A produção in vitro (PIV) de embriões tem sido utilizada amplamente no Brasil como ferramenta para acelerar o melhoramento genético do rebanho. Quando associada à criopreservação, a PIV permite maior flexibilidade da biotecnologia e possibilita estabelecer um banco de embriões. Há a possibilidade que a alta sensibilidade à criopreservação dos embriões bovinos seja influenciada principalmente pela grande quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos, sendo isso relacionado especialmente às condições de cultivo in vitro. O Etossulfato de Fenazina (PES) consiste em um regulador do metabolismo de lipídeos. Através da oxidação de NADPH, estimula a via da pentose-fosfato e assim inibe a síntese de ácidos graxos, podendo levar a efeitos benéficos na criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. O Fator de transcrição denominado proteína de ligação do elemento regulatório de esterol (SREBP-1c), regula preferencialmente a transcrição de genes da síntese de triacilglicerol e fosfolipídios e, a enzima Estearoil Co-A desaturase (SCD1) promove a síntese de ácidos graxos monoinsaturados, conferindo fluidez às membranas celulares. O objetivo desse trabalho foi avaliar a suplementação de diferentes concentrações do etossulfato de fenazina (PES) no meio de cultivo, durante a produção in vitro de embriões bovinos, e verificar o efeito do PES na taxa de gestação, buscando melhorar a qualidade do embrião para a criopreservação através da redução do acúmulo de lipídeos. Foram avaliadas as taxas de desenvolvimento inicial de embriões produzidos in vitro provenientes de ovários de abatedouro, e as taxas de gestação com o uso de embriões bovinos produzidos in vitro a partir da Aspiração folicular de vacas Holandesas e vitrificados. A análise da expressão de genes relacionados com biossíntese de triacilglicerol, SCD1 e SREBP-1c, teve como finalidade auxiliar nos conhecimentos básicos dos mecanismos de ação do Etossulfato de Fenazina, e foi realizada através de PCR quantitativo em Tempo Real, utilizando pools de cinco embriões para cada grupo. Para a análise estatística, foi realizada ANOVA seguida de teste de médias, e o teste qui-quadrado para as taxas de gestação. Não houve diferença estatística na taxa de clivagem e blastocisto entre o grupo controle e os grupos tratados com 0,2µM; 0,3µM; 0,5µM de PES no meio de cultivo in vitro. A taxa de gestação, utilizando-se embriões criopreservados, transferidos para receptoras, não foi alterada pelo uso de PES. A expressão tanto do SREBP-1c, quanto da SCD1 manteve níveis similares na presença ou ausência de PES durante o cultivo in vitro. Sendo assim faz-se necessário novos estudos para investigar mais detalhadamente o mecanismo de ação do PES nos genes da via de biossíntese de lipídeos e se é viável sua utilização a campo. / The in vitro production (IVP) of embryos has been widely used in Brazil as a tool to accelerate the genetic breeding. When combined with cryopreservation, the IVP allows greater flexibility of biotechnology and enable to establish a bank of embryos. There is a possibility that the greater sensitivity to cryopreservation of bovine embryos is influenced mainly by the large amount of intracytoplasmic lipids, and that is especially related to in vitro culture conditions. The phenazine ethosulfate (PES) consists of a lipid metabolism regulator. By NADPH oxidation, stimulates the pentose-phosphate pathway and thus inhibits the fatty acids synthesis, leading to beneficial effects on cryopreservation of bovine embryos in vitro produced. The transcription factor called sterol regulatory element binding proteins (SREBP-1c), preferably regulates the gene transcription of phospholipids and triacylglycerol synthesis and the stearoyl-Co A desaturase (SCD1) enzyme promotes the monounsaturated fatty acids synthesis, giving fluidity to cell membranes. The aim of this study was to evaluate the supplementation of different concentrations of phenazine ethosulfate (PES) in the culture medium during in vitro production of bovine embryos, and determine the effect of PES in the pregnancy rate, aiming to improve the the embryo quality to cryopreservation by reducing the lipids accumulation. We evaluated the early development rates of in vitro produced embryos and pregnancy rates after inovulation of vitrified in vitro produced embryos derived from the Ovum Pick Up of Holstein cows. Expression analysis of triacylglycerol biosynthesis related genes, SCD1 and SREBP-1c, had the purpose to increase the basic knowledge on phenazine ethosulfate mechanisms of action, and was performed by Quantitative Real-Time PCR using pools of five embryos for each group. For statistical analysis, was performed ANOVA followed by mean test, and the chi-square test for pregnancy rates. There was no statistical difference in the cleavage rate and blastocyst rate between the control group and the groups treated with 0,2µM; 0,3µM; 0,5µM of PES in the medium in vitro culture. The pregnancy rate, using cryopreserved embryos transferred to recipient was not altered by the use of PES. The expression of the SREBP-1c as well as SCD1 remained similar in the presence or absence of the PES during in vitro cultivation. Therefore it is necessary further studies to investigate in more details the PES mechanism of action in the genes of lipid biosynthesis pathway and whether it is feasible to use the field.

