L’hémine humaine, connue commercialement sous l’appellation Normosang® ou Panhematin® est un produit utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des attaques aigües de porphyrie, maladie génétique affectant la biosynthèse de l’hème. Récemment, le traitement d’une patiente atteinte d’anémie hémolytique auto-immune sévère et de réticulocytopénie a été pris en charge par un médecin hématologue d’Héma-Québec. Le traitement de cette patiente au Normosang® a entre autres contribué à l’augmentation de son nombre d’érythrocytes et a contribué au rétablissement de son état de santé. Nous avons ainsi entrepris ce projet dans le but d’évaluer les effets de l’hémine sur l’expansion et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon dans un milieu de culture favorisant la différenciation érythroïde. Le suivi de l’expansion montre que l’hémine semble avoir un effet positif sur la croissance des cellules lors de leur différenciation érythroïde. Les résultats montrent que l’hémine semble aussi avoir un effet sur les précurseurs érythroïdes engagés dans ’érythropoïèse. L’analyse de la différenciation montre que l’hémine semble stimuler la différenciation érythroïde, ainsi que l’énucléation. L’approfondissement de ces connaissances pourrait ultimement permettre d’élargir le spectre d’application clinique du Normosang®. / Human hemin, commercialized as Normosang® or Panhematin®, is a therapeutic agent approved for the treatment of acute attacks of porphyria, a genetic disease causing a malfunction of the heme biosynthesis pathway. Recently, the treatment of a patient with severe autoimmune hemolytic anemia and reticulocytopenia was managed by a hematologist from Héma-Québec. The treatment of this patient with Normosang® has, among other things, contributed to the increasing erythrocyte levels and contributed to the complete recovery of this patient. The aim of this project was to evaluate the effects of hemin on the expansion and differentiation of hematopoietic cord blood stem cells in a culture media favoring erythroid differentiation. Results show that hemin has a positive effect on cell growth during their erythroid differentiation. The results show that hemin also appears to have an effect on erythroid precursors. Differentiation analysis points to a possible role for hemin in the stimulation of erythroid differentiation as well as enucleation. More knowledge on the subject could ultimately support a larger spectrum of clinical applications.

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Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l'utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d'une maladie monogénique, obtenues au cours d'un diagnostique pré-implantatoire. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l'utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d'obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j'ai ensuite comparé le profil d'expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J'ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d'utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J'ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l'observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J'ai également étudié l'expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d'Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l'équipe, permettent d'apporter la preuve de concept de l'intérêt d'un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques.

Les cassures double brin (CDB) de l’ADN sont des lésions dangereuses qui peuventêtre produites par des agents physiologiques et environnementaux. La réparation inefficace desCDB dans les cellules souches adultes (CSA), qui sont au sommet de la hiérarchie cellulaire,peut affecter leur capacité d’auto-renouvellement et également le processus de régénération.Le maintien de la stabilité génomique est fondamental et l’altération de ce processus accélèrele vieillissement et peut engendrer des cancers (cellules souches cancéreuses).Les CSA du muscle squelettique (cellules satellites, CS) sont responsables del’homéostasie et de la régénération musculaire. Après activation, les CS quiescentesprolifèrent, régénèrent les myofibres et reconstituent le pool, en s’auto-renouvelant.Ce projet de thèse a eu pour but d’étudier la réparation des CDB dans les CS et leursdescendants, au cours de la différenciation. Nous avons montré que les CS réparent les CDBplus efficacement et plus fidèlement que les cellules différenciées, avec l’implication du NHEJet de DNA-PK. Cette efficacité dépend plus de l’état de différenciation que de la proliférationet la niche a un impact mineur. De plus, des expériences avec des mutants de réparation,apoptose et différenciation suggèrent un mécanisme spécifique de réparation des CDB dans lesCS, qui pourrait être lié à l’architecture distincte de la chromatine de ces cellules. Ces étudesdevraient aider à comprendre comment le maintien de l’intégrité de l’ADN préserve le pooldes CS, influence la régénération et le vieillissement et protège de la carcinogenèse. / DNA double strand breaks (DSBs) are dangerous DNA lesions that are generated byphysiological and environmental DNA agents. Mismanagement of DSBs in adult stem cellsthat are at the top of the hierarchy generating the differentiated tissue, can affect their selfrenewalcapacity and the fate of their progeny. Maintenance of genome stability throughrobust DNA repair is fundamental for tissue regeneration, and impairment of this processaccelerates aging and may lead to cancers (cancer stem cells).Adult muscle stem cells (satellite cells, SCs) sustain skeletal muscle homeostasis andregeneration. Upon activation, quiescent SCs proliferate thereby regenerating muscle fibersand reconstituting the satellite cell pool by self-renewing.This thesis project aims to study DSB repair in SCs and their progeny, duringdifferentiation. We showed that muscle SCs repair DSBs more efficiently and, surprisingly,more accurately than differentiated cells by implicating NHEJ and DNA-PK. The repairefficiency is more a function of the differentiation status than of the replication status ofmyogenic cells, and the niche has a minor effect on the repair efficiency of SCs. Moreover,experiments with DSB repair, apoptosis and differentiation mutants suggest that SCs repairDSBs through a specific mechanism, that may be linked to the distinct chromatin architectureof these cells. These studies should help understanding how the maintenance of genomestability preserves SCs pool, influence regeneration and aging and protect fromcarcinogenesis.

