In Streptococcus pyogenes, the protein SiaA (HtsA) is part of a heme uptake pathway system and involved in heme transfer from Shp to the ABC transporter. SiaA mutants, in which alanine replaces the axial histidine (H229) and methionine (M79) ligands, as well as a lysine (K61) and cysteine (C58) located near the heme propionates, are reported. Studies on a mutant of a cysteine expected to be at a distance from the propionates (C47A) are also reported. The coordination state and spin state of the selected mutants were determined via Resonance Raman studies. The pKa values of mutants ranged from 9.0 to 9.4, which were close to the pKa of the WT SiaA (9.7). The midpoint reduction potential of lysine (K61A) mutant was determined by spectroelectrochemical titration to be 61 ± 3 mV vs. SHE, similar to the WT protein (68 ± 3 mV). The addition of guanidinium hydrochloride resulted in protein denaturation that could show more than one process and occurred over days. The ease of protein unfolding was directly related to the extent of interaction of the residues with the heme: changes in the axial ligands resulted in far greater changes in heme protein stability than changes in the residues near the heme propionates. The causative agent of diphtheriae, Corynebacterium diphtheriae, imports heme via an ABC uptake transporter. In this research, two of the five proteins in the heme uptake pathway of C. diphtheriae were studied. These proteins were HmuT, lipoprotein component of the ABC transporter, and HtaA, the heme receptor. UV-visible spectroscopy and fluorescence spectroscopy showed that HmuT protein as isolated bound a porphyrin, rather than heme. Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) studies suggested that two tetrapyrroles were bound. To assess stability of this protein towards heme release, thermal denaturation studies were performed. For HtaA, UV-visible and fluorescence spectroscopy also showed the protein as isolated was also bound a porphyrin, rather than heme. Homology studies showed that HtaA protein is quiet distant from homologous heme uptake proteins and could be a member of novel heme binding domain family.

Thesis (Ph.D. in Microbiology) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 142-160). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Universiẗat, Diss., 2004--Köln.

Universiẗat, Diss., 2004--Düsseldorf.

Universiẗat, Diss., 2004--Köln.

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-10-19. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:55:27Z : No. of bitstreams: 1 000864535_20161230.pdf: 356823 bytes, checksum: b1429fb38bc530053d5caf023608ebf0 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-02T15:03:58Z: 000864535_20161230.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-02T15:05:11Z : No. of bitstreams: 1 000864535.pdf: 3933353 bytes, checksum: 8bf44adf010cf6c18e755c884adcb9da (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) é o agente etiológico da linfadenite caseosa (CLA), uma doença que afeta diferentes grupos de animais em todo o mundo, especificamente áreas de produção de ovinos e caprinos, que causam perdas econômicas significativas. Estas bactérias podem infectar humanos, e 25 casos de infecções em humanos foram relatados na literatura. Atualmente, não há nenhum tratamento eficiente para esta doença e também não existem estruturas cristalográficas de proteínas de C. pseudotuberculosis que possam ajudar a compreender melhor o mecanismo de ação desse patógeno. No presente estudo, foram expressas e purificadas proteínas-chave que desempenham papéis importantes no metabolismo deste patógeno. Três proteínas de C. pseudotuberculosis foram expressas e purificadas. Triose fosfato isomerase (TIM) é uma enzima ativa da via glicolítica, sendo uma das principais enzimas envolvidas no fornecimento de energia para o organismo. Esta enzima foi expressa purificada e cristalizada. Tiorredoxina redutase (TrxR) e Tioredoxina (Trx) participam do sistema tioredoxina (redox), em que o Trx atua como um substrato para o TrxR. Estas enzimas têm diversas funções nos organismos. Estas enzimas foram expressas, purificadas e caracterizadas. A estrutura cristalográfica da TIM foi determinada a 2,5 Å. Proteínas de veneno de serpente, também foram investigados neste estudo, e cinco proteínas diferentes do gênero Bothrops foram purificados e cristalizadas. A estrutura cristalina da Atroxlysin-I foi determinada a 1,8 Å de resolução e foi comparada com diferentes