Le remplacement des oligodendrocytes myélinisants par des progéniteurs endogènes a été observé dans le contexte des pathologies démyélinisantes via le recrutement de deux populations distinctes de progéniteurs : les progéniteurs dérivant des cellules souches adultes de la zone sous ventriculaire (SVZ) et les précurseurs d'oligodendrocytes (OPCs) du parenchyme. Réactivés par des facteurs présents dans le cerveau après lésion, ces progéniteurs acquièrent de nouvelles propriétés migratoires et sont recrutés au niveau du site lésionnel. Toutefois, ces tentatives d'autoréparation endogènes sont limitées et ne permettent pas une récupération fonctionnelle, dans la grande majorité des cas. Cet échec dans la régénération peut être imputé en parti à des défauts de migration de ces cellules vers les zones lésées. Divers signaux sont impliqués dans le recrutement des cellules progénitrices allant de signaux développementaux ré‐exprimés au niveau de la lésion à l'expression de cytokines induite par la neuroinflammation. Nos données dévoilent de nouvelles fonctions pour Reelin et CNTF dans le contrôle de la migration des progéniteurs neuraux pendant la phase de remyélinisation chez la souris. Alors que Reelin induit la dispersion des cellules dérivant de la SVZ hors de leur niche rendant plus efficace les processus de recrutement spontané vers la lésion démyélinisée, CNTF participe au contrôle directionnel de leur migration vers de la zone endommagée in vivo. L'utilisation de tests in vitro nous a permis de montrer que Reelin, en plus de son effet décrit sur le détachement des neuroblastes de la SVZ migrant en chaîne, exerce un effet chimiocinétique. / Replacement of myelinating oligodendrocytes by endogenous progenitors has been demonstrated to occur in demyelinating diseases via the recruitment of two distinct pools of progenitors: Subventricular zone (SVZ)‐derived progenitors and parenchymal oligodendrocyte precursors (OPCs). Becoming re‐activated by factors present in the brain after injury, these progenitors acquire new migration properties and are recruited to the lesion sites. However these spontaneous repair attempts are limited and do not permit efficient functional recovery. This failure can be due in part to an inefficient migration of these cells to the lesion site. Numerous signals are involved in the migration of precursor cells into the area of brain damage ranging from developmental signals re‐expressed at the lesion site to neuroinflammation‐induced cytokines. Our data uncover new functions for Reelin and CNTF in the control of neural progenitor's recruitment during the remyelination phase in mouse model of demyelination. While Reelin induces SVZ‐derived cells dispersion form their niche which potentiates the spontaneous recruitment processes to the demyelinated lesion, CNTF participates in the control of their migration toward the damaged site in vivo. Using in vitro assays we show that Reelin, in addition to its already described detachment effect on SVZ neuroblasts chain migration, is chemokinetic. CNTF is acting on SVZ derived progenitors and parenchymal OPCs as a chemoattractant, which cells respond to it in gradient sensing manner. All together, these two studies reveal key function for Reelin and CNTF in the post‐lesional migration.

