Les gliomes sont les tumeurs cérébrales primitives les plus fréquentes de l’adulte. Le glioblastome (grade IV) en est la forme la plus agressive, caractérisé par sa résistance aux traitements actuels (chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie). La mortalité de cette pathologie est quasi constante (survie médiane de 15 mois), ce qui justifie l’importance de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Le challenge est d'arriver à identifier des marqueurs spécifiques pour proposer un schéma thérapeutique alignant des stratégies de thérapies ciblées qui vont améliorer la prise en charge clinique, la survie globale et la survie sans progression des patients atteints de ces pathologies. Deux axes sont au centre des recherches fondamentales, translationnelles et cliniques. Le premier axe se définit autour du développement de molécules inhibitrices des voies de signalisation et le second autour du concept de cellules souches tumorales (CST) de glioblastomes (GBM) découvertes récemment dans le cerveau et qui révolutionnent la conception de la transformation tumorale.ASPM (Abnormal Spindle Like Microcéphaly Associated) est une cible candidate pertinente susceptible de participer au développement des gliomes (Horvath et al., 2007 ; Hagmann et al., 2008). Cette protéine régule la prolifération des neuroblastes, elle est fortement exprimée au stade embryonnaire, mais, reste faiblement exprimée dans le cerveau adulte. Par ailleurs, ASPM est impliquée dans divers processus de cancérisation (surexprimée dans les cancers du sein, du foie et du cerveau…), toute fois, le mécanisme responsable de cette dérégulation n’est pas encore bien caractérisé.Nos études menées sur une série de 169 gliomes humains, sélectionnés à partir de notre cohorte de patients, montrent que le gène ASPM est un marqueur de la progression vers la malignité, les grades les plus élevés exprimant le plus fortement ASPM. En outre, nous avons également montré que le niveau des transcrits d’ASPM est augmenté dans les récidives de gliomes et qu’en in vitro, ASPM contrôle la formation des gliomasphères (CST de GBM) avec une augmentation de l’expression de ses transcrits dans les cultures in vitro au fil des passages. En continuité de ces observations, nous avons alors développé un sh-miR-RNA spécifique d’ASPM permettant l’extinction post-transcriptionnelle de ce gène. Les résultats obtenus in vitro montrent que la perte d’expression d’ASPM conduit à un arrêt de la prolifération et aboutit à une mort cellulaire massive.Actuellement, des modèles de greffe de gliomasphères chez la souris (orthotopique) sont en cours de développement pour confirmer les effets observés in vitro et vérifier in vivo la validité de notre approche thérapeutique. En perspective, nous tenterons d’étudier les effets du silencing d’ASPM sur la voie de signalisation la plus dérégulée (pRB / E2F ou PI3K / AKT). Enfin, nous étudierons le rôle potentiel de cette protéine dans le contrôle du cycle cellulaire, et, in fine la mise en évidence de ses partenaires… / Glioblastoma (GBM) is the most frequent and aggressive form of primary brain tumors in adults; it is characterized by its resistance to current treatments (surgery, chemotherapy and radiotherapy). The prognosis is grim with a median survival of only 15 months underlining the importance to develop new therapeutic strategies. The recent development of the “tumor stem cell” (TSC) concept in hemopathies has been secondarily applied to gliomas with the identification of subpopulations of GBM cells which express neural stem cell markers and fulfill the criteria for stemness. Some evidences also suggest that this subpopulation could play a primary role in resistance to radio- and chemotherapy.ASPM (Abnormal Spindle Like Microcephaly Associated) is a protein regulating the proliferation of neuroblasts, highly expressed in the embryonic stage but weakly expressed in the adult brain. Preliminary reports suggesting that it could be involved in the development of gliomas (Horvath et al., 2007, Hagemann et al., 2008) prompted us to analyze further the role of this protein, focusing on its potential as a relevant candidate therapeutic target. In a series of 175 gliomas samples of various grades, we found that ASPM mRNA expression was strongly correlated with increasing tumor grade. We also found that ASPM expression increased at recurrence when compared to the initial lesion. Subsequently, we could demonstrate in vitro and in vivo that ASPM expression also increased over serial passages in gliomaspheres and in a mouse glioma xenograft model. In a therapeutic perspective, the effect of lentivirus-mediated shRNA post-transcriptional silencing of ASPM was evaluated in two different gliomasphere models and a dramatic proliferation arrest and cell death was observed. Taken together, these data suggest that ASPM is involved in the malignant progression of gliomas, possibly through expansion of a cancer stem cell compartment, and could be an attractive therapeutic target in glioblastoma multiforme.Another potential candidate tumor stem cell target in glioma is the sonic hedgehog pathway (hedgehog-Gli) which is required for GBM growth and stem cell expansion. In a collaborative study, it was found that NANOG, a transcription factor critically involved with self-renewal of undifferentiated embryonic stem cells, modulates gliomasphere clonogenicity, CD133+ stem cell behavior and proliferation. NANOG was regulated by hedgehog-Gli signalling and was essential for GBM tumourigenicity in orthotopic xenografts suggesting that it could also be a useful potential therapeutic target.Conclusions: Accumulating evidences suggest that tumor stem cells play an important role in the oncogenesis of gliomas and in their resistance to treatment. Our data support this concept and suggest that specific stemness markers may become useful targets to improve treatment of this devastating disease.

