Les Streptomyces sont des bactéries du sol possédant un chromosome linéaire de grande taille (8-11 Mb), un fort taux en bases G-C (72,1% chez S. coelicolor) ainsi que l’apparition à haute fréquence de mutants, présentant de grands réarrangements touchant les régions terminales chromosomiques. L’analyse des séquences des régions terminales et des séquences partielles de la région centrale de la souche ATCC23877 de S. ambofaciens a permis de montrer que la taille de la région spécifique d’espèce augmente avec l’éloignement phylogénétique. Cette perte progressive de synténie est le résultat d’évènements d’insertions/délétions (indels) de petits fragments d’ADN. La comparaison des séquences des Répétitions Terminales Inversées de deux souches de S. ambofaciens a montré la présence de frontières ancestrales communes et les régions spécifiques situées aux extrémités. Cette variabilité serait la conséquence de remplacements d’extrémités de réplicons linéaires potentiellement d’origine plasmidique. L’intervention différentielle de mécanismes de réparation de cassures double brin ou une fréquence plus importante des cassures le long du chromosome pourraient être à la base de cette variabilité. Une conséquence de la formation de cassures double brin est l’entrée dans le cycle de cassure-fusion-pont (CFP) dont un intermédiaire est un chromosome dicentrique. L’entrée dans ce cycle serait la conséquence de la fusion de deux chromosomes délétés d’un bras chromosomique. L’analyse de souches de S. ambofaciens DSM40697 contenant un second centre de partition précisera l’implication des systèmes de partition dans l’instabilité et l’évolution du chromosome des Streptomyces. / The Streptomyces are soil bacteria with a large linear chromosome, typically 8 to 10 Mb, high part of G-C bases (72.1% for S. coelicolor) and are subject to a high degree of genetic instability, correlated with the formation of large rearrangement occurring in the terminal chromosomal regions. The analysis of the terminal regions sequences and partial sequence central region of S. ambofaciens ATCC23877 shows that the size of the terminal species-specific regions increases as the phylogenetic distance between compared species increases. The synteny observed between central regions degenerates progressively over several hundreds of kilobases before reaching the terminal species-specific regions. This synteny appears as gradually parceled out by multiple insertions/deletions (indels) of genes. The comparison of the sequences of the Terminal Inverted Repeat (TIR) of two S. ambofaciens strains shows the two strains share the same ancestral boundaries of TIRs. On the other hand, the terminals regions are strain-specific suggesting that exchanges of replicon extremities, potentially plasmidic, have occurred, contributing to the terminal variability observed at the intraspecific level. The mechanisms of double breaks repair or the frequency of these double breaks could be the reasons of this variability. Sometimes, the chromosome becomes dicentric and enters in a break-fusion-bridge (BFB) cycle. This cycle is the consequence of a end-to-end fusion of two deleted chromosomes. The analysis of S. ambofaciens DSM40697 strains with a second locus involved in the partitioning narrows the implication of this one in the chromosomic instability and the Streptomyces’ evolution.

Diss.--Biologie moléculaire--Göteborg--Göteborg university, 2002. / Bibliogr. p. 40-47.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Paris 12 : 2005. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de la version imprimée. Pagination : 110 f. Bibliogr. : 134 réf.

Les mycoplasmes sont des bactéries atypiques, dépourvues de paroi et souvent considérées comme des cellules minimales du fait de la taille réduite de leur génome. De nombreuses espèces sont pathogènes et ont un impact économique important dans les filières d'élevage, notamment pour les ruminants. Les mycoplasmes n'échappent pas au phénomène mondial de la résistance aux antibiotiques. Contrairement à la plupart des autres bactéries, les mycoplasmes ne contiennent pas de plasmides conjugatifs souvent incriminés dans la dissémination horizontale de gènes de résistance, la base moléculaire principalement décrite étant la mutation chromosomique des gènes cibles. De façon générale, le transfert horizontal de gènes (HGT) chez les mycoplasmes a longtemps été sous-estimé. Récemment, deux mécanismes de HGT ont été décrits chez Mycoplasma agalactiae : le transfert d'élément conjugatif et intégratif (ICE), et le transfert non-conventionnel de régions chromosomiques par conjugaison appelé MCT (Mycoplasma Chromosomal Transfer). Nos travaux se sont attachés à explorer ce dernier mécanisme et à évaluer son impact sur l'acquisition de la résistance aux antibiotiques. Une analyse de génomique comparative a été conduite à partir du séquençage de nombreux mutants spontanément résistants et de transconjugants générés par des expériences de mating et sélectionnés pour leur résistance. Nos résultats montrent que le MCT conduit de façon distributive au transfert simultané de nombreux fragments. En une seule étape de conjugaison impliquant deux souches, ce phénomène génère une population variée de génomes hautement mosaïques. Il accélère la dissémination de l'antibiorésistance, permettant l'acquisition de plusieurs mutations distantes associées à la résistance en un seul événement. De par les multiples possibilités de réassemblage génomique qu'il produit, le MCT pourrait avoir des conséquences importantes sur d'autres processus adaptatifs comme la virulence ou la spécificité d'hôte. Enfin, les modalités distributives et l’ampleur du MCT expliquent l'origine des transferts de gènes précédemment détectés in silico entre de nombreux mycoplasmes. Ce phénomène pourrait donc avoir eu des répercussions importantes sur l'évolution de ces bactéries minimales et être un facteur clé de leur persistance et virulence actuelles.