Les glycosaminoglycannes : implication dans la régénération tissulaire après ischémie et utilisation de mimétiques comme agents potentialisateurs des progéniteurs endothéliaux humains pour la régénération vasculaire. Contexte scientifique : Les pathologies vasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. Parmi elles, l'ischémie chronique des membres inférieurs conduit fréquemment à une amputation du membre et est associé à une forte mortalité. Les thérapies actuelles, incluant un meilleur mode de vie, les traitements prophylactiques et les interventions chirurgicales ne permettent pas de soigner définitivement les patients. Les progéniteurs endothéliaux circulants (PEC) présentent une capacité de prolifération très élevée, forme des vaisseaux in vivo et s'intègre naturellement à des réseaux vasculaires préexistants. C'est pourquoi, ces cellules sont actuellement considérées comme un outil thérapeutique prometteur pour la réparation vasculaire. Cependant, l'utilisation des PEC en clinique est limitée par leur rareté dans le sang. De plus, les essais cliniques en thérapie cellulaire ont jusqu'à maintenant démontré des résultats prometteurs mais systématiquement limités dans le temps, à cause d'une faible rétention et d'une mort accrue des cellules après injection. Ceci souligne l'importance d'une meilleure compréhension du microenvironnement dans lequel les cellules thérapeutiques sont injectées. Le microenvironnement est en partie constitué par des glycosaminoglycannes (GAG) sulfatés, tels que les Héparanes Sulfates (HS) ou les Chondroïtines Sulfates (CS). Les GAG interagissent avec des partenaires protéiques afin de structurer et de stabiliser la matrice extracellulaire. Les GAG ont également un rôle fonctionnel puisqu'ils régulent de nombreux processus biologiques grâce à leur capacité d'interaction avec des facteurs liant l'héparine.Objectifs: Les objectifs de cette thèse étaient (1) d'améliorer l'isolement des PEC et d'optimiser leurs fonctionnalités endothéliales in vitro à l'aide d'un mimétique de GAG, (2) de caractériser d'un point de vue structurel et fonctionnel les GAG endogènes, et en particulier les HS et les CS, dans le muscle ischémié.Résultats: (1) Nous avons démontrés que l'ajout d'un mimétique de GAG, et plus précisément le composé [OTR4131], pendant les phases d'isolement des PEC à partir du sang de cordon induisait un enrichissement par 4 du nombre de colonies. De plus, l'ajout de ce mimétique dans le milieu de culture permet d'optimiser l'adhérence, la prolifération, la migration ainsi que l'auto-renouvellement des PEC. (2) L'ischémie induit une modification de l'expression des gènes de biosynthèse des GAG, conduisant à des modifications structurelles distinctes des HS et CS. Ces modifications sont corrélées avec des changements dans la capacité des GAG à lier certains facteurs et à moduler l'activité cellulaire. De plus, les CS forment une marque cicatricielle après ischémie.Conclusion & Perspectives: (1) Le mimétique de GAG [OTR4131] devrait permettre d'optimiser les capacités d'expansion des PEC et leurs propriétés endothéliales pour une application thérapeutique. (2) Un intense remodelage des GAG suit l'accident ischémique et perturbe l'activité des facteurs de croissance. Le contrôle des CS constitue une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des lésions du muscle squelettique.Mots-clés : angiogenèse, progéniteurs endothéliaux circulants, glycosaminoglycannes, facteurs liant l'héparine, ischémie, régénération musculaire, réparation vasculaire / Glycosaminoglycans: involvement in tissue regeneration after ischemia and use of mimetic molecules as potentiating agents of human endothelial progenitor cells for vascular regenerationScientific background: Vascular diseases are the leading causes of death in the world. Among them, critical limb ischemia often leads to amputation of the limb and potential mortality. Current therapies including life style management, pharmacological control of risk factors and surgical revascularization do not completely reverse the pathology. Late-outgrowth endothelial colony-forming cells (ECFC) display high proliferative potential, form vessels in vivo and are incorporated into pre-existing vascular networks. Thus, these cells are considered as a promising therapeutic tools for vascular repair. However, the use of ECFC in cell therapy is limited by their rarity in blood. In addition, clinical trials using cell therapy have demonstrated promising results, but there are still a significant problem with poor cell retention and survival. This underlines the relevance to better knowing the microenvironment on which therapeutic cells are transplanted. Microenvironment is in part composed by sulfated glycosaminoglycans (GAG), such as Heparan Sulfate (HS) or Chondroitin Sulfate (CS). GAG interact with proteins to strengthen the structure and stability of the extracellular matrix. GAG have also functional roles since they regulate numerous biological processes through their abilities to interact with heparin-binding