En fin de cytocinèse, le fin pont cytoplasmique qui relie les deux cellules filles est clivé au niveau d’une structure dense en microtubules, le midbody, et permet ainsi la séparation physique de leurs deux cytoplasmes. Les mécanismes cellulaires et moléculaires de ce processus, appelé abscission, sont très étudiés dans des modèles de cellules en culture. Cependant, ils restent encore mal connus dans le contexte d’un organisme en développement. L’ovogenèse de drosophile est un modèle de choix pour l’étude de la régulation développementale de l’abscission. En effet, des cellules à abscission complète (cellules souches germinales) et incomplète (cystes germinaux) sont situées côte à côte au sein de la même unité développementale, le germarium. Les cellules souches se divisent asymétriquement, pour donner une autre cellule souche et un cystoblaste individualisé. Celui-ci entre en alors en différenciation, un programme au cours duquel il réalise quatre cycles cellulaires synchrones au cours desquels la cytocinèse est incomplète. Un cyste germinal de seize cellules interconnectées est ainsi formé. La durée de l’abscission est régulée précisément et dépend du contexte développemental. Notre laboratoire a récemment montré que les kinases Aurora B et Cdk1/ Cyclin B sont des régulateurs de la durée d’abscission dans les cellules germinales de drosophile et en cellules en culture de vertébrés. Mon travail a consisté à explorer la fonction de la protéine Shrub, un membre du complexe ESCRT-III, au cours de l’abscission dans la lignée germinale femelle de drosophile. Nous avons montré que Shrb est localisé au midbody des cellules souches en fin de cytocinèse, et promeut l’abscission. En effet, nous avons montré qu’une réduction du niveau de Shrub dans la lignée germinale provoque un fort délai de l’abscission des cellules souches, supérieur à la durée de leur cycle cellulaire. La cellule souche et son cystoblaste restent donc connecté jusqu’à la mitose suivante, formant ainsi des structures de plusieurs cellules connectées, appelées stem-cyst . L’abscission tardive au sein du stem cyst libère un progéniteur binucléé qui entre en différenciation. En conséquence, des chambres ovariennes à 32 cellules, au lieu de 16, sont formées. De plus, la fonction de Shrub dans l’abscission semble être contrecarrée par Aurora B, puisqu’une réduction des niveaux d’Aurora B dans des hétérozygotes Shrub réduit le nombre de stem-cysts et de chambres à 32 cellules observés. Enfin, nous avons identifié un nouveau facteur impliqué lors de l’abscission, la protéine Lethal giant discs (lgd), dont la perte de fonction induit, comme celle de Shrub, la formation de stem-cysts. En accord avec son rôle dans l’abscission, nous avons montré que Lgd est localisé au midbody. Lgd est requis pour la fonction de Shrub dans la voie endosomale, mais son implication lors de la cytocinèse était inconnue. Nous avons montré qu’un niveau réduit de Lgd augmente le nombre de stem-cysts des hétérozygotes Shrub, indiquant que Lgd et Shrub fonctionnent ensemble pour l’abscission des cellules souches. De façon surprenante, un nombre réduit de chambres à 32 cellules est observé dans ces ovaires, suggérant une fonction antagoniste de Lgd sur Shrub dans les cystes germinaux. Dans ces cystes, une abscission tardive se produit, qui divise en deux cystes de 16 cellules les cystes de 32 cellules, et expliquant ainsi le paradoxe observé (plus de stem-cysts, mais moins de chambres à 32 cellules). / At the end of cytokinesis, a thin cytoplasmic intercellular bridge is cleaved to allow physical separation of the two daughter cells. This process is called abscission, and its cellular and molecular events have been extensively explored in yeast and isolated mammalian cells. However, how abscission is regulated in different cell types or in a developing organism remains poorly understood.Drosophila oogenesis is a great model to study how abscission is regulated developmentally, as within the same developmental unit, the germarium, we find cells undergoing abscission next to others where this process is blocked. Indeed, the germline stem cell (GSC) divides asymmetrically to give rise to another GSC and to an individualized cystoblast. This cell then enters a well-studied process of differentiation, where through four rounds of mitosis with incomplete cytokinesis, gives rives to a cyst of 16 interconnected cells. The duration of abscission, seems to be tightly regulated and dependent on the developmental context. Our lab has recently discovered that AurB and CycB/Cdk1 function as abscission timers in Drosophila GSC and isolated mammalian cells. Thus, my work consisted in exploring how this process is regulated in the Drosophila female germline.We showed that the ESCRT-III protein Shrb localizes to the midbody of the dividing GSC, functioning to promote abscission. Indeed, we found that reduced levels of Shrb resulted in the blockage, or strong delay, of abscission in the GSC and formation of a structure similar to a cyst. In these so called stem-cysts, the GSC keeps dividing while interconnected to its daughter cells. As a consequence, we saw the appearance of egg chambers formed of 32 cells, instead of 16. Furthermore, Shrb function in abscission seems to be counteracted by AurB, as reducing AurB levels in Shrb heterozygous resulted in decreased stem-cysts and 32-cell cysts. Finally, Lethal giant discs (lgd), required for Shrb function in the endosomal pathway, was also seen localizing at the midbody and regulating abscission in GSCs. Removing one copy of Lgd from Shrb heterozygous increased the number of stem-cysts, but surprisingly the number of 32-cell cysts was reduced. This paradoxical result was explained with the observation of late abscission events in mitotic cysts, which divided the 32-cell cysts in the middle, leading to the formation of two cysts of 16 cells.

