Desde hace casi tres décadas, los esfingolípidos han entrado a la escena de los lípidos bioactivos. Dentro de esta gran familia, son sus versiones más simples los que han sido relacionados con importantes funciones celulares. La Ceramida (Cer), y su derivado por deacilación, la esfingosina (Sph), han sido reportados como segundos mensajeros de muerte en diversos tipos celulares. Por su parte, sus derivados fosforilados, en especial la esfingosina-1-fosfato (S1P), se han identificado con funciones proliferativas y pro-supervivencia. Diversas señales mitogénicas contribuyen no solo a la proliferación sino también a la migración celular, siendo de especial interés en ciertas patologías como el cáncer. Sin embargo, los procesos celulares invasivos son relevantes también en la retina, el tejido de interés de este trabajo de tesis. Diversas patologías, como la retinopatía diabética, presentan una proliferación exacerbada de las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo glial de la retina, proceso conocido como gliosis. En su inicio, esta respuesta es un intento fisiológico por aislar al tejido neuronal de la injuria y reparar el daño. Sin embargo, en un estado patológico, ante la continuidad de la injuria, esta proliferación celular termina convirtiéndose en una cicatriz que afecta el normal funcionamiento del tejido retiniano, llevando en última instancia a la pérdida parcial o total de la visión. Por lo expuesto, resulta relevante investigar estos procesos proliferativos de la retina a fin de encontrar nuevos tratamientos terapéuticos. La información sobre las funciones del esfingolípido mitogénico S1P a nivel de la retina es escasa. Por ejemplo, se ha reportado que la S1P promueve la proliferación y respuestas pro-fibróticas y pro-inflamatorias en células de epitelio pigmentario y que participa en la neo-vascularización retinal y coroidal. Además, los niveles retinales y plasmáticos de S1P aumentan en un modelo inflamatorio inducido por lipopolisacárido. En el primer capítulo de este trabajo de tesis, planteamos la hipótesis de que la S1P podría estar involucrada en los procesos glióticos, participando como una señal clave para inducir la migración glial. Para contrastar nuestra hipótesis, utilizamos un modelo de cultivo primario de células gliales de Müller y analizamos la migración glial mediante el “ensayo de la herida”, un método sencillo y ampliamente utilizado para este propósito. Nuestros experimentos revelaron que la adición exógena de S1P induce modificaciones en el citoesqueleto de las CGM, detectadas en las primeras 8-10 h de tratamiento, que llevan a la formación de lamelipodios y al inicio de la motilidad glial sobre el sustrato. Esta motilidad glial fue claramente superior a la de los cultivos controles luego de 18 h de estímulo. Las CGM expresaron dos de los cinco receptores transmembrana para S1P, los S1PR, específicamente los subtipos S1P1 y S1P3, siendo la activación de este último la que desencadena el proceso migratorio, tal como lo demostraron experimentos utilizando antagonistas selectivos de ambos receptores. Nuestros resultados también mostraron que rio-abajo de la activación del S1P3 se activarían dos importantes vías intracelulares, la vía de ERK/MAPK y la vía de PI3K, ya que el pre-tratamiento con inhibidores de estas vías disminuyó significativamente el estímulo migratorio inducido por S1P. Cabe destacar que esta inducción del proceso migratorio no estuvo acompañada de un incremento significativo en la proliferación glial. Por otra parte, no solo la S1P exógena tuvo un rol en la migración glial. Encontramos que la inhibición de la síntesis endógena de S1P, utilizando un inhibidor selectivo de la enzima esfingosina quinasa 1 (Sphk1) (enzima que cataliza la síntesis de S1P), el inhibidor de SphK1 2 (SphKI2), prácticamente abolió la migración glial basal, es decir aquella observada aun en ausencia de S1P. Estos resultados demuestran que la S1P tiene un rol clave en la inducción de migración glial en la retina, y su bloqueo podría ser utilizado como una estrategia terapéutica para las enfermedades proliferativas de la retina. Otro conjunto de patologías de la retina, de creciente avance y lamentablemente aun sin tratamientos efectivos, son las enfermedades neurodegenerativas. Las mismas son un conjunto de patologías, entre las que destacan la retinitis pigmentosa y la degeneración de la mácula con una variada etiología, con múltiples factores, desde genéticos hasta ambientales como desencadenantes, pero que comparten un denominador común: la muerte de los fotorreceptores (FR). Esta degeneración progresiva de los FR lleva, como consecuencia final, a la pérdida de la visión. Como se describió, Cer y Sph son importantes mediadores de muerte celular y han despertado la atención en el campo de las enfermedades neurodegenerativas. Estudios pioneros encontraron que los niveles de Cer se encontraban aumentados en retinas pos mortem de pacientes con la enfermedad de Faber, y que los niveles de este esfingolípido aumentaban frente a la degeneración neuronal inducida por desprendimiento de retina. Posteriores reportes, incluidos los de nuestro laboratorio, establecieron que la Cer es un mediador clave en la muerte de los FR en cultivo. El daño oxidativo estimula la síntesis de Cer que desencadena la muerte de los FR y este proceso es mimetizado por la adición exógena de un análogo sintético de ceramidas endógenas, la C2-Ceramida (C2Cer). Hallazgos posteriores en