisas em biotecnologia e biologia molecular, principalmente devido ao fato da espécie ser de importância ecológica, médica e em controle de pragas nas ciências agrárias / Caligo illioneus illioneus subspecies, known popularly by Owl Butterfly, is an important Lepdoptera of the Brazilian Atlantic Forest, with wide distribution Neotropical, being a voracious predator of various agricultural crops of economic importance when in their caterpillar stages. Since discovery of the first stabilization by Grace (1962), over 500 insect cell lines have been established and are valuable tools for progress in physiological studies, in vitro propagation of pathogens, research on pest control and the production of recombinant proteins. However, few studies showed positive results to embryonic stem cell lines, especially in Lepidoptera. This study aimed to obtain, isolate and characterize undifferentiated stem cells of embryonated eggs from Caligo illioneus illioneus, obtained from primary cultures under specific cell culture protocol to Lepidoptera, storage in liquid nitrogen, evaluation of maintenance and expansion in vitro. By means of anatomical and taxonomic analysis, it was confirmed that the subspecies was Caligo illioneus illioneus. Ultrastructural analysis of the egg chorion, by scanning electron microscopy showed variation of 32-35 vertical carina, having taxonomic differences in egg chorion at the Caligo species. After obtaining the embryonic cells, these were isolated and cultured in cell culture medium DMEM-High supplemented, at 22 ° C without addition of CO2. They were carried out analysis of cytological aspects, cell morphology, cell cycle, immunophenotyping by flow cytometry and electrical and functional potential of mitochondrial membrane. The cells showed globoid shape without adhesion to the substrate, with well-defined nucleus and low cell volume. Data obtained by cell cycle analysis of the four samples at different passages showed that established protocol for cell culture was favorable, with significant yield relative to the number of cells, the expansion and cryopreservation, confirmed by the increase in the proportion of cells in G2/M and Synthesis phases, and the cells were performing the natural processes of interphase and cell division, responsible for embryogenesis and growth. Immunophenotyping analysis by flow cytometry showed positive markings with high expression for pluripotent cells markers (Sox2 e Oct 3/4), markers of cell death by apoptosis (Caspase 3 e HSP70), specific markers for insects (Anti Rab-5, Axons BP 102, GM 130 e Dro. FMR1) and mesenchymal cell markers (Stro-1, Vimentina), presenting low expression only in CD 90. The electrical and functional potential analysis of mitochondrial membrane has resulted in metabolically active cells, not evidencing significant differences among primary cultures and between the third and fifth passages of 4 samples. It was concluded that it was possible to establish a cell culture protocol to Lepidoptera free from pathogens and that embryonated eggs from Caligo illioneus illioneus with 3 to 4 days for hatching showed longer duration in cell culture, having undifferentiated cells, representing in this way, a promising tool with great potential for research in biotechnology and molecular biology, mainly due to this species have ecological and medical importance and in control pests at the agricultural sciences

A implantação de materiais vítreos e vitrocerâmicos bioativos representa estratégia terapêutica importante para se promover a formação de matriz extracelular mineralizada em defeitos ósseos críticos. Quando expostos a fluidos biológicos, estes biomateriais sofrem alterações químicas e topográficas de superfície que afetam as interações de células com sua superfície, reduzindo o espraiamento celular e alterando o padrão de marcação de proteínas do citoesqueleto. O objetivo deste estudo foi avaliar se as alterações no padrão de marcação para as proteínas citoesqueléticas actina e tubulina observadas in vitro em células osteogênicas sobre superfícies do vidro Bioglass® 45S5 e da vitrocerâmica Biosilicato®, são decorrentes de redução quantitativa na expressão do RNAm e das proteínas correspondentes. Células osteogênicas foram obtidas a partir da digestão enzimática de calvárias de ratos Wistar recémnascidos e plaqueadas sobre superfícies de Bioglass® 45S5, Biosilicato® e borosilicato (controle bioinerte) para a avaliação dos seguintes parâmetros: 1) detecção de actina e tubulina por microscopia de fluorescência; 2) expressão de RNAm para actina e tubulina por reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real time PCR); 3) quantificação de actina e tubulina por ensaio imunoenzimático direto (ELISA), e 4) análise da morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Aos 3 e 7 dias, células crescidas sobre borosilicato exibiam padrões de marcação para actina e tubulina típicos de células aderidas e espraiadas sobre substratos planos in vitro, enquanto que sobre Bioglass® 45S5 e Biosilicato® as células apresentavam áreas circulares destituídas de marcação para essas proteínas. Nos mesmos períodos, culturas crescidas sobre os materiais bioativos apresentavam alterações significantes da expressão de RNAm para actina e tubulina, embora fossem observadas apenas discretas variações na quantidade das proteínas correspondentes em relação ao borosilicato. Além disso, apenas para culturas crescidas sobre borosilicato observava-se correlação positiva entre RNAm e proteína e correspondência entre as observações por epifluorescência e os dados quantitativos. Aos 3 dias, imagens de MEV revelaram células aderidas e espraiadas sobre os materiais bioativos, parcial ou totalmente recobertas por acúmulos de material de aspecto semelhante ao da topografia do substrato, por vezes impedindo a visualização dos limites celulares. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que as superfícies bioativas de Bioglass® 45S5 e Biosilicato® afetam a expressão de RNAm para actina e tubulina, mas não de proteína. Assim, as alterações nos padrões de marcação por fluorescência para essas proteínas devem ser atribuídas, pelo menos em parte, a acúmulos de material sobre as células, possivelmente decorrentes das reações de superfície a que estão submetidos Bioglass® 45S5 e Biosilicato® quando em contato com fluidos biológicos. / Bioactive glasses and glass-ceramics have been successfully applied in various therapeutic strategies to promote the formation of mineralized matrix in bone defects. The exposure of these materials to biological fluids results in chemical and topographical modifications that may affect the interactions of cells with the biomaterial surface, with potential effects on cytoskeletal protein expression and/or organization and cell spreading. The aim of the present study was to evaluate whether changes in the labelling pattern for the cytoskeletal proteins actin and tubulin in osteogenic cells cultured on bioactive Bioglass® 45S5 and Biosilicate® are due to altered mRNA and protein expression levels. Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn Wistar rat calvarial bone and plated on Bioglass® 45S5, Biosilicate® and borosilicate (bioinert control) for periods of up to 7 days. The following parameters were assayed: i) qualitative epifluorescence analysis of actin and tubulin distribution; ii) quantitative mRNA expression for actin and tubulin by real time polymerase chain reaction (real time PCR); iii) quantitative actin and tubulin expression by enzymelinked immunoabsorbent assay (ELISA), and iv) qualitative analysis of cell morphology by scanning electron microscopy (SEM). At days 3 and 7, cells grown on borosilicate showed typical actin and tubulin labeling patterns of adherent and spread cells on flat, rigid substrates, whereas those on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® showed dark areas devoid of fluorescent signals for the cytoskeletal proteins. At the same time points, cultures grown on the bioactive materials showed significant changes in mRNA expression for actin and tubulin, although only slight differences in the amount of actin and tubulin were detected compared with borosilicate. Moreover, a positive correlation between mRNA and protein expression levels as well as a correspondence between epifluorescence imaging and the quantitative data were only detected for cultures grown on borosilicate. SEM analysis revealed that cells cultured on bioactive surfaces were partly or totally covered with material accumulations, whose characteristics resembled the ones for the substrate topography, and which, in some cases, prevented the visualization of the cell limits. In conclusion, Bioglass® 45S5 and Biosilicate® affect actin and tubulin mRNA levels, but not the corresponding protein expression, in osteogenic cell cultures. Thus, the observed changes in the labeling pattern for these proteins should be attributed, at least in part, to the accumulation of materials on the cell surface, likely due to substrate reactions that take place on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® when exposed to the cell culture medium.

