Les boîtes quantiques (ou Quantum Dots en anglais - QD) sont une nouvelle génération de sondes polyvalentes pour la biologie, en particulier pour l’imagerie. Pour des applications de marquage des voies intra-cellulaires, les QDs peuvent être conjugués à des biomolécules telles que des acides nucléiques ou des protéines. En partant des travaux du LPEM portant sur le développement de ligands permettant la dispersion des QDs dans l’eau et leur fonctionnalisation, une nouvelle méthode de conjugaison de l'ADN sur les QDs a été développée dans cette thèse. Cette méthode utilise les motifs présents sur les polymères des QDs pour le greffage d'ADN. Les paramètres affectant cette réaction ont été étudiés et cette stratégie de couplage a été étendue à d'autres nanoparticules et biomolécules. En partant de ces QDs-ADN, des protéines modifiées ADN ont pu être attachées aux QDs en utilisant le principe d’hybridation de l’ADN. Les propriétés des conjugués ainsi générés ont été mises en évidence en utilisant la Transferrine (QD-ADN-Tf) et ces complexes ont été étudiés in vitro et in cellulo. Ces conjugués ont ensuite été utilisés pour le suivi de la dynamique des endosomes, exploitant ainsi pleinement le potentiel des QDs pour l’imagerie directe. Dans la dernière partie, des études supplémentaires sur les facteurs influençant la «performance biologique» des QDs ont été réalisées. Pour cela, une large gamme de ligands polymères développée par le groupe a été utilisée pour sonder l'interaction de la surface des QDs avec l'interface biologique. Des expériences biochimiques et cellulaires ont permis de démontrer que les QDs revêtus de divers polymères ont des comportements différents. / Quantum dots (QD) are new generation of versatile probes for biology, particularly for bioimaging. For specific applications, QDs are conjugated to biomolecules such as nucleic acid or proteins and subsequently targeted to unique intra-cellular pathways. Building upon the state-of-the-art ligands for water-dispersible QDs developed by the lab, a novel and highly generalizable method to conjugate DNA to QD is developed in this thesis. This method employs thiols present on polymers on QDs for conjugation to maleimide-functionalized DNA. Extensive characterization of parameters affecting this reaction is carried out and the strategy is extended to other nanoparticles and biomolecules. Following this, a novel method to conjugate proteins to QD via DNA hybridization is discussed. Using a model protein Transferrin (Tf), the unique properties of thus generated QD-DNA-Tf conjugates are studied in-vitro and in-cellulo. These conjugates are subsequently used for tracking endosomal dynamics for up-to 20 minutes, exploiting the fullest potential of QDs for live imaging. In the last part, additional studies on factors affecting the ‘biological performance’ of QDs are carried out. Using a range of highly adaptable polymeric ligands developed by the group, interactions of surface-modified QDs with the biological interface are probed. Systematic biochemical and cellular experiments demonstrate that QDs coated with zwitterionic polymers have superior antifouling properties compared to poly(ethylene glycol)-based polymers and stability in diverse biological contexts.