metaloproteinases-I que foram depositados no PDB / Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) is the etiological agent of Caseous Lymphadenitis (CLA), a disease that affects different groups of animals worldwide, specifically sheep and goat production areas, which result a significant economic losses. These bacteria even infect humans; to date 25 different cases of infections in humans are reported in the literature. Currently, no efficient treatment for this disease is available neither a crystallographic structure of any protein from C. pseudotuberculosis that could assist in better understanding of the mechanism of action of this pathogen. In the present study, we have expressed and purified key proteins that play a major role in the metabolism of this pathogen. Plasmids of three different proteins from C. pseudotuberculosis were designed. Triose phosphate isomerase (TIM) is an active enzyme of glycolytic pathway, which is one of the main energy supplier enzymes for the organisms. This enzyme was expressed, purified and crystallized, the crystal structure was determined at 2.5 Å. Thioredoxin reductase (TrxR), and Thioredoxin (Trx) are the part of thioredoxin (redox) system, in which the thioredoxin act as a substrate for the TrxR. These enzymes have a diverse function in organisms. These enzymes were expressed, purified and characterized. Snake venom proteins were also investigated in this study; five different proteins from genus Bothrops were purified and crystallized. The crystal structure of Atroxlysin-I was determined at 1.8 Å resolutions and compared with different metalloproteinases-I, deposited to PDB

Orientador: Fátima Pereira de Souza / Coorientador: Marcelo Andrés Fossey / Banca: Tatiana Elias Colombo / Banca: José Ramon Beltran Abrego / Resumo: Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria gram-positiva causadora da Linfadenite Caseosa (LC) em caprinos e ovinos. A LC é uma doença infectocontagiosa crônica que prejudica a produção de carne, leite e lã em vários países, incluindo o Brasil. Uma vez que o tratamento da doença é muitas vezes inviável e ineficaz, a eliminação dos animais infectados no rebanho tem sido uma das principais medidas de contenção da enfermidade. Vários grupos de pesquisa vem se dedicando ao estudo de C. pseudotuberculosis visando a identificação de fatores moleculares envolvidos na virulência e patogenicidade durante a infecção. Embora alguns destes componentes já tenham sido descritos, como a fosfolipase D, novos estudos são necessários para que seja possível compreender as diversas interações regulatórias que são intrínsecas a esse microrganismo, assim muitos grupos de pesquisas produzem de forma recombinante a enzima transaldolase de C. pseudotuberculosis, envolvida na glicólise e no metabolismo das pentoses-fosfato a fim de buscar inibidores que possam controlar sua ação enzimática. Nesse contexto, os flavonoides são compostos polifenólicos encontrados nas plantas e, em alguns casos, atuam como inibidores de infecções por microrganismos. Assim, a motivação deste trabalho consistiu em identificar e quantificar uma possível interação do flavonoide morina com a enzima transaldolase, a fim de bloquear a atividade de replicação e infecção de LC. Deste modo os objetivos desse estudo foram... / Abstract: Corynebacterium pseudotuberculosis is a gram-positive bacterium which causes Caseous Lymphadenitis (CL) in small ruminants. CL is a chronic infectious disease which impairs meat, whool and milk production in many countries including Brazil. Once the treatment for CL is not efficient, removing affected animals from herds represents one of the major strategies to prevent the disease from spreading. Many research groups have been looking for molecular components in C. pseudotuberculosis that are involved in virulence and infection, among which phospholipase D stands out as the major one described so far. However, new studies are necessary for the understanding of the microorganism's biology, including its intrinsic regulation mechanisms. The object of study of this work was the enzyme transaldolase involved in glycolysis and in the metabolism of pentoses-phosphate, necessary for the formation of nucleic acids that the bacterium uses to replicate in order to find inhibitors that can control its enzymatic action. In this context, flavonoids are polyphenolic compounds found in plants and, in some cases, act as inhibitors of infections by microorganisms. Thus, the purpose of