La voie de signalisation Hedgehog (Hh) joue un rôle fondamental au cours du développement embryonnaire et participe au maintien des niches neurogéniques dans le cerveau adulte (Ruat et al, 2015). Son activation requiert la liaison d’un peptide Hh sur le récepteur Patched (Ptc) qui réprime l’activité constitutive de Smoothened (Smo), un membre de la classe F des récepteurs couplés aux protéines G (Wang et al, 2013). La dérégulation de la voie Hh peut conduire au développement de tumeurs, comme les médulloblastomes ou les carcinomes basocellulaires. Des agonistes et des antagonistes de Smo ont été développés et présentent un intérêt thérapeutique dans le traitement des maladies neurodégénératives et des tumeurs Hh-dépendantes, respectivement (Ruat and Hoch, 2015). Les études cristallographiques du Smo humain (hSmo) complexé à différents ligands ont identifié deux types d’antagonistes ; ceux se liant principalement aux boucles extracellulaires de Smo (site 1, comme le LY2940680) et ceux se liant plus profondément dans la cavité transmembranaire (site 2, comme le SANT 1) (Ruat et al, 2014).Mes travaux de thèse ont conduit à la caractérisation du composé acylguanidine MRT-92, l’un des plus puissants antagonistes du récepteur Smo. Le MRT-92 inhibe différentes réponses biologiques induites par l’activation de la voie Hh, notamment la prolifération des précurseurs des cellules granulaires du cervelet de rat avec une affinité sub-nanomolaire. Le MRT 92 bloque aussi la translocation de Smo dans le cil primaire induite par l’activation de la voie Hh. Le développement de sa forme tritiée [3H]MRT-92 (Kd = 0.3 nM pour hSmo) a permis d’étudier les interactions des modulateurs avec le récepteur hSmo et d’analyser les résistances associées aux mutations de hSmo. Le composé MRT 92 se lie au récepteur hSmoD473H, résistant au traitement par le GDC-0449, suggérant son intérêt thérapeutique pour le traitement de cette résistance. Par une modélisation moléculaire et une étude de mutagenèse, j’ai identifié que le MRT-92 se lie sur un nouveau site au niveau du domaine transmembranaire de Smo qui se superpose aux sites 1 et 2 préalablement décrits. Le développement d’un modèle pharmacophorique des agonistes de Smo a permis le criblage virtuel d’une banque de molécules et l’identification du composé quinolone GSA-10. Le GSA-10 stimule une voie Hh non canonique qui permet la différenciation des cellules mésenchymateuses C3H10T1/2 en ostéoblastes en se fixant au récepteur Smo. Contrairement au composé SAG, agoniste de référence de Smo, le GSA-10 n’induit pas de prolifération cellulaire des cellules granulaires du cervelet de rat et n’augmente pas la transcription des gènes cibles de la voie tels que Gli1 et Ptc. Le GSA-10 est la première molécule agoniste de Smo qui n’induit pas sa translocation au cil primaire. De plus, nous avons observé que la forskoline, un inhibiteur de l’adénylate cyclase, est un régulateur positif et négatif de la différenciation ostéoblastique induite par le GSA-10 et le SAG, respectivement. Le GSA-10 nous a également permis de mettre en évidence deux formes conformationnelles de Smo, SmoSAG et SmoGSA-10, pouvant être discriminées pharmacologiquement par les antagonistes de Smo. Plusieurs antagonistes comme le GDC-0449, le CUR61414, la cyclopamine ou le MRT-92 perdent leur sensibilité pour inhiber le SmoGSA-10. L’ensemble de ce travail a conduit au développement de nouveaux outils pharmacologiques qui pourraient permettre d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité du récepteur Smo et permettre le développement de nouvelles molécules en clinique pour le traitement des tumeurs du cerveau Hh-dépendantes. / The Hedgehog (Hh) signaling pathway plays a critical role during embryogenesis and participates to the maintenance of neural stem cells in the adult brain (Ruat et al, 2015). Its activation requires the binding of a Hh peptide to its receptor Patched (Ptc) which represses the constitutive activity of Smoothened (Smo), a member of class F G-protein-coupled receptors (Wang et al, 2013). Deregulation of the Hh pathway is associated with the development of tumors, such as medulloblastoma and basal cell carcinoma. Agonists and antagonists of Smo are candidates for the treatment of degenerative diseases and Hh-linked tumors, respectively (Ruat and Hoch, 2015). Crystallization studies of human Smo (hSmo) bound to different ligands have identified two types of 7 transmembrane-directed antagonists : those binding mostly to extracellular loops (site 1, e.g., LY2940680) and those penetrating deeply in the 7-transmembrane cavity (site 2, e.g., SANT-1) (Ruat et al, 2014).The present work allowed the caracterization of the acylguanidine MRT-92, one of the most potent Smo