diversos modelos animales de neurodegeneración retiniana permiten proponer a la Cer como un mediador central en la activación de la muerte de los FR. Pese a esto, aún no se conoce en profundidad cuáles son los mecanismos moleculares involucrados en este proceso. Esta pregunta resulta relevante, ya que la regulación de los distintos blancos intracelulares de Cer podría emerger como posible terapia para las enfermedades neurodegenerativas de la retina. Ante esto, nos planteamos como objetivo en el 2º capítulo de esta Tesis, estudiar los mecanismos moleculares involucrados en la muerte de los FR mediada por C2Cer, utilizando un modelo de cultivo primario de neuronas de retina de rata. Un trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que la C2Cer, en una concentración de 10 μM induce la muerte de los FR y las neuronas amacrinas, los tipos neuronales mayoritarios en los cultivos. Estudiando el proceso de muerte de manera cronológica, encontramos que el tratamiento de cultivos neuronales con C2Cer 10 μM durante 6 h indujo selectivamente la muerte de los FR, disminuyendo el potencial de membrana mitocondrial y aumentando la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). En contraste, las neuronas amacrinas preservaron su viabilidad. Cabe destacar que la cantidad de células marcadas con TUNEL y de FR que expresaron caspasa-3 clivada, forma activa de la caspasa-3, permanecieron constantes y que el pretratamiento con un pan inhibidor de caspasas no evitó la muerte inducida por C2Cer. C2Cer provocó la sobre activación de la poli-ADP ribosil polimerasa-1 (PARP-1). La inhibición de PARP-1 disminuyó la muerte de los FR inducida por C2Cer. A su vez, C2Cer aumentó los niveles de polímero de poli-ADP ribosa (PAR), cuya síntesis es catalizada por PARP-1, e indujo la translocación del factor inductor de apoptosis (AIF) de las mitocondrias al núcleo de los FR, ya que dicha translocación se previno mediante la inhibición de PARP-1. El pretratamiento con un inhibidor de calpaínas y catepsinas, y con un inhibidor de la calpaína redujo la muerte de los FR, mientras que los inhibidores selectivos de catepsinas no otorgaron protección. El pretratamiento combinado con un inhibidor de PARP-1 y un inhibidor de calpaína evidenció la misma protección que cada inhibidor por sí mismo. Esto sugiere que tanto PARP-1 como calpaínas confluyen en el mismo mecanismo de acción rio-abajo de la C2Cer. Ni la autofagia ni la necroptosis estuvieron involucradas en la muerte inducida por C2Cer; no se observó un aumento en la liberación de LDH después del tratamiento con C2Cer y el pretratamiento con inhibidores de la necroptosis y de la autofagia no rescataron a los FR. Estos resultados sugieren que la C2Cer activa la muerte de los FR por un mecanismo novedoso, independiente de caspasas, que implica la activación de PARP-1, disminución del potencial de membrana mitocondrial, activación de calpaína y translocación de AIF, todas las características bioquímicas del tipo de muerte celular denominada parthanatos. Nuestros resultados, sugieren así nuevos blancos terapéuticos, y contribuyen a los avances en la búsqueda de tratamientos efectivos para las enfermedades neurodegenerativas de la retina. / For almost three decades, sphingolipids have entered the bioactive lipid scenery. Within this large family, simple sphingolipids are the ones that have been related to important cellular functions. Ceramide (Cer), and its deacylation derivative, sphingosine (Sph), have been reported as death second messengers in several cell types. On the other hand, its phosphorylated derivatives, especially sphingosine-1-phosphate (S1P) have been related to proliferative and pro-survival functions. Several mitogenic signals contribute not only to proliferation but also to cell migration, being of special interest in certain pathologies such as cancer. However, invasive cellular processes are also relevant in the retina, the tissue of interest in this thesis work. Diverse pathologies, such as diabetic retinopathy, show an exacerbated proliferation of Müller glial cells (CGM, the main glial type of the retina), a process known as gliosis. Initially, this response is a physiological attempt to isolate neuronal tissue from injury and repair the damage. However, in a pathological state, given the continuity of the injury, this cell proliferation gives rise to a scar that affects the normal functioning of the retinal tissue, ultimately leading to a partial or total vision loss. Therefore, it is relevant to investigate these retinal proliferative processes in order to find new therapeutic treatments. There is scarce information on the functions of the mitogenic sphingolipid S1P in the retina. S1P has been reported to promote proliferation, pro-fibrotic and pro-inflammatory responses in pigment epithelial cells and it also participates in retinal and choroidal neovascularization. In addition, there is an increase in retinal and plasma levels of S1P in an inflammatory model induced by lipopolysaccharide. In the first chapter of this thesis we propose the hypothesis that S1P might be involved in gliotic processes, as a key signal in the induction of glial migration. To test our hypothesis, we used a primary culture model of Müller glial cells and evaluated cell migration by the scratch-wound assay, which is a simple and widely used method. Our experiments revealed that the exogenous addition of S1P modified the CGM cytoskeleton, in the first 8-10 hours