Tous les organismes présentent des rythmes biologiques sous le contrôle d’horloges internes synchronisées sur le cycle jour-nuit. La perturbation des horloges (travail posté chez l’homme) conduit souvent à des troubles métaboliques. A l’inverse, obésité et diabète sont associés à des perturbations circadiennes. Mon but est de comprendre les mécanismes impliqués dans le lien réciproque entre perturbations circadiennes et troubles métaboliques. Une première partie révèle le rôle de la leptine dans les troubles circadiens de souris génétiquement obèses, au niveau central et périphérique. Dans une seconde partie, nous montrons que l’altération des cycles jour-nuit induit une désynchronisation circadienne chez un rongeur diurne, entraînant un état pré-diabétique et un vieillissement prématuré des cellules hépatiques. Nos résultats ouvrent la voie à des traitements préventifs visant à diminuer les troubles circadiens des patients obèses et les troubles métaboliques des travailleurs postés. / Most organisms exhibit biological rhythms, generated endogenously by circadian clocks, which are synchronized on the light-dark cycle. Disrupting circadian clocks (e.g, shiftwork) lead in most cases to the occurrence of metabolic disorders. Conversely, obesity and diabetes are associated with circadian disruptions. The aim of my project is to provide new insights in the understanding of mechanisms underlying the reciprocal relationships between circadian disruptions and metabolic disorders. We show in a first part that leptin is involved in circadian disturbances of genetically obese mice, at both central and peripheral levels. In a second part, by altering the light-dark cycle, we induce the circadian desynchronization of a diurnal rodent, which leads in turn to a pre-diabetic state associated with accelerated aging of hepatic cells. Our results pave the road to preventive treatments aiming at reducing circadian disruptions in obese patients and metabolic disorders in shiftworkers.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le nombre croissant d'adoptions internationales, ainsi que les différentes problématiques qui sont associées à 1*adoption, ont mis en évidence le besoin d'explorer l'adaptation de ces enfants, tant au niveau psychologique que physiologique. Un moyen utilisé de plus en plus pour examiner l'adaptation physiologique est le cortisol salivaire, qui se veut une mesure du niveau de stress. Composée de deux articles, cette thèse vise à explorer les liens entre le cortisol salivaire des enfants adoptés de l'international et de leurs mères adoptives, l'harmonisation de leurs rythmes diurnaux et les facteurs pouvant influencer ces rythmes. Le premier article examine les rythmes diurnaux des enfants adoptés de l'international, âgés d'environ 4 ans. et des enfants témoins, qui vivent avec leurs parents biologiques depuis leur naissance. Ces rythmes diurnaux sont examinés en fonction des moyennes des taux de cortisol et aussi par rapport à la variabilité des taux de cortisol. Le deuxième article vise à explorer l'harmonisation des rythmes diurnaux entre les enfants et leurs mères, en explorant la contribution de différents facteurs, tel que l'attachement, dans l'harmonisation des rythmes diurnaux de cortisol. De plus, comme cette thèse est exploratrice, un sous-objectif des deux articles est d'explorer les facteurs pouvant contribuer à la variabilité des rythmes diurnaux de cortisol, comme par exemple, l'âge à l'adoption, le statut socioéconomique de la famille, l'indice de masse corporelle, le périmètre crânien de l'enfant, etc. L'échantillon présent est composé de 60 familles, dont 43 familles adoptives et 17 familles témoins. Le cortisol des enfants et des mères a été prélevé à raison de 6 échantillons de salive par jour, et ce, pendant 2 jours (dans une même semaine) où ces dyades passaient la journée complète ensemble. Ces six échantillons étaient prélevés (1) au lever, (2) 30 minutes après le réveil, (3) vers 10h30, (4) en après-midi, vers 14h30, (5) juste avant le souper et (6) au coucher, et ce afin d'avoir la possibilité d'examiner le rythme diurnal du cortisol. De plus, comme la présente thèse s'inscrit dans le cadre d'une étude longitudinale, l'accès à plusieurs mesures prises dans le passé, tel que les indices physiques à