A ausência de trabalhos verificando a melhor concentração de espermatozoides para se congelar o sêmen de cachaços em palhetas de 0,5 mL, gerou a necessidade deste estudo. Foi proposto, por meio deste expererimento, encontrar uma quantidade ideal, ou seja, uma concentração em que se consiga congelar o maior número de espermatozoides por palheta, sem aumentar os danos já causados pelo processo de criopreservação dos espermatozoides de cachaços. Diante disso, foram realizadas 5 coletas de 5 cachaços (n=25), utilizando apenas a fração rica do ejaculado. Estes foram divididos em cinco concentrações espermáticas diferentes, a saber: 100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL e congelados em palhetas de 0,5mL. Após o processo de criopreservação, realizado por um sistema automatizado, as plalhetas foram acondicionadas em botijão criogênico. Para as análises, 2 palhetas de cada concentração foram descongeladas em banho maria (37ºC por 30 segundos) e submetido às avaliações das características de motilidade por meio do CASA, citometria de fluxo para a análise da integridade das membranas acrossomal e plasmática, potencial mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez da membrana espermática (capacitação), além da morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial de fase. As variáveis avaliadas foram submetidas à análise de variância e ao teste de média PDDIF, ao nível de 5%. O aumento da concentração espermática, na palheta de 0,5mL, afetou significativamente (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade progressiva, velocidade de trajeto, linearidade, retilinearidade, frequência de batimento flagelar e hiperativação. O aumento do número de espermartozoides na palheta não alterou (p>0,05) a porcentagem de células que apresentavam simultaneamente a integridade das membranas plasmática e acrossomal e com potencial mitocondrial (MIAIAP), o aumento não influenciou (p>0,05) as variáveis peroxidação lipídica, capacitação e morfologia espermática. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a congelação de até 300x106 espermatozoides/mL, na palheta de 0,5 mL, sem maiores danos à motilidade e integridade das membranas espermáticas. / The lack of studies veryfing the best concentration of sperm to freeze the boar semen in 0.5 ml straws, bring forth necessity for this study. The experiment proposed to find an optimal amount, in other words a concentration that is possible to freeze the higher number of spermatozoa per straw without increasing the damage already caused by the process of cryopreservation of boar spermatozoa. Therefore, there were 5 semen collections of 5 boars (n = 25) using only the rich fraction of the ejaculate. They were divided into five different sperm concentrations, namely 100, 200, 300, 600 and 800x106 sperm/mL and frozen in 0.5 mL straw. After the cryopreservation process, carried out by an automated system, straws were placed in cryogenic cylinders. For the analysis, two straws of each concentration were thawed in water bath (37°C for 30 seconds) and subjected to evaluations of motility characteristics through CASA, flow cytometry to analyze the integrity of the acrosome and plasma membrane, mitochondrial potential, peroxidation and lipid fluidity of sperm membrane (capacitation), and the sperm morphology by phase differential interference contrast microscopy. The variables were subjected to analysis of variance and the average test PDDIF, at 5%. The increased sperm concentration, in the 0.5mL straw, affected significantly (p <0.05) total and progressive motility, progressive velocity, path velocity, linearity, straightness, flagellar beat frequency and hyperactivation. The increase in the spermatozoa number, in 0,05 mL straw, did not change (p> 0.05) the percentage of cells that simultaneously showed the integrity of plasma and acrosomal membranes and with high mitochondrial potential (MIAIHM), the increase did not affect (p> 0.05) the lipid peroxidation variables, training and sperm morphology. Based on the results, it can be suggested to freeze with 300x106 spermatozoa/mL, in 0.5 mL straw, without major damage to the integrity and motility of the sperm membrane.