De récents résultats d’études cliniques ont démontré l’efficacité de l’immunothérapie chez des patients atteints de cancer. Ce type de thérapie consiste à traiter les cellules cancéreuses en stimulant les défenses immunitaires du patient. Le but de ce projet de thèse est de mettre au point un biomarqueur d’efficacité de cette thérapie, afin d’une part de mieux comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu, et d’autre part d’avoir un indicateur précoce et non-invasif de réponse du patient à l’immunothérapie. Pour ce faire, deux techniques d’imagerie (IRM et TEP) ont été utilisées comme outils de suivi in vivo de la biodistribution de différentes populations de cellules immunitaires. La première étape de ce travail a été d’établir différents protocoles de marquage des cellules immunitaires. Pour l’approche TEP, les cellules immunitaires ont été marquées avec du Zirconium 89 ; quant à l’IRM, deux techniques de marquage ont été étudiées : la première utilise des nanoparticules de fer, l’autre des micelles chargées en Fluor 19. Après validation de leur non-toxicité, la sensibilité de chaque marquage a été évaluée in vitro dans un premier temps, puis in vivo dans un deuxième temps, permettant ainsi d’étudier la biodistribution des cellules immunitaires après différents types d’injections. Le marquage au Zirconium 89 a ensuite été testé sur différents modèles animaux d’immunothérapies (par exemple PD1/PDL1). Enfin, les marquages directs ne permettant pas un suivi optimal des cellules à long terme, une approche de marquage cellulaire utilisant des gènes rapporteurs a été envisagée. Il s’agissait de modifier le génome des cellules immunitaires afin qu’elles puissent exprimer une enzyme (par exemple la thymidine kinase virale HSV1-TK) ou un transporteur (tel que le transporteur d’iode NIS) permettant l’internalisation d’un traceur radioactif in vivo, et de pouvoir ainsi réaliser un marquage indirect des cellules. / Recent clinical trial results have demonstrated the efficacy of immunotherapy in cancer patients. This type of therapy involves treating cancer cells by stimulating the patient's immune defenses. The aim of this thesis project is to develop a biomarker of efficacy for this therapy, in order to better understand the biological mechanisms involved, and to have an early and non-invasive indicator of the patient’s response to immunotherapy. To do this, two imaging techniques (MRI and PET) were used as in vivo monitoring tools for the biodistribution of different populations of immune cells. The first step of this work was to establish different protocols for labeling immune cells. For the PET approach, the immune cells were labeled with Zirconium 89; and for MRI, two labeling techniques were studied: the first uses iron nanoparticles, and the other uses micelles loaded with Fluorine 19. After validation of their non-toxicity, the sensitivity of each labeling was evaluated in vitro, then in vivo in a second step, thus making it possible to study the biodistribution of the immune cells after different types of injections. The labeling with Zirconium 89 was then tested on different animal models of immunotherapies (PD1/PDL1 for example). Finally, since direct markings do not allow optimal cellular monitoring in the long term, a cell labeling approach using reporter genes has been considered. It involved modifying the genome of the immune cells so that they could express an enzyme (for example the viral thymidine kinase HSV1-TK) or a transporter (such as the NIS iodine transporter) allowing the internalization of a radioactive tracer in vivo, and thus be able to carry out indirect labeling of the cells.

L’acide désoxyribonucléique se structure chez les êtres vivants de différentes façons. La plus connue est sa forme double hélice mais de nombreuses autres structures secondaires existent et notamment les G-quadruplex. Il s’agit d’une structure basée sur le repliement d’un brin d’ADN possédant des répétitions de guanines. L’association de quatre guanines entre elles par liaisons hydrogène forme un plan appelé G-quartet. Ce réseau de liaisons hydrogène est appelé appariement de Hoogsteen. L’empilement d’au moins deux quartets autour d’un cation monovalent comme le potassium ou le sodium constitue la structure G-quadruplex. Ces structures ont été très étudiées lors des vingt dernières années et il a été montré qu’elles sont impliquées dans de nombreux mécanismes biologiques tels que la réplication, la transcription, la traduction et également le maintien des télomères. La présence des G-quadruplex peut provoquer une instabilité importante aussi bien génétique qu’épigénétique. C’est pourquoi de nombreuses méthodes ont été développées afin de localiser et comprendre le rôle de ces structures in vivo. Pour cela, un large panel d’outils moléculaires a été utilisé cependant il est encore difficile, à partir de ce panel, d’apporter une réponse à toutes les questions sur