L’infection par Helicobacter pylori touche environ la moitié de la population mondiale et est responsable de plusieurs pathologies gastrointestinales incluant l’adénocarcinome gastrique. Le développement récent d’un modèle d’étude chez l’animal a permis d’identifier la nature des cellules à l’origine de la transformation cancéreuse en réponse à l’infection chronique par Hélicobacter. Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (MSC) seraient recrutées au niveau de la muqueuse gastrique afin de reconstituer, par un mécanisme de différenciation épithéliale, les glandes lésées par l’infection. L’adénocarcinome gastrique se développerait à partir des glandes reconstituées par les MSC. Les objectifs de ces travaux ont été d’analyser, in vitro par une approche séquentielle, les différentes étapes responsables de l’initiation tumorale incluant le recrutement des MSC au niveau gastrique, leur différenciation en cellules épithéliales et leur transformation tumorale lors de l’infection par H. pylori. Ces travaux ont tout d’abord démontré que les cellules épithéliales infectées par H. pylori peuvent recruter les MSC après sécrétion de certaines chimiokines. Nous avons ensuite montré que les MSC sont capables de fusionner avec les cellules épithéliales gastriques aboutissant à l’obtention de cellules épithéliales dérivées des MSC. Finalement, les interactions entre H. pylori et les MSC ont été étudiées et ont fourni des premiers éléments de compréhension des mécanismes de l’initiation tumorale. Nos résultats permettent de mieux comprendre le mécanisme physiopathologique de l’adénocarcinome gastrique et seront utiles à la compréhension d’autres cancers dans lesquels le rôle des MSC comme cellules initiatrices de tumeur est suggéré. / Helicobacter pylori infection is found in about half of the world population and can induce several gastrointestinal pathologies including gastric adenocarcinoma. An animal model recently led to the hypothesis of a cellular origin for the cancer initiating cells after Helicobacter infection. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) are believed to be recruited in the gastric mucosa in order to repair the damages due to infection, by an epithelial differentiation. Gastric carcinoma may rise from MSC reconstituted gastric glands. This study aimed to analyze, by sequential in vitro approaches, the different steps allowing tumor initiation including MSC recruitment by infected epithelial cells, epithelial differentiation of MSC, and cancer marker appearance after H. pylori infection. We first demonstrated that H. pylori infected epithelial cells may recruit MSC by a secretion of cytokines. We then showed that MSC fuse with gastric epithelial cells leading to MSC-derived epithelial cells. Finally, we studied the interaction between H. pylori and epithelial cells providing a preliminary explanation for cancer initiation. Our results allow a better understanding of gastric adenocarcinoma pathophysiology and will be helpful for the understanding of other cancers in which the role of MSC as cancer initiating cells is suspected.

