L'objectif de cette thèse a été d'optimiser la réponse immunitaire anti-tumorale induite par les cellules dendritiques (DC) et les cellules iNKTs, en réponse à la prise en charge du KRN7000 (a-galactosyl-céramide) par la molécule CD1d située sur les DCs. Le premier axe de travail visait à synthétiser de nouveaux analogues du KRN7000, en fonctionnalisant la position C6 du sucre et en greffant un groupement phényl sur l'une des chaînes grasses. Les études in vitro ont montré que les modifications apportées par rapport au KRN7000 n'ont pas altéré la prise en charge des molécules obtenues par les DCs. Dans tous les cas, une sécrétion de cytokines a pu être observée. Des études complémentaires visant à décrire le profil cytokinique in vivo sont en cours. Le second axe a consisté en la mise au point d'une stratégie de vectorisation du KRN7000 afin de favoriser sa présentation aux DCs, en l'associant à des molécules d'intérêt comme un peptide spécifique d'une tumeur, une molécule de ciblage des DCs ou des ligands des TLRs. Dans les conditions utilisées, le phénomène d'anergie induit classiquement par l'administration répétée du KRN7000 n'a pas pu être levé. Cependant, nous avons montré d'une part que le KRN7000 vectorisé dans les liposomes est toujours pris en charge par les cellules dendritiques, et d'autre part qu'une réponse immunitaire se traduisant par la production de cytokines par les cellules iNKTs est induite.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Facteur de transcription Ikaros / La rétine constitue un modèle très intéressant pour l'étude du développement du système nerveux. Elle origine de cellules neuroépithéliales qui se diviseront et se différencieront pour donner naissance à 6 différents types de neurones et un type de cellule gliale. Au cours du développement, la majorité des cellules progénitrices de la rétine (CPRs) sont multipotentes et quelques unes ont même le potentiel de générer tous les différents types cellulaires de la rétine. Cependant, à des stades plus tardifs, les CPRs perdent alors la compétence qui leur permet de générer les cellules dites précoces et acquièrent la capacité de générer les cellules dites tardives. Il est clair que l'ensemble des types cellulaires est produit dans un ordre bien précis et concomitant, mais les mécanismes moléculaires par lesquels les CPRs changent leur compétence au cours du temps pour générer chaque type de cellule au bon moment restent toutefois inconnus. Le facteur de transcription Ikaros avait été largement étudié dans le système hématopoïétique, cependant son rôle potentiel au niveau du système nerveux n'avait que très peu été exploré. Dans cette étude nous avons investigué l'hypothèse qu'Ikaros puisse contrôler la compétence temporelle des CPRs. Nous avons premièrement observé qu'Ikaros est exprimé dans les CPRs au début du développement tandis qu'à des stades plus avancés son expression devient alors restreinte à une sous-population pour finalement être absente dans l'ensemble des CPRs aux derniers stades du développement de la rétine. De plus, chez la rétine adulte, Ikaros est exprimé dans les neurones différenciés de type précoce. En effectuant une analyse clonale à l'aide de rétrovirus, nous avons montré qu'en induisant l'expression d'Ikaros dans les CPRs à des stades tardifs, où il n'est normalement pas exprimé, il est possible d'induire la production de cellules de type précoce au dépend des cellules produites tardivement. De plus, l'analyse de souris dont le gène Ikaros à été inactivé nous a révélé que plusieurs cellules nées précocement au cours du développement sont manquantes. L'ensemble de ces résultats suggère donc un modèle dans lequel l'expression d'Ikaros est à la fois nécessaire et suffisante pour conférer une compétente temporelle précoce au CPRs. Une fois la diversité cellulaire générée, des vagues d'apoptoses successives ont lieu de manière à éliminer les cellules extranuméraires ou corriger les erreurs de connections. La mort cellulaire programmée ou apoptose est donc un procédé essentiel au développement du système nerveux. Cependant, les régulateurs extracellulaires de cette mort cellulaire developpementale restent toutefois très méconnus. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la voie de signalisation du CNTF/LIF durant le développement rétinien in vivo. Nous démontrons que l'exposition au CNTF durant le développement postnatal de la rétine in vivo retarde l'expression de la rhodopsine et résulte en un important déficit spécifique en photorécepteurs. Plus spécifiquement, nous montrons que l'exposition au CNTF induit une augmentation importante de la mort cellulaire des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets. De plus, nous montrons que le blocage de la voie du CNTF/LIF durant le développement de la rétine de souris in vivo résulte en une diminution significative de la mort cellulaire developpementale des photorécepteurs. Nous démontrons aussi que la voie CNTF/LIF est responsable de l'apoptose spécifique des photorécepteurs issuent de clones contenant seulement des photorécepteurs sans toutefois affecter les photorécepteurs issuent de clones mixtes. Nous avons observé que la stimulation ou le blocage de la voie du CNTF/LIF contrôle l'expression génique des isoformes neuronale et endotheliale de la synthase d'oxide nitrique (NOS) et la production subséquente d'oxide nitrique (NO) à partir de ces enzymes est responsable de l'apoptose induite par CNTF . Ces résultats suggèrent donc que la voie de signalisation du CNTF/LIF est active au cours du dévelopement rétinien et agit via la régulation de la production d'oxide nitrique afin de moduler la mort cellulaire programmée des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets.

Ce document présente les notions de base permettant la conception d'un système de biodétection reposant sur la résonance des plasmons de surface. Il expose ensuite les grandes étapes de la conception du système, sa caractérisation, de même que son application à la mesure de l'activité cellulaire. Plus particulièrement, un système de biodétection basé sur la résonance des plasmons de surface a été conçu et réalisé.Ce système, intégrant deux types de détection, soit la modulation de l'angle de couplage aux plasmons de surface ainsi que la modulation de l'intensité d'un laser réfléchi sur le substrat, a été fabriqué sous la forme d'un goniomètre vertical. Un prisme sur lequel était déposé le substrat assurait le couplage de ce dernier avec un laser, permettant la mesure de la résonance des plasmons de surface.Ce système a été caractérisé quant à sa fidélité, sa sensibilité, sa plage dynamique et sa résolution. Finalement, le système a été appliqué à la mesure de l'activité de cellules vivantes induite par l'injection d'agents reconnus pour leur effet sur la morphologie des cellules. Cette application démontre qu'un biocapteur à large plage de détection peut être formé par la combinaison de la résonance des plasmons de surface et d'une monocouche de cellules vivantes.Ce biocapteur permet de détecter en temps réel des agents chimiques ou biologiques induisant des changements morphologiques dans la cellule.

L'objectif de ce projet consiste à identifier des molécules fluorescentes, naturellement présentes dans les cellules, et dont l'évolution de leur concentration sera représentative du comportement métabolique de cellules en suspension. Ces molécules pourront servir au suivi du métabolisme cellulaire en temps réel durant une culture. Un besoin pour ce type d'outils se fait sentir afin de pouvoir développer et optimiser des bioprocédés, dont ceux utilisant des cellules végétales indifférenciées en suspension. La première étape fut la sélection et la caractérisation expérimentale de 11 molécules candidates à l'aide d'un spectrophomètre équipé d'un monochromateur quadruple. Après la réalisation des empreintes optiques des molécules, 16 zones d'intérêt dans le spectre d'autofluorescence furent identifiées et suivies dans le temps. Les signaux de la suspension complète, du milieu et des cellules filtrées furent analysés afin d'identifier 10 marqueurs métaboliques, caractérisés par 10 couples de longueurs d'ondes corrélés à des variables de culture. Cette méthode a permis d'identifier dix marqueurs métaboliques dans la suspension complète et laisse entrevoir la possibilité de plusieurs autres dans le milieu et les cellules filtrées. Le fait que certains marqueurs puissent se valider entre eux rajoute à la puissance de cette méthode. Il a donc été démontré que l'autofluorescence des cellules de plante indifférenciées en suspension contient assez d'information pour permettre le suivi de la croissance cellulaire en temps réel. La prochaine étape sera donc de valider ces marqueurs sur d'autres types de cellules.