O efeito de fármacos pode ser potencializado através do desenvolvimento de novos sistemas de liberação como os sistemas mucoadesivos. Estes sistemas permanecem em contato íntimo com o tecido de absorção, às mucosas, liberando o fármaco no local de ação, com o consequente aumento da biodisponibilidade, podendo promover efeitos locais e sistêmicos. Através do desenvolvimento da bandagem bucal antimicrobiana e testadas sua eficiência sobre a cultura de algumas bactérias bucais (S. mutans e C. albicans) se fez necessário continuar os estudos desse material. O objetivo deste trabalho foi analisar as propriedades bioquímicas e funcionais da bandagem bucal antimicrobiana no que tange a: degradação no meio salivar; adequação da composição para a melhoria da aderência à mucosa bucal; desempenho quanto à liberação controlada de fármacos; absorção de água, perda de massa; medida do pH do líquido residual em diferentes períodos de tempo; citotoxicidade da bandagem em cultura de fibroblastos. As bandagens avaliadas tinham diferentes composições quitosana, quitosana com glicerol, quitosana e alginato com/sem glicerol, e todas com/sem fármaco. Através das análises realizadas foi possível observar que as bandagens que absorveram mais água em tampão foi a membrana híbrida (203%) e em saliva foi a híbrida com glicerol (30%). A membrana que perdeu mais massa em tampão e em saliva foi a híbrida com glicerol (40% e 30%), isso quer dizer que elas se decompõe e liberam suas propriedades no meio. A liberação controlada do fármaco pode avaliar que a membrana híbrida liberou de forma crescente o fármaco (0,075%), facilitando sua liberação. No teste de citotoxicidade todas as bandagens com fármaco foram citotóxicas, já as bandagens de quitosana e quitosana com glicerol promoveram o crescimento celular. / The effect of drugs may be enhanced through the development of new delivery systems as mucoadhesive systems. These systems remain in intimate contact with the tissue absorption, in this case the mucosa, releasing the drug at the site of action, with the consequent increase in bioavailability and may promote local and systemic effects. Mucoadhesion is currently explained by six theories: electronics, adsorption, wetting, diffusion, fracture and mechanics (Carvalho et al., 2010). In 2011, Kloster et al. developed an oral bandage and tested antimicrobial efficiency in the culture of some oral bacteria (S. mutans e C. albicans), the results were promising. The aim of this study was to analyze the biochemical and functional properties of oral antimicrobial bandage with respect to: the salivary environment degradation; the composition adjustment for improving the adherence to the buccal mucous membrane; the performance as to the controlled releasing of drugs; water absorption while analyzing the mass loss; pH measurements of the residual liquid in different periods of time; the plaster cytotoxicity in cell and fibroblast culture. Through the analyzes it was observed that the bandages absorb water and lose mass, it means that they decompose and release their property in the middle. The bandages with drug in viability analysis were cytotoxic cell and different concentrations of drug should be study.

A deficiência de vitamina A é um problema global de saúde pública que afeta especialmente crianças com menos de 5 anos, mulheres durante o parto e 1 ano pós-parto e é a principal causa de cegueira evitável em crianças. Biofortificação é uma estratégia que visa reduzir as deficiências de micronutrientes em populações vulneráveis ao redor do mundo através do aumento da concentração de nutrientes nos alimentos básicos. Investigou-se os efeitos de genótipos e estilos de cocção sobre o conteúdo, retenção e biodisponibilidade de ?-caroteno (?C) em mandiocas biofortificadas e batatas-doces de polpa laranja (BDPL). Cinco genótipos de mandioca biofortificada, três acessos parentais, e uma mandioca branca foram fornecidos por dois programas de melhoramento. Adicionalmente, foram avaliados dois genótipos de BDPL e duas marcas de alimentos infantis. Tanto as raízes de mandioca quanto de batatas-doces foram analisadas cruas, cozidas em água a 100°C, e fritas em óleo de soja a 180°C após cozimento. Os carotenoides foram extraídos e analisados por HPLC-DAD. A biodisponibilidade foi determinada utilizando a digestão oral, gástrica e duodenal in vitro e absorção por culturas celulares Caco-2. Somente o ?C foi detectado em todos os genótipos de mandioca, embora os teores tenham variado