l'arrivée, le statut de la relation d'attachement, était possible. Analyses : L'aire sous la courbe (AUC) et la catégorisation des rythmes diurnaux de cortisol ont été utilisés afin d'examiner le cortisol salivaire des enfants et de leurs mères. De plus, des coefficients de variabilité et des coefficients d'harmonisation ont aussi été créés. Malgré le fait qu'il n'y a pas de différence statistique entre les groupes adoptés et témoins au niveau des aires sous la courbe, des différences dans les catégories de typicalité des rythmes diurnaux de cortisol émergent. Ces résultats démontrent qu'il y a plus d'enfants adoptés qui présentent des rythmes de cortisol soit très bas ou très élevés. En plus, les enfants adoptés après l'âge de 12 mois sont plus à risque de présenter des taux de cortisol atypiques, ce qui confirme l'hypothèse de la durée de l'exposition. Par ailleurs, le deuxième article a démontré que les rythmes diurnaux des enfants étaient harmonisés avec ceux de leurs mères, surtout chez les adoptés. De plus, les enfants présentant un attachement désorganisé présentent un rythme diurnal harmonisé avec celui de leur mère, reflétant que les dyades étaient réactifs en même temps, produisant ainsi des fluctuations physiologiques semblables

Nous proposons un modèle d’automate pour le cycle cellulaire lié à l’horloge circadienne. Ce modèle est utilisé pour déterminer la toxicité de différents schémas d’administration d’agents anticancéreux selon un profil temporel déterminé, dans le but d’optimiser l’efficacité de la chronothérapie des cancers. Fondé sur les transitions séquentielles entre les phases successives du cycle cellulaire G1, S (réplication de l’ADN), G2 et M (mitose), le modèle permet de simuler la distribution des phases du cycle cellulaire et son entraînement par l’horloge circadienne. Le modèle est utilisé pour évaluer l’effet du profil d’administration circadienne de deux agents anticancéreux, le 5-fluorouracile (5-FU) et l’oxaliplatine (l-OHP). Ces médicaments diffèrent par leur mode d’action mais sont complémentaires dans le traitement du cancer colorectal. Le 5-FU, considéré en premier, exerce ses effets cytotoxiques sur les cellules en phase S. Divers profils d’administration circadienne sont comparés, qui diffèrent par le temps du maximum d’administration du 5-FU. Le modèle explique pourquoi un minimum de cytotoxicité est obtenu lorsque le temps du pic d’administration approche 4h du matin, ce qui correspond au profil temporel d’administration utilisé en pratique clinique pour le 5-FU. Nous montrons comment la cytotoxicité de l’agent anticancéreux est affectée par la variabilité de la durée des phases du cycle cellulaire et par la durée du cycle cellulaire en présence et en absence d’entraînement par l’horloge circadienne. Les résultats indiquent qu’un même profil temporel d’administration peut avoir une cytotoxicité minimale pour une population cellulaire (correspondant à une population de cellules saines), et une cytotoxicité élevée pour une seconde population (correspondant à des cellules tumorales). Ainsi le modèle permet de mettre en lumière les mécanismes susceptibles d’améliorer simultanément la chronotolérance et la chronoefficacité des agents anticancéreux. Le cas de l’oxaliplatine (l-OHP) est considéré dans un second temps. Contrairement au 5-FU, l’oxaliplatine élimine les cellules quelle que soit sa phase dans le cycle cellulaire. La phamacocinétique des thiols plasmatiques et du glutathion intracellulaire est incorporée au modèle. Ces composés interfèrent avec l’action de l’OHP en formant des complexes inactifs. Le modèle montre comment des variations circadiennes dans la cytotoxicité de l-OHP peuvent résulter de rythmes circadiens dans les niveaux de thiols plasmatiques et de glutathion. En accord avec les résultats expérimentaux et cliniques, les simulations numériques du modèle d’automate pour le cycle cellulaire montrent que les profiles temporels minimisant la cytotoxicité de l’oxaliplatine sont en antiphase avec ceux minimisant la cytotoxicité du 5-fluorouracile./We propose an automaton model for the cell cycle coupled to the circadian clock. We use this model to assess the toxicity of various circadian patterns of anticancer drug delivery so as to enhance the efficiency of cancer chronotherapy. Based