Glioblastoma multiforme é o tipo mais frequente de tumor cerebral primário, sendo caracterizado por uma alta agressividade e um prognóstico bastante limitado. O ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) é um inibidor específico de histonas desacetilases aprovado para o tratamento de linfoma cutâneo de células T, e em fase de crescente investigação clínica e pré-clínica em tumores sólidos. Neste estudo, avaliamos a eficácia do ácido hidroxâmico suberoilanilida em tratamento combinado com temozolomida, o agente alquilante já utilizado em glioblastomas. Através de testes de viabilidade e analises por citometria de fluxo em células tumorais das linhagens U251MG e C6, observamos que não houve sinergismo de potenciação entre temozolomida e ácido hidroxâmico suberoilanilida, apenas efeito sinergismo de adição O tratamento combinado inicialmente promoveu parada do ciclo celular em fase G2/M (≥48 h) ao passo que a apoptose foi detectada apenas em exposição prolongada (≥96 h) aos fármacos em estudo. Ainda, as células tratadas com TMZ/SAHA apresentaram fenótipo autofágico, como determinado por citometria de fluxo e imunodetecção de proteínas marcadoras de autofagia como LC3 e o p62/SQSTM1. A autofagia temporalmente precedeu a apoptose e exerceu função citoprotetora, uma vez que o bloqueio da terminação autofágica com cloroquina promoveu uma significante redução na viabilidade celular, a qual foi associada a um aumento de apoptose em células de glioma tratadas com TMZ/SAHA. Portanto, os dados apresentados neste trabalho demonstram que a autofagia é um processo que diminui a eficácia antiglioma do temozolomida e do ácido hidroxâmico suberoilanilida, e a inibição deste fenômeno pode ser uma estratégia para aperfeiçoar a terapia com esses fármacos. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and aggressive type of primary brain tumor which has been associated with a dismal prognosis. In this study, we tested the efficacy of combining temozolomide (TMZ) with suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) - an inhibitor of HDACs 1, 2, 3, and 6 approved for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma - in the viability of tumor cells. The data showed that potentiation synergism between TMZ e SAHA was not achieved due to activation of protective autophagy in vitro. The SAHA/TMZ treatment promoted arrest in the G2/M phase of the cell cycle as soon as 48 h after drug exposure whereas apoptosis was only detected after long-lasting exposure (≥96 h). In addition, SAHA and TMZ induced autophagy as detected by flow cytometry of acridine orange stained cells and immunodetection of the lipidated form of LC3 as well as decreases in p62/SQSTM1. Autophagy preceded apoptosis, and by blocking the termination step of autophagy with chloroquine promoted a significant reduction in the viability of glioma cells which was accompanied by increased apoptosis in SAHA/TMZ treatment. Overall, the herein presented data demonstrate that autophagy impairs the efficacy of combined TMZ/SAHA, and inhibiting this phenomenon could provide novel opportunities to improve the therapeutic potential of these compounds.