significativamente dependendo do genótipo. As mandiocas melhoradas continham pelo menos 10 vezes mais ?C do que a branca. O cozimento e a fritura foram associados com a perda e isomerização de ?C na mandioca bem como na BDPL. Houve interação significativa entre genótipo e processamento nos perfis e teores de ?C. Eficiência de micelarização do trans-?C nas mandiocas cozidas foi menor do que nas fritas. As mandiocas biofortificadas prontas para consumo podem fornecer até 28% da IDR de retinol. A absorção pelas células Caco-2 do trans-?C foi analisada em quatro genótipos. Dois deles não foram afetados pela cocção em relação à absorção celular, no entanto, os outros dois genótipos apresentaram aumento com a fritura. Com relação às batatas-doces, o trans-?C foi o principal carotenoide encontrado, embora também tenham sido identificados três isómeros do ?C e ?-caroteno em quantidades menores. O teor do trans-?C em um dos genótipos de BDPL foi duas vezes maior do que nos alimentos infantis. Nos alimentos infantis foi encontrada presença relativa de 13-cis-?C maior do que nas BDPLs. A eficiência de micelarização de trans-?C das batatas-doces foi considerada baixa, e não teve diferença com os processamentos. A absorção por Caco-2 não foi diferente para os genótipos de BDPL e alimentos infantis investigados. A quantidade intracelular acumulada de trans-?C foi proporcional à concentração do material inicial. Em resumo, as culturas biofortificadas estudadas podem aumentar a concentração de ?C na dieta. A mandioca frita apresenta mais ?C biodisponível do que ela cozida. Tanto o genótipo da mandioca quanto o tipo de processamento influenciam a absorção de trans-?C. Por outro lado, não foram encontradas evidências de que a redução de partículas, utilizada no alimento infantil, ofereça maior biodisponibilidade de beta-caroteno das BDPLs / Vitamin A deficiency is a world public health problem that affects especially infants, children less than 5 years of age, women during birthing and 1 year post-partum and is the primary cause of avoidable blindness in children. Biofortification is a strategy aimed at decreasing global micronutrient deficiencies in vulnerable populations by increasing the nutrient density in staple food crops. It was investigated the effects of genotype and cooking styles on the content, retention and bioavailability of ?-carotene (?C) in biofortified cassava and orange fleshed sweet-potatoes (OFSP). Five genotypes of biofortified cassava, three parental accessions, and one white cassava were provided by two different breeding programs. Additionally, two genotypes of OFSP and two brands of high processed baby foods were evaluated. Both cassava and OFSP roots were analyzed raw, after boiling in water at 100°C only or after subsequent frying in soybean oil at 180°C. Carotenoids were extracted and analyzed by HPLC-DAD. Bioavailability was assessed using an in vitro oral, gastric and small intestinal digestion coupled with the Caco-2 human intestinal cell model. Only ?C was detected in all tested genotypes of cassava root, although its content varied markedly depending on genotype. Biofortified genotypes contained at least 10-fold higher ?C than the white variety. Boiling and frying were associated with loss and isomerization of ?C in cassava as well as OFSP. There was an interaction of genotype and cooking style on profile of ?C contents. Efficiency of micellarization of trans-?C in boiled cassava was lower than in fried. Biofortified cassava ready to eat can provide up to 28% of the IDR of retinol. Uptake of trans-?C in micelles generated during digestion by Caco-2 cells was analyzed for the four of the five biofortified genotypes. Cell uptake of ?C from two genotypes were not affected by processing, however the other two genotypes had increased with frying. Regarding sweet-potatoes, trans-?C was the major carotenoid found, although it was identified three ?C isomers and ?-carotene in minimal quantities. The concentration of trans-?C in one genotype of OFSP was two times higher than baby foods and the other genotype. Baby foods had relative presence of the 13-cis-?C higher than in the OFSP. Efficiency of micellarization of trans-?C from cooked OFSP or Baby foods was considered low, and had no statistic differences between boiling and frying. The Caco-2 cells uptake were not different for the genotypes and baby foods investigated. The absolute amount of accumulated trans-?C intracellular was proportional to the concentration of the starting material. In summary, biofortified crops can increase ?C contents in diet. Fried cassava presents more bioavailable ?C than boiled. Cassava genotype and cooking style may influence uptake of trans-?C by absorptive intestinal cells. In contrast, there is no evidence that high processed OFSP has more bioavailability of ?C than homemade boiled or fried OFSP

