La fumée du tabac est un aérosol extrêmement complexe constitué de milliers de composés répartis entre la phase particulaire et la phase vapeur. Il a été démontré que les effets toxicologiques de cette fumée sont associés aux composés appartenant aux deux phases. Plusieurs composés biologiquement actifs ont été identifiés dans la fumée du tabac; cependant, il n’y a pas d’études démontrant la relation entre les réponses biologiques obtenues via les tests in vitro ou in vivo et les composés présents dans la fumée entière du tabac. Le but de la présente recherche est de développer des méthodes fiables et robustes de fractionnement de la fumée à l’aide de techniques de séparation analytique et de techniques de détection combinés à des essais in vitro toxicologiques. Une étude antérieure réalisée par nos collaborateurs a démontré que, suite à l’étude des produits de combustion de douze principaux composés du tabac, l’acide chlorogénique s’est avéré être le composé le plus cytotoxique selon les test in vitro du micronoyau. Ainsi, dans cette étude, une méthode par chromatographie préparative en phase liquide a été développée dans le but de fractionner les produits de combustion de l’acide chlorogénique. Les fractions des produits de combustion de l’acide chlorogénique ont ensuite été testées et les composés responsables de la toxicité de l’acide chlorogénique ont été identifiés. Le composé de la sous-fraction responsable en majeure partie de la cytoxicité a été identifié comme étant le catéchol, lequel fut confirmé par chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse à temps de vol. Des études récentes ont démontré les effets toxicologiques de la fumée entière du tabac et l’implication spécifique de la phase vapeur. C’est pourquoi notre travail a ensuite été focalisé principalement à l’analyse de la fumée entière. La machine à fumer Borgwaldt RM20S® utilisée avec les chambres d’exposition cellulaire de British American Tobacco permettent l’étude in vitro de l’exposition de cellules à différentes concentrations de fumée entière du tabac. Les essais biologiques in vitro ont un degré élevé de variabilité, ainsi, il faut prendre en compte toutes les autres sources de variabilité pour évaluer avec précision la finalité toxicologique de ces essais; toutefois, la fiabilité de la génération de la fumée de la machine n’a jamais été évaluée jusqu’à maintenant. Nous avons donc déterminé la fiabilité de la génération et de la dilution (RSD entre 0,7 et 12 %) de la fumée en quantifiant la présence de deux gaz de référence (le CH4 par détection à ionisation de flamme et le CO par absorption infrarouge) et d’un composé de la phase particulaire, le solanesol (par chromatographie en phase liquide à haute performance). Ensuite, la relation entre la dose et la dilution des composés de la phase vapeur retrouvée dans la chambre d’exposition cellulaire a été caractérisée en utilisant une nouvelle technique d’extraction dite par HSSE (Headspace Stir Bar Sorptive Extraction) couplée à la chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse. La répétabilité de la méthode a donné une valeur de RSD se situant entre 10 et 13 % pour cinq des composés de référence identifiés dans la phase vapeur de la fumée de cigarette. La réponse offrant la surface maximale d’aire sous la courbe a été obtenue en utilisant les conditions expérimentales suivantes : intervalle de temps d’exposition/ désorption de 10 0.5 min, température de désorption de 200°C pour 2 min et température de concentration cryogénique (cryofocussing) de -75°C. La précision de la dilution de la fumée est linéaire et est fonction de l’abondance des analytes ainsi que de la concentration (RSD de 6,2 à 17,2 %) avec des quantités de 6 à 450 ng pour les composés de référence. Ces résultats démontrent que la machine à fumer Borgwaldt RM20S® est un outil fiable pour générer et acheminer de façon répétitive et linéaire la fumée de cigarette aux cultures cellulaires in vitro. Notre approche consiste en l’élaboration d’une méthodologie permettant de travailler avec un composé unique du tabac, pouvant être appliqué à des échantillons plus complexes par la suite ; ex : la phase vapeur de la fumée de cigarette. La méthodologie ainsi développée peut potentiellement servir de méthode de standardisation pour l’évaluation d’instruments ou de l’identification de produits dans l’industrie de tabac. / Tobacco smoke is an extremely complex aerosol composed of thousands of constituents distributed amongst the particulate and vapor phases. Toxicological effects have been linked to compounds present in both of these phases. Many biologically active compounds have been identified within tobacco smoke; however, there is a lack of studies correlating specific in vitro or in vivo biological responses to components within whole tobacco smoke. The goal of this research was to develop reliable and robust smoke fractionation methods using analytical separation and detection techniques in combination with in vitro toxicological assays. In a previous study by our collaborators, toxicological assessment of the particulate phase combustion products of twelve individual tobacco components revealed that the combustion products of chlorogenic acid were the most cytotoxic using the in vitro micronucleus test. Therefore, a preparative liquid chromatography method was developed in this work to fractionate the combustion products of chlorogenic acid to assess the bioactivity of these fractions and to identify the compounds responsible for the toxicity observed. The sub-fraction responsible for the most cytotoxic response comprised catechol, which was identified by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Emerging studies have highlighted the toxicological significance of whole tobacco smoke and specifically the vapor phase, which shifted our focus to whole smoke analyses. The Borgwaldt RM20S® smoking machine in combination with British American Tobacco’s in vitro cell exposure