Le collagène occupe une place importante au niveau de plusieurs champs d'étude. En plus d'être reconnu, dans le domaine de la biologie cellulaire, pour ses propriétés adhésives aux cellules environnantes, physiologiquement le collagène contribue au maintien de l'unité fonctionnelle des organes grâce à son rôle de soutien.Le collagène répond également à maints champs d'exploitation, dont la cosmétologie, pour son apport hydrique, la chirurgie, vu sa propriété d'agrégant plaquettaire et de colle lors de suturation des plaies, mais également celui de l'orthopédie où le collagène sert à la régénérescence osseuse. Cependant, les collagènes utilisés dans ces sphères d'activités, sont majoritairement d'origine bovine, ovine, caprine ou murine. Étant donné que le collagène d'origine mammifère est susceptible d'être contaminé par des prions et donc de transmettre à l'humain l'encéphalopathie spongiforme bovine, une maladie mortelle, et que le collagène de queue de rat n'est disponible qu'en petite quantité et sous une forme dénaturée, nous avions pour objectif d'analyser les particularités d'un nouveau collagène natif extrait de la peau de poissons d'eau chaude. Dans cette étude, nous avons utilisé les cellules épithéliales intestinales humaines indifférenciées HIEC comme modèle cellulaire, afin de comparer la morphologie, l'adhésion, la différenciation et la prolifération des cellules cultivées sur le collagène natif marin à celles cultivées sur le collagène de queue de rat standard. Les résultats obtenus par diverses méthodes dont la microscopie à contraste de phase, les tests d'adhésion, l'immunobuvardage de type Western, le RT-PCR et l'immunofluorescence indirecte ont permis de démontrer de grandes similitudes entre les deux types de collagène analysés. Les résultats obtenus démontrent que le collagène natif marin est très semblable au collagène de queue de rat, en ce qui a trait à son aspect adhésif et son incapacité à induire la différenciation cellulaire. D'autre part, le collagène marin adopte une conformation structurale beaucoup plus organisée, sous forme de fibrilles trimériques, alors que la solution de collagène de queue de rat contient principalement que des monomères. De plus, le collagène marin semble être significativement moins proprolifératif [i.e. prolifératif] que le collagène de queue de rat. Cette particularité nous paraît bien intéressante, puisque le collagène natif marin pourrait avoir de nombreuses retombées sur le marché thérapeutique, afin de soulager les patients atteints de maladies associées avec une hyperprolifération comme le psoriasis. Un baume à base de collagène marin serait en mesure de réduire la prolifération des cellules épidermiques et par le fait même limiter la progression des lésions, par exemple. Plusieurs laboratoires de recherche pourront bénéficier des propriétés comparables du collagène natif marin à moindre coût et plus sécuritaire pour la santé.

Le PAF (Platelet-Activating Factor) est un médiateur reconnu pour son implication dans plusieurs effets physiologiques et pathologiques, particulièrement les états inflammatoires. À l'instar du PAF, les lymphocytes T Th17 sont aussi reconnus comme exerçant un rôle majeur dans la physiopathologie des maladies auto-immunes. L'objectif de ce projet est de déterminer s'il existe un lien entre ces deux composants. En fait, nous avons émis l'hypothèse que le PAF pourrait provoquer une production de cytokines spécifiques par les cellules présentatrices d'antigène qui elles, interagissant avec les lymphocytes T, pourraient mener ultimement à une différentiation en Th17. En effet, les cellules T ne peuvent interagir directement avec le PAF puisqu'elles n'expriment pas de récepteur pour celui-ci à leur surface. Les cellules T Th17 expriment un facteur de transcription spécifique RORr, nécessitent absolument la sous-unité IL-23p19 pour leur expansion et produisent IL-17. Nous avons donc, dans un premier temps, regardé la capacité d'un type de cellules présentatrices d'antigène, les cellules de Langerhans à produire IL-23p19 en réponse au PAF. Ensuite, nous avons mis en contact ces cellules de Langerhans pré-stimulées au PAF avec des lymphocytes T activés pendant 5 jours pour vérifier l'expression de RORII et la production d'IL-17 dans ces lymphocytes T, plus précisément les lymphocytes T CD4 + . Cette étude nous a permis de mettre en évidence que certains éléments impliqués dans les processus inflammatoires sont possiblement inséparables et interagissent probablement les uns avec les autres pour mener aux séquelles multiples de l'inflammation.