Immunhistochemische Vergleichsanalyse von Primärzellaggregaten und Ursprungsgeweben unterschiedlicher Dignität zur Charakterisierung der in-vitro Anpassung Zielsetzung: Dreidimensionale Zellkulturen stellen eine Weiterentwicklung der einschichtigen Zellkultur dar, die den in-vitro Bedingungen im Organismus näherkommt. Darüber hinaus ermöglichen organoide Kulturen, die neben der vorherrschenden Tumorzelle auch Bindegewebszellen und Immunzellen enthalten, eine Analyse der Interaktion dieser Zellen bei wichtigen Aspekten der Krebserkrankung wie Metastasierung, Angiogenese oder der Tumorimmunologie. Materialien und Methoden: Operationsresektate von Schilddrüsengeweben, -adenomen und -karzinomen, Ovarialkarzinomen und Sarkomen wurden in Einzelzellsuspensionen überführt. Nach Inkubation im Schüttler wurden innerhalb von 24-48 Stunden Primärzellaggregate gezüchtet, von denen Kryostatschnitte angefertigt wurden. Mit der APAAP-Methode wurden Epithelzell-, Leukozyten-, Makrophagen- und Endothelzellmarker sowie E-Cadherin, die a2-, a4-, a5- und av Integrinkette, IGF-I und EGF Rezeptoren, cerbB2 sowie Cathepsin D immunhistochemisch untersucht. Die Färbungen der Aggregate und der Herkunftsgewebe wurden statistisch mit dem Mann-Whitney Test verglichen. Ergebnisse: Primäraggregate konnten zu 90-100% aus Operationsresektaten kultiviert werden. Epithelzellen, Leukozyten, Makrophagen und Endothelzellen waren im Primäraggregaten und den Herkunftsgeweben ungefähr gleichmäßig vorhanden. Dies gilt auch für E-Cadherin, a4-Integrin, IGF-I und EGF Rezeptoren, cerbB2 und Cathepsin D. Die a2-, a5- und av Integrinkette trat nur in den Primäraggregaten von Schilddrüsengeweben und -adenomen nicht aber in deren Herkunftsgeweben auf, was auf eine de-novo Exprimierung schließen läßt. Schlußfolgerung: Mit der verwendeten Methode ist es relativ einfach möglich, organoide Primäraggregate zu züchten, die ein geeignetes Forschungsobjekt für verschiedene Aspekte der Tumorpathologie darstellen. Die gefundenen Unterschiede der Integrinexpression zeigen eine Anpassung and die in-vitro Kultivierung und sind möglicherweise eine Reaktion zur Vermeidung der matrix-abhängigen Apoptose. / Immunohistochemical Analysis of primary cell aggregates and their origin tissue of different pathology to evaluate adaptation to in-vitro environment Objective: Three-dimensional cell cultures reflect more closely the in-vitro environment then monolayer cultures. Furthermore, organoid cultures, which contain beside the dominant tumor cell also mesenchymal cells and leucocytes are used to study the interaction of these cells in several aspects of the tumor pathology, such as metastasis, angiogenesis and tumor immunology. Materials and Methods: Specimens obtained from thyroid tissue, thyroid adenomas and carcinomas, ovarian cancer and sarcomas were dissolved to single cell suspensions. After incubation under stirring, primary cell aggregates were cultured within 24-48 hours. Cryostat sections were made and stained with markers of epithelial cells, leucocytes, macrophages, endothelial cells as well as E-cadherin, a2-, a4-, a5- und av Integrin chain, IGF-I und EGF receptor, cerbB2 and Cathepsin D using the APAAP method. The immunhistochemical results of the aggregates and their origin tissue were statistically compared using the Mann-Whitney test. Results: Primary cell aggregates could be obtained from up to 90-100% of all probes. Epithelial cells, leucocytes, macrophages and endothelial cells were found equally in aggregates and their origin tissue. Also E-Cadherin, a4-Integrin, IGF-I und EGF receptors, cerbB2 und Cathepsin D were found equally. The a2-, a5- und av integrin chain was expressed in aggregates of thyroid tissue and adenomas, but not in their origin tissue suggesting a de-novo expression. Conclusion: Primary cell aggregates were easily obtained with the used method and could be used as a model in the study of tumor pathology. The different expressions of integrins show an adaptation to the in-vitro environment and could be a reaction to avoid matrix-related apoptosis.