on the sequential transitions between the successive phases G1, S (DNA replication), G2, and M (mitosis) of the cell cycle, the model allows us to simulate the distribution of cell cycle phases as well as its entrainment by the circadian clock. We use the model to evaluate circadian patterns of administration of two anticancer drugs, 5-fluorouracil (5-FU) and oxaliplatin (l-OHP). These drugs, which differ by their mode of action, are complementary in the clinical treatment of colorectal cancer. We first consider the case of 5-FU, which exerts its cytotoxic effects on cells in S phase. We compare various circadian patterns of drug administration differing by the time of maximum drug delivery. The model explains why minimum cytotoxicity is obtained when the time of peak delivery is close to 4 a.m. which corresponds to the temporal pattern of administration used clinically for 5-FU. We also determine how cytotoxicity is affected by the variability in duration of cell cycle phases and by cell cycle length, in the presence or absence of entrainment by the circadian clock. The results indicate that the same temporal pattern of drug administration can have minimum cytotoxicity toward one cell population, e.g. of normal cells, and at the same time can display high cytotoxicity toward a second cell population, e.g. of tumour cells. Thus, the model allows us to uncover factors that may contribute to improve simultaneously chronotolerance and chronoefficacy of anticancer drugs. We next consider the case of oxaliplatin (l-OHP), which, in contrast to 5-FU, kills cells in different phases of the cell cycle. We incorporate into the model the pharmacokinetics of plasma thiols and intracellular glutathione, which interfere with the action of the drug by forming with it inactive complexes. The model shows how circadian changes in l-OHP cytotoxicity may arise from circadian variations in the levels of plasma thiols and glutathione. Corroborating experimental and clinical results, the numerical simulations of the automaton model for the cell cycle account for the observation that the temporal profiles minimizing l-OHP cytotoxicity are in antiphase with those minimizing cytotoxicity for 5-FU.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La présente étude a investi les effets des lésions des systèmes monoaminergiques surles fonctions motrices et non-motrices, y compris l’évaluation des comportements anxieux etdépressifs ainsi que les rythmes circadiens dans le contexte de la maladie de Parkinson (MP).D’abord, nous avons mis en place un modèle animal approprié en utilisant une intoxication auParaquat/Maneb (PQ/MB) ou avec des lésions sélectives des systèmes monoaminergiques.Ensuite, nous avons caractérisé les modèles en utilisant des approches comportementale,biochimique et électrophysiologique.Dans la première partie de cette étude, nous avons investi la validité du modèle PQ/MB parévaluer les effets du PQ/MB sur : (1) l’activité locomotrice et la coordination motrice enutilisant les tests de l’Open Field et du Rotarod, (2) les comportements anxieux et dépressif enutilisant les tests du labyrinthe en croix surélevé et de la nage forcée respectivement, (3)l’activité neuronale du noyau sous-thalamique en utilisant des enregistrements extracellulairesunitaires et (4) les concentrations tissulaires en dopamine, noradrénaline et sérotonine dans lestriatum et le cortex frontal.Nos résultats montrent que les rats Sprague Dawley mâles ne sont pas sensibles de la mêmefaçon au PQ/MB et que les déficits moteurs observés chez les animaux vulnérables ne sont passeulement le résultat d’une dégénérescence des neurones dopaminergiques, mais pourraient êtreaussi une conséquence des problèmes périphériques. Néanmoins, les troubles non-moteursobservés chez les animaux de tous les groupes traités pourraient constituer une conséquencedirecte de la déplétion dopaminergique bilatérale.En se basant sur les résultats de la première partie, nous avons utilisé le modèle du rat 6-OHDApour investir les effets de dégénérescence des cellules dopaminergique seule ou combinée avecles déplétions noradrénergique et sérotoninergique sur l’activité électrique des neurones dunoyau suprachiasmatique (SCN) en utilisant des enregistrements électrophysiologiquesextracellulaires. Le