chamber allow for the generation of fresh cigarette smoke in various doses and delivery to cell cultures. In vitro biological assays have a high degree of variability, thus, all other sources of variability must be accounted for to accurately assess toxicological endpoints; however, the reliability of dose delivery of the instrument had not been assessed until now. We have determined the reliability (RSD from 0.7-12%) of smoke generation and dilution by quantifying two reference standard gases (CH4 by flame ionization detection and CO by infrared absorption) and the tobacco particulate phase marker, solanesol (by high performance liquid chromatography-ultraviolet absorption detection). The relationship between dose and diluted vapor phase components found within the exposure chamber was then characterized by developing a headspace stir-bar sorptive extraction-gas chromatography/mass spectrometry method. The method repeatability gave an RSD from 10-13% for five reference compounds identified in the vapor phase of cigarette smoke. The maximal peak area response was obtained using the following experimental conditions: exposure-to-desorption time interval of 10  0.5 min, desorption temperature of 200 °C for 2 min, and a cryofocussing temperature of -75 °C. The dilution precision was found to yield a linear response of analyte abundance and was observed to be a function of concentration (RSD from 6.2-17.2 %) with quantities of 6-450 ng for the reference compounds. The findings obtained suggest the Borgwaldt RM20S® is a reliable tool to generate and deliver repeatable and linear doses of cigarette smoke to in vitro cell cultures. Our approach began with designing the methodology to work with an individual tobacco component, which could then be applied to a more complex sample, e.g., the vapor phase of cigarette smoke. The methodology developed can potentially serve as standardized methods for the assessment of instrumentation or screening of products for the Tobacco Industry.

Des immunoadsorbeurs ont été développés à partir de disques CIM monolithiques pour l'analyse de biomarqueurs impliqués dans des maladies cardio-vasculaires. Les colonnes développées ont permis d'isoler sélectivement la myoglobine et le NT-proBNP du sérum humain. Les colonnes anti-NT-proBNP ont permis l'isolation quantitative du NT-proBNP (R2=0,998) à des concentrations jusqu'à 750 amol/μL de sérum.<br />Six matériaux à accès restreints ont été évalués en fonction de leur aptitude à exclure l'hémoglobine d'hémolysats sanguins. Des injections à différents pH ont montré que la rétention de l'hémoglobine est drastiquement restreinte à pH 10,7. En raison d'une bonne stabilité à pH basique, la colonne polymérique Biotrap 500 MS RAM a été retenue pour l'extraction d'antibiotiques d'hémolysats sanguins. Des extractions quantitatives d'analytes à faibles concentrations (200 pg/μL) ont été réalisées sans effet mémoire d'hémoglobine sur la colonne.<br />Un nouveau système 2D-HPLC-ESI-MS/MS pour l'analyse protéomique a été développé. Le système est composé d'une séparation par RP-HPLC à pH 10,0, suivie d'une séparation par IP-RP-HPLC à pH 2,1. Ce nouveau système a été comparé à un système conventionnel SCX x IP-RP-HPLC. L'orthogonalité des méthodes de séparation est plus élevée dans l'approche SCX x IP-RP-HPLC que dans le schéma RP x IP-RP-HPLC. Cependant, en raison d'une meilleure distribution des peptides et d'une meilleure efficacité de séparation, le système RP x IP-RP-HPLC permet d'identifier significativement plus de peptides. Les deux approches sont complémentaires et une combinaison des deux systèmes permet d'identifier plus de peptides que des analyses répétées par un système unique.

La cellulose et ses dérivés sont utilisés dans un vaste nombre d’applications incluant le domaine pharmaceutique pour la fabrication de médicaments en tant qu’excipient. Différents dérivés cellulosiques tels que le carboxyméthylcellulose (CMC) et l’hydroxyéthylcellulose (HEC) sont disponibles sur le commerce. Le degré de polymérisation et de modification diffèrent énormément d’un fournisseur à l’autre tout dépendamment de l’origine de la cellulose et de leur procédé de dérivation, leur conférant ainsi différentes propriétés physico-chimiques qui leurs sont propres, telles que la viscosité et la solubilité. Notre intérêt est de développer une méthode analytique permettant de distinguer la différence entre deux sources d’un produit CMC ou HEC. L’objectif spécifique de cette étude de maitrise était l’obtention d’un profil cartographique de ces biopolymères complexes et ce, par le développement d’une méthode de digestion enzymatique donnant les oligosaccharides de plus petites tailles et par la séparation de ces oligosaccharides par les méthodes chromatographiques simples. La digestion fut étudiée avec différents paramètres, tel que le milieu de l’hydrolyse, le pH, la température, le temps de digestion et le ratio substrat/enzyme. Une cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921 fut utilisée pour la digestion partielle de nos échantillons de cellulose. Les oligosaccharides ne possédant pas de groupements chromophores ou fluorophores, ils ne peuvent donc être détectés ni par absorbance UV-Vis, ni par fluorescence. Il a donc été question d’élaborer une méthode de marquage des oligosaccharides avec différents agents, tels que l’acide 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonique (APTS), le 3-acétylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) et la phénylhydrazine (PHN). Enfin, l’utilisation de l’électrophorèse capillaire et la chromatographie liquide à haute performance a permis la séparation des produits de digestion enzymatique des dérivés de cellulose. Pour chacune de ces méthodes analytiques, plusieurs paramètres de séparation ont été étudiés. / Cellulose and its derivatives are used in a wide range of applications, including the pharmaceutical industry for the manufacturing of medicines as inactive