of treatment. This addition led to the formation of lamelipodia and to the onset of glial motility. This motility was markedly enhanced compared to control conditions after 18 h of S1P addition. CGM expressed two of the five transmembrane receptors for S1P (S1PR), specifically the S1P1 and S1P3 subtypes. However, only activation of S1P3 was required to induce S1P-induced CGM migration, as evidenced by experiments performed with S1P1 and S1P3 antagonists. Analysis of the signaling pathways activated downstream of S1P3 evidenced that two well-known pathways, the ERK/MAPK and PI3K pathways were activated, since pre-treatment with specific inhibitors, significant reduced S1P-induced glial migration. Of note, this induction of the migratory process was not accompanied by a significant increase in glial proliferation. On the other hand, not only exogenous S1P played a role in glial migration. Inhibition of the endogenous synthesis of S1P, using a selective inhibitor of the enzyme sphingosine kinase 1 (Sphk1) (the enzyme that catalyzes the synthesis of S1P), the SphK1 inhibitor number 2 (SphKI2), virtually blocked the basal glial migration, i.e. the migration level observed in the absence of exogenous S1P. These results demonstrated that the S1P-S1P3 axis has a key role in the induction of migration in the retina, and its targeting might provide an interesting approach in the search of new therapeutical treatments for proliferative diseases of the retina. Among retinal pathologies, neurodegenerative diseases are a set of diseases of the retina that progressively lead to vision loss and still lack effective treatments. Pathologies such as retinitis pigmentosa and macula degeneration have very diverse etiologies, varying from genetic to environmental triggers, but which share a common hallmark: the death of photoreceptors (PhRs). This progressive degeneration of PhR leads, as a final consequence, to visual disability and blindness. As described, Cer and Sph are important mediators of cell death and have attracted special attention in the field of neurodegenerative diseases. Pioneering studies found that Cer levels were increased in post-mortem retinas of patients with Faber's disease; furthermore, the levels of this sphingolipid are increased in neuronal degeneration induced by retinal detachment. Subsequent reports, including those from our laboratory, established that Cer is a key mediator in the death of PhRs in culture. Oxidative damage stimulates the synthesis of Cer, which triggers the death of photoreceptors and this process is mimicked by the exogenous addition of a synthetic analogue of an endogenous ceramide, C2-Ceramide (C2Cer). Further work using animal models of retina degeneration support a role for Cer as a crucial signal involved in the induction of PhR death. However, the molecular mechanisms involved in this process are still unknown. Uncovering them is very relevant, since regulating the different intracellular targets of Cer might provide new therapies for neurodegenerative diseases of the retina. The purpose of the second chapter of this thesis was to study the molecular mechanisms involved in the death of PhRs induced by C2Cer, using as a model primary cultures of rat retinal neurons. Previous work from our laboratory showed that 10 μM C2Cer induces the death of PhRs and amacrine neurons, the two major neuronal types in our cultures. A chronological analysis of the death process showed that treatment with 10 μM C2Cer for 6 h selectively induced the death of photoreceptors, decreasing mitochondrial membrane potential and increasing the formation of Reactive Oxygen Species (ROS). In contrast, amacrine neurons preserved their viability. Of note, the number of cells labeled with TUNEL and of photoreceptors expressing cleaved caspase-3 remained constant and a pretreatment with a pan caspase inhibitor did not prevent C2Cer-induced neuronal death. C2Cer caused over-activation of poly-ADP ribosyl polymerase-1 (PARP-1). The inhibition of PARP-1 decreased photoreceptor death induced by C2Cer. In turn, C2Cer increased poly-ADP ribose (PAR) polymer levels, the synthesis of which is catalyzed by PARP-1, and induced the translocation of apoptosis-inducing factor (AIF) from mitochondria to the nuclei, which was prevented by PARP-1 inhibition. Pretreatment with a calpain and cathepsin inhibitor, and with a selective calpain inhibitor, reduced photoreceptor death, whereas selective cathepsins inhibitors did not provide any protection. The combined pretreatment with a PARP-1 inhibitor and a calpain inhibitor showed the same extent of protection as each inhibitor by itself. This suggests that both PARP-1 and calpains converge downstream in the same mechanism. Neither autophagy nor necroptosis were involved in C2Cer-induced cell death; no increase in LDH release was observed after C2Cer treatment and pretreatment with necroptosis and autophagy inhibitors did not rescue photoreceptors. These results suggest that the C2Cer-induced photoreceptor death signaling by a novel caspase-independent mechanism, which involves PARP-1 activation, a decrease in mitochondrial membrane potential, activation of calpain and translocation of AIF, all of which are biochemical characteristics of the cell death type named parthanatos. In conclusion, our results identify a new therapeutic target, thus contributing to the advances in the search for effective treatments for neurodegenerative diseases of the retina.