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:41:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo7705_1.pdf: 573259 bytes, checksum: 2c9fe948815432b366509c54ae0b4c88 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Esta dissertação teve a finalidade de investigar qual a influência da manufatura celular na produtividade dos processos de fabricação de sandálias em uma indústria no Estado de Pernambuco. A pesquisa foi realizada na indústria de sandálias Dupé S/A, localizada na cidade de Carpina, no Estado de Pernambuco. O trabalho investigou a implantação de células de manufatura com o uso das filosofias, técnicas e métodos da produção enxuta. Os dados levantados foram obtidos através de documentos dos controles internos da empresa, antes, durante e após o processo de implementação das células de manufatura. As células de manufatura implantadas ajudaram a empresa a aumentar a sua produtividade e melhorar a qualidade de seus produtos, contribuindo para que ela se tornasse mais flexível e rápida nos seus processos de fabricação de sandálias. Com a implantação das células, a empresa conseguiu lançar novos modelos de sandálias e conquistar novos mercados internos e externos, honrar seus compromissos de entrega e, ao mesmo tempo, auferir lucros para o crescimento contínuo do volume de negócios

Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, enfermidade amplamente distribuída no rebanho suíno mundial, responsável por prejuízos econômicos relevantes. Possui 12 sorotipos, determinados por técnicas de sorotipificação. Além disso é descrita a ocorrência de amostras não sorotipificáveis. O conhecimento do sorotipo prevalente nos surtos da enfermidade é necessário aos programas de profilaxia. Procurando contornar as dificuldades normalmente encontradas na sorotipificação de A. pleuropneumpnoae, a técnica de RAPD foi avaliada na genotipificação de amostras sorotipificáveis e não sorotipificáveis do agente. Foram utilizados amostras ATCC dos 12 sorotipos e amostras dos sorotipos, 1, 3, 5a, 5b, 7, 11 e 12 isolados no Brasil. Os primers OPG e OPG-19, utilizados individualmente nas reações, foram mais adequados para a diferenciação dos sorotipos. O primer OPG-19 detectou polimorfismos semelhantes entrer os sorotipos 1, 3, 4, 5 e 11; e sorotipos 7 e 12. O perfil de RAPD detectado pelo primier OPGF-10 diferenciou os isolados de campo dos sorotipos 1, 7, 11 e 12. Os sorotipos 3 e 5 apresentaram padrão de RAPD semelhantes, sendo diferenciados pelo perfil de exotoxinas característico, determinado previamente através de PCR. Este primer identificou quatro diferentes perfis de RAPD no sorotipo 3. Um destes foi semelhante ao obtido como sorotipo 11. Neste isolado, foi detecta a presença dos genes para ApxI e ApxII, características do sorotipo 11. As amostras do sorotipo 4 apresentaram perfil de RAPD semelhante ao identificado nos sorotipos 3 ou 5 com o primeir OPG-10, sendo identificada, por PCR, a presença dos genes para ApxI e ApxI, os quais não são característicos do sorotipo. Estas amostras foram isoladas em anos posteriores à amostras dos sorotipos 3 e 5 analisadas. Foi possível caracterizar 14 das 14 amostras não sorotipificáveis de A.pleuropneumpniae obtidas de suínos com sinais da doença. Entre as 4 amostras não sorotipificáveis isoladas de leitões sem sinais clínicos, apenas uma foi caracterizada através de RAPD. É possível que as demais amostras sejam outrtas bactérias NAD-dependente isoladas do trato respiratório de suínos. Amostras caracterizadas como A. minor e A. indolicus apresentaram perfis de RAPD divergentes dos identificados em isolados puros de A. pleuropneumoniae, comprovando a capacidade da técnica na caracterização do agente. Diferentes amostras do mesmo sorotipo de A. pleuropneumoniae apresentaram polimorfismos de RAPD idênticos, demonstrando reprodutividade da técnica. Os resultados comprovam a capacidade de tipificação de A. Pleuropneumoniae através de RAPD. A pesquisa de primers adequados para a diferenciação dos sorotipos 3, 4 e 5 aprimorar sua caracterização, o que pode vir a contribuir com as técnicas de sorotipificação tradicionalmente utilizados, ou permitir o uso como método de confirmação nas amostras cuja sorotipificação é problemática.