Le Dimethyl Ampal Thiolester (DIMATE) est un inhibiteur des aldéhydes déshydrogénases (ALDHs) de type 1 et 3. L’intérêt croissant au cours de ces dernières années pour ces enzymes intra cytoplasmiques que sont les ALDHs, s’explique par leurs utilisations comme marqueurs pour distinguer les cellules souches, saines ou cancéreuses, au sein de différents tissus, comme le tissu hématopoïétique. Le traitement des Leucémies Aiguës Myéloïdes demeure une problématique clinique majeure. En effet, malgré un taux de rémission complète moyen d’environ 70% avec les traitements conventionnels, la survie moyenne des patients porteurs d’une LAM n’excède pas les 50% à 5 ans. A ce titre, le DIMATE, semble être un médicament d’avenir. Le DIMATE présente une toxicité majeure sur plusieurs lignées leucémiques humaines et sur des cellules souches leucémiques issues de patients. De manière remarquable, le DIMATE à ces doses anti-leucémiques présente une innocuité quasi-totale sur les cellules souches hématopoïétiques saines. In vivo, chez la souris, le DIMATE permet d’éradiquer spécifiquement les cellules leucémiques humaines xénogreffées et présente en monothérapie une efficacité similaire à l’association Cytarabine + Daunorubicine qui constitue le standard thérapeutique actuel. Ces résultats encourageants vont servir de support conceptuel à la mise en place prochaine d’essais cliniques. / The Dimethyl Ampal Thiolester (DIMATE) is a type 1 and 3 Aldehydes Dehydrogenases (ALDHs) inhibitor as an innovating treatment for AML. Interest in ALDH is due to its activity as a marker for identification of stem cell in different tissues. The different species of ALDHs control the levels of the endogenous apoptogenic aldehydes. Cancer cells protect themselves from the apoptogenic effect of these aldehydes by the ALDHs that oxidize them to their non-apoptogenic carboxylic acids. The vast majority of patients with AML achieve complete remission (CR) after standard induction chemotherapy. However, the majority subsequently relapses and dies of the disease. Therefore, AML remains a clinical challenge and new therapies are urgently needed. For this, DIMATE appears as a promising drug. In vitro, DIMATE is a powerful ALDH inhibitor and has a major cytotoxic activity on human AML cell lines. Moreover, DIMATE is highly active against leukemic population enriched in LSCs, but, unlike conventional chemotherapy, DIMATE is not toxic for healthy hematopoietic stem cells which retained after treatment their self-renewing and multi-lineage differentiation capacity. In immunodeficient mice, xenografted with human leukemic cells, DIMATE eradicates specifically human AML cells and spares healthy mouse hematologic cells. Moreover, DIMATE showed the same efficiency than the association Daunorubicin + Cyrabine, which is considered as the gold standard for AML induction. Results from our work open new therapeutic perspectives in AML and provide a conceptual support for initiation of a phase I-II clinical trials, but also innovating cellular therapy.

Les cellules souches pluripotentes sont capables de donner naissance à tous les types cellulaires constituant un organisme, ce qui leur confère un fort intérêt thérapeutique. A partir de l’embryon de souris on peut en dériver deux types : les cellules souches embryonnaires (ES) au stade blastocyste et les cellules souches d’épiblaste (EpiSC) au stade œuf cylindre. Ces deux types de cellules partagent leurs propriétés pluripotentes mais se distinguent par de nombreux aspects comme leurs conditions de culture et les gènes qu’elles expriment. Nous avons montré que la reprogrammation par clonage par transfert de noyau permet d’obtenir des EpiSC présentant un méthylome et un transcriptome similaires à ceux des EpiSC issues d’embryons après fécondation. Nous avons également caractérisé le profil de méthylation de l’ADN des EpiSC, et montré une tendance à l’hyperméthylation des promoteurs des EpiSC par-rapport aux cellules ES et à l’épiblaste. De plus, l’absence de méthylation empêche la conversion des cellules ES en EpiSC. Les EpiSC semblent donc dépendre fortement de la méthylation de l’ADN pour réguler l’expression de leurs gènes, ce qui les distingue des cellules ES. / Pluripotent stem cells are of great therapeutic interest because of their capability to give rise to all the cells composing an organism. We can derive two types of these stem cells from the mouse embryo: embryonic stem cells (ESCs) from the blastocyst and epiblast stem cells (EpiSCs) from the egg cylinder stage. These two cell types share their pluripotent properties but are distinct on several features, like their culture conditions and gene expression. We showed that reprogramming using cloning by nuclear transfer allows the obtention of EpiSCs with a methylome and a transcriptome similar to those of EpiSCs derived from embryo after fertilisation. We also characterised the DNA methylation pattern of EpiSCs and showed their tendency to present a hypermethylation at their promoters compared to ESCs and epiblast. We also observed that the absence of DNA methylation blocks the conversion of ESCs into EpiSCs. As a conclusion, it seems that EpiSCs are strongly dependant of DNA methylation to regulate gene expression, which distinguishes them from ESCs.