l’implication des G-quadruplex au niveau du génome. Lors de ce travail de thèse, nous avons alors développés de nouvelles molécules capables de cibler sélectivement les G-quadruplex au sein d’un milieu biologique complexe à partir de deux ligands PDC et PhenDC3 affins et sélectifs pour les structures G-quadruplex.Sur la base de molécules de référence que sont PhenDC3 et PDC, de nombreux ligands ont été mis au point. D’une part, des ligands fonctionnalisés avec une biotine et/ou un groupement photoactivable ont été synthétisés afin de capturer et d’extraire des structures G-quadruplex dans un milieu biologique. D’autre part, des dérivés capables d’être fonctionnalisés in cellulo par l’utilisation de chimie bioorthogonale ont également été obtenus. Ceci permet d’ajouter une fonction (fluorescente ou biotine…) après que le dérivé ait interagi avec sa cible cellulaire. L’ensemble des composés a été évalué par des techniques biophysiques, l’expérience de FRET-melting et l’expérience de FID, afin de mesurer leur affinité pour différentes structures G-quadruplex et leur sélectivité. Nous avons proposé une relation entre les deux expériences afin d’avoir un classement de ligands le plus approprié pour les G-quadruplex.Un des objectifs majeurs de ce travail était de localiser les ligands de G-quadruplex au sein de cellules cancéreuses humaines. Dans un premier temps, toute une étude au sein de cellules fixées a été réalisée en utilisant deux réactions de chimie « click », la réaction de cycloaddition d’un azoture et d’un alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC) et la réaction de cycloaddition d’une cyclooctyne et d’un azoture (SPAAC). L’étude s’est, dans un second temps, poursuivie au sein de cellules vivantes en utilisant uniquement la réaction SPAAC à cause de la toxicité in cellulo du cuivre.Ces composés ont également été testés pour l’extraction de G-quadruplex à l’aide de billes magnétiques recouvertes d’une fonction cyclooctyne. Cependant, les résultats observés, lors de cette étude préliminaire, n’ont pas été concluants et demandent une mise au point pour optimiser le système. / Deoxyribonucleic acid has different structures in human beings. The most known is the double helix but a lot of secondary structures exist and particularly G-quadruplex. It consists of guanine-rich nucleic acid sequences. The association of four guanines through hydrogen bonds forms a plan called G-quartet. This set of hydrogen bonds is called Hoogsteen base pairs. The stacking of at least two quartets around a monovalent cation like potassium or sodium establishes the G-quadruplex. These structures have been much studied over the past twenty years. They are involved in numerous biological mechanisms like replication, transcription, translation and also telomere maintenance. G-quadruplex presence can cause an important genetic as well as epigenetic instability. That is why many methods have been developed in order to localize these structures and to understand their role in vivo. To this end, a broad panel of molecular tools has been used. However, it is still difficult to bring an answer to all the questions about the involvement of G-quadruplex at the genomic level with this panel. In this thesis work, we developed new molecular tools able to target selectively G-quadruplex in a complex biological medium from two benchmark ligands, PhenDC3 and PDC, which have very good affinity and selectivity for G-quadruplex.On the one hand, functionalized ligands have been synthetized with a biotin and/or a photoactivatable group in order to trap and pull-down G-quadruplex in various cellular contexts. On the other hand, derivative compounds which are able to be functionalized in cellulo by bioorthogonal reactions have been obtained. Once the compound interacts with its cellular target, a function (fluorophore or biotin) can be added through an orthogonal reaction. The new panel of compounds has been evaluated by biophysical techniques, FRET-melting experiment and FID assay, in order to determine their affinity to G-quadruplex and their selectivity. We proposed a relation between the two biophysical experiments in order to have a good ranking of ligands for G-quadruplex structures.One of the most important objectives of this work was to localize G-quadruplex ligands in human cancer cells. First, a complete study in fixed cells has been performed using two reactions of click chemistry: reaction of copper-catalyzed-alkyne-azide-cycloaddition (CuAAC) and reaction of strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC). Secondly, the study has been pursued in living cells using SPAAC reaction because of the toxicity of copper in cells.These compounds have also been used to extract G-quadruplex from biological systems with cyclooctyne-coated magnetic beads. However, results obtained in this preliminary study are not decisive so it could be interesting to optimize the system before concluding.