A insuficiência hepática aguda é resultante da perda das funções vitais do fígado em consequência da disfunção maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos parácrinos da terapia com células em microcápsulas semipermeáveis, em modelos de insuficiência hepática aguda. Em uma primeira etapa animais submetidos a hepatectomia parcial de 90% foram transplantados com células da medula óssea (CMO) encapsuladas ou cápsulas vazias. Os resultados demonstraram um aumento na sobrevida em 10 dias nos animais tratados com CMO encapsuladas. Estudos em tempos iniciais da regeneração (em até 72 horas) demonstraram que as CMO reduziram a expressão de genes que favorecem a regeneração hepática e aumentaram a expressão de reguladores negativos da regeneração. Como consequência, houve uma diminuição da taxa de regeneração nos animais tratados. Este efeito ocorreu através de mecanismos parácrinos. Na segunda etapa avaliamos a capacidade de diferenciação das células da fração mononuclear da medula óssea (CFMMO) encapsuladas in vivo e in vitro. Animais submetidos a uma lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4) foram transplantados com CFMMO encapsuladas. Animais sem lesão hepática foram utilizados como controle. Observou-se que, 48 horas após o transplante as CFMMO passaram a expressar genes característicos de hepatócitos. A fim de estudar melhor os mecanismos envolvidos nesta diferenciação, utilizamos CFMM encapsuladas em um modelo in vitro que replicasse as características do modelo in vivo. Assim empregamos um sistema de co-cultivo, onde as CFMMO encapsuladas eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos com ou sem lesão por CCl4. Nossos resultados demonstraram que em apenas 6 horas de co-cultivo in vitro as CFMMO encapsuladas expressaram marcadores hepáticos. Estes resultados sugerem a ocorrência de diferenciação das CFMMO em tempos muito precoces por mecanismos parácrinos. Em conjunto, os resultados apresentados nos permitem concluir que a microencapsulação celular se mostrou uma ferramenta adequada para avaliar os processos que ocorrem na lesão hepática aguda de maneira bidirecional. Sendo assim, pudemos observar o efeito que as células da medula óssea (total ou fração mononuclear) exercem sobre o tecido hepático lesado, bem como o efeito que substâncias secretadas por este tecido têm sobre essas células. / Acute liver failure results from loss of the liver’s vital functions due to major dysfunction of hepatic tissue. In several cases, liver transplantation is the definitive treatment, despite the liver’s regenerative capacity. Regeneration mechanisms involve intricate regulatory pathways, with activation of growth factors and cytokines. Cell therapy with bone marrow stem cells has been proposed as a therapeutic alternative. However, its use remains in the experimental field. The objective of this study was to investigate paracrine effects of cell therapy in models of acute liver failure with the use semipermeable microcapsules. First, animals undergoing 90% partial hepatectomy were transplanted with encapsulated bone marrow cells (BMC) or empty capsules. Results showed an increase in 10-day survival in treated animals treated with encapsulated BMC. Studies performed at earlier steps (within 72 hours) demonstrated that BMC reduced expression of genes that promote liver regeneration and increased the expression of its negative regulators. As a consequence, there was a decrease in the rate of liver regeneration in treated animals, and this effect occurred through paracrine mechanisms. In the second study we evaluated the differentiation ability of encapsulated bone marrow mononuclear cells (BMMC) in vivo and in vitro. Animals submitted to carbon tetrachloride (CCl4) induced acute liver injury were transplanted with encapsulated BMMC. Animals without liver injury were used as a control group. It was observed that 48 hours after transplantation, BMMC began to express hepatocyte-specific genes. In order to better understand the mechanisms involved in this differentiation, we used encapsulated BMMC in an in vitro model that replicates the characteristics of the in vivo model. So, we employed a co-culture system, where encapsulated BMMC were kept in contact with medium from hepatocytes with or without injury by CCl4. Our results showed that in just 6 hours of in vitro co-culture the encapsulated BMMC expressed hepatic markers. These results suggest the occurrence of BMMC differentiation at very early steps by paracrine mechanisms. Taken together, results shown here allow us to conclude that cellular microencapsulation proved to be a suitable tool to assess the processes that occur in acute liver injury in a bidirectional manner. Thus, we were able to observe the effect that bone marrow cells (both total and mononuclear fraction) exert on the injured liver tissue, as well as the effect that substances secreted by this tissue have on these cells.