A caprinocultura no Brasil vem crescendo consideravelmente nos últimos anos. No entanto, este crescimento é limitado pela qualidade espermática pós-descongelamento, o que inviabilizaria a utilização de biotecnologias aplicadas à reprodução (e.g., inseminação artificial e transferência de embriões). Um dos motivos para a queda na qualidade espermática pós-descongelação é o ataque das espécies reativas de oxigênio (ROS), que podem levar a danos em membrana, acrossomo, mitocôndria e DNA. Uma alternativa para a melhora na qualidade espermática de amostras criopreservadas de caprinos seria o tratamento do meio diluidor com a antioxidantes. No entanto, é fundamental identificar a espécie reativa de oxigênio mais deletéria ao sêmen de caprinos para determinar o antioxidante ideal. O objetivo do presente estudo foi identificar a ROS mais deletéria ao sêmen de caprinos e, com isso, tratar o diluidor com antioxidantes específicos para a destruição da mesma. No experimento 1, amostras espermáticas de 12 bodes foram submetidas á incubação com 3 sistemas de produção de ROS e um subproduto da peroxidação de lipídeos, conhecida por também levar a danos oxidativos. As amostras espermáticas foram submetidas a incubação com xantina (20mM) e xantina oxidase (ânion superóxido), sulfato de ferro (4mM) e ascorbato (20mM- Radical hidroxila), peróxido de hidrogênio (H2O2; 20 mM) e malondialdeído (20 mM). Após a incubação as amostras espermáticas foram avaliadas quanto a morfologia, motilidade, membrana (eosina/nigrosina), acrossomo (Rosa Bengala/ Fast Green), mitocôndria (3,3 diaminobenzidina) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS, avalia a susceptibilidade do espermatozóide ao estresse oxidativo). Os resultados do experimento 1 indicaram que a ROS mais deletéria ao espermatozóide caprino é o H2O2, que levou a danos de membrana plasmática e mitocôndria. Assim, no Experimento 2, o diluidor para a criopreservação do sêmen caprino foi suplementado com catalase e Glutationa Peroxidase (GPx), antioxidantes enzimáticos responsáveis pela destruição do H2O2. A análise estatística dos dois experimentos foi realizada através do SAS system for Windows. Os resultados do experimento 2 não revelaram efeitos benéficos para nenhuma das variáveis e com a utilização de ambos os antioxidantes. De fato, a catalase apreesntou efeitos deletérios à membrana plasmática das amostras criopreservadas com 240 UI/mL de catalase quando comparadas ao controle (13,42&plusmn;2,96% e 25,08&plusmn;4,80% de espermatozóides com membrana íntegra, respectivamente). De fato, estudos anteriores indicam que as concentrações de catalase em sêmen de caprinos são extremamente baixas, o que indicaria que o tratamento com as dosagens utilizadas de catalase pode ter sido excessivo. Além disto, diferentes antioxidantes aparentemente atuam em diferentes regiões do espermatozóide, sendo que, apenas a combinação de diferentes antioxidante poderia ser eficiente. Por outro lado, os resultados do Experimento 1 foram obtidos em amostras frescas, sendo que provavelmente, em amostras criopreservadas, a espécie reativa mais deletéria poderia ser outra. / The goat production in Brazil has grown considerably in recent years. However, this growth is limited by the post-thaw sperm quality, which would impais the use of biotechnologies applied to reproduction (e.g., artificial insemination and embryo transfer). One reason for the decline in sperm quality after thawing is the attack of reactive oxygen species (ROS), which can lead to damage of membrane, acrosome, mitochondria and DNA. An alternative to improve the quality of cryoprerved goat sperm samples would be the treatment of the extender with antioxidants. However, it is crucial to identify the reactive oxygen species more deleterious to semen of goats to determine the ideal antioxidant. The aim of this study was to identify the ROS more deleterious to semen of goats and thereby to treat the extender with specific antioxidants for the destruction of this ROS. In experiment 1, sperm samples from 12 goats were incubated with 3 systems of production of ROS and a by-product of lipid peroxidation, known to also lead to oxidative damage. The sperm samples were subjected to incubation with xanthine (20 mM) and xanthine oxidase (superoxide anion), iron sulfate (4 mM) and ascorbate (20mM-hydroxyl radical), hydrogen peroxide (H2O2, 20 mM) and malondialdehyde (20 mM). After incubation the samples were evaluated for sperm morphology, motility, membrane (eosin / nigrosin), acrosome (Rose Bengal / Fast Green), mitochondria (3.3 diaminobenzidine) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS, assesses the susceptibility of sperm to oxidative stress). The results of experiment 1 indicated that ROS most deleterious to the goat sperm is the H2O2, especially due to damages to the plasma membrane and mitochondria. Thus, in Experiment 2, the extender for cryopreservation of goat semen was supplemented with catalase and glutathione peroxidase (GPx), enzymatic antioxidants responsible for the destruction of H2O2. Statistical analyses were performed using the SAS system for Windows. The results of experiment 2 revealed no beneficial effects of the use of neither catalase oor GPx. In fact, catalase showed deleterious effects on the plasma membrane of cryopreserved samples; Samples treated with 240 IU / mL of catalase showed a lower percentage of sperm with intact membrane when compared with controls (13.42 &plusmn; 2.96 &plusmn; 4.80% and 25.08%, respectively ). In fact, previous studies indicate that concentrations of catalase in semen of goats are very low, which indicates that catalase treatment with the dosages used in the present study may have been excessive. Apparently different antioxidants work in different regions of the sperm, and only the combination of different antioxidant could be effective. Moreover, the results of Experiment 1 were obtained in fresh samples, and probably, in cryopreserved samples, other ROS could be the most deleterious.

