Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-04-25T13:49:16Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Miguel Gustavo Setúbal Andrade.pdf: 2741651 bytes, checksum: 408525066d9971f7289fcce0e1d3ae7e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-25T13:49:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Miguel Gustavo Setúbal Andrade.pdf: 2741651 bytes, checksum: 408525066d9971f7289fcce0e1d3ae7e (MD5) / CAPES;FAPESB / A enxertia dos maxilares com osso córtico-medular aposicionado condiciona o rebordo para receber implantes de titânio. O osso alógeno congelado tem conquistado espaço por eliminar a necessidade de área doadora. Clinicamente, os enxertos aposicionados sofrem absorção, e o plasma rico em plaquetas (PRP) poderia minimizar esse fenômeno. Nesta tese, foram realizadas três pesquisas. A principal delas estudou a incorporação de enxertos autógenos e alógenos aposicionados à mandíbula de coelho em associação ou não com PRP. As alterações que o congelamento promoveu no osso e o processo de preparação do PRP também foram investigados. Utilizaram-se 54 coelhos. Enxertos córtico-medulares foram removidos do osso ilíaco e aposicionados bilateralmente à cortical externa da mandíbula. Parte dos animais recebeu osso autógeno fresco e outra parte recebeu osso alógeno congelado a -70°C por 120 dias. Em um lado da mandíbula, foi colocado PRP. A eutanásia ocorreu após 3, 7, 14, 28 e 56 dias. A diferença entre os grupos foi ponderada pelo teste de Bonferroni. O osso alógeno foi menos absorvido, mais osteogênico e fibrogênico que o osso autógeno. Sua cortical estava mais espessa e ele induziu maior quimiotaxia de macrófagos e osteoclastos. O PRP, apesar de melhorar, não interferiu significativamente nessas variáveis. Não houve reação de células T e B contra os enxertos. O efeito da criopreservação foi analisado no osso congelado a -20°C e -70°C por 30, 60, 90 e 120 dias e foi comparado ao osso fresco. A diferença foi estimada pelo teste de Tukey. O congelamento aumentou a área das células e dos núcleos na medular e diminuiu a área dos núcleos da cortical. O colágeno da cortical desnaturou com a diminuição da temperatura e o aumento do tempo de congelamento. Essas alterações só comprometeram a morfologia do tecido após 90 ou 120 dias na temperatura de -70°C. O sangue total e o PRP foram comparados pelo teste de correlação de Pearson. A plaquetometria do PRP não dependeu dos eritrócitos e do plasma pobre em plaquetas removidos, mas do hematócrito e da plaquetometria do sangue total. O hematócrito do PRP não interferiu na sua plaquetometria e leucometria, que foi dependente da leucometria inicial. Concluiu-se que o osso alógeno congelado foi bom material para enxertia aposicionada dos maxilares e não induz uma rejeição imunológica. O PRP apresentou apenas uma tendência em melhorar o reparo de enxertos aposicionados, e o congelamento foi eficaz em diminuir a antigenicidade do osso.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2005 / Bibliografia: f. 62-73 / Com a finalidade de avaliar a preservação folicular e as características celulares do tecido ovariano criopreservado e comparar com o não congelado, dez coelhas brancas adultas, sob anestesia, foram submetidas a ooforectomia direita. O ovário ressecado fo / Ten grown up female white rabbits, under anesteshia, had been submitted to right oophorectomy to evaluate the follicular preservation and the histological characteristics of the cryopreserved ovarian tissue and compared to the fresh one. The dryed ovary w

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2007 / Bibliografia: p. 56-62 / A engenharia de tecidos, uma nova área da biotecnologia, tem proposto a produção de estruturas vivas funcionais, tais como vasos sanguíneos, valvas cardíacas, entre outras. Várias foram as tentativas de produzir um substituto valvar com capacidade de cres / Tissue engineering, a new area in biotechnology, has proposed the production of functional live structures, such as blood vessel, heart valves, among others. Several attempts have been made to create functional heart valve replacements with the ability to