growth factors (HBGF).Objectives: The aim of this thesis was (1) to improve production of ECFC and optimize their endothelial properties in vitro using a GAG mimetic molecule, (2) to characterize structurally and functionally endogenous GAG, especially HS and CS species, in ischemic muscle.Results: (1) We demonstrate that the addition of a GAG mimetic molecule, namely the [OTR4131] compound, during the isolation process of ECFC from cord blood induces a 4 fold increase the number of colonies. Moreover, addition of [OTR4131] to cell culture media improves adhesion, proliferation, migration and self-renewal of ECFC. (2) Ischemia induces modifications of expression of GAG biosynthetic enzymes in muscle, leading to changes in HS and CS structures in distinct ways. These changes are correlated with functional modifications of GAG to bind HBGF and to modulate cell activity. Moreover, CS constitute a persistent hallmark of injury after ischemia.Conclusion & Perspectives: (1) The [OTR4131] GAG mimetic should enable optimization of the expansion capacity and the endothelial properties of ECFC for further therapeutic applications. (2) Intense GAG remodeling follows ischemia and disrupts growth factors activities. The control of CS is a promising new therapeutic approach for the treatment of skeletal muscle injury.Keywords: angiogenesis, endothelial progenitor cell, glycosaminoglycans, heparin binding growth factor, ischemia, muscle regeneration, vascular repair

Résumé non transmis / Summary not transmitted

Les cellules souches cancéreuses mammaires sont considérées d'initier et d'être responsable du développement des tumeurs. Un certain nombre de marqueurs ont été proposées, mais la question sur la définition de la CSC dans les cancers du sein RE+ reste ouverte. Nous avons utilisé les lignées MCF7 et T47D comme modèles RE+ et les SUM159 comme RE- pour rechercher les fractions cellulaires enrichies des CSC. Nous avons utilisé un panel de marqueurs tels qu'ALDH, CD44/CD24, combiné avec la formation de mammosphères. Les xénogreffes dérivées de patients (PDXs) de cancer du sein ont également été analysées. ALDH+ et/ou CD44+/CD24- définie des fractions cellulaires enrichies en cellules initiatrices de mammosphères et la capacité de différenciation dans les SUM159 et T47D, mais pas dans les MCF7. Nous avons demandé si cela pourrait être lié à différents statuts de p53. Dans ce but, nous avons généré des cellules MCF7shP53 et a montré une augmentation nette de fraction CD44+/CD24- dans ces cellules et une formation accrue de mammosphères. Cependant, les fractions triées ALDH+ ou CD44+/CD24- ont augmenté la formation de mammosphères d'un facteur 2 maximal. Nous voulions enrichir les CSC (basées sur l'initiation de mammosphères), les cellules en monocouche et en mammosphères sont exposées sous faible tension d'oxygène (<2%) pendant 7 jours, elles sont ensuite caractérisées sur la base de leur expression d'un certain nombre de marqueurs de différenciation soit par FACS soit par immunofluorescence. Dans les mammosphères des lignées RE+, les cellules ont passé à un phénotype bipotent CK5+/CK8+ et augmenté la fraction CD24+/CD44-. La même tendance a été observée parallèlement dans les cellules incubées en hypoxie. En outre, les sphères ne portent pas d'augmentation de la tumorigénicité. En conclusion, les cellules formant les mammosphères correspondent à un sous-ensemble avec un phénotype spécifique qui ne portent pas d'augmentation de la tumorigénicité. / Breast cancer stem cells (BCSCs) are believed to initiate and sustain tumor development. A number of markers have been proposed but open questions remain on the definition of CSC in ER+ breast cancer. We used MCF7 and T47D BCCL as ER+ models and the SUM159 BCCL for ER- to search for BCSC enriched subpopulations. We used a panel of markers such as ALDH, CD44/CD24, combined with mammosphere formation. Breast patient derived xenografts (PDX) were also analyzed. ALDH+ and/or CD44+/CD24- define fractions of cells enriched in mammosphere initiation and differentiation capacity in SUM159 and T47D, but not in MCF7. We asked whether this could be linked to different p53 statuses. To this aim, we generated MCF7-shp53 cells and showed a net increase in CD44+/CD24- in these cells and increased mammosphere formation. However, sorted ALDH+ or CD44+/CD24- cells increased mammosphere formation at most by a factor 2. We wanted to further enrich for CSC (based on mammosphere initiation), cultured 2D and mammosphere cells to low oxygen (<2%) for 7 days and characterized the cells on the basis of their expression of a number of differentiation markers by either FACS or immunofluorescence. In mammosphere of ER+ BCCL cells switched to a bipotent CK5+/CK8+ phenotype and increased the CD24+/CD44- fraction. Parallel findings were made with cells incubated under low O2. Furthermore, spheres do not bear increased tumorigenicity. In conclusion mammosphere forming cells correspond to a specific phenotypic subset of breast cancer cells that do not bear increased tumorigenicity.