Os ácidos graxos poliinsaturados garantem a fluidez à membrana plasmática do espermatozóide. No entanto, as duplas ligações presentes, os tomam mais susceptíveis aos efeitos nocivos da peroxidação lipídica que produz grande quantidade de radicais livres. A adição do antioxidante Glutationa reduzida (GSH) poderia conferir proteção aos espermatozóides de ovinos submetidos a criopreservação contra danos, em membranas plasmáticas, acrossomais, DNA e atividade mitocondrial causados pelo estresse oxidativo. O objetivo do presente experimento foi: avaliar se a GSH protege os espermatozóides ovinos criopreservados contra danos causados pelo estresse oxidativo. Foram colhidos ejaculados de quatro carneiros adultos. As amostras foram avaliadas após a criopreservação (TI). As análises convencionais foram: concentração, motilidade, vigor e morfologia. As análises funcionais foram: integridade de membrana, integridade acrossomal, integridade de cromatina e atividade mitocondrial. O sêmen foi criopreservado utilizando o diluidor Tris-gema-critrato suplementado com GSH (controle, 1, 5 e 10mM). Uma alíquota de cada amostra foi submetida ao protocolo de peroxidação lipídica induzida e subseqüente quantificação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico(TBARS). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Sistema SAS para Windows. Os resultados indicam que não houve efeito do tratamento com GSH sobre as variáveis avaliadas pelos testes convencionais. A GSH diminuiu a proporção de acrossomas íntegros. Amostras tratadas com 5mM de GSH apresentaram menor percentual de células com membranas íntegras quando comparadas com as amostras controle e aquelas tratadas com 10 mM; , o percentual de células sem atividade mitocondrial foi influenciado pela GSH também não houve de efeito nas TBARS. As amostras do grupo controle foram mais susceptíveis à desnaturação da cromatina. Em conclusão, a adição do antioxidante Glutationa reduzida (GSH) confere proteção ao DNA e à atividade mitocondrial de espermatozóides de ovinos. / It is well known that sperm is extremely susceptible to the oxidative stress. This occurs especially due to the high content of poly-unsaturated fatty acids (PUF As) in its plasma membrane. The PUF As provide the necessary fluidity to the plasma membrane, which allows the sperm to move. However the double bonds present in those fatty acids are more susceptible to the oxidative stress. Therefore, sperm is highly dependent of the extra-celluIar environment antioxidant protection. Studies in human indicate that cryopreservation may lead to damages to the sperm due to the oxidative stress. The objective of this experiment was to study if the antioxidant glutathione (GSH) may protect ovine cryopreserved sperm against the damages caused by the oxidative stress. Semen samples of four rams were collected using an artificial vagina. Samples were then cryopreserved using Tris-egg yolk extender supplemented with different concentrations of reduced glutathione (control, 1, 5 and 10 mM). After thawing, samples were evaluated using conventional (motility and vigor) and functional tests (membrane integrity and mitochondrial activity). An aIiquot of each thawed sample was submitted to the protocol of induced lipid peroxidation using ascorbate (20 mM) and ferrous sulphate (4 mM), with the further measurement of the tiobarbituric acid reactive substances (TBARS), as an index of oxidative stress. This technique aims to evaIuate sperm oxidative status by its susceptibility to the lipid peroxidation. Statistical analysis was performed using SAS system for Windows. The results indicate that there was no effect of GSH on the variables assessed by conventional tests. GSH decreased the proportion of intact acrosomes. Samples treated with 5 mM GSH showed a lower percentage of cells with intact membranes when compared with control sampIes and those treated with 10 mM, the percentage of cells with mitochondriaI activity was affected by GSH and there was also no effect on TBARS. Samples from the control group were more susceptible to denaturation of chromatin. In conclusion, the addition of the antioxidant Glutathione (GSH) offers protection to DNA and mitochondrial activity of ovine sperm.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2016. / A criopreservação do ovócito bovino ainda é um desafio. O tamanho celular, a quantidade de água no citoplasma, a reserva de ácidos graxos, a composição da membrana plasmática, são alguns dos fatores responsáveis pela baixa eficiência da técnica. Entre as metodologias utilizadas para a criopreservação de ovócitos, a vitrificação ainda é considerado o método mais eficaz. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar diferentes alternativas para minimizar os efeitos deletérios da vitrificação em ovócitos bovinos imaturos ou maturados. Entre as abordagens utilizadas estão (1) o uso de beta- metil- ciclodextrina (MβCD), como substância para alterar a membrana plasmática e aumentar a fluidez da mesma; (2) a associação de L-Carnitina e Resveratrol durante a maturação in vitro (MIV), para diminuir a reserva de gotículas lipídicas, aumentar a produção de ATP e proteger o ovócito contra o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs); (3) o uso da maturação in vivo para melhorar a qualidade do ovócito e, (4) o uso da transferência intrafolicular de ovócito imaturo, para proporcionar aos ovócitos vitrificados uma ambiente in vivo durante todos os passos da produção de embriões. Em cada experimento, diferentes avaliações foram utilizadas para identificar o sucesso ou insucesso das alternativas propostas. Apesar de alguns procedimentos como o uso de MβCD, terem melhorado a maturação nuclear, nenhum dos procedimentos utilizados aumentou a produção de blastocistos a partir de ovócito vitrificados. Os resultados obtidos mostraram que as lesões sofridas pelo ovócito bovino durante a vitrificação e aquecimento, o comprometem de forma muito severa e irreversível. / Cryopreservation of bovine oocyte is still a challenge. The cell size, the amount of water in the cytoplasm, the reservation of fatty acids, plasma membrane composition , are some of factors responsible for low efficiency of technique for bovine oocytes. Among the methodologies used for cryopreservation of oocytes, vitrification is the one that can minimize the effects of water flow. The main objective of present thesis was to prove different methodologies for vitrification of immature or matured bovine oocytes. For different alternatives were proved: (1) MβCD, a substance to alter the plasma membrane and increase membrane fluidity. (2) the combination of L-carnitine and resveratrol during IVM, to reduce reserves of lipid droplets, increase ATP production and protect against ROS aa. (3) in vivo maturation system where, after hormonal stimulation on bovine heifers, in vivo and theatrically better oocyte were produced. (4) intrafollicular transfer of immature oocyte, we adapted a methodology for immature oocytes could be injected into pre-ovulatory follicles, resulting in a in vivo system. For each experiment, different assessments were used to identify the successes or failures of our hypothesis. A common evaluation used for all experiments was the use of immature or for some experiments matured oocytes, destined for blastocyst development, after IVF. In none of proposed experiments, we have succeeded in increasing the production of blastocysts from vitrified oocytes. Likewise, the results, indicated that the injuries suffered by bovine oocyte during vitrification and thawing, compromise the oocyte at very severe intensity.