Visando o tratamento tópico de tumores cutâneos, desenvolvemos micro e nanoemulsões para a co-localização cutânea de paclitaxel e ceramida C6. A nanoemulsão mostrou-se mais eficaz em promover penetração de ambos os compostos nas camadas viáveis da pele, com aumentos de 11,5 (paclitaxel) e 3,5 (ceramida) vezes comparado a uma solução controle, e não reduziu significativamente a viabilidade de equivalentes epidérmicos, sugerindo sua segurança para aplicação tópica. A incorporação na nanoemulsão diminuiu as concentrações de paclitaxel e ceramida necessárias para reduzir a viabilidade de células de melanoma a 50% em 6 a 15 vezes, respectivamente, sendo que a co-encapsulação desses compostos promoveu uma nova redução (4 vezes) nessas concentrações, demonstrando aumento da eficácia decorrente da associação dos compostos. A administração tópica do nanocarreador contendo paclitaxel e ceramida co-encapsulados promoveu desorganização e morte celular em equivalentes cutâneos com melanoma, demonstrando o potencial desta formulação para o tratamento tópico de tumores cutâneos. / Nano and microemulsions were developed in this study for cutaneous co-localization of the active agents paclitaxel and C6 ceramide for topical treatment of skin cancer. The nanoemulsion was more effective in promoting the penetration of the compounds into viable skin layers, with increases of 11.5- (paclitaxel) and 3.5- fold (ceramide) being observed. The nanoemulsion did not reduce the viability of human epidermis equivalents, suggesting its safety for topical application. Incorporation in the nanoemulsion reduced the concentration of paclitaxel and ceramide required to decrease viability of human melanoma cells to 50% by 6 to 15-fold compared with their solutions; co-encapsulation of the compounds promoted a further reduction of 4-fold. Topical administration of the nanocarrier with co-encapsulated paclitaxel and ceramide to skin equivalents with melanoma promoted disorganization and intense cytotoxicity. These results demonstrate the potential of nanoemulsions for association of paclitaxel and ceramide C6 to improve their cytotoxic effect and skin localization.

Esponjas do gênero Dysidea (Ordem: Dictyoceratida) caracterizam-se por apresentarem grande diversidade de metabólitos secundários, muitos dos quais apresentam potentes atividades biológicas. Este trabalho descreve o estudo de duas amostras de esponjas da espécie Dysidea robusta, DR1 e DR2, coletadas no litoral da Bahia em 1999. Tal estudo consistiu no fracionamento das amostras, nas análises de seus extratos brutos por LC-MS e técnicas de RMN- mono e bidimensionais. Dentre os extratos de DR1, a fração DR1-EP-5A obtida do extrato éter de petróleo apresentou uma mistura de três ceramidas saturadas (22, 23 e 24). Já da amostra DR2, as frações do extrato aquoso DR2-AQ-6B e DR2-AQ-6D mostraram ser constituídas por derivados do ácido pirodisinóico (18, 19, 20 e 21). Com exceção do ácido pirodisinóico (18), os demais compostos isolados ainda não foram relatados na literatura. / Sponges of the genus Dysidea (Order: Dyctioceratida) are characterized as sources of several biologically active secondary metabolites. This work describes the study of two samples of D.robusta, DR1 and DR2, both collected at the Bahia state coastline, in 1999. The investigation aimed the crude extract fractionation and analysis by LC-MS and by 1D and 2D NMR techniques. Among the extracts DR1, the fraction DR1-EP-5A obtained from the petroleum ether extract showed a mixture of three saturated ceramides, represented by 22, 23 and 24. From the DR2 sample, the fractions obtained from the aqueous extract DR2-AQ-6B and -6D presented pirodisinoic acid derivates 18, 19, 20 and 21. Except for pyrodisinoic acid (18), all other isolated compounds haven´t been reported in the literature yet.