SCN est une structure clé impliquée dans le contrôle des rythmescircadiens. Nos résultats montrent pour la première fois que les déplétions monoaminergiquessont à l’origine des changements dans l’activité électrique des neurones du SCN, apportant desrésultats nouveaux qui suggèrent que les changements dans la décharge électrique des SCN quiperturbent les rythmes circadiens font partie de la physiopathologie de la MP. / The present study aimed to investigate the effects of monoaminergic system lesionson the motor and non-motor functions, including anxiety, depression and circadian rhythmswithin the context of Parkinson’s disease. First, we developed appropriate animal models usingcombined paraquat/maneb (PQ/MB) intoxication or using selective lesions of monoaminergicsystems; second, we characterized the models using behavioral, biochemical andelectrophysiological approaches.In the first part of the study, we investigated the relevance of the PQ/MB model by studyingthe effects of combined PQ/MB on: (1) locomotor activity and motor coordination using theopen field and the rotarod test respectively, (2) anxiety and “depressive-like” behaviors usingthe elevated plus maze and the forced swim test respectively, (3) subthalamic nucleus neuronalactivity using extracellular single unit recordings and (4) tissue level of dopamine,noradrenaline and serotonin in the striatum and frontal cortex.Our data provide evidence that male Sprague Dawley rats are not equally sensitive to PQ/MBand that the observed motor deficits in vulnerable animals are not only a result of dopamineneuron degeneration, but may also be a consequence of peripheral disabilities. Nevertheless,the parkinsonian-like non-motor impairments may be a direct consequence of the bilateraldopamine depletion.Based on the results of the first part, we used the 6-OHDA rat model to investigate the effectsof DA cell degeneration, alone or combined with the noradrenaline (NA) and/or serotonin (5-HT) depletions, on the electrical activity of suprachiasmatic nucleus (SCN) neurons usingextracellular electrophysiological recordings. SCN is a key structure involved in the control ofcircadian rhythms. Our data provide the first evidence that monoamine depletions are at theorigin of changes in the firing activity of SCN neurons, suggesting new insight into theinvolvement of these electrical changes in the pathophysiology of circadian rhythms disruptionin PD.

Cette thèse démontre à travers de 11 publications que le vieillissement physiologique se caractérise par une atténuation à la fois du processus homéostasique du sommeil ainsi que des processus circadiens. Dans le vieillissement pathologique (les démences), les rythmes circadiens peuvent être davantage affaiblis. Les répercussions cognitives et psychologiques comprennent les processus de mémorisation d’une part, et nous avons pu démontrer d’autre part que le système circadien joue un rôle majeur sur le bien-­être du sujet âgé. Enfin, les troubles du sommeil augmentant également avec l’âge, nous avons démontré que des facteurs génétiques (APOE4, allèle s du 5-HTTLPR), peuvent agir en tant que modulateur des effets des troubles du sommeil (apnées du sommeil) sur la fonction cognitive. Pour l’allèle s du 5-­HTTLPR, nous avons décrit qu’il interagit avec des mesures biologiques du stress (cortisol) pour affecter la mémoire, probablement via un mécanisme impliquant l’hippocampe. / In this doctoral thesis and its 11 published manuscripts, we show that the physiological aging process is accompanied by an attenuation of the homeostatic sleep process as well as attenuated circadian processes. This weakening of circadian rhythms is even more pronounced during pathological aging (the dementias). Its cognitive and psychological repercussions include memory processes, and we have also demonstrated that the circadian system plays a major rôle on well-­being in older adults.Finally, sleep disorders increase with age, and we have shown that genetic factors such as APOE4 or the 5-­‐HTTLPR s allele act as moderators of sleep disorders’ effect (such as sleep apnea) on cognitive outcomes. For the 5-­‐HTTLPR s allele, we described its interactions with biological measures of stress (cortisol) to affect memory, probably via mechanisms implying the hippocampus.