Les produits de glycation avancée résultent d'une réaction chimique entre les sucres réducteurs, comme le glucose, avec les protéines et ainsi causer la réticulation des tissus exposés. L'hyperglycémie chronique observée dans la pathologie du diabète expose les tissus à des concentrations de glucose beaucoup plus importantes et amplifie la formation de réticulations. Les tissus vasculaires sont la voie de distribution périphérique du glucose et en sont donc directement exposés. La réticulation du système circulatoire serait la cause de complications majeures associées au diabète. Afin de mieux comprendre l'impact de la réticulation sur les vaisseaux sanguins, nous avons effectué des analyses mécaniques de différents éléments structurels composant les tissus vasculaires comme le collagène et les cellules endothéliales. Nous avons, dans un premier temps, étudié les propriétés mécaniques du collagène dans des expériences mécaniques sur des fibres de collagène. La microscopie à force atomique nous a permis d'identifier des déterminants structuraux majeurs dans la compréhension de la mécanique d'élongation des tissus de collagène. Des expériences mécaniques, suite à une réticulation par les produits de glycation avancée, ont révélé que le collagène réticulé perd une grande partie de sa capacité à dissiper la tension appliquée à sa structure. De plus, dans la phase"Toe", représentant le régime de fonctionnement physiologique et associée à une phase de déformation non linéaire, les fibres de collagène requièrent une dépense d'énergie beaucoup plus importante pour leur déformation. Le collagène réticulé par les produits de glycation avancée s'avère effectivement beaucoup plus rigide et cohésif. Ainsi, dans le contexte d'un tissu vasculaire, la réticulation par les produits de glycation avancée pourrait affecter leurs propriétés mécaniques ce qui aurait des impacts directs sur la rigidité et la compliance des vaisseaux sanguins. Parallèlement, nous avons mesuré l'impact de la réticulation sur la rigidité des cellules endothéliales suite à une exposition chronique à de fortes concentrations de glucose par une méthode de spectroscopie de force dérivée de la microscopie à force atomique. Les cellules endothéliales exposées à une forte concentration de glucose sont beaucoup plus rigides. Cette rigidité accrue serait associée à la formation de réticulations par les produits de glycation avancée. L'hyperglycémie diabétique favorise la réticulation de l'endothélium pour en modifier sa structure et affecter ses fonctions. Nous pensons que les impacts de la réticulation sur ces deux éléments des tissus vasculaires sont des facteurs majeurs de la rigidification des vaisseaux sanguins et de la dysfonction endothéliale. Ces phénomènes sont d'ailleurs clairement identifiés comme des causes directes des complications associées au diabète comme l'hypertension et l'artériosclérose.