Esponjas do gênero Dysidea (Ordem: Dictyoceratida) caracterizam-se por apresentarem grande diversidade de metabólitos secundários, muitos dos quais apresentam potentes atividades biológicas. Este trabalho descreve o estudo de duas amostras de esponjas da espécie Dysidea robusta, DR1 e DR2, coletadas no litoral da Bahia em 1999. Tal estudo consistiu no fracionamento das amostras, nas análises de seus extratos brutos por LC-MS e técnicas de RMN- mono e bidimensionais. Dentre os extratos de DR1, a fração DR1-EP-5A obtida do extrato éter de petróleo apresentou uma mistura de três ceramidas saturadas (22, 23 e 24). Já da amostra DR2, as frações do extrato aquoso DR2-AQ-6B e DR2-AQ-6D mostraram ser constituídas por derivados do ácido pirodisinóico (18, 19, 20 e 21). Com exceção do ácido pirodisinóico (18), os demais compostos isolados ainda não foram relatados na literatura. / Sponges of the genus Dysidea (Order: Dyctioceratida) are characterized as sources of several biologically active secondary metabolites. This work describes the study of two samples of D.robusta, DR1 and DR2, both collected at the Bahia state coastline, in 1999. The investigation aimed the crude extract fractionation and analysis by LC-MS and by 1D and 2D NMR techniques. Among the extracts DR1, the fraction DR1-EP-5A obtained from the petroleum ether extract showed a mixture of three saturated ceramides, represented by 22, 23 and 24. From the DR2 sample, the fractions obtained from the aqueous extract DR2-AQ-6B and -6D presented pirodisinoic acid derivates 18, 19, 20 and 21. Except for pyrodisinoic acid (18), all other isolated compounds haven´t been reported in the literature yet.

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de disfunción visual en el mundo desarrollado. En ellas se produce la degeneración y muerte de las neuronas fotorreceptoras, originando una disminución o pérdida total de la visión, en los casos más severos. Las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo de células gliales en la retina, y las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) desempeñan un papel clave tanto en la prevención como en el progreso de estas enfermedades. En condiciones fisiológicas las CGM y las células del EPR son las encargadas del mantenimiento estructural, fisiológico y funcional de la retina. Ante alteraciones fisiológicas o frente a daños de diferentes tipos, las CGM y las células del EPR modifican levemente sus funciones a fin de restablecer las condiciones normales o reparar los daños existentes. La proliferación y la migración se activan como parte de una respuesta inespecífica, pero cuando el daño persiste por mecanismos aún desconocidos estos procesos se descontrolan y exacerban, tornándose contraproducentes. A su vez, la localización de estas células en lugares inadecuados distorsiona severamente la estructura y función de la retina, contribuyendo al desarrollo de la disfunción visual, particularmente en las patologías retinoproliferativas. Dilucidar los mecanismos de regulación de la proliferación y la migración, como así también las moléculas que intervienen, es clave para lograr un tratamiento integral de estas enfermedades. Los esfingolípidos bioactivos son moléculas señal que regulan una gran cantidad de procesos biológicos como la supervivencia, proliferación, migración e inflamación. Entre éstos, la ceramida-1-fosfato (C1P) es un esfingolípido que regula numerosas funciones biológicas en diferentes tipos de células. La C1P es generada por la acción de la ceramida quinasa (CerK), enzima encargada de sintetizar C1P a través de la fosforilación de la ceramida (Cer). La actividad de CerK es clave para la señalización celular mediada por C1P y está regulada por niveles bajos de Ca+2, fosforilación y diversos estímulos. La C1P promueve la proliferación través de la activación de diferentes vías de señalización intracelular y la inflamación mediante la unión y activación de la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2), que interviene en la síntesis de prostaglandinas. Para promover la migración, se ha propuesto que la C1P activa un receptor extracelular específico (parcialmente identificado). Trabajos previos de nuestro laboratorio demuestran que la esfingosina-1-fosfato (S1P), un esfingolípido bioactivo muy relacionado a la C1P, promueve la migración de las CGM (Simón et al. 2015). Dada la estrecha interacción metabólica y funcional entre los esfingolípidos, es de gran interés establecer si la C1P, cuyas funciones son semejantes a las de S1P, interviene en la regulación de los procesos que contribuyen a las patologías retinoproliferativas. El objetivo de esta Tesis es investigar si la C1P y la CerK participan en la migración y en la proliferación de las CGM y las células del EPR. Mediante el ensayo de la herida y utilizando cultivos gliales puros de retina de rata y la línea celular humana de EPR, ARPE-19 investigamos los posibles efectos de C1P/CerK en la migración de estos dos tipos celulares. En estos ensayos de motilidad celular, consideramos la reducción del ancho de la herida como un indicador de la migración. Al evaluar el efecto de C1P sobre la migración de las CGM, determinamos que la C1P aumentó la migración a través de la reorganización del citoesqueleto de actina y la formación de filopodios y lamelipodios. Mediante ensayos de incorporación del nucleótido Bromo-deoxiuridina (BrdU) establecimos que la migración no contribuyó al cierre de la herida. Luego investigamos las vías de