additives. Various cellulosic derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC) and hydroxyethylcellulose (HEC) are readily available for such use. The degree of polymerization and modification differs from one supplier to the other, according to the origin of the cellulose and its process of chemical modification, conferring on them different physico-chemical properties, such as viscosity and solubility. Our interest is to develop an analytical method that can distinguish between different sources of a given CMC or HEC product. The specific objective of this master’s study was to obtain a fingerprint of these complex biopolymers by developing an enzymatic digestion method to produce smaller oligosaccharides that could be separated by simple chromatographic methods. The digestion was studied as a function of various parameters, such as the composition of the hydrolysis solution, the pH, the temperature, the duration of digestion and the substrate/enzyme ratio. A cellulase enzyme from Trichoderma reesei ATCC 26921 was used for the partial digestion of our samples of cellulose. Since these oligosaccharides do not possess a chromophore or fluorophore, they can’t be detected either by absorbance or fluorescence. It was thus necessary to work out the labeling method for oligosaccharides using various agents, such as 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid (APTS), 3-acetylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) and phenylhydrazine (PHN). Finally, the use of capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography allowed the separation of the enzymatic digestion products of the cellulose derivatives (CMC and HEC). For each of these analytical separation techniques, several parameters of the separation were studied.

La fumée du tabac est un aérosol extrêmement complexe constitué de milliers de composés répartis entre la phase particulaire et la phase vapeur. Il a été démontré que les effets toxicologiques de cette fumée sont associés aux composés appartenant aux deux phases. Plusieurs composés biologiquement actifs ont été identifiés dans la fumée du tabac; cependant, il n’y a pas d’études démontrant la relation entre les réponses biologiques obtenues via les tests in vitro ou in vivo et les composés présents dans la fumée entière du tabac. Le but de la présente recherche est de développer des méthodes fiables et robustes de fractionnement de la fumée à l’aide de techniques de séparation analytique et de techniques de détection combinés à des essais in vitro toxicologiques. Une étude antérieure réalisée par nos collaborateurs a démontré que, suite à l’étude des produits de combustion de douze principaux composés du tabac, l’acide chlorogénique s’est avéré être le composé le plus cytotoxique selon les test in vitro du micronoyau. Ainsi, dans cette étude, une méthode par chromatographie préparative en phase liquide a été développée dans le but de fractionner les produits de combustion de l’acide chlorogénique. Les fractions des produits de combustion de l’acide chlorogénique ont ensuite été testées et les composés responsables de la toxicité de l’acide chlorogénique ont été identifiés. Le composé de la sous-fraction responsable en majeure partie de la cytoxicité a été identifié comme étant le catéchol, lequel fut confirmé par chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse à temps de vol. Des études récentes ont démontré les effets toxicologiques de la fumée entière du tabac et l’implication spécifique de la phase vapeur. C’est pourquoi notre travail a ensuite été focalisé principalement à l’analyse de la fumée entière. La machine à fumer Borgwaldt RM20S® utilisée avec les chambres d’exposition cellulaire de British American Tobacco permettent l’étude in vitro de l’exposition de cellules à différentes concentrations de fumée entière du tabac. Les essais biologiques in vitro ont un degré élevé de variabilité, ainsi, il faut prendre en compte toutes les autres sources de variabilité pour évaluer avec précision la finalité toxicologique de ces essais; toutefois, la fiabilité de la génération de la fumée de la machine n’a jamais été évaluée jusqu’à maintenant. Nous avons donc déterminé la fiabilité de la génération et de la dilution (RSD entre 0,7 et 12 %) de la fumée en quantifiant la présence de deux gaz de référence (le CH4 par détection à ionisation de flamme et le CO par absorption infrarouge) et d’un composé de la phase particulaire, le solanesol (par chromatographie en phase liquide à haute performance). Ensuite, la relation entre la dose et la dilution des composés de la phase vapeur retrouvée dans la chambre d’exposition cellulaire a été caractérisée en utilisant une nouvelle technique d’extraction dite par HSSE (Headspace Stir Bar Sorptive Extraction) couplée à la chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse. La répétabilité de la méthode a donné une valeur de RSD se situant entre 10 et 13 % pour cinq des composés de référence identifiés dans la phase vapeur de la fumée de cigarette. La réponse offrant la surface maximale d’aire sous la courbe a été obtenue en utilisant les conditions expérimentales suivantes : intervalle de temps d’exposition/ désorption de 10 0.5 min, température de désorption de 200°C pour 2 min et température de concentration cryogénique (cryofocussing) de -75°C. La précision de la dilution de la fumée est linéaire et est fonction de l’abondance des analytes ainsi que de la concentration (RSD de 6,2 à 17,2 %) avec des quantités de 6 à 450 ng pour les composés de référence. Ces résultats démontrent que la machine à fumer Borgwaldt RM20S® est un outil fiable pour générer et acheminer de façon répétitive et linéaire la fumée de cigarette aux cultures cellulaires in vitro. Notre approche consiste en l’élaboration d’une méthodologie permettant de travailler avec un composé unique du tabac, pouvant être appliqué à des échantillons plus complexes par la suite ; ex : la phase vapeur de la fumée de cigarette. La