Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-06-10T14:43:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alessandra Alves Drumond Siqueira.pdf: 694552 bytes, checksum: 063f14c557446b37809da884d1b0d0a9 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-11T18:36:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alessandra Alves Drumond Siqueira.pdf: 694552 bytes, checksum: 063f14c557446b37809da884d1b0d0a9 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-11T18:39:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alessandra Alves Drumond Siqueira.pdf: 694552 bytes, checksum: 063f14c557446b37809da884d1b0d0a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-11T18:39:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alessandra Alves Drumond Siqueira.pdf: 694552 bytes, checksum: 063f14c557446b37809da884d1b0d0a9 (MD5) Previous issue date: 2004-03-29 / Não Informada / The proteases are enzymes which occupy a pivotal position with respect to their application in medical and commercial fields. Collagenases are detached among several kind of proteases, used in pharmaceutical and cosmetician industry, in processes such as smooth the skin, oral hygiene, disinfect suppurative wounds, cicatrizing processes, burning and as a trombolytic agent. In order to select protease producing yeasts, this study had as objectives to partially characterize the enzyme as for pH and stability temperature and to verify the effect of the enzyme in the degradation of collagen. 50 samples of yeasts isolated from different substrates, obtained from the culture collection DPUA, were analysed. Samples were cultured in Malte extract supplemented with 1,0 % gelatin at 30 ºC in shaking conditions (140 rpm). The qualitative proteolytic activity was determined in agar gelatin-milk medium and the quantitative activity was determined using azocasein 1,0 % as substrate. The best culture conditions to protease production were established for a species, being studied the following parameters: characteristics of pathogenicity, size and age of inoculate, best growth temperature, coal and nitrogen sources. The best stability conditions of protease were assessed for pH (6-12) and temperature (25 º, 37 º, 40 º, 50 º, 60 º, 70 º and 80 ºC) and the effect of the enzyme in the degradation of collagen. Among the identified species, Trichosporon pullulans was selected, because it showed the highest levels of proteolytic activity in qualitative (halo = 27 mm) and quantitative (420 U/mL) assays. The assays to determine the characteristics of pathogenicity of this species showed positive growth at 37ºC, weak positive ureasic activity and there was no phospholipasic activity, the highest proteolytic activity (246,66 U/mL) detected with inoculate corresponded to 10% of the volume of medium and stock of culture growth for 24 hours. Trials to verify the effect of temperature (25 ºC to 50 ºC) on growth and protease production demonstrated that the higher biomass (3,46 mg/mL) and proteolytic activity (513,33 U/mL) were obtained at 30 ºC. Sucrose 1,0 % was the best coal source yielding higher biomass (6,18 mg/mL) and proteasic activity (580 U/mL) and as nitrogen source detached peptone 0,5 % showing the higher values of proteolytic activity (755,55 U/mL) and biomass (7,55 mg/mL). The collagenolytic activity was determined in solid medium using dissolvable collagen as the only coal source. T. pullulans degraded collagen, producing a 28 mm halo. This work demonstrated that protease, with collagenolytic activity; produced by T. pullulans, can be used as therapeutic agent further detailed studies. / As proteases são enzimas que ocupam uma posição central com respeito à aplicação na área médico e industrial. Entre os vários tipos de proteases, utilizadas na indústria farmacêutica e de cosméticos, destacam-se as colagenases utilizadas para amaciamento da pele, higiene oral, na limpeza de feridas purulentas, em processos de cicatrização, queimaduras e como agente anti-trombolítico. Realizou-se este estudo com o objetivo de selecionar leveduras produtoras de proteases, avaliar as melhores condições de crescimento da espécie produtora de protease, caracterizar parcialmente a enzima quanto o pH e temperatura na estabilidade e verificar o efeito desta enzima na degradação do colágeno. Foram analisadas 50 amostras de leveduras isoladas de diferentes substratos, provenientes da coleção de cultura DPUA. As amostras foram cultivadas em extrato de Malte suplementado com gelatina 1,0 % a 30 ºC, sob agitação (140 rpm) por 72 horas. A atividade proteolítica qualitativa foi determinada em meio sólido ágar gelatina-leite e a quantitativa utilizando como substrato azocaseína 1 % p/v. Foram estabelecidas, para a espécie selecionada, as melhores condições de cultivo para produção da protease, foram estudados: características de patogenicidade, tamanho e idade do inóculo, temperatura ótima de crescimento, fontes de carbono e nitrogênio. Foram avaliadas as melhores condições de estabilidade da protease pH (6-12) e temperatura (25 º, 37 º, 40 º, 50 º, 60 º, 70 º e 80 ºC) e também, o efeito da enzima na degradação do colágeno. A determinação da atividade colagenolítica foi realizada em meio sólido utilizando colágeno solúvel como única fonte de carbono. Selecionou-se, entre as espécies identificadas, Trichosporon pullulans (DPUA), por apresentar o maior valor de atividade proteolítica em ensaio qualitativo (halo = 27 mm) e em ensaio quantitativo (420 U/mL). Os experimentos realizados para detectar as características de patogenicidade desta espécie demonstraram crescimento positivo a 37 ºC, atividade ureásica positiva e não foi detectada atividade fosfolipásica; a maior atividade proteolítica (246,66 U/mL) foi detectada com inóculo que correspondeu a 10 % do volume de meio e cultura estoque de 24 horas de crescimento. Os ensaios realizados para verificar o efeito da temperatura no crescimento e na produção da protease demonstraram que a maior biomassa (3,46 mg/mL) e atividade proteolítica (513,33 U/mL) foram obtidas a 30 ºC. A melhor fonte de carbono foi sacarose 1,0 % produzindo maior crescimento (6,18 mg/mL) e maior atividade proteásica (580 U/mL) e como fonte de nitrogênio destacou-se a peptona 0,5 % expressando os maiores valores de atividade proteolítica (755,55 U/mL) e biomassa de 7,55 mg/mL. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a protease produzida por T. pullulans classifica-se como protease alcalina (pH ótimo 8,0). E maior estabilidade térmica da protease foi observada a 37 ºC onde a enzima manteve 100 % de sua atividade durante 40 minutos de incubação. T. pullulans degradou o colágeno produzindo halo de 28 mm. Esse estudo demonstrou que a protease apresenta atividade colagenolítica e poderá ser utilizada como agente terapêutico