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin bei Wachstum und Differenzierung der primär dissoziierten hippocampalen Zellkultur 17 Tage alter Mäuseembryonen zu untersuchen. Besonderes Interesse galt dabei dem Fortsatzwachstum und der Synaptogenese. Durch Beobachtung von Zellmorphologie und Zellwachstum wurde gezeigt, daß die Ausbildung charakteristischer Zelltypen ein intrinsischer Prozeß der hippocampalen Neurone ist. Die Synaptogenese wurde durch die Darstellung der entwicklungsabhängigen Verteilung der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin mittels Immunfluoreszenzmarkierung dokumentiert. Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen wurde die Differenzierung subzellulärer Strukturen der hippocampalen Zellkultur charakterisiert und die Verteilung von Synaptophysin und Synaptobrevin entwicklungsabhängig dargestellt. Synaptophysin fand sich nicht nur in axonalen Präsynapsen, sondern auch in Dendriten. Synaptobrevin war im Gegensatz zu Synaptophysin nicht in allen synaptischen Vesikeln der Axonterminalen darstellbar. Um die Wirkungen von Synaptophysin und Synaptobrevin auf hippocampale Neurone in der Kultur genauer zu untersuchen, standen zwei Versuchsmodelle zur Verfügung: 1. die Synaptophysin-defiziente Maus und 2. das clostridiale Neurotoxin Tetanustoxin (TeNT), das Synaptobrevin spezifisch spaltet. Anhand der Depletion von Synaptophysin wurde untersucht, ob in vitro das Fehlen des Proteins Konsequenzen in Bezug auf Synapsenbildung und morphologisches Erscheinungsbild der Neurone hat. Es konnten lichtmikroskopisch und auch im elektronenmikroskopischen Bild keine Unterschiede zu Kontrollkulturen festgestellt werden. Durch morphometrische Messungen zeigte sich, daß in der Kultur der Synaptophysin-depletierten Maus nach 2 DIV mit hoher Signifikanz die Dendriten länger als in Kontrollkulturen waren. Dies spricht für regulatorische Funktionen des Proteins bei Exo- und Endozytosevorgängen während des dendritischen Wachstums. Nach Zugabe von Tetanustoxin zur pränatalen Zellkultur konnte gezeigt werden, daß die Inaktivierung von Synaptobrevin durch TeNT in vitro keine Konsequenzen in Bezug auf das morphologische Erscheinungsbild der Neurone, die Synapsenbildung und das Wachstumsverhalten hat. Mit morphometrischen Messungen konnten für TeTx-behandelte Neurone keine hochsignifikanten Unterschiede zu Kontrollkulturen festgestellt werden. Synaptobrevin scheint also sowohl beim Axon- als auch beim Dendritenwachstum keine essentielle Rolle zu spielen. / Goal of this work was to investigate the role of the synaptic vesicle proteins synaptophysin and synaptobrevin during development and differentiation of mouse fetal hippocampal neurons in primary culture. The outgrowth of dendritic and axonal fibers and the mechanisms of synaptogenesis were of special interest. Observation of morphology and development showed that generation of characteristic cell types is an intrinsic process of hippocampal neurons. Differentiation of cellular and subcellular structures in hippocampal cell culture, characteristics of synaptogenesis and the stage-dependent distribution of synaptophysin and synaptobrevin were demonstrated by immunofluorescence and electron microscopy. Synaptophysin was localized in presynaptic axon terminals but also in dendrites. In contrast with synaptophysin immunoreaction for synaptobrevin could not be found in all synaptic vesicles of the presynaptic axon terminal. To investigate the influence of synaptophysin and synaptobrevin on hippocampal neurons in culture two experimental models were used, first a synaptophysin-knock-out-mouse and second the clostridial neurotoxin tetanustoxin (TeNT) which selectively cleaves synaptobrevin. With the depletion of synaptophysin we investigated if there are consequences in development of synapses and morphological features of the neurons in vitro. In both, light and electron microscopy, there was no difference to control cultures. In morphometric measurements there was a significant difference in the lenght of developing dendrites after 2 DIV with longer dendrites in the synaptophysin-knock-out-mouse. Therefore synaptophysin may have a regulatory function for exo-/ endocytosis during dendritic growth. Specific inactivation of synaptobrevin by tetanustoxin had no consequences in morphological features, synaptogenesis and growing of the hippoacampal neurons in vitro. Morphometric measurements showed no significant differences between TeNT and control. Therefore we conclude that synaptobrevin has no essential function during axon growth or dendrite elongation.