Les rythmes biologiques aident les organismes vivants à programmer la plupart des processus comportementaux dans la fenêtre temporelle la plus appropriée. Les données de la littérature sur la rythmicité du chat domestique sont rares et conflictuelles. Pour approfondir nos connaissances sur le sujet, nous avons utilisé de récentes technologies de télémétrie pour enregistrer et caractériser les rythmes journaliers d'activité locomotrice et de prises alimentaire chez des chats en fonction des saisons et des conditions d’hébergement. Les rythmes des chats étaient modifiés par la photopériode et la présence humaine. Suivant une périodicité de 24 heures, ils ont affiché une bimodalité dans leurs rythmes quotidiens, avec des creux d'activité locomotrice et de consommation au milieu de la journée et de la nuit. Les deux périodes principales d'activité/alimentaires correspondaient à l'aube et au crépuscule à chaque saison, indépendamment de leur horaire, confirmant la nature intrinsèque crépusculaire de l'espèce. Le rythme alimentaire des chats était plus variable au cours du cycle que celui de leur activité locomotrice, rappelant ainsi le caractère opportuniste de ce prédateur. Les chats ont présenté une plasticité comportementale caractérisée par des rythmes plus faibles et un comportement d'exploration plus nocturne en milieu extérieur qu’en milieu intérieur, au sein duquel ils étaient plus enclins à la routine. Nos résultats ouvrent la voie au développement de solutions nutritionnelles et des recommandations d’hébergement adaptées aux rythmes du chat en respectant les besoins physiologiques de l’animal. / Biological rhythms are of importance for living organisms as they help to schedule most behavioural processes within the most suitable temporal window. Literature on daily rhythmicity is scarce and conflicting regarding domestic cats. To sharpen our knowledge on the subject, we used advanced telemetry technologies to record and characterise the daily rhythms of locomotor activity and feeding in cats according to the seasons and housing conditions. The cats were sensitive to photoperiod and to human presence. Along 24-hour periodicity, they displayed bimodality in their daily patterns, with mid-day and mid-night troughs of locomotor activity and food consumption. The two main activity/eating periods corresponded to dawn and dusk at each season, regardless of the twilight timings, confirming the crepuscular intrinsic nature of the species. The feeding rhythm of the cats was more variable daily than their locomotor activity one, recalling the opportunistic character of this predator. Cats displayed plasticity in their behaviour, such as weaker daily rhythms and more nocturnal exploratory behaviour outdoors, compared to indoors where they were more prone to routine. Our results open new avenues for developing nutritional and housing guidelines fitted to the rhythms of the cats according to their way of life.

Situé dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de l’hypothalamus, l'horloge principale contrôle les rythmes des processus comportementaux et métaboliques chez les mammifères. Par exemple, les rythmes quotidiens de veille-sommeil, d'alimentation-jeûne, de glycémie, de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline sont régulés par l'horloge SCN. La lumière est le synchroniseur principal du SCN, même si de nombreux facteurs autres que la lumière, tels que l'éveil comportemental ou des facteurs métaboliques, peuvent également moduler la phase ou la période des SCN. L'objectif de cette thèse était d'étudier différents aspects des interactions entre l'éveil comportemental, les rythmes circadiens et le métabolisme du glucose. Dans la première partie, nous avons déterminé l'action centrale du Gastrin-Releasing Peptide (GRP), un neuropeptide synthétisé dans le SCN, sur le métabolisme du glucose. Nos résultats indiquent qu’une injection icv de GRP induit une hyperglycémie prolongée. Nous avons également montré qu’une privation de sommeil à court terme conduit à une détérioration de la tolérance au glucose. Dans la deuxième partie, nous avons démontré que l'éveil comportemental induit par la privation de sommeil ou une injection de caféine améliore l’entraînement photique de l'horloge SCN chez un rongeur diurne : le rat roussard du Soudan, Arvicanthis ansorgei. Ces réponses circadiennes chez une espèce diurne qui sont opposées à celles précédemment mises en évidence chez les rongeurs nocturnes pourraient avoir des applications biomédicales. / Located in the hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), the master clock generates rhythms of behavioural and metabolic processes in mammals. For example, daily rhythms of sleep-wake, fasting-feeding, plasma glucose concentration, glucose tolerance and insulin sensitivity are regulated by the SCN clock. Light is the primary synchronizer of SCN pacemaker though many light-independent factors such as behavioural arousal and metabolic cues also have phase and period resetting properties. The aim of thesis was to study different aspects of the interactions between behavioural arousal, circadian rhythms and glucose metabolism. In the first part, we extended the study of brain control of glucose metabolism by investigating the central action of gastrin-releasing peptide (GRP), a neuropeptide synthesized in the SCN, on glucose metabolism. Our result indicates that central GRP induces long-lasting hyperglycemia. We also showed that acute sleep deprivation leads to impaired glucose tolerance. In the second part, we demonstrated that behavioural arousal induced by sleep deprivation or caffeine treatment enhances photic-entrainment of the SCN clock in the diurnal Sudanian grass rat, Arvicanthis ansorgei. These circadian responses in a diurnal species are opposite to the earlier findings in nocturnal rodents and may have biomedical applications.