La protéine E4F1 a été identifiée comme une cible cellulaire de l'onco-protéine virale E1A au cours de l'infection par l'adénovirus de type V. Bien que très peu étudiée jusqu'à présent, les travaux du laboratoire d'accueil indiquent cependant qu'E4F1 est une protéine multifonctionnelle ayant à la fois un rôle de facteur de transcription mais fonctionnant également comme une E3 ligase vis-à-vis d'autres régulateurs transcriptionnels tels que les membres de la famille p53. E4F1 se situe au carrefour de plusieurs voies de signalisation fréquemment altérées au cours de la progression tumorale, notamment les voies impliquant les suppresseurs de tumeurs Rb et p53. In vivo, E4F1 est impliqué dans l'homéostasie des cellules souches à travers différents mécanismes encore non élucidés. L'objectif de mon projet de thèse est d'identifier et de caractériser les voies de signalisation impliquant E4F1 dans l'homéostasie des cellules souches. Pour répondre à cette question, j'utilise diverses techniques : Histologie, IHC,FACS, QPCR et des tests clonogénique sur des cellules issues des épidermes de souris E4F1 WT et KO. / E4F1 protein has been first identified in the 80's as a cellular target of the adenoviral oncoprotein E1A. E4F1 is an atypical multifunctional protein with two different activities. In fact, it can acts as a transcriptional factor thanks to its DNA binding domain and exhibits either positive or negative transcriptional activities depending on the promoter context. In addition to its transcriptional activities, E4F1 is also an atypical E3-ligase for other transcription factors, including the p53 tumor suppressor. A growing body of evidence suggests that the multifunctional protein E4F1 is involved in signaling pathways that play essential roles during normal development and tumorigenesis. Moreover, we have shown that skin defect is one of the most striking phenotype of E4F1 conditional knockout mice. E4F1 inactivation in the entire skin or in the basal compartment of the epidermis (K5 specific knockout mice) induces skin homeostasis defects, as evidenced by transient hyperplasia in the interfollicular epithelium and alteration of keratinocyte differentiation, followed by loss of cellularity in the epidermis and severe skin ulcerations. E4F1 depletion alters clonogenic activity of epidermal stem cells (ESCs) ex vivo and ends in exhaustion of the ESC pool in vivo, indicating that the lesions observed in the E4F1 mutant skin result, at least in part, from cell-autonomous alterations in ESC maintenance. The clonogenic potential of E4F1 KO ESCs is partially rescued by Bmi1 overexpression, or by Ink4a/Arf overexpression or p53 depletion. In additions, in vivo, skin phenotype of E4F1 KO mice is also delayed in animals with Ink4a/Arf and E4F1 compound gene deficiencies. Taking together, our data show the essential role of E4F1 protein into Bmi1-Arf-p53 pathway to regulate ESC-dependent skin homeostasis.

Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont capables de se multiplier de façon autonome en l’absence de facteurs de croissance et de cytokines, un état appelé “état fondamental de pluripotence”. Le cycle cellulaire des cellules ES se caractérise : (i) par une expression élevée et uniforme de la cycline E et des complexes Cycline E-CDK2 au cours de la progression dans le cycle cellulaire et (ii) par une phase G1 très courte (1 heure) dont la traversée ne dépend ni des MAPK ni des points de contrôles régulés par la protéine du rétinoblastome (RB) et p53. Ces observations soulèvent la question de l’existence d’un lien de cause à effet entre ce phénomène de réplication autonome et la pluripotence. Mon projet de thèse se construit autour de trois axes qui montrent que : 1/ la phase G1 des cellules ES de souris est une phase de sensibilité accrue aux inducteurs de différenciation. 2/ la balance entre autorenouvellement et différenciation est perturbée, (i) quand l’expression de la cycline E est altérée, ou (ii) quand l’association de la cycline E avec la kinase CDK2 et le centrosome est bloquée. 3/ La signalisation par le LIF contrôle la formation et l’activation des complexes Cycline E/CDK2. Dans les cellules ES naïves Rex1+, l’allongement de la durée de la phase G1 induit par la privation de LIF précède, ou est concomitante, à la diminution de l’expression de marqueurs de pluripotence et à l’activation des marqueurs les plus précoces de la différenciation. Finalement, nous proposons un modèle dans lequel la signalisation par le LIF régule la transition G1/S et permet le maintien de l’autorenouvellement des cellules ES murines / Pluripotency can be captured and propagated in vitro from the epiblast of the pre-implantation blastocysts in the form of embryonic stem cells (ESCs). ESCs are capable of unlimited proliferation in an undifferentiated state