Thesis (MTech (Horticulture))--Cape Peninsula University of Technology, 2018. / Drosanthemum micans and Drosanthemum hallii are endangered succulent shrubs of horticultural and medicinal value. They are restricted to the Succulent Karroo, which is one of the world’s biodiversity hotspots. The species risk extinction from illegal over-harvesting for water-wise gardens, erosion by occasional flush floods from ephemeral rivers, competition from alien invasive species, overgrazing and clearing of land for agriculture and human settlement. Although seeds and cuttings may be used in propagating these species, they often require seasonal collection and planting and cuttings struggle to establish, hence the need for in-vitro propagation as an alternative solution. Thus, the main objective of the study was to develop a method for rapid in-vitro shoot and root multiplication and acclimatization of D. micans and D. hallii. To initiate shoot formation, disinfected leaf and stem nodal explants were cultured in Murashige and Skoog (1962) media supplemented with different rates (0, 10, 20 or 30μM) of 2-isopentyladenine, 6-Benzyladenine and kinetin for D. hallii or 2-isopentyladenine, 6-Benzyladenine and Thiadiazuron for D. micans. Shoots from explants were rooted in varying rates (0, 10, 20 or 30μM) of IAA for root initiation. Three media, which were used in previous studies, were tested for acclimatization of rooted explants in i) vermiculite, ii) sand (50%): vermiculite (50%) or iii) sand (75%): perlite (25%). For quantitative evaluation of plant stress, chlorophyll fluorescence index (Fv/Fm) was measured as a proxy for plant stressf stress. It emerged that stem nodal explants of D. hallii tend to produce multiple shoots whilst leaf explants tended to produce callus when cultured in full-strength Murashige and Skoog (1962). Shoot multiplication was optimal in both D. hallii and D. micans at 10 μM of kinetin. Root formation in both D. hallii and D. micans only occurred when shoots were transferred to a full-strength Murashige and Skoog (1962) media without any phytohormones added. The intensity of tissue browning increased at higher levels of cytokinins, suggesting an interaction of plant growth regulators with exudates from explants. Different acclimatization media tested showed no significant differences in the level of stress (Fv/Fm). It is recommended that Murashige and Skoog (1962) media with10 μM kinetin be used for shoot development and multiplication, followed by transfer of the shoots to fresh full-strength Murashige and Skoog (1962) media without hormones for root development. Acclimatization of the rooted explants was possible in one of the following media: i) vermiculite, ii) sand (50%): vermiculite (50%) or iii) sand (75%): perlite (25%) and in a misted greenhouse (ca. 60% RH), with gradual weekly reductions in humidity by 10% over 2 weeks.

Orientador: Janaína Habib Jorge / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do envelhecimento de materiais comumente usados como pilares de próteses implanto-suportadas (abutments) sobre suas características físicas de superfície (rugosidade, energia livre de superfície e molhabilidade) e propriedades biológicas (metabolismo de fibroblastos orais e formação de biofilme fúngico). Para isso, discos (N=62) com rugosidade inferior a 0,2 µm foram confeccionados em zircônia (ZrO2) do tipo Y-TZP (yttriumstabilized tetragonal zirconia polycrystalline) e em titânio (Ti) comercialmente puro, e foram submetidos a um processo de envelhecimento simulado em autoclave a 134ᵒC (pressão de 2 bar) por 20 horas. ZrO2 e Ti envelhecidos foram comparados aos seus homólogos não envelhecidos. Os materiais também foram comparados entre si, nas condições envelhecida e não envelhecida. Para os testes biológicos, os grupos também foram comparados a um controle positivo de poliestireno. Todos os testes, exceto o de rugosidade, foram realizados após a formação de película salivar sobre os discos. Os testes biológicos utilizados foram de Alamar Blue (n=9) para avaliar o metabolismo de fibroblastos da gengiva humana (FGH) e de contagem de colônias viáveis (n=9) para verificar a formação de biofilme de uma cepa padrão de Candida albicans (ATCC90028) sobre os materiais. Além disso, microscopia eletrônica de varredura (MEV) (n=2) foi realizada para avaliação da morfologia dos fibroblastos e dos microrganismos. Para a análise estatística, fo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effect of aging of commonly used abutments on their surface physical characteristics (roughness, surface free energy and wettability) and biological properties (oral fibroblasts metabolism and formation of fungal biofilm). For this purpose, discs (N=62) with roughness less than 0.2 μm were made in yttrium-stabilized tetragonal zirconia polycrystalline (Y-TZP) zirconia (ZrO2) and in commercially pure titanium (Ti), and underwent a simulated aging process in autoclave at 134 °C (pressure of 2 bar) for 20 hours. ZrO2 and Ti were compared to their unaged