méthodologie ainsi développée peut potentiellement servir de méthode de standardisation pour l’évaluation d’instruments ou de l’identification de produits dans l’industrie de tabac. / Tobacco smoke is an extremely complex aerosol composed of thousands of constituents distributed amongst the particulate and vapor phases. Toxicological effects have been linked to compounds present in both of these phases. Many biologically active compounds have been identified within tobacco smoke; however, there is a lack of studies correlating specific in vitro or in vivo biological responses to components within whole tobacco smoke. The goal of this research was to develop reliable and robust smoke fractionation methods using analytical separation and detection techniques in combination with in vitro toxicological assays. In a previous study by our collaborators, toxicological assessment of the particulate phase combustion products of twelve individual tobacco components revealed that the combustion products of chlorogenic acid were the most cytotoxic using the in vitro micronucleus test. Therefore, a preparative liquid chromatography method was developed in this work to fractionate the combustion products of chlorogenic acid to assess the bioactivity of these fractions and to identify the compounds responsible for the toxicity observed. The sub-fraction responsible for the most cytotoxic response comprised catechol, which was identified by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Emerging studies have highlighted the toxicological significance of whole tobacco smoke and specifically the vapor phase, which shifted our focus to whole smoke analyses. The Borgwaldt RM20S® smoking machine in combination with British American Tobacco’s in vitro cell exposure chamber allow for the generation of fresh cigarette smoke in various doses and delivery to cell cultures. In vitro biological assays have a high degree of variability, thus, all other sources of variability must be accounted for to accurately assess toxicological endpoints; however, the reliability of dose delivery of the instrument had not been assessed until now. We have determined the reliability (RSD from 0.7-12%) of smoke generation and dilution by quantifying two reference standard gases (CH4 by flame ionization detection and CO by infrared absorption) and the tobacco particulate phase marker, solanesol (by high performance liquid chromatography-ultraviolet absorption detection). The relationship between dose and diluted vapor phase components found within the exposure chamber was then characterized by developing a headspace stir-bar sorptive extraction-gas chromatography/mass spectrometry method. The method repeatability gave an RSD from 10-13% for five reference compounds identified in the vapor phase of cigarette smoke. The maximal peak area response was obtained using the following experimental conditions: exposure-to-desorption time interval of 10  0.5 min, desorption temperature of 200 °C for 2 min, and a cryofocussing temperature of -75 °C. The dilution precision was found to yield a linear response of analyte abundance and was observed to be a function of concentration (RSD from 6.2-17.2 %) with quantities of 6-450 ng for the reference compounds. The findings obtained suggest the Borgwaldt RM20S® is a reliable tool to generate and deliver repeatable and linear doses of cigarette smoke to in vitro cell cultures. Our approach began with designing the methodology to work with an individual tobacco component, which could then be applied to a more complex sample, e.g., the vapor phase of cigarette smoke. The methodology developed can potentially serve as standardized methods for the assessment of instrumentation or screening of products for the Tobacco Industry.

L'objectif de ce travail de thèse était d'étudier l'effet de la stérilisation par électrons accélérés sur les copolymères d'oléfines cycliques (COC), utilisés comme conditionnement de produits pharmaceutiques, ainsi que son impact sur les interactions avec des formulations pharmaceutiques. Grâce à la méthodologie analytique adoptée qui a fait appel à différentes techniques de caractérisation, telles que la chromatographie d'exclusion stérique, la chromatographie liquide haute performance à polarité de phases inversée, la spectroscopie infra rouge à transformée de Fourier, la microscopie à force atomique et les mesures d'angles de contact, nous avons pu mettre en évidence différents types de modifications dans le volume et sur la surface du matériau après stérilisation ainsi qu'après vieillissement. La modification principale du dans la masse du matériau, observée à la dose réglementaire de stérilisation (25 kGy), est la scission des chaînes du polymère, qui s'accompagne de la création de composés de faible masse molaire, donc de migrants potentiels risquant d'influencer la sécurité d'emploi des COC. En effet, certains de ces composés ont été retrouvés avec une concentration relativement importante dans les solutions de mise en contact avec les COC stérilisés, et notamment en solution aqueuse. Toutefois, l'étude préliminaire de toxicité a montré l'absence de cytotoxicité des extractibles obtenus à la dose de la stérilisation.Les modifications relatives à la surface des COC radio-stérilisés sont, quant à elles, de deux natures : physique avec une augmentation de la rugosité de surface et chimique avec la formation de produits d'oxydation polaires ; ces deux types de modifications conduisent à l'augmentation de la mouillabilité de surface. Cependant dans certains cas, notamment après vieillissement, ces modifications sont relativement faibles, même à des doses supérieures à celle préconisée pour la stérilisation, ce qui peut être corrélé à l'absence de l'effet de l'irradiation sur le comportement des COC vis-à-vis des solutions médicamenteuses. En effet, aucune variation de la sorption des principes actifs choisis n'a été montrée entre les COC irradiés et non irradiés vieillis.