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Após a colheita, o sêmen foi avaliado macro e microscopicamente, e prédiluído nas soluções TES, TRIS e PBS, no entanto sem a adição dos crioprotetores (Solução A), onde permaneceram por 1h. Posteriormente, o sêmen foi diluído com as soluções TES, TRIS e PBS, já contendo os crioprotetores, novamente avaliado, para então ser envasado, sendo submetido aos diferentes tempos de equilíbrio, e em seguida, congelado. Após a descongelação, foi avaliado a motilidade e o vigor, e após o TTR, a motilidade, o vigor e o desprendimento do acrossoma. Na criopreservação com TRIS, a motilidade e o vigor foram estatisticamente similares (p>0,05) no sêmen congelado com equilíbrio de 4h (17,2% e 1,6), 8h (22,4% e 2,1) e 12h (14,8% e 1,6) (p>0,05). Após o TTR não foi observado diferença estatística (p>0,05) para a motilidade e o vigor em 4h (10,4% e 1,1) e em 12h (10,0% e 1,2) de equilíbrio, porém houve um aumento em 8h (15,6% e 1,6) (p<0,05). Não houve diferença estatística (p>0,05) no índice de desprendimento do acrossoma entre 4h (35,1) e 12h (37,6) de equilíbrio, havendo uma redução nestes índices em 8h (30,4) (p<0,05). Na criopreservação com TES, a motilidade do sêmen congelado com equilíbrio de 4h (24,8%) e 12h (27,6%) foram estatisticamente similares (p>0,05), sendo que o tempo de 8h (40,4%) diferiu estatisticamente dos demais. O vigor foi estatisticamente similar (p>0,05) para o sêmen descongelado com equilíbrio de 4h (2,0), 8h (2,6) e 12h (2,3), não diferindo estatisticamente (p>0,05). Após o TTR não foi observado diferença estatística (p>0,05) para a motilidade em 4h (18,8%) e em 12h (17,4%) de equilíbrio, porém houve um aumento em 8h (29,6%) (p<0,05). Em relação ao vigor e ao desprendimento do acrossoma não houve diferença estatística (p>0,05) em 4h (2,0 e 35,8), 8h (2,1 e 33,4) e 12h (1,8 e 42,2) de equilíbrio. Na criopreservação com o PBS, não foram observados motilidade e vigor após a descongelação. Esses resultados indicam que o diluente à base de TES e o tempo de equilíbrio de 8h mostraram-se mais adequados para a diluição e congelação de sêmen ovino. / During cryopreservation are numerous changes experienced by the sperm cells, which leads to the decrease in motility and loss of viability after thawing. For this reason, there arises the need to refine the process technology of semen, especially regarding the use of diluents. The aim of this study was to evaluate the viability of spermatozoa undergoing the process of cryopreservation and dilution, using three extenders (TES, TRIS and PBS) and three years of stability (4h, 8h and 12h), and the study was divided into nine groups: TES-4h-8h TES, TES- 12h, TRIS-4h-8h TRIS, TRIS-12h-4h PBS, PBS and PBS-8h-12h. After collection, semen was evaluated macro and microscopically, and pre-diluted solutions in TES, TRIS and PBS, but without the addition of cryoprotectants (Solution A), where they remained for 1 hour. Subsequently, semen was diluted with solutions TES, TRIS and PBS, already containing the cryoprotectants, again assessed to be so packed, and subjected to different periods of equilibrium, and then frozen. After thawing, motility was assessed and vigor, and after the TTR, motility, vigor and detachment of the acrosome. On cryopreservation with TRIS, motility and vigor were statistically similar (p> 0.05) in semen frozen with a balance of 4h (17.2% and 1.6), 8h (22.4% and 2.1) and 12h (14.8% and 1.6) (p> 0.05). After the TTR was not observed statistical difference (p> 0.05) in motility and vigor in 4h (10.4% and 1.1) and 12h (10.0% and 1.2) of balance, but there was an increase in 8h (15.6% and 1.6) (p <0.05). There was no statistical difference (p> 0.05) in the rate of detachment of the acrosome between 4h (35.1) and 12 (37.6) equilibrium, with a reduction in these indices at 8 am (30.4) (p <0 , 2005). On cryopreservation with ERT, the motility of frozen semen with a balance of 4h (24.8%) and 12h (27.6%) were statistically similar (p> 0.05), although the time of 8h (40.4% ) differed significantly from the others. The force was statistically similar (p> 0.05) for thawed-balanced 4h (2.0), 8h (2.6) and 12h (2.3), not statistically different (p> 0.05) . After the TTR was not observed statistical difference (p> 0.05) for sperm motility in 4h (18.8%) and 12h (17.4%) of balance, but there was an increase in 8h (29.6%) (p <0.05). In relation to the force and the detachment of the acrosome was no statistical difference (p> 0.05) 4h (2.0 and 35.8), 8h (2.1 and 33.4) and 12h (1.8 and 42 , 2) equilibrium. On cryopreservation with PBS, showed no motility and vigor after thawing. These results indicate that solvent-based TES and the equilibrium time of 8h were more suitable for dilution and freezing of ram semen.