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3089_1.pdf: 770384 bytes, checksum: 9c54cc6a2a126071254fd185f79c29bd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As colagenases são enzimas, obtidas a partir de procariotos e eucariotos, que clivam a cadeia protéica do colágeno em pH e temperatura fisiológicos. Estas enzimas são empregadas em diversas aplicações industriais com destaque para a indústria farmacêutica, onde são aplicadas no tratamento médico de feridas, cicatrizes e queimaduras. A proposta para a utilização do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é devido à alta relação custo-benefício, baixa tensão interfacial, fácil escalonamento e a sua capacidade de purificar uma proteína em um ambiente rico em água (80-90%), o que favorece a estrutura protéica e retém assim a sua atividade biológica após purificação. Este trabalho visa à purificação de colagenase produzida por Penicillium aurantiogriseum (URM-4622) utilizando SDFA PEG/fosfato. O planejamento experimental (23) foi usado para selecionar as variáveis significativas no processo de purificação, e a massa molar do PEG (MMPEG), concentração do PEG (CPEG) e concentração do fosfato (CFOS) foram as variáveis estudadas. O sistema de duas fases aquosas foi composto de PEG 550, 1500 e 4000 g/mol nas concentrações de 15, 17,5 e 20% (m/m) e concentrações de fosfato de 12,5, 15 e 17,5% (m/m). As variáveis de resposta escolhidas foram: coeficiente de partição (K), rendimento de atividade (Y) e fator de purificação (PF). Os dados e gráficos obtidos passaram por análise estatística. Observou-se que PEG de massa molar 550 (g/mol) em concentração de 20% (p/p), concentração de fosfato 17,5% (p/p) e pH 6.0 foram as melhores condições para purificação de colagenase. Estas condições geraram um coeficiente de partição de 1,01, um rendimento de atividade de 242% e fator de purificação de 23,5. Os resultados mostraram que SDFA foi seletivo para colagenase e esta enzima particionou para a fase rica em polímero

A leptospirose é uma zoonose, amplamente difundida pelo mundo, causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais silvestres e domésticos. A transmissão ocorre, principalmente, pelo contato direto com água e solo contaminados com a urina de animais infectados que podem ser clinicamente assintomáticos. As leptospiras patogênicas invadem os tecidos do hospedeiro através da penetração da pele lesada ou mucosas da boca, narina e olhos. Logo após ultrapassar as superfícies de contato, as bactérias chegam rapidamente à corrente sanguínea e espalham-se para todos os órgãos causando lesões, principalmente, no fígado e rins onde produzem hemorragia e necrose tecidual. Após a entrada no hospedeiro, a progressão da infecção envolve a adesão das bactérias às células eucarióticas e às proteínas de matriz extracelular seguida pela invasão aos tecidos. Estudos recentes demonstraram que as leptospiras são capazes de se translocarem através das monocamadas celulares, o que poderia ser um mecanismo de evasão do sistema imune e também facilitaria a entrada e saída da corrente sanguínea para infectar órgãos-alvo. O mecanismo envolvido na invasão do patógeno através das barreiras extracelulares não está bem elucidado. Enzimas capazes de degradar proteínas da matriz extracelular poderiam contribuir com a motilidade e quimiotaxia das bactérias durante a invasão. Bactérias patogênicas sintetizam e secretam diferentes tipos de proteases, que atuam degradando colágeno e glicoproteínas entre outras proteínas do hospedeiro. Recentemente, um estudo, utilizando gelatina e caseína como substratos e lisado bacteriano, mostrou haver uma variedade de proteases em Leptospira spp. Análises do genoma indicam a presença de vários genes que codificam prováveis proteases. A comprovação experimental da existência e a caracterização funcional destas proteínas poderão contribuir no entendimento da patogenia da leptospirose. Neste sentido, este trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e caracterização funcional de uma provável colagenase (ColA) de L.interrogans sorovar Copenhageni. As sequências codificantes do domínio de colagenase 1 (D1), do domínio de colagenase 2 (D2) e de ambos os domínios (Full) da ColA foram amplificadas por PCR a partir de DNA genômico de Leptospira e clonadas no vetor de expressão pAE. Os fragmentos D1, D2 e Full da ColA foram expressos em E. coli BL21 - SI e purificados a partir das frações insolúveis por cromatografia de afinidade a níquel. Os fragmentos recombinantes purificados foram utilizados na obtenção dos antissoros policlonais, e as atividades enzimáticas de cada um foram avaliadas. Os antissoros policlonais produzidos em coelho apresentaram elevados níveis de anticorpos detectados por ELISA. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína ColA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. As proteínas Full e D2 apresentaram atividade catalítica sobre o colágeno desnaturado e sobre peptídeo sintético e atividade hemorrágica em camundongos. Estes resultados indicam que ColA é provavelmente uma proteína de leptospira envolvidas na invasão de tecidos do hospedeiro. / Leptospirosis is a zoonosis widespread throughout the world, caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, which colonize the renal tubules of wild and domestic animals. Transmission occurs mainly through direct contact with water and soil contaminated with urine of infected animals that may be clinically asymptomatic. Pathogenic leptospires invade host tissues by penetrating damaged skin or the mucous membranes of the mouth, nostrils and eyes. Soon after passing the contact surfaces, leptospires come quickly into the bloodstream and spread to all organs causing damage mainly in the liver and kidneys where they produce hemorrhage and tissue necrosis after entering the host, the progression of the infection involves the adhesion of bacteria to eukaryotic cells and extracellular matrix proteins followed by invasion of tissues. Recent studies have shown that leptospires are able to translocate across cell monolayers, which could be a mechanism for evasion of the immune system and also facilitate the entry and exit from the bloodstream to infect target organs. The mechanism involved in pathogen invasion through extracellular barriers is not well elucidated. Enzymes capable of degrading extracellular matrix proteins could contribute to motility and chemotaxis of bacteria during the invasion. Pathogenic bacteria synthesize and secrete different types of proteases that degrade collagen and glycoproteins among other host proteins. Recently, a study using gelatin and casein as substrates and bacterial lysate showed a variety of proteases in Leptospira spp. Analysis of the genome indicate the presence of several genes encoding probable protease. The experimental proof of the existence and functional characterization of these proteins may contribute to the understanding of the pathogenesis of leptospirosis. In this sense, this work aimed the cloning, expression and functional characterization of a probable collagenase (ColA) from L.interrogans serovar Copenhageni. Coding sequences of the collagenase domain 1 (D1), collagenase domain 2 (D2), and both domains (Full) of the ColA gene were amplified by PCR from genomic Leptospira DNA and cloned into the pAE expression vector. The D1, D2 and Full fragments of ColA protein were expressed in E. coli BL21-SI and purified from the insoluble fractions by nickel affinity chromatography. The purified fragments were used to obtain the polyclonal antiserum, and their enzymatic activities were evaluated by zymography. Rabbit polyclonal antiserum against the recombinant protein fragments were produced with a high antibody level detected by ELISA. Western-blotting experiments demonstrated the presence of ColA protein in different pathogenic serovars of Leptospira. The Full and D2 proteins showed catalytic activity on denatured collagen and synthetic peptide and hemorrhagic activity in mice. These results indicated that ColA is probably a leptospiral protein involved in invasion of host tissues.