while maintain the potential to differentiate into cells of all three germ layers in the embryo, including the germline. Two key features the ES cell mitotic cycle are (i) a vastly elevated and uniform expression of Cyclin E and Cyclin E/CDK2 complexes throughout the cell cycle and (ii) a short G1 phase characterized by the lack of RB- and p53-dependent checkpoints, and reduced dependency on MAPK signalling. During my PhD project, we explored whether and how the regulation of the cell cycle actively sustains self-renewal of mouse ESCs (mESCs). We demonstrated that: 1/ the G1 phase of mESCs is a phase of increased susceptibility to differentiation inducers. Thus shortening of G1 might shield undifferentiated cells from differentiation inducers and help ESCs to self-renew in the pluripotent state. 2/ Cyclin E opposes differentiation and supports self-renewal of mESCs by two independent mechanisms, one of which being independent of CDK2 activation. 3/ LIF signalling regulates Cyclin E/CDK2 kinase activity therefore accelerating the G1 to S phase transition. Finally, we propose a model in which LIF signalling stimulates the G1 to S phase transition to shield mESCs from undesired differentiation signals and help them to self-renew in the pluripotent state

Les chimiokines sont des protéines appartenant à la famille des cytokines. A l'origine, ces molécules ont été étudiées pour leur implication dans la régulation du trafic leucocytaire. Depuis une dizaine d'années, de nombreuses études ont cependant démontré que les chimiokines sont aussi impliquées dans les différentes étapes de la cancérogénèse : inhibition de l'immunité anti-tumorale, rôle de facteur de croissance des cellules tumorales, régulation de l'angiogénèse et particulièrement induction de la migration des métastases. En effet, les chimiokines sont capables de guider les cellules métastatiques de la tumeur primaire vers leur lieu d'implantation. Ce guidage passe par la liaison de la chimiokine à son récepteur, ce qui conduit à l'activation de différentes cascades signalétiques intracellulaires qui aboutiront in fine à la migration et le guidage des cellules le long du gradient de chimiokine, et ce jusqu'au lieu d'implantation où une tumeur secondaire pourra alors se former.C'est la compréhension du rôle des chimiokines dans la migration des métastases qui a conduit à l'étude de l'expression de leurs récepteurs dans le cancer. Après avoir étudié dans un premier temps les outils nécessaires à l'obtention de résultats fiables notamment en PCR quantitative, le profil d'expression de différents récepteurs aux chimiokines a été analysé chez des patients atteints d'un cancer colorectal. Les résultats montrent que seules les expressions des récepteurs CCR10 et CXCR4 diminuent chez les patients ayant développé des métastases. De plus cette baisse est corrélée à un mauvais pronostique. Cependant, des études in vitro démontrent que les lignées coliques métastatiques surexpriment ces récepteurs, et que la migration de celles-ci est sensible à un gradient de CCL27, le ligand du récepteur CCR10.Ces résultats a priori paradoxaux prennent tout leur sens lorsqu'on rapproche le concept métastatique du concept de cellule souche. Dans les deux cas, ces types cellulaires aux capacités phénotypiques communes (migration, survie, prolifération) peuvent donner une population cellulaire hétérogène. La mise au point d'une méthode permettant de faire passer les cellules tumorales (prolifératives) en cellules métastatiques (migratoires) et vice versa nous a conduit à un concept syncrétique dans lequel les notions de cellules tumorales, de métastases et de cellules souches se confondent. Dans celui-ci, les cellules tumorales, qu'elles soient ou non issues de cellules souches saines, sont capables de changer réversiblement de phénotype pour former des métastases (équivalent de la transition épithélio-mésenchymateuse). La notion de réversibilité est ici essentielle car elle permet d'expliquer comment une cellule métastatique, une fois implantée, peut s'activer et redonner une population cellulaire tumorale proliférative. Cela implique aussi que les métastases, capables de rester plusieurs mois en dormance, partagent les mêmes mécanismes que les cellules souches.Enfin, l'étude en parallèle de nouvelles voies de régulation de l'angiogénèse - qui fournit aux métastases le moyen de quitter la tumeur primaire - faisant intervenir le récepteur à la thrombine PAR1 d'une part et la chimiokine CXCL4, plus communément appelée PF4 d'autre part, pourrait aboutir à l'élaboration de nouvelles molécules à visée thérapeutique. / Chimiokines are proteins belonging to the cytokines' family. In the beginning, chemokines were studied for their implication in the leucocytic trafic regulation. Since ten years, many studies however show that chemokines