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 549736 bytes, checksum: 94f356a8e6012cc38a152d4e5b05791a (MD5) Previous issue date: 2007-04-20 / The objective of the present study was to evaluate the effect on the freezability of equine semen with the addition of glycerol in 0, 35 and 60 minutes the cooling period. Semen from two adult stallions (Mangalarga Marchador) were used, totalizing 11 colections of semen. The evaluation consisted of sperm progressive straight motility, total motility, sperm vigor, live/death cells (supravital), functional integrity of sperm plasma membrane (Hyposmotic Swelling test - Host) and sperm morphology analyses in the semen in natura , before and after freezing the semen. Each collected semen was divided in three treatments. T1: addition of the cryoprotector occurred before the cooling; T2: addition occurred after 35 minutes of the cooling; T3: the addition occurred immediately before the freezing, to the 60 minutes of cooling. After the minimum frozen period of 12 days, the semen samples had been thawed at 75º C per 7 seconds. The thawed samples had remained for 120 minutes at 38º C for longevity evaluation. Differences (P < 0.05) among the animals used in the experiment, were noted in sperm morphology. One of the stallions showed average values of abnormal sperms bellow of the praised standards. No relations (P > 0.05) were registered among average values of the morphology test, supravital test and Host in semen in natura . The supravital test showed relation (P < 0.05) only with the sperm vigor in the analysis of the semen in natura . No differences (P > 0.05) were registered among physical analyses, in the Host, supravital test, the morphologic analysis and in the evaluation of longevity in the frozen/thaw semen of three considered protocols. These results suggest that the time of balance between the semen and glycerol does not affect the quality and the longevity of the semen. Seminal qualities had been considered impracticable in fertility terms, after 60 minutes of incubation on longevity test. The supravital test of the frozen/thawed semen showed relation with the progressive sperm motility (r = 0.81) and sperm vigor (r = 0.64) in the 3 considered trataments. The values of the Host used in this experiment were satisfactory due the large reaction of the spermatozoa when in contact with the hyposmotic solutions, however this test did not show relations (P > 0.05) with the sperm physical parameters. The physical parameters of the semen before cooling did not present relation (P > 0.05) with the physical parameters and with supravital test of frozen/thaw sperm. The no significant relations among the different tests used in this study, suggests that the information of these tests are used under different aspects, ratifying the complementary character of the same ones. / O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição do glicerol em tempo 0, 35 e 60 minutos de resfriamento sobre a congelabilidade do sêmen equino. Foram utilizados 2 garanhões adultos da raça Mangalarga Marchador, totalizando 11 ejaculados. Foram avaliadas a motilidade espermática progressiva total e retilínea, vigor espermático, percentual de células vivas e mortas (supravital), integridade funcional de membrana (Hiposmótico) e morfologia espermática no sêmen in natura , pré e pós congelamento. Cada ejaculado foi dividido em três tratamentos. T1: adição do crioprotetor ocorreu antes do resfriamento; T2: adição ocorreu aos 35 minutos de resfriamento; T3: a adição ocorreu imediatamente antes do congelamento, aos 60 minutos de resfriamento. Após o período mínimo de 12 dias de congelados, as amostras de sêmen foram descongeladas a 75º C por 7 segundos. As amostras descongeladas permaneceram por 120 minutos incubadas a 38º C para avaliação de longevidade pelo teste de termoresistência. Foram registradas diferenças (P < 0,05) entre as alterações de morfologia espermática entre os animais utilizados no experimento, sendo que no garanhão 2 os valores médios estavam acima dos padrões preconizados. Não foram registradas relações (P > 0,05) entre os valores médios dos testes de morfologia, Hiposmótico e supravital na avaliação dos ejaculados. O teste supravital apresentou relação (P < 0,05) apenas com o vigor espermático na análise do sêmen in natura . Não foram registradas diferenças (P > 0,05) entre os valores médios obtidos nas análises físicas, no teste Hiposmótico, no teste supravital, na análise morfológica e na avaliação de longevidade pelo teste de termoresistência entre o sêmen congelado de acordo com os três protocolos propostos. Esses registros sugerem que o tempo de equilíbrio entre o sêmen e o glicerol não interfere na