antagonist. MRT-92 inhibits Smo induced-responses in different cell-based assays, notably the proliferation of rat cerebellar granule cell with nanomolar potency. We developed its tritiated derivative [3H]MRT-92 (Kd= 0.3 nM for hSmo) for creating a comprehensive framework for the interaction of small molecule modulators with hSmo and for understanding chemoresistance linked to hSmo mutations. MRT-92 binds to the mutated hSmoD473H receptor resistant to GDC-0449 treatment, suggesting its therapeutic interest for the treatment of this resistance. Guided by molecular docking and site-directed mutagenesis data, we demonstrated the existence of a third type of Smo antagonists represented by MRT 92 that simultaneously recognized and occupied both sites 1 and 2.The development of a pharmacophoric model of Smo agonists allowed a virtual screening strategy to identify the GSA-10 compound, a quinolinecarboxamide. GSA-10 stimulates a non-canonical Hh pathway allowing C3H10T1/2 mesenchymal cells differentiation into osteoblasts. However, GSA-10 does not induce Gli-dependent reporter gene transcription nor rat cerebellar granule cell proliferation, and it does not regulate the subcellular localization of Smo at the primary cilium. Moreover, we observed that forskolin, a known activator of adenylate cyclase, is a positive and negative regulator of GSA-10 and SAG-mediated cell differentiation, respectively. Our data provide also evidences for two different conformational forms of Smo named SmoSAG and SmoGSA-10, which can be pharmacologically discriminate by Smo antagonists. Different antagonists including GDC 0449, CUR61414, Cyclopamine and MRT-92 loose their sensibility to inhibit SmoGSA-10.The present work allowed the identification of new pharmacological tools which should be useful for understanding the mechanisms underlying the resistance of Smo inhibitors in cancer cells and may help to design new therapies with improved pharmacological properties for treating Hh-linked brain tumors.

Contrairement aux mammifères adultes, la rétine des amphibiens possède la particularité de croître durant toute la vie de l'animal grâce à l'activité continue d'une population de cellules souches localisée au sein d'une niche bien délimitée, la zone marginale ciliaire (ZMC). Ce modèle offre ainsi la possibilité d'étudier in vivo les mécanismes moléculaires à l'origine du maintien et de la prolifération des cellules souches neurales à des stades post-embryonnaires. Dans ce but, l'identification et la caractérisation des différentes voies de signalisation présentes au sein de la niche biologique des cellules souches rétiniennes est une première étape indispensable. Mon projet de thèse a été divisé en deux objectifs principaux: l'étude des interactions entre les voies Wnt et Hedgehog au sein de la ZMC chez le xénope et la réalisation de l'étude fonctionnelle de Yap, l'effecteur principal de la voie de signalisation Hippo dans ce modèle. Par des approches génétiques et pharmacologiques, la première partie de ce projet a permis de mettre en évidence un antagonisme inattendu entre les signaux Wnt et Hedgehog au sein de la ZMC qui régule l'activité proliférative des cellules souches et des progéniteurs rétiniens. Ce travail nous a conduit à proposer un modèle dans lequel ces deux voies réguleraient la balance prolifération/différenciation dans la rétine post-embryonnaire. Dans un deuxième temps, les expériences de gain et de perte de fonction du gène Yap ont montré que ce dernier joue un rôle essentiel dans la régulation du programme temporel de la phase de réplication de l'ADN des cellules souches rétiniennes. En effet, l'inhibition de Yap entraîne une importante réduction de la durée de la phase S du cycle cellulaire associée à une instabilité génomique. Une surexpression de c-Myc et de la voie p53-p21 semble impliquée dans ce phénotype. Nos travaux nous ont également permis d'identifier un nouveau partenaire de YAP, le facteur de transcription PKNOX1. L'ensemble de ces données nous a ainsi conduit à proposer un modèle selon lequel le complexe YAP/PKNOX1 pourrait être nécessaire au bon déroulement de la phase de réplication des cellules souches, indispensable à la maintenance de l'intégrité du génome de ces cellules et de leur descendance. / In contrast to the adult mammals, the retina of amphibians shows continuous growth during adulthood through active neural stem cells localized in the defined niche called ciliary marginal zone (CMZ). This model offers an exceptional tool to study in vivo the molecular mechanisms involved in the maintenance and proliferation of neural stem cells during post-embryonic stages. In this order, the identification and the characterization of the signaling pathways acting in