señalización involucradas en el efecto de C1P. La inhibición de las vías PI3K/Akt y JNK con LY294002 y SP600125, respectivamente, disminuyó la migración glial, tanto en los controles como en los cultivos tratados con C1P. Mediante ensayos de Western blot comprobamos que el agregado de C1P aumentó los niveles de p-Akt, forma activa de la Akt, respecto a los controles, confirmando la activación de la vía de la PI3K. Al inhibir la vía de ERK / MAPK con el inhibidor U0126 disminuyó la migración promovida por la C1P, pero no se alteró la migración en los controles. A continuación, evaluamos el papel de la cPLA2, mediador de C1P en la inflamación, que es activada por su unión a C1P. El tratamiento con ATK, un inhibidor de cPLA2, redujo notablemente la migración glial en cultivos tratados con C1P, mientras que en los cultivos controles la migración no fue alterada. Demostramos así que la C1P promueve la migración de las CGM mediante la activación de cPLA2 y JNK, PI3K y ERK / MAPK. Además, el agregado conjunto de C1P y S1P, evidenció que estos esfingolípidos tuvieron juntos el mismo efecto promotor de la migración glial que cuando fueron suplementados por separado, evidenciando una interrelación entre ellos en la regulación de los mecanismos que activan río abajo. Como la realización de la herida activó la migración celular, decidimos evaluar si la síntesis endógena de C1P estaba involucrada en dicha migración. Para ello, establecimos en primer término, mediante RT-PCR que las CGM expresaban CerK. Incubando los cultivos gliales con NVP231, un inhibidor de la CerK, demostramos que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración glial en los controles y para la estimulación de la migración por C1P. Para descartar que la inhibición de la motilidad reflejara una pérdida de viabilidad celular, evaluamos dicha viabilidad por ensayo de MTT. Determinamos que el tratamiento de los cultivos gliales con NVP231 no alteró la viabilidad celular. En las células del EPR el tratamiento con C1P aumentó la migración, mediante la reorganización del citoesqueleto de actina y el desarrollo de extensos lamelipodios. Al evaluar el rol de la síntesis endógena en la migración del EPR, comprobamos que el tratamiento de los cultivos con NVP231 inhibió la formación de lamelipodios y bloqueó la migración de las células epiteliales. Determinamos, mediante el ensayo de MTT, que el tratamiento con NVP231 no alteró la viabilidad de las células del EPR. La C1P y la S1P promovieron la migración de las células del EPR, pero cuando los cultivos fueron tratados con NVP231 antes del agregado de estos esfingolípidos, el aumento de la migración que promovían fue bloqueado. Estos resultados demuestran que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración promovida por C1P y S1P, evidenciando que la síntesis de C1P es clave en la estimulación de la migración por estos dos esfingolípidos. A continuación evaluamos el rol de C1P en la proliferación. Ensayos de incorporación del nucleótido BrdU en cultivos no confluentes demostraron que el agregado de C1P no alteró la proliferación ni en los cultivos gliales ni en los epiteliales. La inhibición de la síntesis de C1P redujo la proliferación en las CGM, mientras que no alteró la tasa de proliferación de los cultivos epiteliales, lo que sugiere que la C1P sería un mediador necesario para la proliferación glial en el período activo de mitogénesis de estas células. En conclusión, en este trabajo evidenciamos por primera vez que la C1P agregada exógenamente como así también aquella sintetizada por CerK en el interior celular, potenciaron la migración de las CGM y de las células del EPR. Demostramos también que la síntesis de C1P fue necesaria para la proliferación glial. Considerando la importancia del proceso de migración y proliferación en los dos tipos celulares de la retina decisivos en la mayoría de las enfermedades retinianas, proponemos a C1P/CerK como clave en el desarrollo y avance de las retinopatías proliferativas. / Retinal neurodegenerative diseases are the main cause of visual dysfunction in the developed world. Their common feature is the degeneration and eventual death of photoreceptors, which leads to visual impairment and eventual blindness in the most severe cases. Müller Glial Cells (MGC) are the main type of retinal glia and along with the Retinal Pigmented Epithelium (RPE) these cell types are two key factors in both the prevention and progression of these diseases. Under physiological conditions, MGCs and the RPE are in charge of the structural, physiological and functional maintenance of the retina. When faced with physiological changes or different damages, they alter their regular functions in order to either reestablish a proper environment or repair the existing damages; however, if the damage persists, the long-term changes of their aforementioned functions can be counterproductive and contribute to the development of retinal neurodegenerative pathologies. Proliferation and migration are activated as an unspecific response upon different damages in order to repair them but, due to unknown mechanisms, these processes finally provoke retina structural and functional loss, thus contributing to the progression of the visual dysfunction. The elucidation of the regulatory mechanisms involved in controlling migration and proliferation, including the molecules involved, is crucial for developing an integral treatment of these diseases. Bioactive sphingolipids are signaling molecules that