qualidade e na longevidade do sêmen de garanhões. Aos 60 minutos de incubação (TTR), as qualidades seminais foram consideradas inviáveis em termos de fertilidade. O teste supravital do sêmen descongelado apresentou relação com os parâmetros de motilidade espermática progressiva (r = 0,81) e vigor espermático (r = 0,64) independente do tratamento avaliado. Os valores do teste hiposmótico mostraram taxas de espermatozóides reativos satisfatórios, porém não foram registradas relações (P > 0,05) com os parâmetros físicos avaliados. As avaliações físicas do sêmen pré-resfriamento não apresentaram relação (P > 0,05) com os parâmetros físicos e com o teste supravital do sêmen descongelado. As relações não significativas entre os diferentes testes utilizados nesse estudo sugerem que as informações são fornecidas sob diferentes aspectos, ratificando o caráter complementar dos mesmos.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-07-06T18:04:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 909533 bytes, checksum: 6baed208f90f67624120c4e48d7b27aa (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-06T18:04:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 909533 bytes, checksum: 6baed208f90f67624120c4e48d7b27aa (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Inúmeras biotécnicas visam obter melhores índices de viabilidade espermática pós-descongelamento. Diferenças de características bioquímicas e funcionais entre espécies, ejaculados, estações do ano, animais, e outros, não possibilitaram o desenvolvimento de um protocolo definitivo. O presente estudo objetivou avaliar os efeitos da inclusão de colesterol na criopreservação do sêmen asinino sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento. Vinte e cinco ejaculados de cinco jumentos foram divididos em dois tratamentos experimentais: T1: controle sem adição de ciclodextrina carregada com colesterol – (CCC); e T2 com adição de CCC. As avaliações seminais pós- descongelamento foram divididas em duas fases (1 e 2). Na fase 1 avaliou-se os efeitos da incorporação ou não de 1,5 mg de CCC aos espermatozoides, avaliando a cinética espermática dos espermatozoides no pós- descongelamento. As amostras descongeladas dos dois tratamentos foram submetidas ao Computer Assisted Sperm Analyser (CASA) e obteve-se as variáveis motilidade total (MT, %), motilidade progressiva (MP, %), velocidade curvilinear (VCL, μm/s), velocidade progressiva (VSL, μm/s), velocidade de trajeto (VAP, μm/s), linearidade (LIN, %), retilinearidade (STR, %), amplitude de deslocamento lateral da cabeça (ALH, μm) e frequência de batimentos (BCF, Hz). Na fase 2 as amostras dos dois tratamentos foram submetidas à incubação com diferentes sondas e posterior análise por citometria de fluxo para avaliação: da integridade da membrana plasmática e acrossomal (FITC-PSA), do estresse oxidativo citoplasmático (DHE), da peroxidação dos lipídios de membrana (BODIPY 581/591 ), da organização da bicamada lipídica (M540), do potencial de membrana mitocondrial (JC-1) e da apoptose celular (Yo-Pro). Os resultados relativos à avaliação da cinética espermática dos tratamentos experimentais mostraram que os parâmetros MT, MP, VCL, VSL, VAP, ALH, e BCF apresentaram maiores valores (p<0,05) no T1 (29,92 ± 13,82; 12,44 ± 6,03; 64,45 ± 9,65; 43,50 ± 7,30; 52,02 ± 8,17; 2,65 ± 0,48; 7,67 ± 0,76) em relação ao T2 xiv (17,33 ± 7,18; 5,33 ± 2,69; 46,16 ± 8,16; 31,83 ± 6,73,; 38,76 ± 7,63; 1,63 ± 0,43; 6,51 ± 1,76). Não foram observadas diferenças nos ejaculados (p>0,05) entre o T1 e T2 para as variáveis LIN (67,60 ± 1,28 e 68,74 ± 1,61) e STR (83,55 ± 0,81 e 81,91 ± 1,05). Na fase 2, a incorporação de colesterol resultou em maior (p<0,05) porcentagem de células com integridade de membrana acrossomal e plasmática dos espermatozoides (21,42 ± 12,94), bem como maior (p<0,05) potencial de sua membrana mitocondrial (15,49 ± 12,36). Não houve diferença (p>0,05) entre o T1 e T2 em relação à peroxidação dos lipídeos de membrana (669,81 ± 337,87 e 743,42 ± 417,26) e quanto à desorganização da membrana plasmática (8163,07 ± 1929,75 e 7068,01 ± 3680,08). A incorporação de colesterol resultou em maior (p<0,05) produção de espécies reativas de oxigênio citoplasmático (%) no T2 (3,73 ± 1,64) em relação ao T1 (2,10 ± 1,20). Além disso, a incorporação do colesterol se mostrou eficaz em aumentar (p<0,05) a porcentagem de células vivas pós descongelamento (23,67 ± 