Les microscopies optiques super-résolues aident à mieux comprendre certains mécanismes biomoléculaires, notamment au sein des neurones. Nous avons construit un tel microscope de type STED (STimulated Emission Depletion) pour observer des défauts azote-lacune (NV) fluorescents dans le diamant, et avons atteint une résolution de 50 nm. À plus long terme, cet instrument permettra d’étudier l’organisation macromoléculaire de protéines impliquées dans la plasticité synaptique, et marquées avec des nanodiamants (ND) fluorescents. Dans cette perspective, nous avons étudié la limite de résolution du STED pour des ND de tailles sub-longueur d’onde. Nos expériences, menées avec l’équipe de Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) ont montré que la taille du spot STED d’un NV dans un ND pouvait atteindre 10 nm, performance similaire à celle obtenue dans un diamant macroscopique. Nous pouvons aussi résoudre plusieurs centres NV dans un ND séparés de seulement ~15 nm. Ces résultats sont en accord avec les simulations numériques faites par l’équipe de Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). En parallèle, nous avons démontré l’internalisation spontanée de ND fluorescents dans des neurones corticaux d’embryons de souris en culture primaire, et étudié leur colocalisation avec des vésicules du réseau trans-Golgi. Enfin, nous avons débuté l’étude du trafic des vésicules contenant les ND et montré qu’il dépend du réseau de microtubules. Les paramètres du mouvement sont compatibles avec ceux des moteurs moléculaires, mais nous nous attendons à ce qu’ils soient différents dans le cas de la surexpression de protéines impliquées dans le trafic (travail en cours). / Super resolution microscopy techniques are a useful tool to understand some biomolecular mechanisms, particularly in neurons. We have built such a STED (STimulated Emission Depletion) microscope for observing Nitrogen-Vacancy (NV) fluorescent defect in diamond, and have reached a resolution of 50 nm. In the longer term, this instrument will study the macromolecular organization of proteins involved in synaptic plasticity and marked with fluorescent nanodiamonds (ND). In this context, we studied the resolution limit of STED for ND of subwavelength size. Our experiments, conducted with the team of Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) showed that the STED spot size of an NV in ND could reach 10 nm, which is similar to performances obtained in a macroscopic diamond. We can also resolve several NV centers, which are separated from only ~15 nm in the same ND. These results are in agreement with numerical simulations carried out by the team of Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). In parallel, we have demonstrated the spontaneous internalization of fluorescent ND in primary culture of cortical neurons from mouse embryos, and studied their colocalization with vesicles of the trans-Golgi network. Finally, we started the study of trafficking vesicles containing ND and showed that it depends on the microtubule network. The motion parameters are compatible with those of molecular motors, but we expect them to be different in the case of overexpression of proteins involved in traffic (work in progress).

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L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est un enjeu majeur de santé publique. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est de plus en plus utilisée pour la prise en charge en urgence des patients, afin de sélectionner les patients candidats aux thérapies de reperfusion, seul traitement approuvé à ce jour. La découverte de nouvelles thérapeutiques constitue donc un véritable enjeu pour protéger le cerveau à la suite d’un AVCi. La piste des thérapeutiques anti-inflammatoires est particulièrement intéressante. En effet, il a été démontré que dans l’AVCi, l’inflammation cérébrale serait à l’origine d’une aggravation de la lésion ischémique. Il est maintenant admis que les cellules du système monocluée phagocytaire ont un rôle prédominant dans la cette réaction inflammatoire, contribuant dans certains cas aux dommages tissulaires. Plus récemment, il a également été démontré que les plexus choroïdes joueraient un rôle important dans le recrutement de cellules immunitaires au niveau de la lésion ischémique. Pour améliorer la compréhension de l’implication des cellules phagocytaires dans l’AVCi et dans les pathologies neuroinflammatoires en général, l’imagerie in vivo est un outil translationnel précieux. Au sein de notre équipe, la méthode non invasive d’IRM couplée à l’injection intraveineuse de nanoparticules d’oxyde de fer, les USPIOs, a été mise au point. Cette technique permet d’imager les cellules phagocytaires présentes au niveau de la lésion ischémique, suite à leur internalisation des USPIOs. Dans ce contexte, ma thèse s’est articulée autour des deux axes suivants : 1) Evaluer le potentiel d’une nouvelle nanoparticule multimodale, la « NanoGd », pour imager les cellules phagocytaires présentes au niveau de la lésion ischémique. Un protocole expérimental précis a été mis en place dans un modèle d’occlusion permanente de l’artère cérébrale moyenne chez la souris