A presente tese aborda os principais aspectos da biologia do vírus Epstein-Barr (EBV), suas relações com doenças, seu potencial uso como ferramenta para a biologia celular e a reprodutibilidade desta célula para o auxílio no diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM) através da medida de atividades de hidrolases lisossômicas. Os objetivos deste trabalho foram investigar as alterações celulares e morfológicas nos linfócitos B infectados com EBV, afim de confirmar a transformação celular nos 12 dias de cultura, para certificação do protocolo empregado; determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180, 365 e 730 dias de criopreservação em nitrogênio líquido, das enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a- glicosidase e a-iduronidase em Linhagens Celulares Linfoblastóides (LCL) transformados com EBV de indivíduos normais e determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180 dias de criopreservação das enzimas β-glicosidase, a-galactosidase e a- iduronidase em LCLs transformados com EBV de pacientes com doenças de Gaucher e Fabry e Mucopolissacaridose tipo I. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo EBV através das 3 ferramentas utilizadas: imunohistoquímica, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia confocal. Foram observados, através destes instrumentos, o aparecimento de clusters celulares, vacúolos citoplasmáticos, binucleação e aumento no conteúdo de organelas, o que é esperado em células infectadas por EBV. Foi observado também que as células cultivadas por 12 dias com EBV apresentavam a atividade da β-glicosidase e da a-iduronidase diferente significativamente daquela de linfócitos não infectados. Após 6 meses, 1 e 2 anos de criopreservação das células transformadas com EBV, em nitrogênio líquido, as enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a-glicosidase e a-iduronidase mantiveram suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. O mesmo ocorreu quando utilizamos amostras de pacientes com doença de Gaucher, Fabry e Mucopolissacaridose tipo I após 6 meses de criopreservação. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo vírus Epstein Barr e que uma vez congeladas até pelo menos 1 ano em nitrogênio líquido, todas as enzimas analisadas mantém suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. / The present study addresses the main aspects of the biology of the Epstein-Barr virus (EBV) and its relationships with diseases, its potentials as a tool in cell biology, and the reproducibility of EBV-infected cells to assist in the diagnosis of Inborn errors of metabolism (IEM) using a measure of the activities of lysosomal hydrolases. The objectives of this study were (i) to investigate the cellular and morphological changes in B-lymphocytes infected with EBV to confirm cell transformation within the 12-day culturing period in order to verify the applicability of the method; (ii) to determine the activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-iduronidase, α-galactosidase and α- glucosidase in lymphoblastoid cell lines at the moment of collection (12-day culturing) and immediately after 180, 365 and 730 days in lymphoblastoid cell lines (LCLs) transformed with EBV of normal individuals frozen in liquid nitrogen and (iii) to determine the activities of the enzymes β-glucosidase, α- galactosidase and α-iduronidase at the moment of collection (12 days of culturing) and immediately after 180 days in LCLs transformed by the EBV of patients with Gaucher and Fabry diseases and with muccopolysaccharidosis type I frozen in liquid nitrogen. The results showed that the protocol was efficient to transform B-lymphocytes by EBV using three tools: immunohistochemistry, transmission electron microscopy and confocal microscopy. The technique afforded to observe the emergence of clusters, cytoplasm vacuoles, binucleatoon and increased organelle contents, which are expected in EBV-infected cells. Also, it was observed that cells cultured with EBV for 12 days presented β-glucosidase and α-iduronidase significantly different from that of non-infected lymphocytes. Activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-galactosidase. α-glucosidase and α- iduronidase measured after 180, 635 and 730 days in cryopreservation of EBVtransformed cells in liquid nitrogen were similar to that of samples after 12-day culturing of cells. The same was observed when we used samples from patients with Gaucher, Fabry and muccopolysaccharidosis type I after a 6-month cryopreservation period. This study shows that the protocol was efficient in transforming B-lymphocytes by EBV and that the activities of all enzymes frozen for at least one year in liquid nitrogen remained similar to that of samples collected after 12-day culturing.