regulate a wide array of biological processes, such as survival, proliferation, migration and inflammation. Among them, ceramide-1-phospate (C1P) is a sphingolipid generated by ceramide kinase (CerK), the enzyme responsible of phosphorylating ceramide (Cer) molecules. CerK activity has a central role in C1P-mediated cellular signaling, and is regulated by low levels of Ca2+, phosphorylation and many other stimuli. C1P promotes proliferation by activating several intracellular signaling pathways, as well as promoting inflammation by coupling with and activating the cytosolic phospholipase A2 (cPLA2), which participates in prostaglandin synthesis. Both for proliferation and migration, it has been proposed that C1P activates a (partially identified) specific extracellular receptor. Previous work from our group has shown that sphingosine-1-phospate (S1P), which is metabolically closely related to C1P, promotes MGC migration (Simón et al. 2015). Due to the close interconversions and functions of sphingolipids, uncovering the role of C1P in the processes involved in proliferative retinopathies is highly relevant. The purpose of this thesis is to investigate whether C1P and CerK participate in the regulation of migration and proliferation of MGC and RPE. By using the scratch wound assay in pure rat glial cultures and the RPE cell line ARPE-19, we assessed the effects of C1P/CerK in the migration of these two cell types. In these cellular motility assays we considered the reduction on the wound width as a positive indicator of cell migration. When evaluating the effect of C1P on migration, we determined that C1P enhanced migration by reorganizing the actin cytoskeleton and the formation of filopodia and lamellipodia. By quantifying the uptake of Bromide-deoxyuridine (BrdU) by MGC we determined that proliferation did not contribute to the reduction in the scratch width. We also investigated the signaling pathways involved in this process. Inhibition of PI3K/Akt and JNK pathways with the selective inhibitors LY294002 and SP600125, respectively, showed a decrease in glial migration in both control and C1Ptreated cultures. Western Blot assays showed that the addition of C1P increased the levels of p-Akt (the active form of Akt) when compared to controls, therefore confirming the activation of this pathway. Selective inhibition of the ERK/MAPK pathway with U0126 showed a decrease in C1P-induced migration, but did not alter it in control conditions. We also evaluated the role of cPLA2, a mediator of C1P in inflammation, which is activated by C1P binding. Treatment with ATK, a selective inhibitor of cPLA2, showed a substantial decrease in migration on C1P-treated cultures, while there was no alteration of the migrating capabilities in control conditions. We therefore showed that C1P is a promotor of MGC migration by activating cPLA2 as well as the JNK, PI3K and ERK/MAPK pathways. In addition, the combined addition of C1P and S1P showed that these sphingolipids had the same effect together than when they were added separately, suggesting either a direct relation between them or with the downstream mechanisms they trigger. Since we determined a basal reduction in the scratch width in control conditions, we evaluated whether the endogenous synthesis of C1P was involved in this migration. Initially, we established by RT-PCR assays that CGM expressed CerK. By incubating glial cultures with NVP231, a selective inhibitor of CerK, we showed that endogenous C1P synthesis was necessary for glial migration under control conditions, and that when this synthesis was inhibited addition of C1P did not restore cell migration. In order to verify that NVP231 did not affect cell viability, we evaluated viability by the MTT assay. We determined that treatment of glial cultures with NVP231 did not alter cell viability. On RPE cells, treatment with C1P increased cell migration by inducing actin cytoskeleton reorganization and extensive development of lamellipodia. When evaluating the role of the endogenous synthesis on RPE migration, we concluded that treating cultures with NVP231 inhibited lamellipodia formation and blocked RPE migration. We also determined that the viability of NVP231-treated RPE cells was not altered. Both C1P and S1P promoted RPE cell migration, but treating the cultures with NVP231 beforehand, abolished the migratory stimulus. These results show that endogenous C1P synthesis is essential for C1P and S1P-promoted migration, establishing that C1P synthesis is crucial to promote the migration of these two sphingolipids. Furthermore, we evaluated the possible role of C1P on cell proliferation. BrdU uptake assays on non-confluent cultures showed that the addition of C1P did not alter the proliferating capabilities on either MGC or RPE cultures. The inhibition of C1P synthesis impaired proliferation of MGCs, but did not affect that of RPE cells, suggesting that C1P might be a necessary mediator for glial proliferation in the active mitogenic stage of these cells. In this work we showed for the first time that both addition of C1P as well as the endogenous C1P produced by CerK promote migration of MGC and RPE cells. We also demonstrated that C1P synthesis is required for glial proliferation. Taking into consideration the relevance of migration and proliferation of both cell types in the development of most retinal diseases, we propose that C1P/CerK is instrumental in the development and progression of proliferative retinopathies.