Une nouvelle théorie du cancer s’est récemment imposée dans la communauté scientifique. Selon cette dernière, les cancers se développeraient à partir d’une sous-population bien particulière de cellules cancéreuses, appelées « cellules souches cancéreuses » (CSC). Les partisans de la théorie des CSC soutiennent que les rechutes seraient causées par ces cellules, plus aptes à échapper aux thérapies classiques. En conséquence, ils soutiennent que l’élimination de toutes les CSC, dans un cancer donné, est nécessaire et suffisante pour guérir le patient. Dans cette thèse, je propose d’examiner cette stratégie thérapeutique de ciblage des CSC et je montre que sa capacité à guérir les cancers dépend de la façon dont on envisage la nature de la propriété souche. En effet, les cellules souches cancéreuses sont définies par la possession de la propriété souche, c’est-à-dire par leur capacité à s’auto-renouveler et à se différencier. Cependant, cette propriété elle-même reste obscure quant à sa nature. S’agit-il d’une propriété catégorique ou d’une disposition ? Une cellule non-souche (cancéreuse ou non) peut-elle acquérir la propriété souche et sous quelle condition ? En me basant sur une analyse de la littérature scientifique, je montre que quatre conceptions distinctes de la nature de la propriété souche sont aujourd’hui possibles et que, si la théorie des CSC est vraie, déterminer la nature exacte de la propriété souche est capital pour le traitement des cancers. / A new theory of cancer has recently gained importance in the scientific community. According to this theory, cancers develop from a particular sub-population of cancer cells, named “cancer stem cells” (CSCs). The proponents of the CSC theory argue that relapses are caused by CSCs because they escape classical therapies. Consequently, they claim that eliminating all the CSCs of a given cancer is a necessary and sufficient condition to cure the patient. In this dissertation, I scrutinize this therapeutic strategy and I argue that its ability to cure cancers will depend on our understanding of the nature of stemness. Indeed, cancer stem cells are characterized by this property, that is, the capacity to self-renew and to differentiate. However, the nature of stemness is rather obscure. Is it a categorical property or a disposition? Can a non-stem cell (cancerous or not) acquire stemness, and under which conditions? On the basis of analysis survey of the scientific literature, I distinguish four possible concepts of the nature of stemness. I contend that if the CSC theory is true, determining the exact nature of stemness is essential for cancers treatments.

Les agressions graves de la surface oculaire peuvent se compliquer d'ulcérations cornéennes épithéliales, de néovascularisation, d'opacification et d'inflammation chroniques, échappant à tout traitement médical. Les progrès dans la compréhension de la physiologie du renouvèlement de l'épithélium et du stroma cornéen ont permis d'introduire une approche thérapeutique, la greffe de cellules souches. L'objectif de notre étude est d'apporter une source de cellules souches cornéennes par thérapie cellulaire afin de restituer une fonction épithéliale et stromale permettant l'obtention d'une cornée claire chez l'animal. Les cellules souches épithéliales limbiques (LSC) et les cellules stromales limbiques (SSC) ont été isolées dans un milieu exempt de produits animaux tout en gardant leur caractère indifférencié. L'effet régénérateur des SSC a été étudié in vivo dans un modèle de fibrose cornéenne chez la souris. Les SSC ont été injectées dans le stroma cornéen et ont permis la restitution d'un stroma organisé et d'une cornée transparente. Le projet a aussi consisté à élaborer et mettre en forme une matrice à base de collagène I afin de favoriser la culture concomitante de tous les types cellulaires présents dans la cornée tout en préservant organisation, transparence et propriétés mécaniques. La connaissance des conditions physico-chimique du collagène a permis de produire des matrices transparentes qui ont pu être colonisées par les SSC et les LSC. Notre étude ouvre de nouvelles perspectives dans le traitement des pathologies provocant des opacités cornéennes afin de faire face au manque de dons de cornée. / Cornea, the outer part of the eye, features high transparency crucial for good vision. The maintenance of a healthy cornea is linked to the presence of corneal stem cells in the limbus (peripheral region of the cornea). Several diseases can lead to its opacification requiring transplantation of donor tissue to restore vision. Although corneal transplantation has achieved clinical success, there is a shortage of donor corneas worldwide. To solve this problem, cell therapy and tissue-engineered artificial cornea are promising approaches that could eventually outperform current treatment. Corneal epithelial stem cells (LSC) and stromal stem cells (SSC) were isolated in feeder free and xeno free medium. The therapeutic effect of SSC was investigated in vivo by their injection in mouse cornea treated with liquid nitrogen. SSC have the ability to restore the extracellular matrix organization and corneal transparency. Transparent collagen I fibrillated matrices have been synthesized and were evaluated for fibril organization, transparency, mechanical properties and their ability to be repopulated by corneal stromal stem cells and to support limbal epithelial stem cell growth. We show that the matrices were organized and transparent. SSC and LSC were able to repopulate and to grow into the collagen matrix. These cells present a potential for stem cell-based treatment of corneal blindness.