Tese de mestrado. Projecto e Planeamento do Ambiente Urbano. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Universidade de Coimbra. Faculdade de Ciências e Tecnologia. 2006

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000391140-Texto+Completo-0.pdf: 3891847 bytes, checksum: a692cff7af22978c19d6e2954a337d26 (MD5) Previous issue date: 2007 / Depression is the most common manifestation of affective disorders. It is one of the most disable diseases, and causes a significant burden to both the individual and the society and, if not treated, it can increase morbidity and mortality. The use of antidepressants drugs is the base of depression treatment. The selective serotonin reuptake inhibitors, such as fluoxetine and sertraline, and the tricyclic antidepressants, nortriptyline and clomipramine, are constantly used in the treatment for depression. Evidence has shown the important role performed by ATP and adenosine in the central nervous system. ATP can be stored and co-released with other neurotransmitters, such as noradrenaline and serotonin. Extracellular ATP can be hydrolyzed to adenosine by the action of ecto-nucleotidases. These ecto-enzymes promoted the enzymatic conversion of ATP, controlling the levels of this nucleotide and its nucleoside adenosine. Among the ecto-nucleotidases, we can highlight the NTPDases family and the ecto-5´-nucleotidase. Considering that: (i) adenosine exerts an important neuromodulatory role, (ii) ATP can be co-released with serotonin and noradrenaline, and (iii) the ecto-nucleotidases represent the main pathway for extracellular adenosine formation through ATP catabolism, become important to evaluate the effects of antidepressant drugs on the ecto-nucleotidases. Fluoxetine, sertraline, nortriptyline and clomipramine were tested for in vitro treatment, in the concentrations of 100, 250 and 5007M, in the blood serum and in hippocampal and cerebral cortex synaptosomes from rats. ATP and ADP hydrolysis were inhibited in a dose-dependent manner in the in vitro treatment with the four drugs in the hippocampal and cerebral cortex synaptosomes from rats, but AMP hydrolysis was not altered. The in vitro treatment did not affect any enzyme activities tested in rat blood serum. Fluoxetine and nortriptyline were used for the in vivo treatment in a dose of the 10mg/Kg. The acute treatment (1 hour after the administration) with nortriptyline promoted an inhibition on ATP hydrolysis in rat blood serum. However, the chronic treatment (14 dias) with both drugs caused an inhibition on NTPDases and ecto-5´-nucleotidasis activities in blood serum. Fluoxetine acute treatment did not alter the enzymes activities in synaptosomes of hippocampus and cerebral cortex. The acute treatment with nortriptyline induced an increase of ADP hydrolysis in cerebral cortex and a decrease of ATP and ADP hydrolysis in the hippocampus. The chronic treatment with fluoxetine promoted an inhibition of the ATP hydrolysis in the hippocampus and cerebral cortex and increased the ADP and AMP hydrolysis in the cerebral cortex. After chronic treatment with nortriptyline, there was a decrease of ATP hydrolysis in the hippocampus, but it was observed an increase of enzymes activities in cerebral cortex. The gene expressions of NTPDases and ecto-5´- nucleotidase were altered after acute and chronic treatments with fluoxetine and nortriptyline in hippocampus and cerebral cortex of rats. The findings demonstrated that these antidepressants drugs can affect the enzymes involved in the adenosine production, suggesting that the purinergic system can be a target to neurochemical effects promoted by these drugs. / A depressão é a manifestação mais comum dos distúrbios afetivos. É uma das doenças mais debilitadoras e causa problemas tanto para o indivíduo quanto para a sociedade e, se não for tratada, pode levar ao aumento da morbidade e mortalidade. O uso de fármacos antidepressivos é a base dos tratamentos para depressão. Os inibidores seletivos da recaptação de serotonina, como a fluoxetina e a sertralina, e os antidepressivos tricíclicos, nortriptilina e clomipramina, são constantemente utilizados no tratamento para a depressão. Evidências têm demonstrado o importante papel desempenhado pelo ATP e a adenosina no sistema nervoso central. O ATP pode ser armazenado e co-liberado juntamente com outros neurotransmissores, tais como a noradrenalina e a serotonina. O ATP extracelular pode ser hidrolisado até adenosina pela ação de um grupo de ecto-nucleotidases. Estas ecto-enzimas promovem a conversão enzimática de ATP, controlando os níveis deste nucleotídeo e do seu nucleosídeo adenosina. Dentro do grupo das