are also implied in all of carcinogenesis steps: antitumor immunity inhibition, role of growth factor of tumoral cells, angiogenesis regulation and especially metastases migration induction. Indeed, chemokines are able to guide metastatic cells from the primary tumour towards their secondary site thanks to chemokine / chemokine receptors interactions which lead to metastases migration along a chemokine gradient until their secondary site. Then, metastases activation will lead to the development of a secondary tumour.It is the understanding of chemokines' role in metastases migration that led to the study of their receptors expression in cancer. After having initially studied the tools that were necessary to obtain reliable results in particular in quantitative PCR, expression profile of several chemokine receptors was established on patients developing a colorectal cancer. Results show that only CCR10 and CXCR4 expressions significantly decrease in patients who develop metastases. Moreover this decrease is correlated with poor prognostic. However, in vitro studies show that metastatic colon cell lines overexpress the both receptors, and that migration of those cells is sensitive to a CCL27 gradient, the CCR10 ligand.These paradoxical results may however be easily explained if the metastatic concept is compared to the stem cell one. In both cases, these cellular types share phenotypical properties (migration, survival, proliferation) and are able to give a heterogeneous cellular population. The development of a protocol that turns proliferative tumoral cells into migratory metastatic ones (and vice versa) led us to a syncretic concept in which tumoral cells, metastases and stem cells notions are merging. In this concept, tumoral cells (which result or not from healthy stem cells), are able to reversibly change their phenotype to form metastases (‘epithelial-mesenchymal transition' equivalent). Reversibility is actually an essential concept because it may explain how a metastatic cell, once established, can be activated again and become a proliferative tumoral cell. That also implies that metastases, able to remain several months in dormancy, share the same mechanisms as stem cells ones.Lastly, the study of new angiogenesis regulation pathways - which provides to metastases the means of leaving the primary tumour - involving on the one hand PAR1 thrombin receptor, and on the other hand chemokine CXCL4 (also called PF4), may lead to the development of new therapeutic molecules.

L’ostéoporose liée à l’âge se caractérise par une perte osseuse et une augmentation de l’adiposité médullaire tout en s’accompagnant d’un stress oxydant général. L’ostéoblaste et l’adipocyte ont un précurseur commun, la cellule souche mésenchymateuse (CSM), dont la capacité à se renouveler et à se différencier est influencée par le statut redox cellulaire. Le Strontium (Sr) est un élément possédant un effet antifracturaire significatif in vivo cependant, il n’affecte que peu les marqueurs d’activités des cellules osseuses différenciées. Partant de ce constat, nous avons émis l’hypothèse que les CSMs pouvaient être une cible cellulaire du Sr, et notamment que l’inhibition de leur différenciation adipocytaire pouvait diminuer la lipotoxicité médullaire néfaste à la survie des ostéoblastes au cours du vieillissement. Nous montrons chez des souris traitées 3 semaines au Sr une diminution de l’adiposité médullaire et une augmentation du volume osseux trabéculaire par rapport aux animaux témoins. Nos résultats démontrent que le Sr inhibe rapidement l’adipogenèse des cellules multipotentes mésenchymateuses (CMMs) C3H10T1/2 en réprimant PPARγ2 et l’accumulation des gouttelettes lipidiques de façon partiellement dépendante de la voie ERK. Ce mécanisme serait dépendant de son effet proliférateur puisque que nous observons qu’en présence de Sr plus la Cycline D1 est exprimée, plus PPARγ2 est réprimé. De plus, le Sr prévient la mise en place de processus impliqués dans le statut redox cellulaire et nécessaires à la maturation d’un adipocyte comme la biogenèse mitochondriale, l’accumulation de Rac1 (une sous unité régulatrice de l’activité de la Nadph oxydase) et l’augmentation de l’expression des enzymes antioxydantes. Nous montrons aussi que le Sr diminue la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) de façon précoce ce qui pourrait expliquer son action anti-adipogénique. En effet, les ERO sont indispensables à l’engagement des CSMs vers l’adipogenèse et elles oxydent des lipides qui sont alors activateurs de PPARγ. L’ensemble de ces données nous montre que le Sr, en modifiant la production d’ERO intracellulaire, maintiendrait un statut redox favorable à la prolifération des CMMs et défavorable à leur différenciation adipocytaire. Ainsi la capacité antioxydante et antiadipogénique