this work is to identify and quantify a possible interaction of the flavonoid morin with the enzyme transaldolase, in order to block LC's replication activity and infection. The objectives of this study included expression and purification of C. pseudotuberculosis's transaldolase protein, the characterization of the secondary structure and thermal stability by circular dichroism and the study of the interaction between transaldolase and morin by fluorescence spectroscopy. The transaldolase protein, with approximately 40kDa, was purified on affinity chromatography followed by molecular exclusion chromatography. Its secondary structure had 74% of alpha helix, 0% of beta sheet, 7.9% of loops (turn) and 18.1% of ... / Mestre

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Ljubica Tasic / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Fábio Rogério de Moraes / Banca: Lisandra Marques Gava Borges / Resumo: Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis), é uma bactéria gram positiva anaeróbia facultativa, pleomórfica, que não esporula, não forma cápsula, e que apresenta 2 biotipos ou biovares, sendo o biovar equi capaz de infectar preferencialmente equinos, enquanto o biótipo denominado ovis acomete pequenos ruminantes. Esta bactéria faz parte do grupo CMNR (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia e Rhodococcus), que demonstra grande importância veterinária e médica, uma vez que estes micro-organismos comumente infectam animais, podendo infectar o homem, causando perdas econômicas pela ineficácia ou alto custo de terapias existentes. Um exemplo seria a linfadenite caseosa (LC) causada por C. pseudotuberculosis, que afeta particularmente a pecuária de caprinos e ovinos, com a condenação da carcaça e redução da produção de lã e de carne. A transmissão da doença e contágio dos animais é direta, muitas vezes através da alimentação e ingestão de água em local contaminado por animais doentes. Essa doença possui incidência na pecuária mundial, principalmente de caprinos e ovinos, havendo registros de ocorrência no Brasil, Europa, Oriente Médio, Austrália, Nova Zelândia, África do Sul, Canadá e Estados Unidos e mesmo com todos os avanços tecnológicos, ainda não há métodos de prevenção totalmente eficazes, como vacinas e medicamentos, tampouco para o tratamento de animais infectados, que geralmente são de custo elevado, por longos períodos e sem a garantia de cura ou de... / Abstract: Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis), is a gram-positive, facultative anaerobe, pleomorphic, non-sporulating bacterium with two biotopes or biovars, being the biovar equi capable of infecting horses, whereas the biotype called ovis infects small ruminants. It is part of the CMNR group (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia and Rhodococcus), which demonstrates great veterinary and medical importance, since these common microorganisms infect animals and can infect humans, causing economic losses due to the inefficiency or high cost of existing therapies. An example is a caseous lymphadenitis (LC) caused by C. pseudotuberculosis, which particularly affects the goats and sheep livestock, with carcass condemnation and reduction of wool and meat production. The transmission of disease and the contagion of animals is direct, often through feeding and drinking water in places contaminated by sick animals. This disease has an incidence in the world livestock, mainly of goats and sheep, with occurrence records in Brazil, Europe, the Middle East, Australia, New Zealand, South Africa, Canada and the United States and even with all technological advances, still there are no totally effective prevention methods, such as vaccines and medications, nor for the treatment of infected animals, which are usually of a high cost, for long periods and without guarantee of cure or exemption from recurrence of LC. In this way, faster and easier techniques for the detection of ... / Doutor