counterparts. The materials were also compared to each other in the aged and unaged conditions. For the biological tests, the groups were also compared to a positive control of polystyrene. All tests, except roughness, were performed after the formation of salivary film on the discs. The biological tests used were Alamar Blue (n=9) to evaluate the metabolism of human gingival fibroblasts (HGF) and colony counting test (n=9) to verify the biofilm formation of a reference strain of Candida albicans (ATCC90028) on the materials. In addition, scanning electron microscopy (SEM) (n=2) was performed to evaluate the morphology of fibroblasts and microorganisms. For statistical analysis, the t-test for paired samples was used for roughness, t-test for independent samples was used for surface free energy, wettability and fibroblasts metabolism, and one-way ANOVA with Welch correction and Games-Howe... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2016-03-22T17:26:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gilca Costa Nachtigal.pdf: 1083938 bytes, checksum: ed8ef909e729d1ec7f63cb5239671c25 (MD5) Previous issue date: 2011-07-28 / Introduction-The incidence of cancer increases annually and is considered one of the main causes of mortality worldwide. Sixty-percent of chemotherapics were obtained from natural sources. Objective - this study aimed to assess the antiproliferative activity of extracts from leaves of Jodina rhombifolia Hook. Et Arn. (methanolic and watery) and seeds of Carapa guianensis Aubl. (methanolic and etheric). Methods - The extract activity was assed by sulforhodamine B colorimetric assay (SRB) on human tumor cell lines of acute myeloid leukemia (HL-60), Daudi Lymphoma and mouse embryonic fibroblasts (NIH-3T3), as control cells. The cell lines were grown using microculture plates and were incubated with five different extract concentrations (2.0, 10.0, 60.0, 100.0 e 600.0 mg/mL) for 72 hours. The anti-proliferative effect was determined by the use of a microplate reader spectrophotometer. With the obtained results a doseresponse curve was generated and the IC50 and ICT values were determined. For statistical analysis the was used with linear regression for different concentrations. The p<0.05 values were considered statistically significant. Results The methanolic extract from Carapa guianensis presented the highest anti-proliferative activity on HL-60 line, with IC50 = 12.6 &#956;g/mL and ICT = 80.5 &#956;g/mL (p<0.05). On Daudi Lymphoma line, the aqueous extract of Jodina rhombifolia presented the best effect: CI50 = 41.09 &#956;g/mL and ICT = 55.90 &#956;g /mL (p<0.05). No statistically significant inhibition was found in control cells (p>0.05). Discussion- The results showed that the extracts obtained from the plants Jodina rhombifolia Hook. et Arn. and Carapa guianensis Aubl. have antiproliferative effect on neoplastic cells of hematopoietic origin. Further studies are necessary to obtain new drugs for clinical use / Introdução - A incidência de câncer aumenta anualmente, sendo uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo. Sessenta por cento dos quimioterápicos são derivados de fontes naturais. Objetivo - O presente trabalho objetivou avaliar a atividade antiproliferativa de extratos obtidos a partir de folhas da Jodina rhombifolia Hook. et Arn. (metanólico e aquoso) e de sementes de Carapa guianensis Aubl. (metanólico e etérico). Métodos - A atividade dos extratos foi avaliada por ensaio colorimétrico com Sulforodamina B (SRB) sobre as linhagens celulares tumorais humanas de Leucemia Mielóide Aguda (HL-60), Linfoma Daudi e fibroblastos embrionários murinos (NIH-3T3), como células controle. As linhagens celulares foram cultivadas em placas de microculturas, e foram incubadas com cinco concentrações diferentes dos extratos (2.0, 10.0, 60.0, 100.0 e 600.0 mg/mL) por um período de 72 horas. Para determinar o efeito antiproliferativo foi realizada leitura das placas em espectrofotômetro. Com os resultados obtidos a partir das concentrações testadas de cada extrato, foi gerada uma curva dose-resposta e determinadas a CI50 e CIT. Para análise estatística dos resultados, usou-se o teste de regressão linear para as diferentes concentrações. Valores de p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Resultados O extrato metanólico da Carapa guianensis foi o que apresentou maior atividade antiproliferativa sobre a linhagem HL-60, com CI50=12,6 &#956;g/mL e CIT=80,5 &#956;g/mL (p<0.05). Sobre a linhagem Linfoma Daudi o extrato aquoso da Jodina rhombifolia apresentou melhor efeito, com CI50=41,09 &#956;g/mL e CIT=55,90 &#956;g/mL (p<0.05). Não houve inibição estatisticamente significativa nos controles (p>0.05). Discussão- Esses resultados demonstram que os extratos obtidos das plantas Jodina rhombifolia Hook. et Arn e Carapa guianensis Aubl têm efeito antiproliferativo em células neoplásicas de origem hematopoiéticas, sendo aconselhado expandir essas pesquisas, buscando obter fármaco que venha a ter utilização clínica