En 2007, le Centre International de Recherche sur le Cancer (CIRC) a classé le “travail de nuit entrainant une perturbation du rythme circadien” comme probablement cancérogène pour l'homme (groupe 2A) sur la base de preuves suffisantes chez l’animal mais limitées chez l'Homme. A ce jour, peu d’études se sont intéressées au rôle du travail de nuit et des gènes de l’horloge dans la survenue du cancer de la prostate. Dans ce contexte, nous avons étudié le rôle du travail de nuit, des gènes circadiens ainsi que leurs interactions dans le risque de cancer de la prostate, à partir des données d’EPICAP, étude cas-témoins réalisée en population générale), incluant 819 cas et 879 témoins. Un questionnaire standardisé a permis de recueillir des informations détaillées sur le travail de nuit, qu’il soit fixe ou rotatif. La réalisation d’un prélèvement biologique a permis un génotypage de l’ADN pour l’étude des gènes de l’horloge. Globalement, nous n’avons pas mis en évidence d’association entre le travail de nuit et le cancer de la prostate quelle que soit l'agressivité du cancer de la prostate, alors que nous avons observé une augmentation du risque chez les hommes ayant un chronotype du soir. Une durée d’exposition d’au moins 20 ans au travail de nuit fixe associée au cancer de la prostate agressif et de manière plus prononcée en combinaison avec des nuits de longue durée (en moyenne de plus de 10 heures par nuit) ou avec un nombre maximal de nuits consécutives supérieur à 6. Nous avons observé une association significative avec le cancer de la prostate pour les gènes NPAS2 et PER1, alors que seul le gène RORA était significatif pour les cancers agressifs. L’analyse de l’interaction entre les gènes de l’horloge et le travail de nuit dans le risque de survenue de cancer de la prostate a révélé des interactions significatives avec les gènes RBX1, CRY1, NPAS2 et PRKAG2. Les résultats de notre étude renforcent l'hypothèse d'un lien entre le travail de nuit en tant que facteur de perturbation du rythme circadien et le risque de cancer de la prostate et fournissent également de nouvelles preuves d'un lien potentiel avec les variants des gènes de l’horloge. Ces résultats, pourraient contribuer à l’identification de nouveaux facteurs de risque modifiables pour le cancer de la prostate pouvant être accessibles à la prévention. Des recherches plus approfondies aideront à mieux cerner les mécanismes biologiques impliquant les gènes circadiens dans le développement du cancer de la prostate ainsi que leurs interactions avec le travail de nuit. / In 2007, the International Agency for Research on Cancer (IARC) classified "shift work leading to a disruption of circadian rhythm» as probably carcinogenic to humans (Group 2A) on the basis of sufficient evidence in animals but limited evidence in humans. To date, few studies have focused on the role of night work and clock genes in prostate cancer occurrence. In this context, we studied the role of night work, circadian genes and their interactions in prostate cancer risk, using data from EPICAP, a population-based case-control study, including 819 cases and 879 controls. A standardized questionnaire was used to collect detailed information on both fixed and rotating night work. Biological samples were also collected for DNA genotyping and for prostate cancer-clock genes association study. Overall, we did not find an association between night work and prostate cancer whatever the disease aggressiveness, while we observed an increased risk in men with an evening chronotype. At least 20 years of exposure to fixed night work was associated with aggressive prostate cancer and this was more stricken in combination with long nights (on average more than 10 hours per night shift) or more than 6 consecutive night shifts. We observed a significant association with prostate cancer for the clock genes NPAS2 and PER1, while only RORA was significant for aggressive cancers. We found significant interaction between clock genes and night work in the risk of prostate cancer for RBX1, CRY1, NPAS2 and PRKAG2. Our results provide support for the hypothesis that night work disrupting circadian rhythm could be associated with prostate cancer and they also provide new evidence of a potential link between clock genes variants and prostate cancer. These results may particularly contribute to the identification of new prostate cancer risk factors that could be modifiable and available for prevention. Further studies are warranted to better understand the biological mechanisms involving circadian genes in the development of prostate cancer and their interactions with night work.