transgénique CX3CR1-GFP. L’originalité de notre étude repose sur le fait que ces souris ont été imagées in vivo avec des sessions d’IRM combinées à des sessions de microscopie biphotonique intravitale, nous permettant d’obtenir de précieuses informations sur les origines biologiques des signaux visualisés avec l’IRM. Nos résultats indiquent que l’imagerie multimodale de la NanoGd permettent d’imager in vivo les cellules phagocytaires à la suite d’un AVCi. 2) Evaluer le potentiel de notre technique d’IRM couplée à l’injection intraveineuse d’USPIOs comme outil pour imager in vivo l’implication des plexus choroïdes dans des phénomènes inflammatoires précoces. Pour cela, nous avons travaillé avec un modèle murin de neuroinflammation induite par injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide. La présence des USPIOs au niveau des plexus choroïdes a été quantifiée sur les images IRM à l’aide d’un système de scoring multi-opérateurs, et comparée entre le groupe de souris LPS et le groupe contrôle. Nous avons montré que l’IRM couplée à l’injection iv d’USPIOs permettait de mettre en évidence in vivo les phénomènes inflammatoires à l’intérieur des plexus choroïdes. Cette étude sur l’imagerie in vivo de l’inflammation dans les plexus choroïdes fait suite à la rédaction d’une revue sur l’imagerie clinique des plexus choroïdes en conditions physiologiques et pathologiques. Nous avons montré que les plexus choroïdes sont impliqués de nombreuses manières dans le maintien de l’homéostasie cérébrale, et que bien qu’il s’agisse d’un domaine en pleine expansion, l’imagerie clinique de ces structures est encore largement insuffisante. Ce travail de thèse a donc permis de mettre au point et de valider deux approches d’imagerie in vivo pour l’étude de l’inflammation cérébrale, dans l’AVCi et les pathologies avec une composante neuroinflammatoire, et l’utilisation de ces méthodes dans des modèles souris de neuroinflammation a d’ores et déjà permis d’améliorer la compréhension des mécanismes inflammatoires dans ces pathologies / Stroke is a major public health issue. Magnetic resonance imaging (MRI) is increasingly used for the emergency management of these patients, during the interruption of blood flow to better select patients who are candidates for reperfusion therapies, the only treatment approved to date. The discovery of new therapeutics is therefore a real challenge to protect the brain following a stroke. Among the different lines of research, anti-inflammatory therapeutics are particularly interesting. Indeed, cerebral ischemia causes an inflammatory reaction and it has been shown that the runaway of this reaction would cause an aggravation of the cerebral lesions. Although the establishment of this inflammatory reaction is still to be characterized more precisely, significant progress has been made in this area. It is now recognized that cells of the phagocytic monoclonal system play a predominant role in the establishment and maintenance of this inflammatory response, contributing in some cases to tissue damage. More recently, it has also been shown that choroid plexuses play an important role in the recruitment of immune cells to the level of ischemic injury, including circulating monocytes/macrophages. To improve our understanding of phagocytic cells involvement in ischemic stroke and neuroinflammatory pathologies in general, in vivo imaging is a promising translational tool. In our team, the non-invasive MRI method coupled with the intravenous injection of iron oxide nanoparticles, the USPIOs, has been developed and validated through pre-clinical and clinical studies. This technique enables to image the phagocytic cells present at the level of the ischemic lesion, following their internalization of the USPIOs.In this context, my thesis was articulated around the following two axes:1) Evaluate the potential of a new multimodal nanoparticle composed with gadolinium fluoride, the "NanoGd", to image phagocytic cells present in the ischemic lesion. A precise experimental protocol was implemented in a model of permanent occlusion of the middle cerebral artery in CX3CR1-GFP transgenic mouse. The originality of our study rests on the fact that these mice were imaged in vivo with MRI sessions back-to-back with intravital two-photon microscopy sessions, allowing us to obtain valuable information on the biological origins of the signals visualized with the MRI. Our results indicate that multimodal imaging of NanoGd can be used to image phagocytic cells in vivo following ischemic stroke. 2) Evaluate the potential of USPIO-enhanced MRI as a tool to image in vivo the involvement of choroid plexuses in early inflammatory phenomena. For this, we worked with a mouse model of neuroinflammation induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide. The presence of USPIOs at the level of the choroid plexuses was quantified on the MRI images using a multi-operator scoring system and compared between the LPS mouse group and the control group. We have shown with our study that the MRI coupled with the iv injection of USPIOs allowed to highlight in vivo the inflammatory phenomena inside the choroid plexuses. This study on in vivo imaging of inflammation in choroid plexuses followed the writing of a review about the clinical imaging of choroid plexuses in physiological and pathological conditions. In this study, we have shown that choroid plexuses are involved in many ways in maintaining cerebral homeostasis, and that although this is a rapidly expanding field, the clinical imaging of these structures is still largely insufficient. This work has allowed to develop and validate two in vivo imaging approaches for the study of brain inflammation, in stroke and pathologies with a neuroinflammatory component, and the use of these methods in mouse models of neuroinflammation has already made it possible to improve the understanding of inflammatory mechanisms in these pathologies