biological retinal stem cell niche is an essential step.My PhD research was divided in two main parts: the study of the interaction between the Wnt and Hedgehog pathways within the CMZ and the functional study of Yap, the downstream effector of the Hippo pathway in this model. By using genetic and pharmacological tools, the first part of this project demonstrated an unexpected antagonism between the Wnt and the Hedgehog signaling in the CMZ that regulates proliferative activity of retinal stem and progenitor cells. In this article, we propose a model in which an antagonistic interplay of Wnt and Hedgehog pathways may regulate the balance proliferation/differentiation in the post-embryonic retina. Second, gain and loss of function experiments of Yap have shown that this factor plays a key role in the regulation of temporal replication of DNA retinal stem cells. Indeed, inhibition of Yap leads to strong reduction of the S-phase length during the cell cycle associated with genomic instability. c-Myc and p53-p21 overactivation seems to be involved in this phenotype. This work also allowed us to identify a novel YAP partner, the transcriptional factor PKNOX1. We indeed propose a model in which the YAP/PKNOX1 complex may be required for the successful convening of the replication phase on stem cells, essential for the maintenance of genome integrity on the cells and their progeny.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse ont été intensivement étudiées pour leur capacité de régénération et leurs propriétés immunomodulatrices. Beaucoup d’études ont montré que la thérapie qui utilise les CSM améliore les fonctions de tissu ostéo-articulaire particulièrement le cartilage en vue de leur capacité de différenciation en chondrocytes. Les CSM présentent un certain nombre d'avantages pour la médecine régénérative, ces cellules peuvent être facilement isolées et multipliées en culture pour obtenir un nombre approprié pour la thérapie cellulaire. De plus, elles ont une faible immunogénicité, ce que les rende aptes à la transplantation allogénique. Depuis les années 1960, de nombreuses études ont souligné les propriétés médicinales des polysaccharides notamment les β-glucanes qui ont une place particulière du fait de leurs effets immunostimulants. L’objectif de notre travail était de mettre en évidence les capacités d’un β-glucane particulier, la laminarine, sur la prolifération et la différenciation des CSM dans la perspective d’applications dans l’arthrose. Les CSM ont été cultivés dans les milieux de croissance et de différenciation chondrocytaire. La viabilité et l'apoptose des cellules ont été explorées par le comptage, les tests MTT et la coloration à l'annexine V. En outre, l'analyse des protéines spécifiques de la prolifération a été effectuée par le western blott. De plus, l'expression des marqueurs spécifiques des CSM et des chondrocytes a été étudiée à l'aide de la RT-qPCR et de l’immunofluorescence. Nos résultats ont démontré que la stimulation des CSM à la laminarine avec la dose de 1 mg/ml soit en condition de culture de croissance basique ou en chondrogenèse a inhibé la prolifération des cellules sans induire leur apoptose. Encore, dans les conditions de culture chondrogénique, la laminarine à une dose similaire a empêché la différenciation des CSM en chondrocytes. / Mesenchymal stems cells (MSCs) are a population of multipotent cells residing in several readily available adult tissue compartments, thus allowing for their ex vivo expansion. MSCs have a reliable potential for differentiation (plasticity) into cells of the mesodermal lineage (chondrocytes, osteoblasts, adipocytes). Bone marrow-derived MSCs have been a focus of stem cell research in light of their relative ease of isolation and expansion and of their high potential for differentiation. Herein, the aim of the present PhD is to explore the potential of a β-glucan (laminarin) on Mesenchymal stem cell proliferation and differentiation for future benefit for osteoarthritis treatment. MSCs were cultured in MSC growth and chondrogenic differentiation mediums. Cells viability and apoptosis were explored by cell count, MTT assays and Annexin V staining. In addition, Analysis of the specific protein of cell proliferation was performed by western blott. Furthermore, mRNA and protein expression of specifics markers for MSCs and chondrocytes were studied using qPCR and immunofluorescence. Our results demonstrated that stimulation of MSC with laminarin at a dose of 1 mg/ml in either basic growth culture or chondrogenesis inhibited cell proliferation without inducing their apoptosis. Furthermore, under chondrogenic culture conditions, laminarin at a similar dose prevented the differentiation of MSC into chondrocytes.