de futures molécules pourraient définir de nouvelles approches dans le traitement de l’ostéoporose / Age-related osteoporosis is associated with both an increased marrow adiposity while bone mass decreased and an increased oxidative stress. Mesenchymal stem cells (MSCs) differentiate into osteoblasts or adipocytes and their capacity of self-renewal and differentiation is influenced by cell redox status. Strontium (Sr) have an anti-fracture effect in vivo however, it doesn’t clearly modulate markers of mature bone cell activities. Starting from this observation, we hypothesized that MSCs could be a cellular target of Sr, and particularly the inhibition of their adipocyte differentiation could reduce the marrow lipotoxicity which is deleterious for the osteoblast survival during aging. Our study showed that Sr-treated mice presented a lower medullary adiposity and a higher trabecular bone volume as compared to control animals. It was demonstrated that Sr rapidly inhibited adipogenesis of multipotent mesenchymal cells (MMCs) C3H10T1/2 by repressing PPARγ2 and droplet lipid formation in a partially ERK-dependant pathway. This mechanism was linked to its proliferative effect since in presence of Sr the higher Cyclin D1 gene expression; the lower was that of PPARγ2. Moreover, Sr prevented the establishment of processes involved in the cell redox status and necessary for the adipocyte maturation such as mitochondrial biogenesis, Rac1 protein accumulation (a NADPH oxidase regulatory subunit) and increase of the antioxidant enzyme expression. Sr also induced intracellular reactive oxygen species (ROS) decrease that could explain its anti-adipogenic action. Indeed, ROS are essential for the CSM commitment toward adipogenesis and they oxidize lipids which could in turn activate PPAR. Taken together, these data showed that Sr by modulating the intracellular ROS production maintained a redox status supporting the MMCs proliferation and preventing adipocyte differentiation. Thus, the antioxidant and anti-adipogenic capacities of future molecules could define new therapeutic approaches for osteoporosis treatment

La recherche sur les cellules souches, enjeux d'une future médecine régénérative, est emblématique à la fois des opportunités liées au progrès scientifique et des nouvelles questions que ce progrès pose à la société. Recherche sur l'embryon humain, clonage thérapeutique, clonage reproductif sont autant de sujets au coeur d'une actualité brûlante.Quels sont les enjeux scientifiques, éthiques, économiques et juridiques de ces recherches ? En quête d’un équilibre entre le respect de la dignité de l'être humain et la liberté de la recherche, malgré la disparité des pratiques et des législations nationales, l'Europe est devenue le cadre du développement d'un nouveau corpus juridique. Cette étude se propose de montrer de quelle manière la controverse autour de la recherche sur les cellules souches s’intègre «dans une aventure politique européenne» dans laquelle se trouvent impliqués individus, institutions et autorités publiques, engagés dans un processus de «décision ouverte». S’inscrivant dans une perspective comparative, pluridisciplinaire et transdisciplinaire, ce travail a comme objectif de montrer l’évolution et le fonctionnement du droit européen de la bioéthique et surtout de dévoiler le processus qui a amené à l’adoption des règles dans ce domaine. L’importance de cette nouvelle branche du droit pour l’Europe, appelée à répondre aux nouveaux défis scientifiques, économiques et de société, est ainsi mise en évidence. / Research on stem cells, challenges for of a future regenerative medicine, is emblematic of the opportunities related to scientific progress and the new questions that it implies for society. Research on human embryo, therapeutic cloning and reproductive cloning are burning issues.What are scientific, ethical, economic and legal aspects of this research at stake? Looking for a balance between the respect of the dignity of the human being and the freedom of research, in spite of the disparity of national practices and legislations, Europe became the framework for the development of a new legal corpus. This study aims at showing how the controversy related to research on stem cells come within “a European political adventure” in which individuals, institutions and public authorities, engaged in a process of “open decision”, are implied. In a comparative, multidisciplinary and trans-disciplinary perspective, this work has the objective to highlight the evolution and functioning of the European law of bioethics and especially to reveal the process which brought to the adoption of European rules in this field. The importance of this new sector of law for Europe, called to face the new scientific, economic and society challenges, is also emphasized.