L'osmose inverse semble un procédé intéressant pour traiter les condensats de distilleries et les recycler en fermentation alcoolique. Il permettrait de retenir les molécules organiques inhibitrices de la fermentation. Cependant, les mécanismes de rétention de ces molécules sont encore mal connus et l'optimisation du procédé reste très empirique.<br />Des méthodes de chromatographies liquides et gazeuses ont été développées et/ou améliorées pour quantifier les composés inhibiteurs et un test de fermentation a été mis au point. Les membranes les plus adaptées ainsi qu'un pilote à membrane spiralée ont été sélectionnés pour réaliser l'étude. <br />Les molécules et les membranes ont été caractérisées plus finement : les premières par des descripteurs moléculaires, les secondes par mesures de potentiels zêta et d'angles de contact. Du fait de ces propriétés, le phényl-2-éthanol, l'acide butyrique et le furfural s'adsorbent fortement sur les membranes. L'acide acétique se dissout dans l'eau interstitielle.<br />Ces interactions expliquent partiellement le transfert des solutés au cours du procédé, mais d'autres phénomènes sont en jeu : la diffusion dans la membrane, la densité de flux de perméat, les compétitions entre molécules. <br />L'utilisation de la membrane ESPA2 à 10 bar, à pH naturel permet d'obtenir un perméat fermentescible jusqu'à un facteur de réduction volumique de 8.<br />Un modèle a été développé pour prendre en compte les interactions et représenter le traitement industriel. Les constantes d'adsorption sont obtenues expérimentalement tandis que le coefficient de diffusion est ajusté.

Il existe une forte demande sociétale de moyens analytiques robustes permettant d'authentifier de manière objective les modes d'élaboration des produits alimentaires, notamment lorsqu'ils sont d'origine animale. L'objectif de cette thèse était de développer une méthode d'authentification de l'alimentation à l'herbe des agneaux, basée sur l'analyse de la fraction volatile de leurs tissus adipeux. Les animaux étudiés ont été élevés dans le cadre de dispositifs expérimentaux, où leur alimentation était étroitement contrôlée. Le tissus périnéal, sous-cutané caudal, et péricardiaque ont été analysés au moyen d'un système d'Espace de Tête Dynamique-Chromatographie en Phase Gazeuse- Spectrométrie de Masse (ETD-CPG-SM), dont le signal a été corrigé et stabilisé par différentes procédures chimiométriques. La première étape de ce travail de recherche visait à identifier les traceurs distinctifs de tissus adipeux d'agneaux nourris soit à l'herbe soit aux concentrés. Une fois les conditions d'analyse des composés volatils optimisés,126 traceurs de l'alimentation au pâturage ont été identifiés. Cette expérimentation a également permis de montrer l'intérêt de l'analyse parallèle de tissus de natures différentes pour la discrimination des deux alimentations. La deuxième étape avait pour objectif de montrer l'intérêt de l'analyse de la fraction volatile de tissus adipeux d'agneau pour l'authentification des régimes alternés. Ces régimes, couramment utilisés pour l'élevage des ruminants consistent à alterner une période d'alimentation au pâturage avec une finition aux concentrés, ou inversement. Les variations des abondances des traceurs volatils d'une alimentation au pâturage ont été suivies dans les tissus adipeux d'animaux nourris avec ces régimes alternés. Les résultats montrent que les composés volatils permettent de discriminer des tissus adipeux d'animaux nourris d'une part à l'herbe et finis aux concentrés pour un engraissement final de 0, 4, 8, ou 12 kg ; et d'autre part aux concentrés et finis au pâturage durant 0,17, 51, ou 85 jours. Couplés aux données de la littérature, l'ensemble des dispositifs d'élevage mis en oeuvre au cours de cette thèse ont permis de mettre en évidence 19 composés volatils traceurs de l'alimentation à l'herbe particulièrement robustes et génériques. Ces travaux démontrent aussi la faisabilité de l'authentification de l'alimentation d'animaux nourris au moyen de régimes contrastés ou alternés. Enfin, ils confirment aussi l'intérêt des procédures de traitement du signal, comme la correction des dérives instrumentales ou l'utilisation de ratios de variables, pour amplifier le pouvoir discriminant des modèles d'authentification.