ecto-nucleotidases, podemos destacar a família das NTPDases (Nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5´- nucleotidase. Considerando que: (i) a adenosina exerce um importante papel neuromodulador, (ii) o ATP pode ser co-liberado com serotonina e noradrenalina e (iii) as ecto-nucleotidases representam a principal rota de formação de adenosina extracelular através do catabolismo do ATP, torna-se importante avaliar o efeito de fármacos antidepressivos sobre a via das ecto-nucleotidases. Fluoxetina, sertralina, nortriptilina e clomipramina foram testadas no tratamento in vitro, nas concentrações de 100, 250 e 500 µM no soro e em sinaptossomas de hipocampo e córtex cerebral de ratos. A hidrólise de ATP e ADP foram inibidas de maneira dose-dependente no tratamento in vitro realizado com os quatro fármacos em sinaptosomas de hipocampo e córtex cerebral de ratos, mas a hidrólise de AMP não foi alterada. O tratamento in vitro em soro de ratos não afetou nenhuma das atividades enzimáticas estudadas. Fluoxetina e nortriptilina foram testadas no tratamento in vivo, na dose de 10mg/Kg. O tratamento agudo (1 hora após a administração) com nortriptilina provocou uma inibição na hidrólise de ATP em soro de ratos. Entretanto, o tratamento crônico (14 dias) com ambas as drogas provocou uma inibição na atividade das NTPDases e da ecto-5´-nucleotidase em soro. O tratamento agudo com fluoxetina não alterou a atividade das enzimas em sinaptossomas de hipocampo e córtex cerebral. Entretanto, o tratamento agudo com nortriptilina levou a um aumento na hidrólise de ADP no córtex cerebral e induziu uma diminuição na hidrólise de ATP e ADP no hipocampo. O tratamento crônico com fluoxetina provocou uma inibição na hidrólise de ATP no hipocampo e no córtex cerebral e aumentou a hidrólise de ADP e AMP no córtex cerebral. Após tratamento crônico com nortriptilina, houve uma diminuição da hidrólise de ATP no hipocampo, mas foi observado um aumento nas atividades destas enzimas no córtex cerebral. A expressão gênica das NTPDases e ecto-5´-nucleotidase foi alterada após os tratamentos agudo e crônico com fluoxetina e nortriptilina em hipocampo e córtex cerebral de ratos. Os resultados demonstram que estes fármacos antidepressivos podem influenciar as enzimas envolvidas na formação do neuromodulador adenosina, sugerindo que o sistema purinérgico pode ser alvo dos efeitos neuroquímicos promovidos por estes fármacos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000447382-Texto+Completo-0.pdf: 4486344 bytes, checksum: 86fdbbba27db00743c8e29d0d264ba0e (MD5) Previous issue date: 2013 / A wide variety of studies have demonstrated that physical activity has beneficial effects on brain function, including the improvement of cognition, the enhancement of learning and memory processes, and also displays neuroprotective effects. One of the mechanisms responsible for these beneficial effects is the influence that exercise has on brain plasticity. In this sense, the hippocampus is a brain region particularly important in the formation of new memories and featured as one of the main structures of the brain where we observe neurogenesis in adulthood. The astrocytes are important glial cells, critical for neuronal energy metabolism by regulating the concentration of various molecules and as neurons, are believed to participate actively in the synaptic function. Furthermore, astrocytes are susceptible to plasticity induced by environmental stimuli such as physical exercise. The aim of this study was to investigate whether physical exercise can alter the immunoreactivity for Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), density and morphology of GFAP positive astrocytes, in the stratum radiatum of the CA1 region of the rat hippocampus. Thirteen male rats were divided in two groups: Sedentary (n=6) and Exercise (n=7). The animals in the exercise group were submitted to a protocol of 30 minutes of daily physical exercise on a treadmill for 4 consecutive weeks. GFAP immunoreactivity was evaluated using optical densitometry and the analysis of the astrocyte ramification was done using an adaptation of Sholl's concentric circles method. The results show that physical exercise is capable of increasing the density of GFAP positive astrocytes as well as the regional and cellular GFAP expression. In addition, physical exercise altered astrocytic morphology as shown by the increased degree of ramification observed in the lateral quadrants and in the length of the longest astrocytic processes in the central quadrants. This data demonstrate important changes in astrocytes promoted by physical exercise, supporting the idea that these cells