O apelo pela conservação ambiental e o significativo aumento no número de organismos cultivados de alto valor genético demandam tecnologias que permitam conservar sua genética, mesmo após a morte do animal. A criopreservação de gametas possibilita a preservação da genética de espécies ameaçadas e de interesse comercial, prolongando sua vida reprodutiva evitando assim a perda de material genético por doenças, catástrofes, transferência de animais ou perda do habitat natural. A criopreservação tem sido aplicada à conservação de ovários e tecido ovariano, no entanto, há muitas controvérsias acerca de qual seria o melhor protocolo a ser utilizado. Tendo isso em vista, o presente estudo teve como objetivo avaliar a morfologia do tecido ovariano de zebrafish criopreservado em cápsula de metal com o uso de diferentes soluções crioprotetoras. As soluções crioprotetoras utilizadas foram: 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol (SC1); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO (SC2); 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol + 0,5 M sacarose (SC3); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose (SC4). Após o descongelamento a integridade de cinco estágios de desenvolvimento folicular foi avaliada em cada grupo. A morfologia celular foi observada através de análise histológica. A análise dos dados mostrou que os folículos em estágio I e II foram os melhores criopreservados em todos os grupos experimentais. Sendo que, os grupos SC4 e SC2 foram os que apresentaram os melhores resultados, respectivamente com 88,26% e 84,2% de folículos sem alterações morfológicas. Já os estágios foliculares mais avançados de desenvolvimento (estágios IV e V) apresentaram-se com alterações em todos os grupos. Portanto, apesar do sucesso na criopreservação dos estágios foliculares mais iniciais (I e II) foi possível identificar alterações morfológicas em todos os grupos avaliados. Dentre as principais alterações identificadas estão a aglutinação do citoplasma e enrugamento e ruptura da membrana do envelope celular. Ao avaliar os resultados pode-se concluir que apesar do uso da capsula de metal em associação com as soluções SC4 e SC2 apresentarem os melhores resultados, as soluções SC1 e SC3 também foram eficientes na manutenção da integridade morfológica de folículos imaturos, e portanto essa metodologia pode ser utilizada com sucesso na criopreservação de folículos imaturos. / The appeal for environmental conservation and the significant increase in the number of farmed organisms with high genetic value demand technologies to allow preserving their genetics, even after the death. Cryopreservation of gametes allows the preservation of genetics of the endangered and commercial species, prolonging their reproductive life. Furthermore, this technology prevents the loss of genetic material caused by diseases, disasters, transfer of animals or loss of natural habitat. Cryopreservation has been applied to the conservation of ovaries and ovarian tissue, however, there are many controversies regarding what would be the best protocol to use. Thus, the aim of this study was to evaluate the morphology of cryopreserved zebrafish ovarian tissue using a metal capsule with four different cryoprotectant solutions. The cryoprotectant solutions used were: 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol (CS1); 1.5M methanol + 5.5 M Me2SO (CS2); 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose (CS3); Methanol + 1.5 M 5.5 M 0.5 M sucrose + Me2SO (CS4). After heating the integrity of the five stages of follicular development was assessed in each group. Cell morphology was observed by histological analysis. The thermal gradient inside the capsule and the sample was verified by a thermistor Pt500, model Keithley 2001A. The data analysis shows that the follicles at stage I and II were better cryopreserved among all experimental groups. The treatments CS4 and CS2 showed the best results, respectively with 88.26% and 84.2% of follicles without morphological changes in stage I. The most advanced follicular development stages (stages IV and V) showed changes in all treatments. Therefore, despite the successful cryopreservation of earlier follicular stages (I and II), it was possible to identify morphological changes in all the groups. Among the main changes identified, agglutination of cytoplasm and rupture of cell and wrinkling of the egg envelope could be observed. Despite the use of the metal capsule in association with the CS4 and CS2 solutions showed the best results, CS1 and CS3 solutions were also effective in maintaining the morphological integrity of immature follicles, therefore this method can be successfully used in the cryopreservation of immature follicles.