Le cancer colorectal représente la deuxième cause de mortalité par cancer en France. Dans l’intestin, l’initiation et la progression tumorale sont corrélées à l’accumulation séquentielle de mutations génétiques et épigénétiques au niveau du compartiment de renouvellement de l’épithélium. Ces altérations ont pour conséquence une croissance incontrôlée de l’épithélium et, à terme, la formation de lésions cancéreuses. En tenant compte du nombre croissant de cas de cancers colorectaux, la découverte de facteurs de prédisposition de cette pathologie reste d’un intérêt majeur. Les données de séquençage du génome humain ne suffisant pas à expliquer la prévalence de la maladie à l’échelle de la population, nous nous intéressons aux mécanismes permettant le contrôle de l’expression de certains gènes : les mécanismes épigénétiques. Dans notre équipe nous disposons de modèles animaux génétiquement modifiés nous permettant d’étudier, dans des conditions proches de la pathologie humaine, les phases précoces de l’initiation tumorale. Ces souris, bien que génétiquement identiques, développeront pourtant un nombre de tumeurs intestinales très variable. En comparant les profils moléculaires de souris développant peu ou beaucoup de tumeurs intestinales, nous souhaitons mettre en évidence les facteurs épigénétiques mis en jeu pour expliquer cette différence de susceptibilité à la tumorigenèse. Pour ce faire, nous avons mis en place une stratégie visant à prélever un échantillon intestinal, par chirurgie, sur de jeunes souris qui ont ensuite été suivies jusqu’à l’âge adulte et à l’apparition des tumeurs. Cette stratégie innovante nous a permis de corréler les profils d'expression et de methylation d'ADN d’intestins développant peu ou beaucoup de tumeurs, ouvrant la possibilité de disposer de nouveaux marqueurs prédictifs quant aux chances de développer un cancer. Ces données sont complétées par une étude sur les conséquences de la perte du gène suppresseur de tumeur Apc, un gène couramment muté dans les cancers colorectaux humain. A l’aide de modèles de souris d’invalidation inductible, nous avons déterminé les conséquences de la perte d’Apc sur les profils de méthylation de l'ADN des cellules souches intestinales, et leur capacité à initier une tumeur. L’ensemble de ces différentes projets développés dans le cadre de ma thèse nous ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires liés à la prédisposition et à l’initiation tumorale et de proposer des nouvelles stratégies diagnostiques et d’évaluation du risque individuel. / Cancer initiation and progression represent the outcome of the progressive accumulation of genetic and epigenetic alterations. Global changes in the epigenome are now considered as a common hallmark of malignancies. However, most of our present knowledge represents the result of the comparison between fully established malignancies and their surrounding healthy tissue. Such comparison is not informative about the epigenetic contribution to the very early steps of cancer onset. By performing DNA methylation and gene expression profiling of the intestinal epithelium of relevant in vivo models we aim at shedding light on the correlation between the interindividual epigenetic polymorphisms within the population and the relative risk to develop malignancies, and establish the existence of a molecular signature associated with an increased susceptibility to develop intestinal cancer. Our results confirm that a considerable degree in the variability associated to cancer susceptibility cannot be ascribed to major genetic changes and that such heterogeneity seems to correlate with distinct molecular profiles associated to classes of poorly or highly susceptible isogenic animals.We also investigated in vivo the timing at which the remodeling occur at the epigenomic scale by analyzing the alterations in the DNA methylation and gene expression profiles of intestinal stem cells upon the loss of the Apc gene, the most common genetic lesion associated with human colorectal cancer initiation. We found that the loss of function of Apc in the Lgr5-positive intestinal stem cell compartment is rapidly accompanied by a reprogramming of the DNA methylation profiles resulting in altered gene expression and impaired fate determination in those cells. The results show that part of the phenotype resulting from the constitutive activation of the Wnt pathway upon Apc loss is acquired via differential epigenetic regulation of key biological processes controlling the balance between self-renewal and differentiation. By using conditional genetic ex vivo models we found part of these oncogenic effects to be reversible via the modulation of the machinery responsible for de novo methylation of the DNA.Overall, this work confirms that the epigenetic remodeling is an early event in tumorigenesis that might even precede actual cell transformation. The functional impact of our findings on cancer initiation is currently under investigation.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à l’origine de l’ensemble des cellules hématopoïétiques, mais les mécanismes responsables de leurs réponses au stress ne sont que partiellement compris. J’ai étudié le rôle du facteur de transcription Helios dans les CSH, dans lesquelles il est fortement exprimé. J’ai trouvé que les CSH de souris nulles pour Helios (He-/-) possèdent un plus fort potentiel de reconstitution que les CSH WT dans des expériences de transplantations en série. De manière frappante, les souris âgées de 2 ans possèdent 8 fois plus de CSH fonctionnelles par rapport aux souris vieilles WT. De plus, le pool de CSH de long terme de souris He-/- vieilles ressemblent aux CSH WT jeunes en termes de phénotype et de fréquences. Les CSH He-/- vieilles présentent une dérégulation de gènes impliqués dans le vieillissement. De plus,les CSH He-/- jeunes sous-expriment des gènes codant des protéines impliquées dans la réparationde l’ADN ainsi que dans la voie p53. Quand les CSH He-/- et WT sont traitées avec différents agents radiomimétiques qui induisent des cassures simple et double brins à l’ADN, tels que la néocarzinostatine, la camptothécine ou l’étoposide, l’entrée en apoptose, en sénescence et l’arrêt de la prolifération des CSH He-/- sont altérées. Ce phénotype est accompagné d’une faible induction des gènes cibles de p53 et d’une altération du dégagement des foyers gammaH2AX. De plus, j’ai montré que Helios agit en synergie avec p53 pour réguler les réponses aux dommages à l’ADN des CSH. Mes résultats suggèrent qu’en synergie avec p53, Helios contrôle le vieillissement des CSH en prévenant l’accumulation des dommages de l’ADN des CSH. / Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood cell lineages but the mechanisms responsible of HSCs responses to stress remain partially understood. I studied the role of the transcription factor Helios in HSCs, where Helios is highly and specifically expressed. I found that HSCs from young Helios null mice (He-/-) reconstitute the hematopoietic system of irradiated recipient mice similarly to HSCs from WT mice in primary transplantations, but out-perform WT cells in secondary and tertiary transplantations. Strikingly, HSCs from 2-year-old He-/- mice had 8-fold higher reconstitution potential than old WT HSCs in primary transplantations. Moreover, the pool of long-term HSCs in old He-/- mice resembles that of young WT animals in both phenotype and frequency. HSCs from old He-/- mice present a down regulation of genes involved in aging. Further, young He-/- HSCs express reduced mRNA levels of genes encoding DNA repair proteins as well as those associated with thep53 pathway. When He-/- and WT HSCs were subjected to DNA damage by different agents like neocarzinostatin, camptothecin, or etoposide, DNA damage-induced apoptosis, senescence and cell cycle arrest were significantly impaired in He-/- HSCs. This phenotype was accompanied by a poor induction of p53 target genes and impaired clearance of gammaH2AX foci. Furthermore, I found that Helios synergies with p53 to regulate the DNA damage responses of HSCs. My results suggest that,in synergy with p53, Helios controls HSC aging by preventing the accumulation of DNA damage in these cells.