Les protéines alpha-synucléine (αsyn) et « Leucine-Rich Repeat Kinase 2 » (LRRK2), jouent toutes deux un rôle majeur dans la physiopathologie des formes sporadiques et génétiques de la maladie de Parkinson (MP). En particulier, la mutation G2019S de LRRK2, située dans son domaine kinase, est la cause la plus fréquente de formes génétiques de la MP. Il a été suggéré que l’αsyn et LRRK2 agiraient de concert pour induire la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNpc) dans cette maladie. Dans notre laboratoire, il a été montré qu’en effet LRRK2 G2019S pouvait potentialiser la mort des neurones dopaminergiques induite par l’αsyn dans la SNpc de rats, confirmant l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les deux protéines. De plus, il est connu depuis plusieurs années que les dysfonctionnements mitochondriaux joueraient un rôle central dans la MP. De nombreuses études ont montré que les deux protéines individuellement pouvaient entraîner des dysfonctionnements de cet organite. Notre hypothèse est donc que l’interaction fonctionnelle entre l’αsyn et LRRK2 pourrait passer par une action commune sur la mitochondrie. Nous avons ainsi pu montrer in vitro, dans des cultures primaires de neurones de rat surexprimant l’αsyn et LRRK2, que LRRK2 G2019S, mais pas sa forme sauvage (WT) ni sa forme sans activité kinase (DK, Dead Kinase) augmentait significativement le nombre de neurones présentant un marquage pathologique de l’αsyn (phospho-S129), sans induire de mort cellulaire. Au niveau cellulaire et moléculaire, une diminution significative du taux de production d’ATP mitochondrial a été mise en évidence dans les cellules co-exprimant LRRK2 (WT, G2019S, et encore plus DK) avec l’αsyn par rapport à celles exprimant l’αsyn seule, ceci sans différence dans la quantité totale d’ATP. Les mitochondries des neurones co-exprimant LRRK2 et l’αsyn parcouraient également de plus longues distances le long des neurites que celles des neurones exprimant uniquement l’αsyn. Pour résumer, dans ce modèle in vitro, LRRK2 augmente donc l’accumulation somatique d’une forme pathologique de l’αsyn, d’une manière dépendante de son activité kinase. Dans ces conditions, les mitochondries sont capables de maintenir leur homéostasie, notamment en adaptant leur production d’ATP. Cela semble indiquer l’existence d’un stress mitochondrial modéré, induit par la co-expression de l’αsyn et de LRRK2. / The proteins alpha-synuclein (αsyn) and Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) both play major roles in the physiopathology of sporadic and genetic forms of Parkinson’s Disease (PD). In particular, the G2019S mutation of LRRK2, located in its kinase domain, is the most prevalent cause of genetic forms of PD. It has been suggested that αsyn and LRRK2 could act together to induce the selective loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the pathogenesis of this disease. In our laboratory, it has been shown that G2019S LRRK2 could increase the dopaminergic cell loss induced by αsyn in the SNpc of rats, confirming the existence of a functional interaction between the two proteins. Moreover, it has been known for years that mitochondrial dysfunction played a major role in PD. Many studies showed that both LRRK2 and αsyn induced mitochondrial dysfunction. Therefore, we hypothesized that the functional interaction between αsyn and LRRK2 could take place through a common effect on mitochondria. We showed in vitro, in primary rat neurons, that G2019S LRRK2, but not the wild type (WT) form nor the dead kinase mutant (DK), significantly increased the number of neurons expressing a pathological form of αsyn (phospho-S129). This was not associated with any cell loss. At the cellular and molecular levels, there was a significant decrease in the mitochondrial ATP production rate in cells co-expressing LRRK2 (WT, G2019S and even more pronounced with DK) with αsyn, without any change in total ATP levels. The mean distance travelled by mitochondria along neurites was higher in neurons co-expressing αsyn and LRRK2 than in neurons only expressing αsyn. To summarize, in this in vitro model LRRK2 increases the somatic accumulation of a pathologic form of αsyn, in a kinase-dependent manner. In these conditions, mitochondria are able to maintain their homeostasis, in particular by adapting their ATP production rate. This seems to indicate a moderate mitochondrial stress induced by the co-expression of αsyn and LRRK2.