A leptospirose é uma zoonose, amplamente difundida pelo mundo, causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais silvestres e domésticos. A transmissão ocorre, principalmente, pelo contato direto com água e solo contaminados com a urina de animais infectados que podem ser clinicamente assintomáticos. As leptospiras patogênicas invadem os tecidos do hospedeiro através da penetração da pele lesada ou mucosas da boca, narina e olhos. Logo após ultrapassar as superfícies de contato, as bactérias chegam rapidamente à corrente sanguínea e espalham-se para todos os órgãos causando lesões, principalmente, no fígado e rins onde produzem hemorragia e necrose tecidual. Após a entrada no hospedeiro, a progressão da infecção envolve a adesão das bactérias às células eucarióticas e às proteínas de matriz extracelular seguida pela invasão aos tecidos. Estudos recentes demonstraram que as leptospiras são capazes de se translocarem através das monocamadas celulares, o que poderia ser um mecanismo de evasão do sistema imune e também facilitaria a entrada e saída da corrente sanguínea para infectar órgãos-alvo. O mecanismo envolvido na invasão do patógeno através das barreiras extracelulares não está bem elucidado. Enzimas capazes de degradar proteínas da matriz extracelular poderiam contribuir com a motilidade e quimiotaxia das bactérias durante a invasão. Bactérias patogênicas sintetizam e secretam diferentes tipos de proteases, que atuam degradando colágeno e glicoproteínas entre outras proteínas do hospedeiro. Recentemente, um estudo, utilizando gelatina e caseína como substratos e lisado bacteriano, mostrou haver uma variedade de proteases em Leptospira spp. Análises do genoma indicam a presença de vários genes que codificam prováveis proteases. A comprovação experimental da existência e a caracterização funcional destas proteínas poderão contribuir no entendimento da patogenia da leptospirose. Neste sentido, este trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e caracterização funcional de uma provável colagenase (ColA) de L.interrogans sorovar Copenhageni. As sequências codificantes do domínio de colagenase 1 (D1), do domínio de colagenase 2 (D2) e de ambos os domínios (Full) da ColA foram amplificadas por PCR a partir de DNA genômico de Leptospira e clonadas no vetor de expressão pAE. Os fragmentos D1, D2 e Full da ColA foram expressos em E. coli BL21 - SI e purificados a partir das frações insolúveis por cromatografia de afinidade a níquel. Os fragmentos recombinantes purificados foram utilizados na obtenção dos antissoros policlonais, e as atividades enzimáticas de cada um foram avaliadas. Os antissoros policlonais produzidos em coelho apresentaram elevados níveis de anticorpos detectados por ELISA. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína ColA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. As proteínas Full e D2 apresentaram atividade catalítica sobre o colágeno desnaturado e sobre peptídeo sintético e atividade hemorrágica em camundongos. Estes resultados indicam que ColA é provavelmente uma proteína de leptospira envolvidas na invasão de tecidos do hospedeiro. / Leptospirosis is a zoonosis widespread throughout the world, caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, which colonize the renal tubules of wild and domestic animals. Transmission occurs mainly through direct contact with water and soil contaminated with urine of infected animals that may be clinically asymptomatic. Pathogenic leptospires invade host tissues by penetrating damaged skin or the mucous membranes of the mouth, nostrils and eyes. Soon after passing the contact surfaces, leptospires come quickly into the bloodstream and spread to all organs causing damage mainly in the liver and kidneys where they produce hemorrhage and tissue necrosis after entering the host, the progression of the infection involves the adhesion of bacteria to eukaryotic cells and extracellular matrix proteins followed by invasion of tissues. Recent studies have shown that leptospires are able to translocate across cell monolayers, which could be a mechanism for evasion of the immune system and also facilitate the entry and exit from the bloodstream to infect target organs. The mechanism involved in pathogen invasion through extracellular barriers is not well elucidated. Enzymes capable of degrading extracellular matrix proteins could contribute to motility and chemotaxis of bacteria during the invasion. Pathogenic bacteria synthesize and secrete different types of proteases that degrade collagen and glycoproteins among other host proteins. Recently, a study using gelatin and casein as substrates and bacterial lysate showed a variety of proteases in Leptospira spp. Analysis of the genome indicate the presence of several genes encoding probable protease. The experimental proof of the existence and functional characterization of these proteins may contribute to the understanding of the pathogenesis of leptospirosis. In this sense, this work aimed the cloning, expression and functional characterization of a probable collagenase (ColA) from L.interrogans serovar Copenhageni. Coding sequences of the collagenase domain 1 (D1), collagenase domain 2 (D2), and both domains (Full) of the ColA gene were amplified by PCR from genomic Leptospira DNA and cloned into the pAE expression vector. The D1, D2 and Full fragments of ColA protein were expressed in E. coli BL21-SI and purified from the insoluble fractions by nickel affinity chromatography. The purified fragments were used to obtain the polyclonal antiserum, and their enzymatic activities were evaluated by zymography. Rabbit polyclonal antiserum against the recombinant protein fragments were produced with a high antibody level detected by ELISA. Western-blotting experiments demonstrated the presence of ColA protein in different pathogenic serovars of Leptospira. The Full and D2 proteins showed catalytic activity on denatured collagen and synthetic peptide and hemorrhagic activity in mice. These results indicated that ColA is probably a leptospiral protein involved in invasion of host tissues.