12,46) em relação ao grupo que não recebeu o tratamento (12,69 ± 8,84). Não houve diferença (p>0,05) entre T1 e T2 em relação à prevenção dos eventos semelhantes a apoptose nos espermatozoides (23,28 ± 9,81 e 22,08 ± 12,24). A incorporação de colesterol ao sêmen melhora os parâmetros seminais in vitro do sêmen descongelado de jumentos da raça Pêga. / Many biotechniques are directed to obtain better rates of sperm viability after thawing. Differences in biochemical and functional characteristics between species, ejaculates, seasons of the year, among animals, and others, preclude a definitive protocol. The objective of this study was to evaluate the effects of cholesterol inclusion on cryopreserved Pêga donkey spermatozoa and sperm viability in vitro post-thawing. Twenty five ejaculates of five donkeys were divided in two experimental treatments, T1: control, without addition of cyclodextrin loaded cholesterol – (CCC) and T2: treated with addition of CCC. Post-thawing seminal evaluations were divided into two phases (1 and 2). The effects of incorporation (T2) or not (T1) of 1.5 mg of CCC to the semen on sperm kinetics of post-thawing spermatozoa were evaluated. In phase 1, samples of the two treatments were submitted to the Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA) and the kinetic characteristics: total motility (MT, %), progressive motility (MP, %), curvilinear velocity (VCL, μm/s), progressive velocity (VSL, μm/s), trajectory velocity (VAP, μm/s), linearity (LIN, %), rectilinearity (STR, %), amplitude of lateral head displacement (ALH, μm) and beating frequency (BCF, Hz) were obtained. In phase 2, samples of the two treatments were submitted to incubation with different probes and later analysed by flow cytometry to evaluate the plasma and acrosomal membrane integrity (FITC-PSA), cytoplasmic oxidative stress (DHE), plasma membrane lipid peroxidation (BODIPY 581/591 ), lipid bilayer organization (M540), mitochondrial membrane potential (JC-1) and cellular apoptosis (Yo-Pro). Results regarding the evaluation of spermatic kinetics of the experimental treatments showed the parameters MT, MP, VCL, VSL, VAP, ALH and BCF were higher (p<0,05) in T1 (29,92 ± 13,82; 12,44 ± 6,03; 64,45 ± 9,65; 43,50 ± 7,30; 52,02 ± 8,17; 2,65 ± 0,48; 7,67 ± 0,76) in relation to T2 (17,33 ± 7,18; 5,33 ± 2,69; 46,16 ± 8,16; 31,83 ± 6,73; 38,76 ± 7,63; 1,63 ± 0,43; 6,51 ± 1,76). No differences were shown (p> 0.05) between T1 e T2 for the LIN (67,60 ± 1,28 e 68,74 ± 1,61) and STR (83,55 ± 0,81 e 81,91 ± 1,05) variables. In phase xvi 2, the incorporation of cholesterol resulted in greater (p <0.05) percentage of integrity on the spermatozoa acrosomal and plasma membrane (21,42 ± 12,94), as well as higher (p<0.05) potential of its mitochondrial membrane (15,49 ± 12,36). No difference was detected (p>0.05) between T1 e T2 in relation to membrane lipid peroxidation (669,81 ± 337,87 e 743,42 ± 417,26) and plasma membrane disorganization (8163,07 ± 1929,75 e 7068,01 ± 3680,08). Cholesterol incorporation resulted in higher (p<0.05) production of reactive cytoplasmic oxygen species % in T2 (3,73 ± 1,64) in relation to the T1 (2,10 ± 1,20) spermatozoa. In addition, cholesterol incorporation was effective in increasing (p<0.05) the percentage of post-thaw live cells (23,67 ± 12,46) in relation to T1 (12,69 ± 8,84). No difference was detected (p>0.05) between T1 e T2 regarding the prevention of apoptosis-like events in spermatozoa (23,28 ± 9,81 e 22,08 ± 12,24). The incorporation of cholesterol to the semen improves seminal parameters of in vitro of post-thawing donkey semen.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-25T09:51:00Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 467608 bytes, checksum: 415cfc97bb8e785d82d9258a9338dec2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T09:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 467608 bytes, checksum: 415cfc97bb8e785d82d9258a9338dec2 (MD5) Previous issue date: 2015-11-19 / Análises seminais por meio da associação de sondas fluorescentes possibilitam a avaliação dos diversos compartimentos da célula espermática, simultaneamente, oferecendo um prognóstico mais acurado frente ao caráter subjetivo de alguns testes de rotina. Neste estudo foi utilizada a associação de três sondas fluorescentes com objetivo de avaliar a integridade da membrana plasmática (iodeto de propídio e Hoechst 33342) e o potencial de