xxi, 199 p. ： ill. (some col.) / Mimicking the simplicity and efficiency of Nature in the synthesis and design of non-covalent receptors for ions in solution has piqued the interest of the chemical community since the mid 20th century. Until recently most of that focus has been on the binding, sensing, or remediation of inorganic cations instead of their anionic counterparts. With the realization of the role anions play in biological function or dysfunction, the development of selective probes for these highly solvated and elusive targets has become an important goal in the chemical and biological communities. Concurrently the optoelectronic properties of planar extended π-systems have been exploited in the development of novel light absorbing and emitting organics and carbon-rich materials with tunable optical outputs. While many of these compounds exhibit desirable sensor properties, their insolubility and non-specificity has hindered the inclusion of these materials in probes for biologically relevant substrates. This body of research seeks to combine our knowledge of supramolecular structure-function relationships with novel extended aromatic topologies to yield highly specific probes for anions in competitive media that exhibit discrete, tunable outputs upon interaction with their target substrates. Chapter I provides a brief overview of phenylacetylene topologies as they have been used in supramolecular assemblies and sensor design, with an emphasis on their use in anion-directed complexes. Chapter II focuses on our choice of specific arylethynylpyridine architectures upon which we can build a modular synthetic scheme to access working receptors. Chapter III encompasses the synthesis of urea and sulfonamide derivatives of phenylethynylpyridine and binding studies with these receptors and halide salts in organic media. Chapters IV and V focus upon the optoelectronic properties of these receptors, the tunability of their outputs and how we utilized their behavior in aqueous media to develop in vitro sensors for halides. This chapter concludes with recent results regarding their self-assembly on the micro-scale. This dissertation contains my previously published and co-authored work. / Committee in charge: Victoria DeRose, Chairperson; Michael Haley, Co-Advisor; Darren Haley, Co-Advisor; Shih-Yuan Liu, Member; David Schmidt, Outside Member

The present thesis deals with different aspects of the chemistry and photo-biology of various ferrocene-conjugates, their interaction with double helical DNA, DNA photocleavage and photo-enhanced cytotoxicity in visible light, localization and cellular uptake to study the mechanism of cell death. Phenyl analogues of the active complexes have been synthesized and used for comparison in biological assays. Chapter I presents an overview of cancer and its types, various treatments for cancer. A general overview on the Photodynamic Therapy, a new modality of light activated cancer treatment and its various possible mechanism of action, has been made. The promise of photoactivated chemotherapy is discussed with recently developed metal based antitumor agents. Biological applications of few ferrocene conjugates as anticancer and anti-malarial agents are discussed. The objective of the present investigation is also presented in this chapter. Chapter II presents the synthesis, characterization, structure, DNA binding, DNA photocleavage, photocytotoxicity and cellular localization of ferrocene-conjugated dipicolylamine oxovanadium(IV) complexes of curcumin. To explore the role of the ferrocenyl moiety the phenyl analogue of the ferrocenyl complexes is synthesized and used as a control for comparison purpose. Chapter III deals with the photo-induced DNA cleavage and photo-enhanced cytotoxicity of ferrocene-conjugated oxovanadium(IV) complexes of heterocyclic bases. The synthesis, characterization, structural comparisons, DNA binding, DNA photocleavage and photocytotoxic activity in visible light are discussed in detail. Chapter IV describes the synthesis, characterization and structure of ferrocene-conjugated oxovanadium(IV) complexes of acetylacetonate derivatives. The complexes are evaluated for DNA binding, DNA photocleavage and photocytotoxic activity in HeLa, MCF-7, 3T3 cells in visible light. The fluorescent nature