As metaloproteinases da matriz (MMPs) foram relacionadas a diversas doenças inflamatórias como artrite e também ao câncer. O presente trabalho tem por objetivo estabelecer o papel da MMP-2, MMP-9 e MMP-8 no processo de inflamação pulpar. Foram adotadas as seguintes hipóteses nulas: (1) o padrão de expressão das MMP-2, MMP-9 e MMP-8 não sofre alteração nos diferentes estágios da polpa humana: normal, reversível, transição, irreversível ou necrose; (2) não há diferença de expressão das MMP-2, -9 e MMP-8, considerando-se um mesmo estágio de inflamação tecidual pulpar. Os métodos utilizados foram: (I) Obtenção dos espécimes, que foram divididos em grupos de acordo com critérios adotados de semiologia subjetiva e objetiva. Obtiveram-se os seguintes grupos: GI (Controle) dentes hígidos (n=7); GII (Pulpite Reversível n=4); GIII (Pulpite Transição n=4); GIV (Pulpite Irreversível/Necrose n=8). Logo após exodontia, os dentes obtidos foram cortados ligeiramente abaixo da junção amelodentinária e fixados em formol a 10% por 48h. Foram lavados em água corrente (24h) para então serem processados histologicamente. Foram obtidas secções de 4m, aderidas em lâminas silanizadas e submetidas à imunomarcação (Técnica da Peroxidase), utilizando os anticorpos anti MMP-2, MMP-9 e MMP-8 humanos. A presença de imunomarcação foi realizada através da análise semi-quantitativa por escores, sendo que a quantificação de marcação por corte seguiu o seguinte escore: 0= ausente; 1= leve; 2= moderada; 3= intensa. Realizou-se teste estatístico não paramétrico Kruskal-Wallis, p<0,05. As comparações intergrupos revelaram, para CO: (1)MMP-2 - GI=GII=GIII, GIII=GIV, GI>GIV (p<0,01) e GII>GIV (p<0,05); (2)MMP-9 GI=GII=GIV, GII=GIII e GIII>GI (p<0,01); (3)MMP-8 GI=GII=GIII=GIV. Na região central da polpa, obteve-se: (1)MMP-2 GI=GII=GIII, GIII=GIV, GI>GIV (p<0,001) e GII>GIV (p<0,01); (2)MMP-9 GI=GII=GIII, GIII=GIV, GIV>GI (p<0,001) e GIV>GII (p<0,01); (3)MMP-8 GI=GII, GIII=GIV, GIII>GI (p<0,05), GIV>GI (p<0,01), GIII>GII (p<0,05) e GIV>GII (p<0,05). Quanto às comparações intragrupos, na CO mostraram: (1)GI - MMP-2>MMP9 (p<0,001), MMP-2=MMP-8 e MMP-9=MMP-8; (2)GII MMP-2>MMP-9 (p<0,01); MMP-2=MMP-8 e MMP-9=MMP-8; (3)GIII e GIV MMP-2=MMP-9=MMP-8. Para a região mais central da polpa: (1)GI e GII MMP-2=MMP-9=MMP-8; (2)GIII MMP9>MMP-2 (p<0,05), MMP- 2=MMP-8 e MMP-9=MMP-8; (3)GIV MMP-9>MMP-2 (p<0,01), MMP-2=MMP-8 e MMP-9=MMP-8. Sendo assim, as duas hipóstese nulas foram rejeitadas. Conclui-se ainda que MMP-2, MMP-9 e MMP-8 atuam no processo de inflamação pulpar de maneira distinta na CO e polpa central; MMP-2 é mais expressa em polpa sadia; a maior expressão de MMP-9 relaciona-se à presença de inflamação pulpar; em polpas inflamadas, a expressão de MMP- 8 é maior quando comparadas a polpas normal, embora tal enzima seja também levemente expressada em tecido pulpar normal. / The matrix metalloproteinases (MMPs) have been related to various inflammatory diseases, such as arthritis, as well as to cancer. The aim of the present study was to establish the role of MMP-2, MMP-9 and MMP-8 in the process of dental pulp inflammation. The following null hypotheses were adopted: (1) the pattern of MMP-2, MMP-9 and MMP-8 expression does not undergo alteration in the following different stages of human pulp: normal, reversible, transition, irreversible or necrosis; (2) there is no difference in the expression of MMP-2, -9 and MMP-8, when considering the same stage of pulp tissue inflammation. The methods used were: (I) Obtainment of specimens, which were divided into groups according to the subjective and objective criteria of semiology adopted. The following groups were obtained: GI (Control) healthy teeth (n=7); GII (Reversible Pulpitis n=4); GIII (Transition Pulpitis n=4); GIV (Irreversible Pulpitis/Necrosis n=8). Soon after extraction the teeth obtained were cut slightly below the amelodentinal junction and fixed in 10% formol for 48h. They were washed under running water (24h) and were histologically processed afterwards. Sections of 4m were obtained, adhered to silanized slides, and submitted to immunomarking (Peroxidase Technique), using human anti MMP-2, MMP-9 and MMP- 8 antibodies. The presence of immunomarking was determined through semi-quantitative analysis by scores, and marking by cut was quantified using the following score: 0= absent; 1= slight; 2= moderate; 3= intense. The Kruskal-Wallis non-parametric statistical test was performed, p<0.05. Intergroup comparisons revealed the following: for CO: (1)MMP-2 - GI=GII=GIII, GIII=GIV, GI>GIV (p<0.01) and GII>GIV (p<0.05); (2)MMP-9 GI=GII=GIV, GII=GIII and GIII>GI (p<0,01); (3)MMP-8 GI=GII=GIII=GIV. In the central region of the pulp, the following results were obtained: (1)MMP-2 GI=GII=GIII, GIII=GIV, GI>GIV (p<0.001) and GII>GIV (p<0.01); (2)MMP-9 GI=GII=GIII, GIII=GIV, GIV>GI (p<0.001) and GIV>GII (p<0.01); (3)MMP-8 GI=GII, GIII=GIV, GIII>GI (p<0.05), GIV>GI (p<0.01), GIII>GII (p<0.05) and GIV>GII (p<0.05). With regard to intragroup comparisons, in CO the following were shown: (1)GI - MMP-2>MMP9 (p<0.001), MMP-2=MMP-8 and MMP-9=MMP-8; (2)GII MMP-2>MMP-9 (p<0.01); MMP-2=MMP-8 and MMP-9=MMP-8; (3)GIII and GIV MMP- 2=MMP-9=MMP-8. For the most central region of the pulp: (1)GI and GII MMP-2=MMP- 9=MMP-8; (2)GIII MMP9>MMP-2 (p<0.05), MMP-2=MMP-8 and MMP-9=MMP-8; (3)GIV MMP-9>MMP-2 (p<0.01), MMP-2=MMP-8 and MMP-9=MMP-8. Therefore, the two null hypotheses were rejected. Moreover, it was concluded that MMP-2, MMP-9 and MMP-8 act in the process of pulp inflammation in a distinct manner in CO and central pulp; more MMP-2 is expressed in healthy pulp; the highest expression of MMP-9 is related to the presence of pulp inflammation; in inflamed pulp, the expression of MMP-8 is higher when compared with that of normal pulp, although this enzyme is also slightly expressed in normal pulp tissue.