Les traitements antinéoplasiques peuvent induire des leucémies myéloblastiques (t-LAM). Ces t-LAM présentent des anomalies cytogénétiques spécifiques de l'agent mutagène. Des monosomies 5 ou 7 ou 5q-/7q- se rencontrent après expositions aux alkylants; des translocations équilibrées impliquant souvent la région 11q23, se voient après anti topoisomérases II. Ces anomalies acquises se voient aussi dans des leucémies myéloblastiques de novo (p-LAM) laissant suggérer des mécanismes leucémogènes identiques entre t-LAM et p-LAM. L'utilisation de la CGH array haute résolution permet la mise en évidence d'anomalies cryptiques. 36 patients présentant une t-LAM et 49 atteints d'une p-LAM sont étudiés avec cet outil. Le but est de rechercher des CNA (Copy Number Alteration) au sein des t-LAM et des p-LAM. Les CNA sont regroupées en régions minimales critiques (RMC) pouvant contenir des gènes candidats à la leucémogenèse. Ces résultats sont comparés à des données déjà publiées. Les RMC situées en 5q et en 7q sont encore trop grandes pour définir aisément des gènes candidats. Dans d'autres régions, RUNX1, NF1, ETS2 ou TET2 sont mis en évidence avec des fréquences différentes entre les t-LAM et les p-LAM. Un classement des anomalies génomiques acquises des LAM en 3 groupes est proposé: les anomalies communes aux t-LAM et aux p-LAM, les anomalies essentiellement retrouvées dans les t-LAM ou dans les p-LAM. L'étude du transcriptome et du miRNome a porté sur un petit nombre de patients étudiés en CGH array. L'interprétation des résultats préliminaires reste difficile lorsqu'ils sont comparés aux données génomiques.

Les qualités intrinsèques spermatiques (état de condensation de la chromatine, intégrité de l’ADN, contenu chromosomique, capacités fécondantes..) sont très variables d’un spermatozoïde à l’autre. Le pari aujourd’hui en assistance médicale à la procréation est de relier un aspect morphologique spermatique à ces qualités intrinsèques dans le but de mieux choisir le spermatozoïde vivant à injecter et d’améliorer les taux de grossesse. Depuis 2002, le MSOME (Motile Sperm Organelle Morphology Examination) permet d’observer les spermatozoïdes à fort grossissement, en contraste interférentiel de Nomarski et d’observer des structures qu’on appelle les « vacuoles ». L’injection intra-ovocytaire de spermatozoïdes sélectionnés en MSOME (IMSI) comme non porteurs de vacuoles céphaliques permettrait d’améliorer les taux de grossesses évolutives. Ici, nous avons montré que les vacuoles spermatiques correspondaient à des cratères nucléaires en lien avec une non-condensation chromatinienne (non remplacement des histones au cours de la spermiogenèse). Certaines atypies morphologiques spermatiques sont aussi en lien avec une non-condensation de la chromatine. De plus, spermatozoïdes vacuolés présentent parfois des taux de fragmentation élevés. Aucun lien n’a cependant été retrouvé entre un aspect morphologique spermatique d’une part et un contenu chromosomique ou des capacités fécondantes particulières d’autre part. De ces liens, nous avons pu dégager de nouvelles indications d’IMSI. Ainsi, nous avons avancé dans la description des critères de sélection du spermatozoïde humain vivant donnant le moins de risque d’échec d’implantation embryonnaire et/ou d’anomalies pour la descendance / Intrinsic sperm quality criteria (chromatin condensation, DNA fragmentation, chromosome content, fecundity, etc.) vary from one spermatozoon to another. It is critical to be able to link morphological aspects to these quality criteria, in order to improve the selection of high-quality, live spermatozoa and thus improve pregnancy and delivery rates. Since 2002, motile sperm organelle morphology examination has been used to screen for defects under high magnification and thus select vacuole-free spermatozoa (which are known to be associated with higher pregnancy rates in intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) programmes). Here, we demonstrate that sperm vacuoles are nuclear concavities associated with chromatin condensation failure (due to a lack of histone replacement during spermiogenesis). A number of other morphological abnormalities were found to be linked to chromatin condensation failure. In some cases, vacuolated spermatozoa were seen to be more DNA-fragmented than vacuole-free ones. In contrast, sperm morphology was not related to chromosomal content or fecundity characteristics. Our observations enabled us to identify new indications for IMSI and refine the criteria for selecting the best spermatozoon: the spermatozoon with the lowest risk of implantation failure or abnormalities in the offspring