are involved in regulating neural activity and plasticity. / Diversos estudos demonstram que a prática de atividade física diária tem efeitos benéficos sobre a função cerebral, incluindo melhora da cognição e dos processos de aprendizagem e memória, além de apresentar efeitos neuroprotetores. Um dos mecanismos responsáveis por esses efeitos benéficos é a influência que o exercício físico exerce sobre a plasticidade neural. Neste sentido, o hipocampo é uma região encefálica especialmente importante nos processos de formação de novas memórias e caracterizado como um dos principais locais do encéfalo onde observamos neurogênese em fase adulta. Os astrócitos são importantes células da glia, fundamentais para o metabolismo energético neuronal, regulando a concentração de várias moléculas e assim como os neurônios, acredita-se que participem ativamente da função sináptica. Além disso, os astrócitos são células suscetíveis à plasticidade induzida por estímulos ambientais, como o exercício físico. O objetivo deste estudo foi investigar se o exercício físico é capaz de alterar a imunorreatividade para a Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP), a densidade e a morfologia dos astrócitos GFAP positivos, do stratum radiatum da região CA1 do hipocampo de ratos Wistar. Treze ratos machos foram divididos em 2 grupos: Sedentário (n=6) e Exercício (n=7). Os animais do grupo exercício foram submetidos a 4 semanas de exercício físico diário em esteira durante 30 minutos por dia. A imunorreatividade para GFAP foi avaliada por densitometria óptica e a análise da ramificação astrocitária foi realizada por uma adaptação do método dos círculos concêntricos de Sholl. Os resultados obtidos demonstram que o exercício físico foi capaz de aumentar a densidade de astrócitos GFAP positivos, bem como a expressão regional e celular de GFAP. Além disso, os astrócitos alteraram sua morfologia em resposta ao exercício físico, o que foi demonstrado pelo aumento no grau de ramificação dos astrócitos nos quadrantes laterais e no comprimento dos processos astrocíticos nos quadrantes centrais. Estes achados demonstram importantes alterações astrocitárias após o exercício físico, corroborando a ideia de que estas células estão envolvidas na regulação da atividade neural e da plasticidade.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401649-Texto+Completo-0.pdf: 937750 bytes, checksum: 1be2b50a72c9a07775715c1800439014 (MD5) Previous issue date: 2008 / The granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is a cytokine that belongs to a group of glycoprotein that regulates the proliferation and differentiation of hematopoietic cells, more specifically granulocytes and macrophages. The human GM-CSF is a 14. 4 kDa protein consisting of 127 amino acid polypeptide chain and shares 52% of similarities with murine protein. The human protein has 4 cysteine residues that forms two disulphide bonds; only the Cysteine 54 and 96 are required for the biologic activity of it. This biopharmaceutical has been widely used in neutropenic patients who receive high-dose chemotherapy or were transplanted. Therefore, GM-CSF is used to restore hematopoietic dysfunctions, to stimulate the hyper-production of functionally primed effectors cells and to augment host defense against infection and malignant diseases. Its use is associated with significant decreases in chemotherapy-associated infections, antibiotic use, length of hospital day and mortality. The international patent of the biopharmaceutical Molgramostim (generic name) expired in 2006, and thus became an interesting product to pharmaceutical industries, including those settled in Brazil. Presently, Molgramostim is sold in Brazil as an imported biopharmaceutical, which, in turn becomes very costly to the Brazilian government. Therefore, the aim of this work is to develop a methodology for subsequent production of a national Molgramostim. In this work the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene was assembled by PCR. It was cloned into pET30a(+) expression vector and the best condition for expression of the protein was in the BL21(DE3) strain from Escherichia coli. To the isolation of inclusion bodies an efficient protocol was developed using multi step washing procedure and purification method of the recombinant protein from inclusion bodies using only a cationic and then an anionic exchange column. The immunoassay and N-terminal sequencing confirmed the identity of rhGM-CSF. The result of the biological activity assay, in vitro, showed that the rhGM-CSF produced has an equivalent biological potential to the standard reference. The protein rhGM-CSF was produced