L’analyse des contaminants émergents (ECs) suscite l’intérêt de la communauté scientifique, de sorte que plusieurs études ont rapporté leur présence dans les eaux usées et dans les eaux de surface. Toutefois, la plupart des études ont concentré leurs travaux principalement sur la phase dissoute, si bien que la concentration des ECSs dans les particules en suspension (SPM – suspended particulate matter) demeure peu connue. De plus, la plupart des méthodes traitant l’analyse des ECs sont basées sur le couplage de la chromatographie liquide couplée à un triple quadripôle (QqQ). Typiquement, ces QqQ fonctionnent à basse résolution, augmentant ainsi la probabilité d’obtenir des faux positifs. Afin de diminuer le taux de faux positifs un nouveau protocole permettant l’analyse de 31 ECs dans la fraction dissoute et la fraction solide a été développé à l’aide de la spectrométrie de masse à haute résolution. De plus, un dépistage du potentiel estrogénique par des levures a été effectué. Cela représente l’un des premiers rapports décrivant les concentrations en ECs dans les eaux usées et les SPM combiné avec un dépistage du potentiel estrogénique. La séparation des particules en suspension a été réalisée via la filtration des échantillons liquides. Les ECs ont été extraits de la fraction solide à l’aide d’ultrasons en utilisant du MeOH : ACN (1:1, v/v) avec l’ajout de 1% de HCOOH. Par la suite, l’extrait de la fraction solide et de la phase aqueuse ont été soumis à la SPE (solid phase extraction – extraction sur phase solide) à l’aide d’une cartouche polymérique composé d’acide benzènesulfonique. Une colonne de type C-18 a été utilisée pour séparer les ECs sélectionnés. Un spectromètre de masse de haute résolution (Q-Exactive), constitué d’un quadripôle et d’une trappe ionique orbitale à haute résolution a été utilisé en mode balayage (FS, full scan) avec une résolution de 70 000 FWHM (FWHM– Largeur à mi-hauteur, Full width at half maximum) à m/z 200 pour l’analyse de la fraction solide et en mode suivi des réactions parallèles (PRM, Parallel reaction monitoring) à 17 500 FWHM à m/z 200 pour la fraction liquide. Une ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI, Atmospheric pressure chemical ionisation) en modes positif et négatif a été utilisée. La méthode a été appliquée sur des échantillons réels afin de déterminer non seulement la portion d’ECs sur les SPM, mais également leur devenir dans le traitement des eaux usées jusqu’à leur déversement dans les eaux réceptrices. La récupération des composés d’intérêt a été de 27 à 102 % et de 43 à 122%, pour la fraction solide et liquide respectivement. Les limites de détections se situaient entre 0.5 à 104 ng L-1 et de 0.3 à 2.3 ng g-1. Les courbes d’étalonnages dans les matrices d’eaux usées et les solides ont montré une bonne linéarité (R2 > 0.991) pour les analytes cibles ainsi qu’une précision acceptable avec des coefficients de variation inférieurs à 25%. / The trace analysis of emerging contaminants (ECs) is gaining more interest and several studies have widely reported their occurrence in waste and surface water. However, most studies found in the literature reported concentrations only in the dissolved phase often without considering the suspended particulate matter (SPM). Moreover, most of the methods dealing with the analysis of ECs are based on liquid chromatography tandem mass spectrometry with a triple quadruple (QqQ). The majority of QqQ operate at low resolution, thus increasing the possibility of false positive identification. The current study presents a new protocol to quantify 31 emerging contaminants not only in the effluent wastewater, but also from SPM of municipal wastewater samples using high-resolution mass spectrometry, an improvement to reduce false positives. Furthermore, Yeast estrogen screen assay (YES-assay) adapted from direct measurement of estrogenic activity was tested on filtered wastewater samples. This represents one of the first reports describing ECs in wastewater and SPM with direct measurement of estrogenic activity. The separation of suspended particulate matter was realized using filtered water samples. The ECs were extracted from the matrix by sonication using MeOH:ACN (1:1, v/v) with 1% HCOOH. Thereafter, the extracts of the solid fraction and the aqueous phase were subjected to an off-line solid phase extraction (SPE) with a Strata-X-C cartridge to concentrate and clean-up the extracts. A C18 chromatography column was used to separate ECs. A QExactive mass spectrometer, which combines a quadruple analyser with a high resolution orbital ion trap (OrbitrapTM) was used in full scan (FS) mode with 70 000 FWHM (Full width at half maximum) at m/z 200 for analysis of the solid fraction, while analysis of the liquid fraction was realised using parallel reaction monitoring (PRM) with 17 500 FWHM at m/z 200. An APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) source in positive and negative mode was used for the ionization of target compounds. The method was successfully applied to real samples allowing us to determine the proportion of ECs in suspended particulate and the fate of the selected ECs during wastewater-treatment processes and their release into receiving surface waters. Recoveries of target compounds ranged from 27 to 102 % and from 43 to 122 % for the liquid and the solid fraction respectively. The limits of detection ranged from 0.5 to 104 ng L-1 and from 0.3 to 2.3 ng g-1. Calibration curves in wastewater and solid matrix showed good linearity (R2 > 0.991), for all target analytes, and precision (intraday and interday) showed coefficients of variation below 25%.