L'organisation de la chromatine a une importance fonctionnelle pour contrôler le programme d'expression des gènes. Par contre, les liens qui l'unissent au déroulement de la réplication de l'ADN sont beaucoup moins connus. Grâce à des approches basées sur la capture d'interactions chromosomiques et sur l'imagerie cellulaire, nous avons étudié les liens entre le repliement à grande échelle de la chromatine et le timing de réplication. Cette analyse, effectuée dans des cellules humaines lymphoblastoïdes, des cellules mononucléées du sang (PBMC) et des cellules issues d'une leucémie myéloïde à caractère érythrocytaire, a permis l'identification de domaines structuraux du noyau. Ces domaines sont relativement isolés les uns des autres et leurs frontières coïncident avec les zones d'initiation précoce. De plus, notre étude montre que ces zones d'initiation précoce interagissent préférentiellement, aussi bien entre voisins immédiats (séparation génomique de l'ordre de la mégabase) que le long du chromosome entier. Les loci répliqués tardivement interagissent eux-aussi avec leurs homologues, conduisant, dans l'espace nucléaire, à une ségrégation des loci en fonction de leur timing de réplication. Ces résultats sont soutenus par des mesures de distances sur des hybridations in-situ qui montrent que les loci répliqués en début de phase S sont plus proches qu'attendus. Nos travaux révèlent enfin que l'organisation de la chromatine est similaire dans des cellules en phase G0 (PBMC dormantes), démontrant qu'elle n'est pas spécifique des cellules en phase S. Pris ensemble, ces résultats apportent des preuves directes d'une organisation robuste de la chromatine, partagée par les cellules en cycle et dormantes, et corrélée au timing de réplication à différentes échelles.

Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne de grade IV dont le pronostic est de 14,6 mois avec le traitement standard. Le pronostic des patients est difficile à préciser et de meilleures connaissances de révolution de ce cancer nous permettraient d’identifier de nouveaux marqueurs permettant d’estimer plus précisement le stade du cancer et ainsi, la survie des patients. L’équipe du Dr Ju Yan a étudié les profils de longueurs individuelles des télomères des cellules de patients normaux et de patients atteints de leucemie myéloïde chronique (LMC) avec les techniques d’analyse des fragments terminaux de restriction des télomères (TRF) et d’hybridation in situ observée en fluorescence de façon quantitative (Q-FISH). En utilisant les mêmes protocoles sur les GBM, nous avons évalué les longueurs individuelles des télomères et leurs profils. L’analyse complète de onze spécimens de GBM humains et de la lignée cellulaire de glioblastome U-87 MG nous a permis d’observer que les télomères 12p, 16p, 22q, 17p, 17q, 19p et 22q sont maintenus plus longs dans les profils de longueurs individuelles relatives. En comparant avec les données du Dr Yan, nous avons pu déterminer que les télomères 21p et 2q sont fréquemment observés parmi les télomères les plus courts dans les GBM et dans la LMC. Les comparaisons des télomères significativement plus courts à ceux plus longs nous ont permis d’identifier l’allongement des télomères 12p, 16p et 20q de même que le raccourcissement des télomères 3q, 9p et 22q comme étant des événements potentiellement spécifiques à révolution des GBM. Les télomères 12q et 22q ont été observés parmi les télomères les plus courts et parmi les plus longs dans différents cas de GBM et de LMC, suggérant que le maintien de la longueur et le raccourcissement de ces extrémités peuvent jouer un rôle dans l'évolution du cancer. L’utilisation du FISH multicolore (M-FISH) nous a permis d’identifier les chromosomes impliques de façon récurrente parmi les anomalies de nombre et de structure. Nous avons noté les délétions des chromosomes 1, 2, et 20 ainsi que des segments des chromosomes 6, 11q , 13q, 14q et 18. Au niveau des duplications, on retrouve majoritairement le bras court du chromosome 4 et un segment du chromosome 7. Nous avons aussi observé dans nos analyses que les chromosomes 1, 6, 12, 13, 22 et 14 sont particulièrement impliqués dans les réarrangements et leurs télomères sont fréquemment retrouvés dans les plus courts (1p, 1q, 13p, 22p et 6p). Globalement, nous avons observés que les tumeurs décrites comme étant agressives sont associées avec une survie courte après diagnostic et elles présentent des télomères courts et/ou plusieurs anomalies chromosomiques. Les tumeurs décrites comme étant indolentes sont associées avec une survie longue après diagnostic et elles présentent des télomères souvent de longueur normale et un nombre inférieur d’anomalies chromosomiques comparativement aux tumeurs agressives.