L’augmentation de la moyenne de vie a modifié le spectre des maladies cardiaques vers l'insuffisance cardiaque, un désordre progressif incurable, marqué par une perte massive de cardiomyocytes. En raison de la rareté des donneurs, la transplantation cardiaque, devient de plus en plus difficile. En 2003, la découverte des cellules souches cardiaques humaines (hCSC) pouvant supporter la réparation du myocarde après un infarctus a soulevé l’espoir d’approches thérapeutiques plus prometteuses. La transplantation des cellules autologues (issues du patient) a montré une efficacité limitée en raison de la mauvaise qualité des cellules après infarctus. De ce fait, l’utilisation des CPC allogéniques provenant de donneurs sains semble aujourd’hui le choix le plus réaliste et représente un potentiel produit thérapeutique abordable et disponible pour tous. Cependant les cellules allogéniques soulèvent des problèmes immunologiques importants qu’il faut résoudre avant leur utilisation clinique. Concernant la réponse immune innée, nos résultats indiquent que les hCPC allogéniques ont une susceptibilité modeste à la lyse NK et pourraient même être protégées contre cette lyse en contexte inflammatoire. Contrairement à la réponse immunitaire innée favorable contre les hCPC allogéniques, la présence des alloanticorps anti-HLA peut être néfaste. Nos résultats ont montré que les DSA-HLA I spécifiques de l’haplotype des hCPC peuvent induire leur lyse par CDC et ADCC et cette lyse est fortement augmentée par les conditions inflammatoires. L’ensemble de ces résultats indique que les hCPC allogéniques sont des cellules à faible risque immunologique en ce qui concerne la réponse immune innée, par contre une élimination rapide par CDC ou tardive par ADCC des hCPC pourrait se produire chez les patients ayant des DSA-HLA I spécifiques de l’allèle(s) exprimé(s) par les hCPC incitant ainsi le dépistage des DSA-HLA avant l’infusion thérapeutique des hCPC. / The increase in average life changed the spectrum of heart disease to heart failure, a progressive incurable disorder, characterized by a massive loss of cardiomyocytes. Due to the scarcity of donors, cardiac transplantation, only effective treatment known to date is becoming increasingly difficult. In 2003, the discovery of human cardiac stem cells (HCS/PC) can support the repair of the myocardium after myocardial raised hopes of promising therapeutic approaches. Transplantation of autologous (from the patient) showed limited efficiency because of the poor quality of the cells after infarction. Therefore, the use of stem / progenitor heart (CPC) from allogeneic healthy donors seems today the most realistic choiceand represents a potential therapeutic product available to all. However allogeneic cells raise significant immunological problems that must be resolved before clinical use. Regarding the innate immune response, our results indicate that allogeneic HCPC have a modest susceptibility to NK lysis and could even be protected against this lysis in the inflammatory context. In addition, allogeneic HCPC seem able to inhibit the activity of NK cells. Unlike the favorable innate immune response against the allogeneic HCPC, the presence of anti-HLA alloantibodies can be harmful. Our results showed that the DSA-specific HLA class I haplotype of the HCPC can induce their lysis by CDC and ADCC and this lysis is greatly increased by inflammatory conditions. However, the DSA-specific HLA II do not induce HCPC lysis. All these results indicate that allogeneic HCPC are cells with low immunological risk regarding the innate immune response. On the contrary, rapid elimination by CDC or ADCC of HCPC may occurs in patients with DSA- HLA class I specific allele (s) expressed by the HCPC thus prompting the screening of HLA-DSA prior to therapeutic infusion of HCPC.