of the complexes is used to study the cellular localization of the complexes and the mechanism of cell death induced by the complexes is also discussed. Chapter V presents the photocytotoxic effect of ferrocene-conjugated oxovanadium(IV) complexes of different curcuminoids in HeLa , HepG2 and 3T3 cells. Curcumin based fluorescence has been successfully used to study the cellular uptake and localization behavior of the complexes. The positive role of the ferrocenyl complex is evident from the ~4 fold increase in its photocytotoxicity compared to the phenyl analogue. The apoptotic mode of cell death is evident from nuclear co-staining using Hoechst dye. Chapter VI describes the synthesis, characterization and photochemotherapeutic efficacy of ferrocene conjugates of N-alkyl pyridinium salts. Mitochondria targeting property of ferrocene compound having n-butyltriphenylphosphonium group has been studied by JC-1 assay. FACS analysis showed significant sub G1/G0 phase cell-cycle arrest in cancer cells on visible light treatment. Finally, the summary of the dissertation and conclusions drawn from the present investigations are presented. The references in the text have been indicated as superscript numbers and compiled at the end of each chapter. The complexes presented in this thesis are represented by bold-faced numbers. Crystallographic data of the structurally characterized complexes are given in CIF format in the enclosed CD (Appendix-I). Due acknowledgements have been made wherever the work described is based on the findings of other investigators. Any unintentional omission that might have happened due to oversight or mistake is regretted. INDEX WORDS: Ferrocene conjugates Crystal structure DNA binding DNA photocleavage Photocytotoxicity Vanadium Cellular Imaging

Due to an ever-increasing global population and limited resource availability, there is a constant need for detection of both natural and anthropogenic hazards in water, air, food, and material goods. Traditionally a different instrument would be used to detect each class of contaminant, often after a concentration or separation protocol to extract the analyte from its matrix. Raman spectroscopy is unique in its ability to detect organic or inorganic, airborne or waterborne, and embedded or adsorbed analytes within environmental systems. This ability comes from the inherent abilities of the Raman spectrometer combined with concentration, separation, and signal enhancement provided by drop coating deposition Raman (DCDR) and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS). Herein the capacity of DCDR to differentiate between cyanotoxin variants in aqueous solutions was demonstrated using principal component analysis (PCA) to statistically demonstrate spectral differentiation. A set of rules was outlined based on Raman peak ratios to allow an inexperienced user to determine the toxin variant identity from its Raman spectrum. DCDR was also employed for microcystin-LR (MC-LR) detection in environmental waters at environmentally relevant concentrations, after pre-concentration with solid-phase extraction (SPE). In a cellulose matrix, SERS and normal Raman spectral imaging revealed nanoparticle transport and deposition patterns, illustrating that nanoparticle surface coating dictated the observed transport properties. Both SERS spectral imaging and insight into analyte transport in wax-printed paper microfluidic channels will ultimately be useful for microfluidic paper-based analytical device (𝜇PAD) development. Within algal cells, SERS produced 3D cellular images in the presence of intracellularly biosynthesized gold nanoparticles (AuNP), documenting in detail the molecular vibrations of biomolecules at the AuNP surfaces. Molecules involved in nanoparticle biosynthesis were identified at AuNP surfaces within algal cells, thus aiding in mechanism elucidation. The capabilities of Raman spectroscopy are endless, especially in light of SERS tag design, coordinating detection of analytes that do not inherently produce strong Raman vibrations. The increase in portable Raman spectrometer availability will only facilitate cheaper, more frequent application of Raman spectrometry both in the field and the lab. The tremendous detection power of the Raman spectrometer cannot be ignored. / Ph. D.