Submitted by Renorbio (renorbioba@ufba.br) on 2018-04-25T17:41:58Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Maria da Conceição Aquino de Sá.pdf: 3251110 bytes, checksum: f7580c2d7b59b8cd7c2c1409212927e0 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2018-05-04T14:16:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Maria da Conceição Aquino de Sá.pdf: 3251110 bytes, checksum: f7580c2d7b59b8cd7c2c1409212927e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-04T14:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Maria da Conceição Aquino de Sá.pdf: 3251110 bytes, checksum: f7580c2d7b59b8cd7c2c1409212927e0 (MD5) / FUNDACAO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DA BAHIA - EDITAL 013/2014 Programa De Bolsas De Mestrado e Doutorado / A procura por produtos da caprino-ovinocultura é frequente e contribui para aumentar a economia mundial, por isso é necessário produzir em larga escala e com qualidade para atender à demanda da população. Entretanto, diversos fatores na criação desses animais ainda necessitam melhorar, principalmente na área sanitária, na qual muitas doenças acometem o rebanho, dentre elas, a Linfadenite Caseosa, doença causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, uma bactéria que apresenta sua toxicidade através de genes de virulência, assim como pela produção de biofilme, que protege a bactéria de ambientes hostis. Dessa forma, estudos sobre esse patógeno são necessários, a exemplo do sequenciamento genômico, na busca de conhecer genes para análises de biomoléculas e com isso compreender melhor a sua antigenicidade e imunogenicidade com o objetivo de melhorar a especificidade e sensibilidade de testes sorológicos, utilizados como prevenção da doença no rebanho. Além disso, é essencial entender o mecanismo de patogenicidade desta bactéria no hospedeiro e suas formas de defesa no sistema imunológico do animal. Assim, no presente estudo, foram caracterizados os genomas de quatro cepas de C. pseudotuberculosis, comparando as cepas produtoras (OVI2C, CAPJ4) e não produtoras (OVI03, CAP3W) de biofilme. As cepas foram extraídas para produção de antígenos somáticos e de superfícies. A partir de estudos prévios com immunoblotting, foram escolhidas as cepas de origem caprina (CAPJ4 e CAP3W) para o estudo in vivo com dezoito caprinos da raça Canindé, divididos em três grupos experimentais, um grupo controle e dois grupos infectados com cepas de C. pseudotuberculosis, para avaliar a patogenia clinicamente, realizando hemograma, além de outras análises sorológicas através do ensaio de ELISA e Western Blotting. Também foi realizada a cultura de células sanguíneas para o estudo da imunidade celular com IFN- e cultivo de células mononucleares do sangue periférico para observar a modulação da expressão de proteínas do sistema GTPases, Rab 5 e Rab 7. Após esses estudos, observou-se que os genes contidos no genoma das cepas de C. pseudotuberculosis possuem similaridade, mostrando que eles são altamente conservados. A extração das bactérias resultou em antígenos de superfície F3, que apresentaram reatividade no immunoblotting frente aos soros de ovinos experimentalmente infectados. De todos os antígenos, os de origem caprina, apresentaram melhor antigenicidade. No experimento in vivo, após a infecção dos animais, foram realizadas outras colheitas de sangue e foi possível observar que a cepa produtora de biofilme é mais resistente, causando danos maiores aos animais. Para as condições de infecção experimental, os valores do hemograma estão dentro dos parâmetros. Na análise sorológica os caprinos infectados experimentalmente responderam à exposição primária, o que contribui para o aumento da imunoglobulina IgG. A produção de IFN-  também foi observada. Foi verificado que as cepas de C. pseudotuberculosis produtora e não produtora de biofilme podem alterar a expressão de proteínas Rab 5 e Rab 7 em macrófagos derivados de células mononucleares do sangue periférico cultivados in vitro. Esses resultados forneceram informações importantes para a produção de testes diagnósticos, com maior acurácia. / The consumption of sheep and goat products is frequent and increases the values of world economy, so it is necessary to produce large scale and quality to meet the demand of population. However, several factors in the breeding of these animals still have to improve, especially in sanitary area, where many diseases affect the cattle, among them, Caseous Lymphadenitis, caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, a bacterium that presents its toxicity through virulence genes, also by production of biofilm that protects the bacteria from hostile environments. Thus, studies of this pathogen are necessary, such as genomic sequencing, in search to know antigenic genes for biomolecule analysis and with this to understand better its antigenicity and immunogenicity, to be possible improve the specificity and sensitivity of serological tests, that are used as prevention of disease in the