Les hélicases sont des enzymes ubiquitaires catalysant la séparation de l’ADN double-brin et impliquées dans la réplication, la réparation de l’ADN et dans le maintien des télomères. Chez l’Homme, 3 hélicases présentent des mutations responsables de syndromes cliniques : WRN pour le syndrome de Werner, BLM pour le syndrome de Bloom et RECQL4 pour le syndrome de Rothmund-Thomson. Tous ces syndromes associent un vieillissement pathologique accéléré à un risque accru de développement de cancer notamment par une augmentation de l’instabilité génomique. Les connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces maladies du vieillissement sont encore très partielles, notamment en ce qui concerne le lien entre l’instabilité génomique et le vieillissement. Au cours de ce projet, l'utilisation de prélèvements sanguins et cutanés de patients atteints de ces pathologies rares a permis de générer des modèles de cellules souches pluripotentes induites (iPS). Ces cellules présentent l’avantage de s’auto-renouveler et de pouvoir théoriquement se différencier dans tous les types cellulaires d’un organisme. Parallèlement, un témoin de sénescence a été généré de la même manière avec des cellules d’un patient souffrant du syndrome de la progéria de Hutchinson-Gilford. Après caractérisation de ces cellules, nous avons identifié des ensembles de phénotypes cellulaires et moléculaires dans le but de récapituler in vitro les pathologies. Nous avons également engagé les cellules iPS dans des voies de différenciation proches des tissus atteints dans les pathologies in vivo. Enfin, nous avons étudié la stabilité génomique de ces lignées dans les différents types cellulaires cultivés. Ainsi nous avons observé que la lignée Bloom est le siège de recombinaisons particulièrement fréquentes et est caractérisée par une instabilité du génome dans tous les types cellulaires étudiés. Egalement, la lignée Werner semblerait se distinguer par une instabilité de ses télomères. Enfin, l’ensemble des lignées des pathologies du vieillissement prématuré présenterait un défaut mitochondrial. / Helicases process the double-stranded DNA dissociation. They are involved in replication, DNA repair and maintenance of telomeres. In human, 3 helicases display mutations responsible for clinical syndromes: WRN for the Werner syndrome, BLM for the Bloom syndrome and RECQL4 for the Rothmund-Thomson syndrome. All these diseases cause premature ageing and high risk of cancer. Molecular and cellular mechanisms involved in these diseases are not well defined. Particularly, little is known concerning the link between genomic instability and ageing. During this project, we used blood samples and skin biopsies of affected patients to generate models by reprogramming cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs). These cells have the advantage of self-renewing and theoretically could be differentiated in all cell types. At the same time, an iPSC senescence control was performed from cells of a Hutchinson-Gilford Progeria syndrome patient. iPSCs were characterized for pluripotency. In the aim of recapitulate these pathologies in vitro, we identified sets of cellular and molecular phenotypes. We also engaged differentiation of iPSCs in cell pathways closed to the affected tissues in vivo. Finally, we studied the genomic stability of iPSCs and derived cells. We observed that Bloom cells are susceptible to frequent recombinations and are characterized by a genome instability through all studied cell types. Werner cells showed an instability of telomeres length. Finally, all premature ageing diseases displayed mitochondrial defects.