Moderne analytische Verfahren ermöglichen eine höchst effiziente Auftrennung und eine selektive Detektion von Zielanalyten. Dies ist vor allem in der Medizin von Bedeutung, da eine frühzeitige Diagnose von Krankheiten in den meisten Fällen zu einer wesentlich erfolgreicheren Behandlung beiträgt. In unserer heutigen Industriegesellschaft werden daher hochsensitive und effiziente Analysemethoden stärker benötigt als je zuvor. Diverse Umweltgifte oder gesundheitliche Schadstoffe gelangen vermehrt in Grundwasser und Umwelt. Eine Analyse ist aufgrund der oft nur geringen Konzentrationen und der Komplexität diverser Proben häufig mit großen Schwierigkeiten verbunden. Obwohl die Sensitivität und Effizienz zur Bestimmung von Krankheitsmarkern (Biomarker) und Schadstoffen immer weiter zunimmt, stoßen selbst höchstsensitive Analysemethoden an ihre Grenzen. Gerade bei kleinsten Konzentrationen an Zielanalyten oder bei komplexen Gemischen ist eine direkte Detektion ohne weitere Vorbehandlung, wie Aufkonzentrierungen oder Markierungen, äußerst schwierig oder nicht möglich. Eine Optimierung dieser Methoden, deren Automatisierung sowie sensitivere Detektorsysteme werden benötigt. Darüber hinaus ist die Entwicklung von neuartigen, selektiveren mobilen und stationären Phasen ein hochinteressantes und umfangreich untersuchtes Forschungsgebiet. Die Verwendung von hochselektiven Additiven, wie Cyclodextrinen, Kronenethern, Mizellen und andere chirale Selektoren in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Kapillarelektrophorese (CE)[1,2] oder in der Dünnschicht-Chromatographie (TLC)[3] wurde bereits umfangreich untersucht und etabliert. Hochfunktionalisierte Polymere als äußerst spezifische Selektoren mit hoher Selektivität stellen vielversprechende Materialien dar, die ebenfalls eine Optimierung in der HPLC und CE erzielen.[4-9] Der Einsatz von Polymeren in molekular geprägten Matrizen (molecular imprinted polymers, MIP) oder in monolithischen Trennsäulen wird bereits äußerst erfolgreich in der TLC, HPLC und CE genutzt.[7-11] Eine solch hochselektive Säulenmodifizierung bietet eine sehr gute Performance und hervorragende Trennleistungen. Ein Nachteil dieser hochselektiven Modifizierung ist jedoch die Spezialisierung nur auf das jeweilige Problem. Eine universelle Verwendung für komplexe Gemische und eine Fülle von Analyten ist limitiert. Ein sehr vielversprechender Aspekt ist der Einsatz von Polymeren als chirale Selektoren in der stationären wie auch in der mobilen Phase. Die große Anzahl an kommerziell erhältlichen Trennsäulen mit einer Polymermodifizierung und das ständig umfangreichere Angebot solcher Säulen[12] verdeutlichen diesen Trend und zeigen, dass die Nutzung von polymeren Architekturen für eine weitere Optimierung diverse Möglichkeiten bietet. Hochverzweigte Polymere stellen unter den Polymeren vielversprechende Materialien dar, die aufgrund ihrer Vorteile zu einer effektiven Optimierung beitragen können.[12] Die hohe Anzahl an terminalen Gruppen ermöglichen es, gut zugängliche anwendungsorientierte Modifizierungen durchzuführen, um gewünschte Eigenschaften zu generieren. Durch die hohe Variabilität der Polymere selbst und der diversen Modifizierungsmöglichkeiten zeigen maßgeschneiderte Polymere ein enormes Potential und die Möglichkeit hochselektive Wechselwirkungen mit Zielanalyten zu etablieren. Die Modifizierung mit einer Schale um den polymeren Kern ermöglicht weitere Optimierungen für den Einsatz von Kern-Schale-Architekturen. Beispiele hierfür sind unter anderem die Vermittlung höherer Löslichkeit durch eine Modifizierung des hydrophilen/hydrophoben polymeren Kerns zur Etablierung einer äußeren Schale. Ebenso können durch die Modifizierung gezielte Eigenschaften generiert werden, die eine spezifische Interaktion mit Oberflächen oder Wirkstoffen ermöglichen. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist die Synthese und die Untersuchung von Kern-Schale-Architekturen als chromatographische Selektoren. Als polymerer Kern wird hochverzweigtes Poly(ethylenimin) (PEI) verwendet, das mit einer Oligosaccharidschale modifiziert wird. Das PEI wird mit den Kerngrößen 5 und 25 kDa verwendet, wodurch eine Untersuchung des Kerneinflusses möglich ist. Weiterhin wird die Dichte der Oligosaccharidschale eingestellt. Dafür wird eine dichte, moderate bis offene und eine sehr offene Oligosaccharidschale um den polymeren Kern generiert. Infolge dessen kann der Einfluss der Schalendichte auf die Interaktion mit Beispielanalyten evaluiert werden. Für die Oligosaccharidschale (OS) werden darüber hinaus drei verschiedene Oligosaccharide (Maltose, Lactose und Maltotriose) verwendet, um den Einfluss der Art der Schale zu prüfen. Durch diese Variationen können 15 unterschiedliche PEI-OS Kern-Schale-Architekturen synthetisiert und untersucht werden. Weiterhin soll der hydrophobe Anteil der Kern-Schale-Architekturen durch die Anbindung von unpolaren Seitenketten an einen PEI-Kern erhöht werden. Auf diese Art und Weise können nicht-kovalente Wechselwirkungen mit lipophilen Systemen