Le gène unr (upstream of N-ras) code une protéine de liaison à l’ARN, Unr, qui régule la stabilité et la traduction d’ARN messagers cibles. L’invalidation du gène unr chez la souris conduit à une létalité embryonnaire à mi-gestation (10,5 jours post-coitum, jpc). Unr est donc essentielle pour le développement de la souris. Le phénotype le plus frappant des embryons unr-/- est leur petite taille qui est déjà visible à 8,5jpc. Ce phénotype pourrait refléter un problème précoce de prolifération/différenciation au cours du développement qu’il est possible d’étudier dans les cellules souches embryonnaires (ES). Les cellules ES sont dérivées des cellules pluripotentes des embryons au stade blastocyste (3,5jpc). Les cellules ES peuvent s’auto-renouveler c’est à dire proliférer indéfiniment sous forme non différenciée ce qui correspond à leur état pluripotent ou différencier en tous les types cellulaires (lignages) adultes dérivés des feuillets primordiaux (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) ce que défini la pluripotence. Ces deux propriétés des cellules ES conditionnent leur devenir et définissent leur identité. Nous avons remarqué que les cellules ES unr-/- ont tendance à différencier spontanément alors qu’elles sont cultivées dans des conditions qui les maintiennent dans un état non différencié et prolifératif (état pluripotent). En routine, les cultures de cellules ES unr-/- contiennent environ 25% de cellules morphologiquement différenciées. Nos travaux montrent en effet, qu’elles différencient en endoderme primitif. Nous avons reproduit ce phénotype dans une autre lignée des cellules ES de fond génétique différent par déplétion stable d’Unr. La restauration de l’expression d’Unr dans les cellules ES unr-/- limite fortement leur engagement en différenciation. Unr contribue donc au maintient de l’état pluripotent des cellules ES en prévenant leur différenciation spontanée vers le lignage endodermique primitif (Epr). Ce tissu au cours du développement va former l’épithélium de la poche embryonnaire ou sac vitellin. Nos données préliminaires montrent que les cellules ES en absence d’Unr maintiennent tout de même leur capacité de différenciation multi-lignages (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) quand celle-ci est induite. Ensuite, nous nous sommes intéressés au(x) mécanisme(s) d’action d’Unr. Nous avons fait l’hypothèse qu’Unr pourrait directement agir en régulant positivement des gènes qui inhibent la différenciation des cellules ES en Epr ou en régulant négativement des gènes qui l’induisent. Nous avons identifié le gène gata6 comme cible potentielle d’Unr. Une augmentation modérée de l’expression du facteur de transcription Gata6 dans les cellules ES conduit à une autorégulation positive du gène gata6 et induit la différenciation des cellules ES en Epr. Nos données suggèrent qu’Unr pourrait directement déstabiliser les ARNms Gata6 dans les cellules ES afin de prévenir leur différenciation spontanée en Endoderme primitif. / Unr (upstream of N-ras) is a cytoplasmic RNA-binding protein with cold shock domains, involved in regulation of messenger RNA stability and translation. Unr is essential to mouse development since Embryos deficient for Unr die at mid-gestation. Here we report that unr knockout ES cells maintained under growth conditions that sustain self-renewal spontaneously differentiate toward the primitive endoderm (PrE) lineage. This phenotype was reproduced in another ES line (E14tg2a) after shRNA-induced Unr depletion. Moreover, Unr rescue in Unr-deficient ES cells limits their PrE differentiation engagement. However, Unr is dispensable for multilineage differentiation, as shown by knockout ES cells capacity to produce differentiated teratomas. We further investigated the molecular mechanisms underlying the differentiation of unr-/- ES to primitive endoderm, and found that Unr acts downstream of Nanog. Our data also show Gata6 mRNAs are more stable in Unr-deficient ES cells as compared to wild-type ES cells. We propose that the possible repression by Unr of this key inducer of PrE differentiation at a post-transcriptional level may contributes to the stabilization of ES cells pluripotent state.