through simple, cost effective and economically feasible process and is extremely important to the industrial procedure and healthcare community. / O fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) é uma citocina pertencente a um grupo de glicoproteínas que regula a proliferação e a diferenciação de células hematopoiéticas, mais especificamente macrófagos e granulócitos. O GM-CSF humano é uma proteína de 14,5 kDa constituída de 127 aminoácidos e possui 52% de similaridade com a proteína de rato. A proteína humana possui 4 resíduos de cisteína formando duas pontes dissulfeto, porém apenas as cisteínas 54 e 96 são requeridas para a atividade biológica da mesma. Este biofármaco tem sido usado em pacientes neutropênicos que receberam altas doses de quimioterapia ou transplantados. Além disso, GM-CSF é usado para restabelecer disfunções hematopoiéticas, estimular a hiper-produção de células efetoras pré-induzidas (“primed”) funcionalmente e promover a defesa do hospedeiro contra doenças infecciosas e malignas. O uso dos mesmos está relacionado à redução no número de infecções associadas à quimioterapia, no uso de antibióticos e no tempo total de internação do paciente bem como no número de mortes. A patente internacional do biofármaco Molgramostima (nome genérico) expirou em 2006 e, além disso, tornou-se um interessante produto para indústrias farmacêuticas, inclusive para aquelas estabelecidas no Brasil. Molgramostima é vendida no Brasil como um biofármaco importado, o qual, desta forma, torna-se muito custoso para o governo brasileiro. Contudo, o objetivo deste trabalho é desenvolver uma metodologia para a posterior produção industrial de uma molgramostima a nível nacional. Neste trabalho, o gene para o hGM-CSF foi construído por PCR, clonado no vetor de expressão pET30a(+) e expresso na cepa BL21(DE3) de Escherichia coli na sua forma insolúvel. Para o isolamento e solubilização dos corpos de inclusão um eficiente protocolo foi desenvolvido utilizando múltiplos passos de lavagem e um método de purificação usando somente duas colunas cromatográficas de troca catiônica e aniônica, respectivamente. O teste de atividade biológica in vitro demonstrou que o rhGM-CSF produzido tem potencial equivalente ao padrão internacional utilizado. A proteína foi obtida por meio de um processo simples e econômico, sendo de extrema importância em procedimento industrial e para saúde da população.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000348257-Texto+Completo-0.pdf: 502199 bytes, checksum: 153dec6d7d64e7e505527b64b42f0540 (MD5) Previous issue date: 2006 / The gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) has been implicated in central nervous system diseases, including neurodevelopmental disorders associated with autism. In the present study we examined the effects of GRPR blockade during the neonatal period on behavioral measures relevant to animal models of neurodevelopmental disorders. Male Wistar rats were given an intraperitoneal (i. p. ) injection of either saline (SAL) or the GRPR antagonist [D-Tpi6, Leu13 psi(CH2NH)-Leu14] bombesin (6-14) (RC-3095; 1 or 10 mg/kg) twice daily for 10 days from postnatal days (PN) 1 to 10. Animals treated with RC-3095 showed pronounced deficits in social interaction when tested at PN 30-35 and impaired 24-h retention of memory for both novel object recognition (NOR) and inhibitory avoidance tasks tested at PN 60-71. Neither short-term memory tested 1. 5 h posttraining nor open field behavior were affected by neonatal GRPR blockade. The implications of the findings for animal models of neurodevelopmental disorders are discussed. / O receptor do peptídeo liberador de gastrina (GRPR) vem sendo relacionado a doenças do sistema nervoso central, incluindo desordens do desenvolvimento neurológico associadas ao autismo. No presente estudo, analisamos os efeitos do bloqueio do GRPR durante o período neonatal em medidas comportamentais relevantes em modelos animais de desordens do desenvolvimento neurológico. Ratos Wistar machos receberam injeções intraperitoneais (i. p) de salina (SAL) ou do antagonista do GRPR [D-Tpi6, Leu13 psi(CH2NH)-Leu14] bombesina (6-14) (RC-3095; 1 ou 10 mg/kg) duas vezes ao dia, do primeiro ao décimo dias de vida. Os animais tratados com RC-3095 demonstraram déficits pronunciados em interação social quando testados no período de 30-35 dias de idade. Prejuízos na retenção da memória 24h após o treino em ambas as tarefas; de reconhecimento do objeto novo (RON) e de esquiva inibitória, foram demonstrados quando os animais foram testados aos 60-71 dias de idade. O bloqueio neonatal do GRPR não afetou o comportamento em teste de memória de