membrana mitocondrial (MitoTracker red), em sêmen fresco e descongelado de cão. Os resultados obtidos foram comparados aos resultados dos testes de rotina. Todos os testes demonstraram capacidade em detectar queda de qualidade seminal pós- descongelamento. A associação das sondas fluorescentes iodeto de propídio (IP), Hoechst 33342 (H33342) e MitoTracker red (CMXRos) mostrou-se eficaz na distinção de diferentes populações de espermatozoides em ejaculados descongelados de cão doméstico. Foram distintas 4 populações: IC (membrana plasmática íntegra e com potencial de membrana mitocondrial), IS (membrana plasmática íntegra e sem potencial de membrana mitocondrial), LC (membrana plasmática lesada e com potencial de membrana mitocondrial) e LS (membrana plasmática lesada e sem potencial de membrana mitocondrial). Esta associação permitiu também quantificar e qualificar as injúrias causadas às membranas plasmáticas das células espermáticas, pelo processo de congelamento/descongelamento, nesta espécie. Foi observada correlação (p<0,05) entre a coloração das sondas fluorescentes e a avaliação da motilidade espermática e teste hiposmótico. Desta forma, sugere-se a inclusão da combinação de sondas fluorescentes nos protocolos de análise de sêmen, como teste complementar aos testes convencionais, tornando mais precisa a avaliação das injúrias à célula espermática desta espécie. Entretanto, nem os testes de rotina e nem as sondas fluorescentes são hábeis em predizer a capacidade do espermatozoide de ligar-se ao ovócito, evento crucial para a fecundação. Assim, faz-se importante a adoção de testes de ligação entre espermatozoides e ovócitos nas pesquisas referentes à avaliação dos protocolos de congelamento/descongelamento do sêmen. Embora o status metabólico dos ovócitos, assim como o efeito fêmea, limitem a exatidão das interpretações, tem-se buscado substratos de ligação mais homogêneos e de mais fácil obtenção. Neste contexto, a membrana perivitelina do ovo de galinha (MPOG) tem se demonstrado eficiente na avaliação da capacidade de ligação do sêmen em diversas espécies. O teste de ligação de espermatozoides à MPOG apresenta comportamento semelhante aos resultados dos testes de rotina da avaliação do sêmen, assim como os testes com as sondas fluorescentes, apresentando diferença quando comparados sêmen fresco e sêmen descongelado (p<0,05). Neste estudo, o teste hiposmótico correlacionou-se positivamente com o número de espermatozoides ligados à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha. O comportamento da MPOG e das sondas, entre os tratamentos, demonstraram sensibilidade da membrana em distinguir sêmens de diferentes potenciais de ligação (p < 0,05) nesta espécie. / Seminal analysis by means of the association of fluorescent probes allows for the simultaneous evaluation of several compartments of the spermatic cell, offering a more accurate prognostic when compared to the subjective character of some routine tests. In this study, the association of three fluorescent probes was used with the goal of evaluating the integrity of plasma membrane (propidium iodide and Hoechst 33342) and mitochondrial membrane potential (Mito Tracker red), in dog semen, both fresh and frozen. The attained results were compared to those of routine tests. All tests showed the capacity of detecting a drop in seminal quality after being unfrozen. The association of the fluorescent probes propidium iodide (IP), Hoechst 33342 (H33342) and Mito Tracker red (CMXRos) showed efficiency when differentiating sperm populations in the frozen semen of domestic dogs. There were four distinct populations: IC (intact plasma membrane and with mitochondrial membrane potential), IS (intact plasma membrane without mitochondrial membrane potential), LC (injured plasmatic membrane with mitochondrial membrane potential) and LS (injured plasmatic membrane without mitochondrial potential). This association also allows the quantification and qualification of the injuries caused on the sperm cell by the freezing/thawing process in this species. A correlation was observed between the coloring of the fluorescent probe and the evaluation of sperm motility and hypo- osmotic swelling test (p<0,05). However, the attained results with the probes showed a higher precision rate when detecting injuries to the spam cells thus suggesting the inclusion of the combination of fluorescent probes in semen analysis