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:06:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000411483-Texto+Completo-0.pdf: 9511623 bytes, checksum: 6e96dbea5095542343d03d019de7bb7c (MD5) Previous issue date: 2009 / Introduction: Hemorrhage subependymal layer/intraventricular, also called the germinal matrix hemorrhage occurs in premature infants with less than 34 weeks and 1500 grams or below. The development of models for understanding the evolution of brain damage before and after the hemorrhage is important to determine strategies for treatment of disease. Objective: Developing a neonatal experimental model of hemorrhage subependymal layerintraventricular in newborn rats by collagenase type VII and evaluate the outcomes of the injury through neuromotor tests, cognitive test, and macroscopic and microscopic evaluation of subgroups: negative control, saline group and collagenase. Method: Rats were subjected to the P6 hemorrhage by free hand technique (freehand) through an injection with intracranial collagenase type VII; one group caused a unilateral hemorrhage in another bilateral hemorrhage. They were evaluated with neuromotor and cognitive tests in P7, P11, P15 and P30. After the neuromotor and cognitive test, macroscopic and histological examinations were performed. A group of animals also were evaluated histologically in P7 hemorrhage after injury. Results: It was possible to cause injury to the germinal matrix with collagenase type VII, and easy to play. Neuromotor changes as ambulation; negative geotaxis, surface righting, and forelimb grip have a significant value in the acute phase. But the test of the cylinder and the test of recognition of objects were not statistically significant. The test of the open field was significant, for the group with bilateral hemorrhage. We found decrease in the volume of encephalon and the germinal matrix lesion in histological evaluation. Conclusion: The model of hemorrhage subependymal layer/intraventricular in newborn rats (P6) was established using the collagenase type VII, and easy to implement. There was no significant difference in cognitive evaluation and the neuromotor changes are remarkable in the acute phase. Histological evaluation showed changes similar to those of humans. Reduction in the volume of the encephalon in the hemisphere corresponding to the lesion. / Introdução: A hemorragia subependimária-intraventricular, também chamada de hemorragia da matriz germinativa, ocorre, em pré-termos com menos de 34 semanas e/ou abaixo de 1500 gramas. O desenvolvimento de modelos para entender a evolução da lesão cerebral antes e depois da hemorragia é importante para determinar estratégias de tratamento da doença. Objetivo: desenvolver um modelo experimental neonatal de hemorragia subependimária-intraventricular em ratos recém-nascidos, através da colagenase tipo VII e avaliar os desfechos da lesão através de testes neuromotores, cognitivos e avaliação macroscópica e microscópica dos subgrupos: controle negativo, grupo salina e colagenase. Método: Ratos Wistar no P6 foram submetidos à hemorragia pela técnica da mão livre (freehand) através de uma injeção intracraniana com colaganese tipo VII. Num grupo foi provocada hemorragia unilateral, e, em outro, hemorragia bilateral. Os mesmos foram avaliados com testes neuromotores e cognitivos (P7, P11, P15 e P30). Após os testes neuromotores e cognitivos, foram realizadas as avaliações macroscópicas e histológicas. Um grupo de animais também foi avaliado histologicamente no P7 após a lesão hemorrágica. Resultados: Foi possível provocar lesão na matriz germinativa com colagenase tipo VII, sendo fácil de reproduzir. As alterações neuromotoras, como ambulação, geotaxia negativa, reflexo de endireitamento e o teste de preensão das patas anteriores apresentaram valores significativos na fase aguda. Já o teste do cilindro e o reconhecimento de objeto não foram estatisticamente significativos. O teste do campo aberto foi significativo para o grupo com hemorragia bilateral. Encontramos diminuição do volume do encéfalo e lesão da matriz germinativa na avaliação histológica. Conclusão: O modelo de hemorragia subependimária-intraventricular em ratos Wistar recém-nascidos (P6) foi estabelecida utilizando a colagenase tipo VII, sendo de fácil execução. Não houve diferença significativa na avaliação cognitiva e as alterações neuromotoras são notáveis na fase aguda. A avaliação histológica evidenciou alterações semelhantes às do humano. Houve redução do volume do encéfalo na região do hemisfério correspondente à lesão.