La première étape de la réponse immune est réalisée par des cellules "sentinelles": les cellules dendritiques (DC). Elles ont à la fois un rôle de surveillance de l’organisme et une capacité unique à alerter les lymphocytes T naïfs. Leur efficacité à présenter des antigènes rencontrés en périphérie à des lymphocytes résidant dans les organes lymphoïdes résulte d’une spécialisation de fonction au cours du temps. A l’état immature, elles capturent et apprêtent les antigènes protéiques au niveau de divers organes, mais ont une faible capacité stimulatrice. Par contre, à l’état mature, elles perdent la capacité de capturer des antigènes, acquièrent celle de sensibiliser des lymphocytes T et migrent vers les organes lymphoïdes. Cependant, des DC immatures sont présentes dans les organes lymphoïdes en contact avec les cellules T laissant supposer qu’elles pourraient jouer d’autres rôles que celui de sentinelles. L’immunisation de souris par injection de DC immatures ou matures nous a permis de mettre en évidence un rôle potentiel des DC immatures. Ces dernières induisent en effet une prolifération des cellules T CD4 et leur différenciation en cellules de mémoire en absence de réponse primaire effectrice (absence d’IFN-) suite à une production d'IL-10. La différenciation de cellules de mémoire par des DC immatures pourrait être un mécanisme permettant d’alerter le système immunitaire lors d’infections limitées ou dans un contexte peu activateur (en présence d'IL-10) ne nécessitant pas l’induction de réponse immune immédiate. De plus, les DC spléniques immatures et matures semblent migrer des sites d’immunisation vers la zone des cellules T des ganglions drainants dans les mêmes proportions. La migration est un mécanisme impliquant les DC injectées mais aussi une activité physiologique des souris immunisées: aucune migration n’est observée chez des souris anesthésiées. En outre, les résultats obtenus au cours de cette étude suggèrent qu’un transfert de membranes pourrait avoir lieu entre les DC injectées et celles de l’organisme receveur. Ce mécanisme permettrait d’amplifier le signal antigénique exposé par les DC migrant de la périphérie.

Résumé Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) sont considérées comme quantitativement et qualitativement supérieures aux autres types cellulaires pour la synthèse des interférons (IFNs) de type I lors d’une infection virale. Plusieurs observations viennent supporter cette désignation. Tout d’abord, elles expriment un éventail très large des sous-types d’IFN-alpha en comparaison aux autres types cellulaires. Par ailleurs, elles possèdent la capacité de détecter la présence des virus via leurs TLR7 et TLR9, reconnaissant respectivement l’ARN ou l’ADN d’origine virale. Enfin, elles expriment de manière constitutive dans leur cytoplasme le facteur de transcription IRF-7 qui permet une synthèse rapide et robuste des IFNs de type I en réponse à l’infection. Dans un précédent travail, il a été montré que les pDCs néonatales présentent un défaut majeur de synthèse d’IFN-alpha en réponse aux CpG ODNs, ligands du TLR9. Nous avons ensuite étendu notre étude des pDCs néonatales en les stimulant avec le R-848, ligand du TLR7, mais également en présence de virus tels que HCMV et HSV. Dans ces conditions également, la synthèse de l’IFN-alpha est déficiente dans les pDCs du nouveau-né. Nous avons également observé une déficience de production de l’IFN-beta suite à une stimulation via les ligands TLR7 et TLR9, tant au niveau protéique que de l’expression de l’ARN messager. Par ailleurs, la synthèse des cytokines/chimiokines inflammatoires par les pDCs du sang de cordon ainsi que leur maturation, fonctions dépendantes du facteur NF-kappaB, sont également diminuées en comparaison aux pDCs adultes, suite à une stimulation en présence du CpG ODN ou du R-848. L’ensemble de ces données nous a amené à étudier de manière plus précise les voies de signalisation des pDCs néonatales suite à leur activation. Tout d’abord, nous avons observé que les taux d’expression des TLR7 et 9 tout comme le taux basal d’IRF-7 sont équivalents dans les pDCs néonatales et les pDCs adultes. Ensuite, grâce à la technique d’ImageStream (Amnis corporation), nous avons pu quantifier la translocation nucléaire des facteurs de transcription IRF-7 et de NF-kappaB dans les pDCs activées. Nous avons ainsi pu observer que la translocation de NF-kappaB est comparable dans les pDCs adultes et néonatales en réponse aux ligands TLR7 ou TLR9. Par contre, elle est déficiente lors d’une stimulation par HSV. La translocation du facteur IRF-7, quant à elle, est significativement déficiente en réponse au CpG ODN et au virus HSV dans les pDCs néonatales. Nous proposons que le défaut de translocation d’IRF-7 mis en évidence dans les pDCs néonatales pourrait en partie expliquer la déficience de synthèse des IFNs de type I de ces cellules et fournir une base moléculaire à la plus grande susceptibilité du nouveau-né vis-à-vis des infections virales.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.