protocols, once evidence shows greater efficiency when compared to routine tests. Consequently, the inclusion of the combination of the fluorescent probes in the semen analysis is suggested as a complementary test, making the evaluation of the injuries to the spermatic cell of this species more precise. However, neither the routine tests nor the fluorescent probes are capable of predicting spermatozoon’s capability to bind to the oocyte, an crucial event to fecundation. Therefore, it is important to introduce biding assays between spermatic cells and oocytes in the research that refer to the evaluation of the freezing/ thawing semen protocols. Although the oocytes metabolic status, like the ‘’female effect’’, limit the accuracy of the interpretations, substrate binding that are more homogeneous and easier to obtain are being pursued. In this context, the perivitelline layer of the egg yolk has demonstrated to be efficient in evaluating the binding capacity of sperm in a number of species. The binding tests of sperm to the MPOG shows a behavior that is similar to the results obtained from semen’s routine evaluation tests, as well as the test with the fluorescent probes, presenting a difference when comparing fresh with unfrozen semen (p<0,05). In this study, the hypoosmotic test correlated positively to the number of spermatozoon connected to the perivitelline layer of the egg yolk. The behavior the MPOGs and that of the probes, between other treatments, demonstrated the membrane’s sensibility in distinguishing semen of different potential binding (p<0,05) in this species.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-25T10:13:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1390337 bytes, checksum: 8d3099a51770199af75e5456c99bc784 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T10:13:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1390337 bytes, checksum: 8d3099a51770199af75e5456c99bc784 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este trabalho foi realizado com intuito de relacionar os constituintes bioquímicos e proteômicos do plasma seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador com a criopreservação. Em ambos os estudos foram utilizados garanhões hígidos da raça Mangalarga Marchador, com idades entre quatro e 15 anos e peso entre 400 e 500 kg. As colheitas foram realizadas no período de junho a agosto de 2013, totalizando 77 amostras. No experimento 1, após as colheitas foram retirados 3 mL de sêmen para análises bioquímicas de cálcio, colesterol, glicose, magnésio, fósforo, proteína total, potássio e sódio. Em sequencia as amostras seminais foram diluídas na proporção 1:1 (sêmen/ diluente) e congeladas para realização dos testes de motilidade espermática total, vigor espermático, teste hiposmótico e teste supravital. Após o descongelamento, os ejaculados de cada animal foram separados em grupos de alta (> 40%) e baixa congelabilidade (< 40%). Não foram visualizadas diferenças nos parâmetros bioquímicos e seminais entre os animais (P>0,05), entretanto foram observadas diferenças na concentração de colesterol e glicose nos animais 1 e 3 (P<0,05), sendo a maior concentração no grupo de animais de baixa congelabilidade e correlação negativa entre o potássio e a motilidade constituintes espermática bioquímicos pós- do descongelamento. Concluiu-se plasma não seminal que os influenciam na congelabilidade seminal na raça Mangalarga Marchador. No experimento 2, após as análises físicas e morfológicas do sêmen, foram selecionados para o perfil proteômico, os plasmas seminais correspondente aos sêmen de maior e menor motilidade pós-descongelamento por animal. O perfil das proteínas foi avaliado pelo sistema SDS–PAGE e as proteínas identificadas por MALDI- TOF/ TOF, utilizando o software Mascot para a busca em banco de dados. O site do UniProt (SWISSPROT, NCBI, Equidae) foi consultado para identificação das proteínas e a validação dos resultados foi realizada pelo programa SCAFOLD. As amostras não validadas pelo SCAFOLD foram analisadas pelo programa flexAnalysis (BRUKER®) para identificação de espectros de MS2 identificados pelo software Mascot. Foi observado diferença significativa em relação a CRISP 3 no grupo de sêmen de baixa congelabilidade e não foram observadas diferenças entre a HSP 1, a calicreína e a motilidade pós- descongelamento entre os grupos de sêmen de alta e baixa congelabilidade . Conclui-se que a CRISP3 