untersucht werden. Um polymere Kern-Schale-Architekturen möglichst effizient in der TLC, HPLC und CE einsetzen zu können, ist es essentiell, ihre Eigenschaften und die Art und Weise der Wechselwirkungen zu kennen, die sie mit möglichen Gastmolekülen eingehen. Durch die Untersuchung dieser Wechselwirkungen können Informationen über deren Interaktionen und eine mögliche Manipulation bzw. Optimierung dieser erhalten werden. Ein zielgerichteter und effektiver Einsatz mit diesen Kern-Schale Architekturen kann so vorbereitet werden. [1] T. J. Ward, K. D. Ward, Anal. Chem. 2012, 84, 626-35. [2] W. J. Cheong, S. H. Yang, F. Ali, J. Sep. Sci. 2013, 36, 609-28. [3] M. D. Bubba, L. Checchini, L. Lepri, Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 533-554. [4] M. Hanson, K. K. Unger, Trends Anal. Chem. 1992, 11, 368-373. [5] J. Kirkland, J. Chromatogr. A 2004, 1060, 9-21. [6] F. Gasparrini, D. Misiti, R. Rompietti, C. Villani, J. Chromatogr. A 2005, 1064, 25-38. [7] A. Martin-Esteban, Trends Anal. Chem. 2013, 45, 169-181. [8] I. Nischang, J. Chromatogr. A 2013, 1287, 39-58. [9] R. D. Arrua, M. Talebi, T. J. Causon, E. F. Hilder, Anal. Chim. Acta 2012, 738, 1-12. [10] P. Jandera, J. Chromatogr. A 2013, 1313, 37-53. [11] F. Svec, J. Sep. Sci. 2004, 27, 1419-1430. [12] M. Tang, J. Zhang, S. Zhuang, W. Liu, Trends Anal. Chem. 2012, 39, 180-194.

Introduction : Les modèles murins sont grandement utilisés dans l’étude des maladies rénales et des pathologies associées. La concentration de la créatinine sérique est un bon indicateur de la filtration glomérulaire et en présence d’insuffisance rénale chronique (IRC), les concentrations de créatinine sérique (et la clairance) reflètent la sévérité de l’IRC. De plus, il a été démontré que l’IRC modifie le métabolisme des médicaments en diminuant l’activité et l’expression des enzymes hépatiques du cytochrome P450 (CYP450). Afin d’étudier la modulation du P450 par l’IRC avec un modèle murin et de confirmer nos résultats chez le rat, nous devons 1) développer un modèle d’IRC chez la souris, 2) mettre au point une technique de dosage des marqueurs de l’IRC et, 3) évaluer l’expression protéique du CYP450 en présence IRC. Matériel et Méthode : Trois modèles chirurgicaux d’IRC chez la souris ont été développés. Une méthode du dosage de la créatinine par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) a été mise au point chez la souris et l’expression protéique du P450 a été mesurée par immunobuvardage de type Western. Résultats : Plusieurs paramètres de CLHP comme le pH, la concentration et le débit de la phase mobile modifient le pic d’élution et le temps de rétention de la créatinine. Concernant le modèle expérimental, on observe une perte de poids et une augmentation de la concentration plasmatique de la créatinine chez les souris avec une IRC. De plus, l’expression protéique de plusieurs isoformes du cytochrome P450 est modulée par l’IRC. Nous observons une diminution du CYP 2D de 42% (p < 0,01), du CYP 3A11 de 60% et du CYP 1A de 37% (p <0,01) par rapport aux souris témoins. On ne dénote aucun changement significatif au niveau de l’isoforme 2E1. Conclusion : Il est possible d’induire une insuffisance rénale chronique chez la souris suite à une néphrectomie. La technique de dosage de la créatinine par CLHP est précise et exacte et permet de caractériser la sévérité de l’IRC chez la souris. L’expression protéique du CYP450 est régulée à la baisse dans le foie des souris atteintes d’IRC. / Background: Mice models are widely used in renal studies. Seric creatinine concentration is used to evaluate glomerular filtration rate and is a good marker of chronic renal failure (CRF). It has been shown that CRF diminishes drug metabolism in the rat because of a downregulation of hepatic cytochrome P450 (CYP450) isoforms. To study CYP450 regulation in the mouse model, we needed to 1) develop a model of CRF in the mouse, 2) define a method of dosage of CRF markers, and 3) evaluate CYP450 protein expression in the liver of mice with CRF. Methods: Models of CRF were tested and sub-total nephrectomy was selected because of the efficacy and reproducibility to induce CRF. A high pressure liquid chromatography (HPLC) method for the dosage of creatinine in mice sera was developed. Liver protein expression of CYP1A1, CYP3A11, CYP2D and CYP2E1 was assessed by Western Blot analysis. Results: HPLC parameters such as pH, mobile phase concentration and flow rate modified the elution profile. Weight loss and high seric creatinine concentrations are seen in mice with CRF. Furthermore, protein expression of CYP1A, CYP3A11 and CYP2D was decreased in liver microsomes of mice with CRF by 37%, 60% and 42%, respectively (p<0.01) compared to sham-operated mice. We found no significant difference in the expression of CYP2E1. Conclusions: CRF models are reproducible in the mouse. The HPLC method for creatinine determination is precise and accurate, and can assess the severity of CRF. Hepatic protein expression of CYP450 is modulated in presence of CRF as in the rat.