curta duração, 1,5h após o treino, tampouco o comportamento em campo aberto. As implicações desses achados em modelos animais de desordens do desenvolvimento neurológico são discutidas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000400016-Texto+Completo-0.pdf: 696310 bytes, checksum: 7f8908ad96586598d5473332eb4bd96b (MD5) Previous issue date: 2008 / Interferons are proteins expressed by different human cells and synthesized in response to many chemical and biological agents. They are involved in antiviral, antiproliferative and immunomodulatory responses, acting to both maintain homoeostasis and in host defense. Because of this biological activity, interferons are now licensed worldwide for the treatment of various viral, malignant and immune disorders. Interferon β1, for instance, is one of the few substances which has proved to have effectiveness in suppressing manifestations of multiple sclerosis that is a chronic disease of the central nervous system. It is commercially produced in microorganisms such as Escherichia coli by using recombinant DNA techniques and is thus designated as biopharmaceutical. The patents for many originator biopharmaceuticals are expiring, and a new generation of follow-on molecules, termed “biosimilars”, is under development. Interferon β1 was approved for use in the treatment of relapsing-remitting multiple sclerosis by U. S. Food and Drug Administration in 1993 and lost its patent protection in 2007 becoming a target to biosimilar production for pharmaceutical industries. The development of interferon β1 biosimilar is an alternative to the high cost of the originator biopharmaceutical. We have developed a protocol to produce large quantities of pure interferon β1 in which approximately 3 mg of homogeneous recombinant protein could be obtained from 1 g of E. coli Rosetta(DE3) cells. N-terminal amino acid sequencing and mass spectrometry analysis provided evidence for the identity and purity of the recombinant protein. Reverse phase liquid chromatography analysis demonstrated the content of deamidates and sulphoxides were similar to a commercial standard, and no heterogeneous forms of rhIFN-β1ser17 were detected. Size exclusion chromatography analysis demonstrated the absence of high molecular mass aggregates and dimers. The protocol developed may be used to biosimilar production by pharmaceutical industries and thereby lower costs to healthcare payers and consumers. / Interferons são proteínas expressas por diferentes células humanas e sintetizadas como resposta a muitos agentes químicos e biológicos. Eles estão envolvidos em repostas antiviral, antiproliferativa e imunomodulatória, atuando na manutenção da homeostase e na proteção do organismo contra patógenos. Devido a essa atividade biológica, os interferons são atualmente aprovados no mundo inteiro para o tratamento de várias desordens virais, malignas e imunológicas. Interferon β1, por exemplo, é uma das poucas substâncias que provou ser efetiva na supressão das manifestações da esclerose múltipla que é uma doença crônica do sistema nervoso central. Ele é produzido comercialmente em microorganismos como Escherichia coli, utilizando a tecnologia do DNA recombinante e é chamado de biofármaco. As patentes de muitos biofármacos originais estão expirando e uma nova geração de moléculas, chamadas “biossimilares”, está em desenvolvimento. O interferon β1 foi aprovado para uso no tratamento da esclerose múltipla surtoremissão pelo Departamento de Controle de Drogas e Alimentos dos EUA em 1993 e perdeu sua proteção de patente em 2007, tornando-se um alvo para a produção do biossimilar pelas indústrias farmacêuticas. O desenvolvimento do biossimilar interferon β1 é uma alternativa para o alto custo do biofármaco original. Desenvolvemos um protocolo para produzir grandes quantidades do interferon β1, no qual aproximadamente 3 mg da proteína recombinante homogênea podem ser obtidos a partir de 1 g de células de E. coli Rosetta(DE3). As análises por seqüenciamento N-terminal de aminoácidos e espectrometria de massas proveram evidências para a identidade e pureza da proteína recombinante. A análise por cromatografia líquida de fase reversa demonstrou que o conteúdo de deamidados e sulfóxidos foi similar ao padrão comercial, e nenhuma forma heterogênea da proteína rhIFN-β1ser17 foi detectada. A análise por cromatografia líquida de exclusão molecular demonstrou a ausência de agregados de alta massa molecular e de dímeros. O protocolo desenvolvido poderá ser utilizado para a produção do biossimilar pelas indústrias farmacêuticas e deste modo, diminuir os custos do Ministério da Saúde e dos consumidores com este biofármaco.