Orientador: Claudio de Oliveira / Resumo: Embora a ictiofauna Neotropical seja considerada a mais diversa do mundo, apenas 12,2% das espécies de peixes tiveram cariótipos descritos. A dificuldade de se obter preparações cromossômicas de boa qualidade para algumas espécies de peixes Neotropicais ainda é um dos grandes desafios na área de Citogenética, principalmente para peixes de pequeno e grande porte. Uma alternativa é uso de metodologias indiretas, tais como cultura de células, amplamente utilizada e estabelecida em mamíferos, entretanto para peixes ainda é pouco empregada pela dificuldade de padronização da técnica de isolamento e manutenção das culturas celulares. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de uma metodologia de cultura de células aderentes para obtenção de cromossomos mitóticos em peixes neotropicais, estabelecendo linhagens celulares de diferentes espécies e a determinação de suas características citogenéticas. Seis espécies de peixes Neotropicais da ordem Characiformes foram utilizadas para obtenção das culturas primárias, desenvolvimento e criopreservação das linhagens celulares e analise citogeneticamente. Para obtenção das linhagens, células de tecido muscular foram isoladas usando enzimas proteolíticas. As células isoladas foram cultivadas em frascos ou placas tratadas com um filme à base de gelatina e mantidas à 27,5ºC, 5% CO2 em meio completo (DMEM+soro fetal bovino+antibióticos+antimicóticos). Quando as células cobriram toda a superfície do substrato, elas foram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Although Neotropical ichthyofauna is considered the most diverse in the world, only 12.2% had karyotypes described. The difficulty of obtaining good quality chromosome preparations for some Neotropical fish species is still one of the major challenges in the area of cytogenetics, especially for small and large fish. An alternative is the use of indirect methodologies, such as cell culture, widely used and established in mammals, however for fish is still little used for the difficulty of standardization of the technique of isolation and maintenance of cell culture. Thus, the present study aimed to develop a methodology for adherent cell culture to obtain mitotic chromosomes in Neotropical fish, establishmenting cell lines of different species and the cytogenetic characteristics of these lines. Six species of Neotropical fish of the order Characiformes were used to obtain primary cell, development and cryopreservation of the cell lines and cytogenetic analysis. To obtain the cell lines, muscle tissue were isolated using proteolytic enzymes. The isolated cells were cultured in flasks or plates treated with a gelatin-based film and maintained at 27.5 °C, 5% CO2 in complete medium (DMEM + fetal bovine serum + antibiotics + antimycotics). When the cells covered almost all surface of the substrate, they were transferred to new flasks to obtain chromosome preparations and cryopreservation. The chromosome preparations of the cell lines were performed in different passages in the spec... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Marco Antonio Alvarenga / Coorientador: Katia Roberta A. Belaz / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Banca: Mateus José Sudano / Resumo: A congelação e refrigeração são biotecnologias muito utilizadas na reprodução equina, entretanto um significativo número de garanhões possuem baixa qualidade seminal após a criopreservação. Diversos autores descreveram a importância da composição e lipídica das membranas espermáticas sobre a resistência à criopreservação. Desta forma, este estudo teve como objetivo analisar a relação do perfil lipídico das membranas espermáticas com a raça e a resistência espermática à congelação e refrigeração. No experimento 1 foram verificadas as diferenças do perfil de fosfolipídios das membranas espermáticas de garanhões das raças Mangalarga Marchador e Quarto de Milhaa e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 728,6; 741,5 e 744,5 nos Mangalarga Marchador. No experimento 2 foram avaliados os fosfolipídios das membranas espermáticas entre garanhões com espermatozoides sensíveis ou resistentes à danos decorrentes da congelação e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 703,5; 728,6; 781,5; 808,5 e 836,6 nos animais sensíveis à congelação. No experimento 3 comparou-se os fosfolipídios das membranas espermáticas dos garanhões com a resistencia à refrigeração e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 772,5 e 774,6 nos animais resistentes à refrigeração. No experimento 4 observou-se não serem os mesmo lipídios que conferem resistência espermática à congelação e à refrigeração. Como os resultados do presente estudo, pode-se concluir que existe diferença no perfil lipídico das membranas espermáticas entre animais Quarto de Milha e Mangalarga Marchado, entre animais sensíveis e resistentes à congelação, entre animais sensíveis e resistentes à refrigeração. Além disso não há relação do perfil lipídicos que confere resistência espermática à congelação e à refrigeração / Abstract: The freezing and refrigeration are biotechnology very used in equine reprodution, although a significant number of stallion have low seminal quality after cryopreservation. Many authors described the importance of lipid composition of spermatic membrane in crypreservation resistance.The aim of this study is to analisy the lipid profile with MALDI-MS of plasmatic membrane of stallion sperm, checking its relation with breed and with spermatic resistance to freezing and refrigeration. Four experiments were done. The experiment 1 verified the diference of phospholipid spermatic membrane in stallions of Mangalarga Marchador and Quarter horse breeds, which was observed bigger relative abundance of ions m/z 728,6; 741,5 e 744,5 in Mangalarga Marchador. The experiment 2 evaluated the spermatic phospholipid membrane between stallions with weak and resistant to the damage of freezing and was observed bigger relative abundance of ions m/z 703,5; 728,6; 782,5; 808,5 and 836, 6 in the animals weaks to freezing. The experiment 3 compared the phospholipids of stallions spermatic membranes with sperm weaks or resistant to the damage of refrigeration and was observed bigger relative abundance of ions m/z 772,5 e 774,6 in animals resistants to refrigeration. The experiment 4 showed that not the same lipids offer spermatic resistance to freezing and refrigeration.The results of this study demonstrate tha there is a diference in lipid profile of spermatic membrane between Quarter Horse and Mangalarga Marchador breeds, between animals weak and resistant to freezing and between animals weak and resistant to refrigeration. Besides there is no relation of lipid profile that offer spermatic resistance to freezing and refrigeration / Mestre