As metaloproteinases da matriz (MMPs) foram relacionadas a diversas doenças inflamatórias como artrite e também ao câncer. O presente trabalho tem por objetivo estabelecer o papel da MMP-2, MMP-9 e MMP-8 no processo de inflamação pulpar. Foram adotadas as seguintes hipóteses nulas: (1) o padrão de expressão das MMP-2, MMP-9 e MMP-8 não sofre alteração nos diferentes estágios da polpa humana: normal, reversível, transição, irreversível ou necrose; (2) não há diferença de expressão das MMP-2, -9 e MMP-8, considerando-se um mesmo estágio de inflamação tecidual pulpar. Os métodos utilizados foram: (I) Obtenção dos espécimes, que foram divididos em grupos de acordo com critérios adotados de semiologia subjetiva e objetiva. Obtiveram-se os seguintes grupos: GI (Controle) dentes hígidos (n=7); GII (Pulpite Reversível n=4); GIII (Pulpite Transição n=4); GIV (Pulpite Irreversível/Necrose n=8). Logo após exodontia, os dentes obtidos foram cortados ligeiramente abaixo da junção amelodentinária e fixados em formol a 10% por 48h. Foram lavados em água corrente (24h) para então serem processados histologicamente. Foram obtidas secções de 4m, aderidas em lâminas silanizadas e submetidas à imunomarcação (Técnica da Peroxidase), utilizando os anticorpos anti MMP-2, MMP-9 e MMP-8 humanos. A presença de imunomarcação foi realizada através da análise semi-quantitativa por escores, sendo que a quantificação de marcação por corte seguiu o seguinte escore: 0= ausente; 1= leve; 2= moderada; 3= intensa. Realizou-se teste estatístico não paramétrico Kruskal-Wallis, p<0,05. As comparações intergrupos revelaram, para CO: (1)MMP-2 - GI=GII=GIII, GIII=GIV, GI>GIV (p<0,01) e GII>GIV (p<0,05); (2)MMP-9 GI=GII=GIV, GII=GIII e GIII>GI (p<0,01); (3)MMP-8 GI=GII=GIII=GIV. Na região central da polpa, obteve-se: (1)MMP-2 GI=GII=GIII, GIII=GIV, GI>GIV (p<0,001) e GII>GIV (p<0,01); (2)MMP-9 GI=GII=GIII, GIII=GIV, GIV>GI (p<0,001) e GIV>GII (p<0,01); (3)MMP-8 GI=GII, GIII=GIV, GIII>GI (p<0,05), GIV>GI (p<0,01), GIII>GII (p<0,05) e GIV>GII (p<0,05). Quanto às comparações intragrupos, na CO mostraram: (1)GI - MMP-2>MMP9 (p<0,001), MMP-2=MMP-8 e MMP-9=MMP-8; (2)GII MMP-2>MMP-9 (p<0,01); MMP-2=MMP-8 e MMP-9=MMP-8; (3)GIII e GIV MMP-2=MMP-9=MMP-8. Para a região mais central da polpa: (1)GI e GII MMP-2=MMP-9=MMP-8; (2)GIII MMP9>MMP-2 (p<0,05), MMP- 2=MMP-8 e MMP-9=MMP-8; (3)GIV MMP-9>MMP-2 (p<0,01), MMP-2=MMP-8 e MMP-9=MMP-8. Sendo assim, as duas hipóstese nulas foram rejeitadas. Conclui-se ainda que MMP-2, MMP-9 e MMP-8 atuam no processo de inflamação pulpar de maneira distinta na CO e polpa central; MMP-2 é mais expressa em polpa sadia; a maior expressão de MMP-9 relaciona-se à presença de inflamação pulpar; em polpas inflamadas, a expressão de MMP- 8 é maior quando comparadas a polpas normal, embora tal enzima seja também levemente expressada em tecido pulpar normal. / The matrix metalloproteinases (MMPs) have been related to various inflammatory diseases, such as arthritis, as well as to cancer. The aim of the present study was to establish the role of MMP-2, MMP-9 and MMP-8 in the process of dental pulp inflammation. The following null hypotheses were adopted: (1) the pattern of MMP-2, MMP-9 and MMP-8 expression does not undergo alteration in the following different stages of human pulp: normal, reversible, transition, irreversible or necrosis; (2) there is no difference in the expression of MMP-2, -9 and MMP-8, when considering the same stage of pulp tissue inflammation. The methods used were: (I) Obtainment of specimens, which were divided into groups according to the subjective and objective criteria of semiology adopted. The following groups were obtained: GI (Control) healthy teeth (n=7); GII (Reversible Pulpitis n=4); GIII (Transition Pulpitis n=4); GIV (Irreversible Pulpitis/Necrosis n=8). Soon after extraction the teeth obtained were cut slightly below the amelodentinal junction and fixed in 10% formol for 48h. They were washed under running water (24h) and were histologically processed afterwards. Sections of 4m were obtained, adhered to silanized slides, and submitted to immunomarking (Peroxidase Technique), using human anti MMP-2, MMP-9 and MMP- 8 antibodies. The presence of immunomarking was determined through semi-quantitative analysis by scores, and marking by cut was quantified using the following score: 0= absent; 1= slight; 2= moderate; 3= intense. The Kruskal-Wallis non-parametric statistical test was performed, p<0.05. Intergroup comparisons revealed the following: for CO: (1)MMP-2 - GI=GII=GIII, GIII=GIV, GI>GIV (p<0.01) and GII>GIV (p<0.05); (2)MMP-9 GI=GII=GIV, GII=GIII and GIII>GI (p<0,01); (3)MMP-8 GI=GII=GIII=GIV. In the central region of the pulp, the following results were obtained: (1)MMP-2 GI=GII=GIII, GIII=GIV, GI>GIV (p<0.001) and GII>GIV (p<0.01); (2)MMP-9 GI=GII=GIII, GIII=GIV, GIV>GI (p<0.001) and GIV>GII (p<0.01); (3)MMP-8 GI=GII, GIII=GIV, GIII>GI (p<0.05), GIV>GI (p<0.01), GIII>GII (p<0.05) and GIV>GII (p<0.05). With regard to intragroup comparisons, in CO the following were shown: (1)GI - MMP-2>MMP9 (p<0.001), MMP-2=MMP-8 and MMP-9=MMP-8; (2)GII MMP-2>MMP-9 (p<0.01); MMP-2=MMP-8 and MMP-9=MMP-8; (3)GIII and GIV MMP- 2=MMP-9=MMP-8. For the most central region of the pulp: (1)GI and GII MMP-2=MMP- 9=MMP-8; (2)GIII MMP9>MMP-2 (p<0.05), MMP-2=MMP-8 and MMP-9=MMP-8; (3)GIV MMP-9>MMP-2 (p<0.01), MMP-2=MMP-8 and MMP-9=MMP-8. Therefore, the two null hypotheses were rejected. Moreover, it was concluded that MMP-2, MMP-9 and MMP-8 act in the process of pulp inflammation in a distinct manner in CO and central pulp; more MMP-2 is expressed in healthy pulp; the highest expression of MMP-9 is related to the presence of pulp inflammation; in inflamed pulp, the expression of MMP-8 is higher when compared with that of normal pulp, although this enzyme is also slightly expressed in normal pulp tissue.