A leishmaniose é uma doença parasitária de ampla distribuição, para a qual se dispõe de um limitado arsenal terapêutico. Trabalhos recentes mostraram que tamoxifeno é eficaz no tratamento de leishmaniose experimental. Nesse trabalho, avaliamos a terapia combinada de tamoxifeno com os fármacos utilizados atualmente no tratamento desta enfermidade. A interação entre os fármacos mostrou-se aditiva, tanto in vitro como in vivo. Em paralelo, analisamos os efeitos de tamoxifeno na biossíntese de esfingolipídios em Leishmania, sendo identificada a redução da síntese de fosfatidilinositol e inositolfosforil ceramida (IPC) e acúmulo de ceramida acilada. A redução na biossíntese de IPC não pode ser atribuída a redução no transporte de inositol, mas provavelmente está relacionada à inibição da enzima IPC sintase. Estes resultados indicam novas estratégias para superar as deficiências encontradas no tratamento de leishmaniose utilizando tamoxifeno, um fármaco clinicamente bem conhecido que exerce ações em múltiplos alvos em Leishmania. / Leishmaniasis is a parasitic disease with wide distribution and limited treatment. Recent reports demonstrate that tamoxifen is an effective drug for experimental leishmaniasis treatment. In this work, we evaluated the combined therapy of tamoxifen with current drugs used in leishmaniasis chemotherapy. The drug interaction was additive both, in vitro and in vivo. We also evaluated tamoxifen effect on in Leishmania sphingolipids biosynthesis. We found a reduction in phosphatidylinositol and inositol phosphorylceramide (IPC) synthesis and an accumulation of acilceramide. The reduction in IPC biosynthesis could not be assigned to the reduction observed in inositol transport, but probably is related to IPC synthase inhibition. These results show new strategies to circumvent shortcomings of leishmaniasis treatment using tamoxifen, a multitarget drug in Leishmania and widely used in the chemotherapy of breast cancer.

A leishmaniose é uma doença parasitária de ampla distribuição, para a qual se dispõe de um limitado arsenal terapêutico. Trabalhos recentes mostraram que tamoxifeno é eficaz no tratamento de leishmaniose experimental. Nesse trabalho, avaliamos a terapia combinada de tamoxifeno com os fármacos utilizados atualmente no tratamento desta enfermidade. A interação entre os fármacos mostrou-se aditiva, tanto in vitro como in vivo. Em paralelo, analisamos os efeitos de tamoxifeno na biossíntese de esfingolipídios em Leishmania, sendo identificada a redução da síntese de fosfatidilinositol e inositolfosforil ceramida (IPC) e acúmulo de ceramida acilada. A redução na biossíntese de IPC não pode ser atribuída a redução no transporte de inositol, mas provavelmente está relacionada à inibição da enzima IPC sintase. Estes resultados indicam novas estratégias para superar as deficiências encontradas no tratamento de leishmaniose utilizando tamoxifeno, um fármaco clinicamente bem conhecido que exerce ações em múltiplos alvos em Leishmania. / Leishmaniasis is a parasitic disease with wide distribution and limited treatment. Recent reports demonstrate that tamoxifen is an effective drug for experimental leishmaniasis treatment. In this work, we evaluated the combined therapy of tamoxifen with current drugs used in leishmaniasis chemotherapy. The drug interaction was additive both, in vitro and in vivo. We also evaluated tamoxifen effect on in Leishmania sphingolipids biosynthesis. We found a reduction in phosphatidylinositol and inositol phosphorylceramide (IPC) synthesis and an accumulation of acilceramide. The reduction in IPC biosynthesis could not be assigned to the reduction observed in inositol transport, but probably is related to IPC synthase inhibition. These results show new strategies to circumvent shortcomings of leishmaniasis treatment using tamoxifen, a multitarget drug in Leishmania and widely used in the chemotherapy of breast cancer.