ATAD3A est une protéine de la famille des AAA-ATPase (ATPases Associés à diverse Activités cellulaires) spécifique des eucaryotes multicellulaires (1). Au laboratoire, la protéine ATAD3A avait été identifiée comme étant une cible spécifique d'interaction calcium-dépendante de la protéine S100B (2). Chez les hominidés, il existe un deuxième membre de la famille ATAD3, la protéine mitochondriale ATAD3B. L'objectif de ma thèse a été de résoudre la topologie mitochondriale d'ATAD3A et d'ATAD3B et d'étudier leurs fonctions et interactions. Nous avons montré que ces deux protéines sont ancrées dans la membrane interne des mitochondries aux zones de contact avec la membrane externe et qu'elles forment des complexes hexamèriques. Nous avons ensuite mise en évidence l'expression spécifique d'ATAD3B dans les cellules embryonnaires humaines et sa réexpression dans les iPS et certaines lignées cancéreuses. Des expériences complémentaires ont été réalisées à l'aide de l'invalidation et de l'expression de mutants dominants-négatifs dans la lignée de cancer de poumon, H1299. Nos résultats suggèrent qu'ATAD3B interagit et forme des hétéro-oligomères avec ATAD3A. ATAD3B sembleraient alors agir entant que dominant-négatif d'ATAD3A. Afin de mieux comprendre la fonction d'ATAD3A in vivo, nous avons développé des modèles chez la Drosophile dont les études démontrent qu'ATAD3A est requis pour la croissance cellulaire et le développement de l'organisme. (1): Gilquin et al. The AAA+ ATPase ATAD3A controls mitochondrial dynamics at the interface of the inner and outer membranes. (Mol Cell Biol. 2010 Apr;30(8):1984-96) (2): Gilquin et al. The calcium-dependent interaction between S100B and the mitochondrial AAA-ATPase ATAD3A and the role of this complex in the cytoplasmic processing of ATAD3A. (Mol Cell Biol. 2010 Mar 29) / ATAD3A is part of a novel family of mitochondrial AAA+ ATPase (ATPases Associated to diverse cellular Activities) specific to the multicellular eukaryotes (1). In the laboratory, we have identified ATAD3A as a specific target for the Ca2+/Zn2+-binding S100B protein (2). In the Hominidae, there is a second member of the ATAD3 family, the mitochondrial protein ATAD3B. The aim of my thesis was to solve the mitochondrial topology of ATAD3A and ATAD3B and to study their functions and interactions. We have shown that these two proteins are anchored in the inner mitochondrial membrane at the contact sites with the external membrane and that they form hexameric complexes. We have then shown that ATAD3B is specifically expressed in the human embryonic stem cells and is re-expressed in iPs (induced Pluripotent stem cell) and certain cancer cell lines. Complimentary studies were done using the down regulation of ATAD3B by shRNA and expression of dominant-negative ATAD3A mutants in the human lung cancer cell line, H1299. Our results suggest that ATAD3B interacts and forms hetero-oligomers with ATAD3A. ATAD3B seems to behave like a dominant negative of ATAD3A. To have a better understanding of the function of ATAD3A in vivo, we developed models in Drosophila with which results show that ATAD3A is required for cell growth and organism development. (1): Gilquin et al. The AAA+ ATPase ATAD3A controls mitochondrial dynamics at the interface of the inner and outer membranes. (Mol Cell Biol. 2010 Apr;30(8):1984-96) (2): Gilquin et al. The calcium-dependent interaction between S100B and the mitochondrial AAA-ATPase ATAD3A and the role of this complex in the cytoplasmic processing of ATAD3A. (Mol Cell Biol. 2010 Mar 29) STAR

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale la plus agressive. L’échec thérapeutique s’explique par son caractère hétérogène. Nous étudions l’intégrine α5β1, le récepteur de la fibronectine, dont les travaux du laboratoire ont montré l'implication dans l’agressivité du GBM. Il a été observé que l’expression de l’intégrine α5 est hétérogène entre patients et au sein d’une même tumeur. Nous avons émis l’hypothèse que cette hétérogénéité peut être expliquée par l’existence de différentes cellules souches de GBM (CSGs). Nos travaux montrent que certaines CSGs expriment l’intégrine après différentiation, démontrant une hétérogénéité intertumorale. Une expression hétérogène a également été mise en évidence au sein d’une même lignée, indiquant une hétérogénéité intratumorale. Nos résultats démontrent que les CSGs programmées à exprimer l’intégrine forment des cellules différenciées agressives. Nos données montrent que l’intégrine α5 est impliquée dans l’expansion tumorale mais aussi dans la survie et la migration en présence de fibronectine. Ce travail permet de mieux comprendre l’origine de foyers plus agressifs et souligne l’intérêt de l’intégrine α5β1 comme cible thérapeutique pour une sous-population de patients. / Glioblastoma (GBM) is the most aggressive primary brain tumor. Treatment failure is explained by inter and intratumoral heterogeneity. Our previous results showed that the α5β1 integrin, the fibronectin receptor, is implicated in GBM aggressiveness. We observed that its expression was heterogeneous between patients' tumors but also between different areas in a given tumor. We hypothesized that this heterogeneity may be linked to different glioma stem cells (GSC). We confirmed that α5 expression is induced after differentiation in about half of the cell lines supporting the notion of inter-tumoral heterogeneity. We also observed with single cell-derived clone analysis that intra-tumoral GICs heterogeneity exists. We noticed that when GICs are programmed to express α5 integrin, differentiated cells become more aggressive. Our data support that differentiated cells expressing the integrin have an increased capacity of proliferation and acquire a fibronectin-dependent motility and a resistance phenotype. This work provides a better understanding of the origin of more aggressive foci and highlights the interest of α5β1 integrin as a therapeutic target for a subpopulation of patients.