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-23Bitstream added on 2014-06-13T20:21:52Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_am_dr_botfmvz_parcial.pdf: 86138 bytes, checksum: d515fed4a55e2525dda1d5a656ecfe36 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-04T11:39:27Z: carvalho_am_dr_botfmvz_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-02-04T11:40:12Z : No. of bitstreams: 1 000712006.pdf: 483818 bytes, checksum: c5b2ca06d97c52e38a0b52ec53856bd6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A lesão do tendão flexor digital superficial (TFDS) é uma importante causa de claudicação em equinos. Embora existam diversos tratamentos descritos, poucos são eficazes na melhora significativa da qualidade da matriz extracelular. Recentemente, diversos experimentos vêm focando no potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais (CTMs) e do plasma rico em plaquetas (PRP) em casos de lesões de difícil cicatrização. O objetivo geral deste estudo foi a obtenção, cultivo e caracterização das células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdCTMS), a adoção de uma nova técnica de indução de lesão tendínea utilizando colagenase em gel e a avaliação da reparação tendínea após terapia com a associação terapêutica de AdCTMs e PRP através da análise clínica, ultrassonográfica, histopatológica, imunoistoquímica (colágeno tipo III e fator VIII) e da expressão gênica (COL1A1, COL3A1, TNC, TNMD, SCX). Foi possível isolar e cultivar as AdCTMs, concluir sua caracterização através da diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica, além da confirmação da expressão destas células aos marcadores CD44, CD90 e CD105 na citometria de fluxo. A indução da lesão do TFDS foi realizada com sucesso, sendo observado na avaliação clínica e ultrassonográfica o desenvolvimento de tendinite focal similar a lesão de ocorrência natural. O uso das AdCTMs associadas ao PRP demonstrou ser viável e resultou na prevenção da progressão da área da lesão no grupo tratado na avaliação ultrassonográfica, maior fluxo sanguíneo do grupo tratado na avaliação com Power Doppler, e melhora da organização cicatricial, com diminuição do infiltrado inflamatório na avaliação histopatológica. Não foram observadas diferenças entre os grupos... / Superficial digital flexor tendon (SDFT) lesion is an important cause of lameness in horses. Although there are many treatments described, few are effective in maintain the quality of the extracellular matrix. Recently several studies have focused on the therapeutic potential of mesenchymal stem cells (MSCs) and platelet-rich plasma (PRP) in some damage tissues. The aim of this study was to perform the isolation, cultivation and characterization of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AdMSCs), the adoption of a new tendon lesion induction technique using collagenase in gel, and evaluation of tendon repair after treatment with the AdMSCs and PRP association by clinical, ultrasonographic, histopathological, immunohistochemical (collagen type III and factor VIII) and gene expression (COL1A1, COL3A1, TNC, TNMD, SCX) analysis. It was possible to isolate, cultivate and perform the characterization of AdMSCs by adipogenic, osteogenic, chondrogenic differentiation, and to confirm the expression of CD44, CD90 and CD105 cell markers on flow cytometry. The SDFT injury induction was successful observed in clinical and ultrasonographic evaluation, with development of focal lesion similar to naturally occurring. The use of AdMSCs and PRP association proved to be feasible and resulted in preventing the progression of the lesion area in the treated group on ultrasound evaluation, increased blood flow on the Power Doppler evaluation and decreased inflammatory infiltrate and improved the organization on histopathological evaluation. No differences were observed between the groups regarding the immunohistochemistry evaluation and the expression of the tested genes. It can be concluded based on the results observed: (1) that the AdMSCs were properly processed and characterized with the methods employed; (2) tendon.. (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Coorientador: Carlos Alberto Hussni / Banca: Alexandre Secorun Borges / Banca: Elenice Deffune / Banca: Anna Paula Balesdent Barreira / Banca: Rafael Resende Faleiros / Resumo: A lesão do tendão flexor digital superficial (TFDS) é uma importante causa de claudicação em equinos. Embora existam diversos tratamentos descritos, poucos são eficazes na melhora significativa da qualidade da matriz extracelular. Recentemente, diversos experimentos vêm focando no potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais (CTMs) e do plasma rico em plaquetas (PRP) em casos de lesões de difícil cicatrização. O objetivo geral deste estudo foi a obtenção, cultivo e caracterização das células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdCTMS), a adoção de uma nova técnica de indução de lesão tendínea utilizando