herd. Besides, it is essential to understand the mechanism of pathogenicity of this bacterium in host and its forms of defense against the animals immune system. At the present study, the genomes of four strains of C. pseudotuberculosis were characterized, comparing the biofilm producing (OVI2C, CAPJ4) and non-producing (OVI03, CAP3W) strains. These strains were extracted for production of somatic and surfaces antigens. From previous studies with immunoblottingting, strains of goat origin (CAPJ4 and CAP3W) were chosen for in vivo study with 18 Canindé goats, divided into three experimental groups, one control group and two groups infected with strains of C. pseudotuberculosis, to evaluate clinically the pathogenesis and through hemogram, in addition to other serological tests as ELISA assay and Western Blotting. Also was performed blood cell culture for the study of cellular immunity with IFN-, as culture of peripheral blood mononuclear cells to observe the modulation of expression of GTPases, Rab 5 and Rab 7 system proteins. After these studies, it was observed that the genes contained in the genome of the strains of C. pseudotuberculosis are genetically homogeneous, showing that they are highly conserved. The extraction of bacteria resulted in F3 surface antigens, that showed reactivity in immunoblottingting against sera from experimentally infected sheep. Of all antigens, those of goat origin had better antigenicity. At the in vivo experiment, after the infection of animals, other blood samples were collected and it was possible to observe that the biofilm producing strain is more resistant, causing greater damages to animals. For the conditions of experimental infection, blood count values are between normal limits. In the serological analysis, the experimentally infected goats responded to primary exposure, which contributes to increase of immunoglobulin IgG. The production of IFN- was also observed. In conclusion, it was observed that strains of C. pseudotuberculosis producing and not producing biofilm can modify the expression of Rab proteins in macrophages derived from mononuclear cells of peripheral blood cultivated in vitro. These results provided important information for production of diagnostic tests, with greater accuracy.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-13T17:37:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Renato Carminati.pdf: 854115 bytes, checksum: 8d88e20d9828adf29e18fda53a89e4b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2016-08-23T15:46:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Renato Carminati.pdf: 854115 bytes, checksum: 8d88e20d9828adf29e18fda53a89e4b8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T15:46:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Renato Carminati.pdf: 854115 bytes, checksum: 8d88e20d9828adf29e18fda53a89e4b8 (MD5) / A linfadenite caseosa é uma doença crônica que acomete principalmente caprinos e ovinos. O agente etiológico é a bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis e a doença caracteriza-se pela formação de granulomas nos linfonodos internos ou superficiais e em outros órgãos. A avaliação da resposta imune humoral é uma importante ferramenta para localização de animais possivelmente infectados, dificultando desta forma a disseminação do agente. O presente estudo avaliou a sensibilidade e especificidade de quatro ensaios imunoenzimáticos (ELISA), tendo como padrão ouro o isolamento microbiológico, confirmado por PCR. Foram utilizados dois antígenos sendo o primeiro o sobrenadante da cultura de C. pseudotuberculosis em caldo BHI e o outro obtido a partir do fracionamento em três fases (TPP) do sobrenadante de cultura de C. pseudotuberculosis, no mesmo meio. Foram usadas 49 amostras de soro de caprinos que apresentavam granulomas superficiais, dos quais isolou-se C. pseudotuberculosis, as bactérias isoladas e identificadas por provas bioquímicas foram submetidas a reação de polimerase em cadeia. Foram usadas 50 amostras de soro de caprinos clinicamente sadios. A sensibilidade e especificidade do ELISA indireto BHI foi de 98% e 98%. Para o ELISA indireto TPP obteve-se uma sensibilidade e especificidade de 100% e 100%. Para o ELISA sanduíche BHI a sensibilidade e especificidade foram, de respectivamente 86% e 84%. A sensibilidade e especificidade para o ELISA sanduíche TPP, foram 74% e 72%. A banda de 815 bp para do fragmento 16S RNA de C. pseudotuberculosis foi amplificada para todas as 49 amostras isoladas.