Les glioblastomes (GBM) sont des tumeurs astrocytaires au pronostic défavorable. L’échec des thérapies actuelles (chimio et radiothérapies) est principalement lié à la résistance des cellules souches cancéreuses (CSCs). Ces cellules ont besoin de communiquer en permanence avec leur microenvironnement pour leur survie et pour maintenir une niche favorable à leur développement. Le transfert de matériel entre les CSC, les cellules tumorales et le microenvironnement contribue à l’échappement thérapeutique. Des travaux récents révèlent l’importance des récepteurs aux neurotrophines TrkB et TrkC dans la survie et la croissance des CSC de GBM. Nos travaux préliminaires dans le cancer bronchique démontrent que les récepteurs aux neurotrophines sont transférés aux cellules du microenvironnement via les exosomes afin de les contrôler. Cependant, le mécanisme de diffusion de récepteurs oncogéniques à partir de CSC n’a jamais été étudié. Notre objectif principal était donc de déterminer l’implication des récepteurs des neurotrophines dans le transfert du phénotype agressif des CSC vers les cellules du microenvironnement afin de favoriser la résistance thérapeutique du glioblastome. Nos résultats ont permis d’établir un lien entre le stade de différenciation des cellules tumorales, l’expression des neurotrophines et leur interaction avec le microenvironnement tumoral via les exosomes. Le transfert de TrkB au sein des exosomes joue un rôle clé dans la progression tumorale du GBM et dans l’agressivité cellulaire. Néanmoins, le transfert des récepteurs aux neurotrophines via les exosomes pourrait également être impliqué dans les mécanismes de radiorésistance. Des études menées sur des cellules de GBM humain irradiées et traitées par des exosomes démontrent l’implication de ces derniers dans l’échappement thérapeutique. Parmi les cellules du microenvironnement ciblées par les exosomes, les CSM sont celles qui ont été les moins étudiées bien qu’elles possèdent un tropisme spécifique pour le GBM. Nos travaux démontrent que les exosomes de GBM modifient le phénotype des CSM et augmentent leurs capacités prolifératives et migratoires. La fonction exacte du transfert des récepteurs des neurotrophines devra être analysée dans ces différents modèles afin de préciser son importance dans la physiopathologie du glioblastome et sa progression. L’expression des récepteurs aux neurotrophines dans ces exosomes permet d’envisager leur utilisation en tant que biomarqueurs diagnostiques et/ou pronostiques dans le GBM. Mots clés : Glioblastomes, cellules souches cancéreuses, neurotrophines, TrkB, radiothérapie, cellules souches mésenchymateuses, exosomes. / Glioblastoma are tumors derived from astrocytes with a dark prognosis. Current therapies fail to inhibit relapses due to radioresistant properties of cancer stem cells (CSC). Communication between CSC and their microenvironment is required for maintain “stem cells niche” and cell survival . The transfer of materials between CSC, tumor cells and microenvironment contributes to therapeutic resistance. In glioma, recent studies reveal the major role of TrkB and TrkC in survival of CSC. Our previous work, in lung cancer, have shown that neurotrophin receptors exhibits a control on microenvironment cells and angiogenesis through exosome transfer. However, similar mechanism of oncogenic receptor transfer from CSC has never been studied. Our main goal was to determine the involvement of neurotrophin receptors in the transfer of biological aggressiveness to microenvironment cells in order to promote therapeutic resistance in glioblastoma. Our findings suggest a relationship between cell differentiation status, expression of neurotrophin receptors and their interaction with the microenvironment through exosomes. TrkB-containing exosomes play a key role in the control of glioblastoma progression and cell aggressiveness. Mechanisms of radioresistance might also be dependent of the transfer of neurotrophin receptors through exosomes. Indeed, our results on irradiated human GBM cells and treated by exosomes demonstrate the involvement of exosome in radioresistance mechanisms. Although mesenchymal stem cells (MSCs) are considered as stromal components of glioblastoma, their communication with CSC, particularly through exosomes, remain largely undefined. Our results show that GBM-derived exosomes modify the phenotype of MSCs and increase their proliferative and migratory abilities. The putative function of neurotrophin receptors transfer should be analyzed in these models to determine their prime role in glioblastoma pathogenesis and progression. This finding suggest that the neurotrophin receptor expression in exosomes could be used as diagnostis and prognosis biomarkers of GBM.