colagenase em gel e a avaliação da reparação tendínea após terapia com a associação terapêutica de AdCTMs e PRP através da análise clínica, ultrassonográfica, histopatológica, imunoistoquímica (colágeno tipo III e fator VIII) e da expressão gênica (COL1A1, COL3A1, TNC, TNMD, SCX). Foi possível isolar e cultivar as AdCTMs, concluir sua caracterização através da diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica, além da confirmação da expressão destas células aos marcadores CD44, CD90 e CD105 na citometria de fluxo. A indução da lesão do TFDS foi realizada com sucesso, sendo observado na avaliação clínica e ultrassonográfica o desenvolvimento de tendinite focal similar a lesão de ocorrência natural. O uso das AdCTMs associadas ao PRP demonstrou ser viável e resultou na prevenção da progressão da área da lesão no grupo tratado na avaliação ultrassonográfica, maior fluxo sanguíneo do grupo tratado na avaliação com Power Doppler, e melhora da organização cicatricial, com diminuição do infiltrado inflamatório na avaliação histopatológica. Não foram observadas diferenças entre os grupos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Superficial digital flexor tendon (SDFT) lesion is an important cause of lameness in horses. Although there are many treatments described, few are effective in maintain the quality of the extracellular matrix. Recently several studies have focused on the therapeutic potential of mesenchymal stem cells (MSCs) and platelet-rich plasma (PRP) in some damage tissues. The aim of this study was to perform the isolation, cultivation and characterization of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AdMSCs), the adoption of a new tendon lesion induction technique using collagenase in gel, and evaluation of tendon repair after treatment with the AdMSCs and PRP association by clinical, ultrasonographic, histopathological, immunohistochemical (collagen type III and factor VIII) and gene expression (COL1A1, COL3A1, TNC, TNMD, SCX) analysis. It was possible to isolate, cultivate and perform the characterization of AdMSCs by adipogenic, osteogenic, chondrogenic differentiation, and to confirm the expression of CD44, CD90 and CD105 cell markers on flow cytometry. The SDFT injury induction was successful observed in clinical and ultrasonographic evaluation, with development of focal lesion similar to naturally occurring. The use of AdMSCs and PRP association proved to be feasible and resulted in preventing the progression of the lesion area in the treated group on ultrasound evaluation, increased blood flow on the Power Doppler evaluation and decreased inflammatory infiltrate and improved the organization on histopathological evaluation. No differences were observed between the groups regarding the immunohistochemistry evaluation and the expression of the tested genes. It can be concluded based on the results observed: (1) that the AdMSCs were properly processed and characterized with the methods employed; (2) tendon.. (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:32:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 411483.pdf: 9511623 bytes, checksum: 6e96dbea5095542343d03d019de7bb7c (MD5) Previous issue date: 2009-03-02 / Introdu??o: A hemorragia subependim?ria-intraventricular, tamb?m chamada de hemorragia da matriz germinativa, ocorre, em pr?-termos com menos de 34 semanas e/ou abaixo de 1500 gramas. O desenvolvimento de modelos para entender a evolu??o da les?o cerebral antes e depois da hemorragia ? importante para determinar estrat?gias de tratamento da doen?a. Objetivo: desenvolver um modelo experimental neonatal de hemorragia subependim?ria-intraventricular em ratos rec?m-nascidos, atrav?s da colagenase tipo VII e avaliar os desfechos da les?o atrav?s de testes neuromotores, cognitivos e avalia??o macrosc?pica e microsc?pica dos subgrupos: controle negativo, grupo salina e colagenase. M?todo: Ratos Wistar no P6 foram submetidos ? hemorragia pela t?cnica da m?o livre (freehand) atrav?s de uma inje??o intracraniana com colaganese tipo VII. Num grupo foi provocada hemorragia unilateral, e, em outro, hemorragia bilateral. Os mesmos foram avaliados com testes neuromotores e cognitivos (P7, P11, P15 e P30). Ap?s os testes neuromotores e cognitivos, foram realizadas as avalia??es macrosc?picas e histol?gicas. Um grupo de animais tamb?m foi avaliado histologicamente no P7 ap?s a les?o hemorr?gica. Resultados: Foi poss?vel provocar les?o na matriz germinativa com colagenase tipo VII, sendo f?cil de reproduzir. As altera??es neuromotoras, como ambula??o, geotaxia negativa, reflexo de endireitamento e o teste de preens?o das patas anteriores apresentaram valores significativos na fase aguda. J? o teste do cilindro e o reconhecimento de objeto n?o foram estatisticamente significativos. O teste do campo aberto foi significativo para o grupo com hemorragia bilateral. Encontramos diminui??o do volume do enc?falo e les?o da matriz germinativa na avalia??o histol?gica. Conclus?o: O modelo de hemorragia subependim?ria-intraventricular em ratos Wistar rec?m-nascidos (P6) foi estabelecida utilizando a colagenase tipo VII, sendo de f?cil execu??o. N?o houve diferen?a significativa na avalia??o cognitiva e as altera??es neuromotoras s?o not?veis na fase aguda. A avalia??o histol?gica evidenciou altera??es semelhantes ?s do humano. Houve redu??o do volume do enc?falo na regi?o do hemisf?rio correspondente ? les?o.