com baixa massa molecular (22- 30 kDa) pode ser utilizada como biomarcador de baixa congelabilidade e que a calicreína e a HSP1 não podem ser utilizadas como marcadores de congelabilidade na raça Mangalarga Marchador. / The aim of this study was evaluating biochemical and proteomic constituents of Marchador Mangalarga stallions seminal plasma by cryopreservation. Both studies were carried out on healthy Marchador Mangalarga stallions, ageing from four to 15 years old and weighting between 400 and 500 kg. The samples were collected from June to August 2013, totalizing 77 samples. In experiment 1 after collection, 3 ml total semen were taken for calcium cholesterol, glucose, magnesium, phosphorus, total protein, sodium and potassium biochemical analyses. Subsequently, semen samples were diluted on 1: 1 (semen / diluent) and frozen in order to perform motility, sperm vigor, hyposmotic and supravital tests. After thawing, the ejaculate from each animal was divided into high (>40%) and poor (<40%) freezability groups. No differences on biochemical and seminal parameters among animals (P>0.05) were reported but differences on cholesterol and glucose concentrations in animals 1 and 3 (P<0.05) were observed. Animals from the low freezability group showed higher concentration and negative correlation between potassium and sperm motility after freezing. It might be concluded that seminal plasma biochemical constituents did not affect Mangalarga Marchador seminal freezability. In experiment 2, after physical and morphological semen analyses, seminal plasma corresponding to higher and lower semen post freezing motility per animal were selected for the proteomic profile. Protein profile was assessed by SDS-PAGE system and proteins identified by MALDI-TOF / TOF using the Mascot software searching the database. The site UniProt (SWISSPROT, NCBI, Equidae) was checked out identifying proteins and validation results by scafold program were performed. No validated samples by scafold by flexAnalysis program (BRUKER®) were analyzed verifying the MS2 spectra identified by Mascot software. Significant difference in regarding to the CRISP 3 in lower freezability group was observed and no difference to the HSP 1 between high and low semen freezability groups, kallikrein and post-thaw motility was observed. It might be concluded that the CRISP3 low molecular weight (22- 30 kDa) might be used as biomarker low freezability biomarker, as well as, kallikrein and the HSP1 might not be used as markers on freezability tests Mangalarga Marchador.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-01T16:42:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 942255 bytes, checksum: 78707c68d18c95c144f96f780a8b1aa1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-01T16:42:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 942255 bytes, checksum: 78707c68d18c95c144f96f780a8b1aa1 (MD5) Previous issue date: 2015-12-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologia de conservação de sêmen de Prochilodus vimboides e Prochilodus lineatus, da bacia do rio Paraíba do Sul, a curto e a longo prazo. Os experimentos foram realizados na estação de piscicultura do Projeto Piabanha/PESAGRO–RJ e no Campo Experimental EPAMIG de Leopoldina, durante as piracemas de 2013/2014 e 2014/2015. Exemplares de Grumatã Prochilodus vimboides e Curimba Prochilodus lineatus foram induzidos com extrato bruto de hipófise de Carpa. Posteriormente, o sêmen foi coletado e suas características seminais avaliadas. No experimento de resfriamento o sêmen foi diluído na proporção 1:9 (v/v, sêmen: diluidor) em soluções compostas por NaCl 0,9%, NaCl 1,2%, glicose 5%, BTS 5% ou MIII 6%. Uma alíquota do sêmen foi mantida sem diluição (controle). A motilidade espermática foi ativada como solução de NaCl 0,29% e subjetivamente avaliada após 0, 1, 2, 3, 4 e 5 dias de armazenamento a 4-6oC. Na criopreservação do sêmen, foram utilizados os mesmos diluidores testados no resfriamento, porém combinados com três crioprotetores (dimetilsulfóxido-DMSO, Metilglicol e Etilglicol), na proporção 1:8:1 (sêmen:diluidor:crioprotetor). As amostras seminais diluídas foram envasadas em palhetas de 0,5 mL, congeladas em botijão de vapor de nitrogênio líquido e posteriormente armazenadas em nitrogênio líquido. Após o descongelamento em banho- maria a 60°C por 8 segundos, a motilidade espermática foi subjetivamente estimada em percentagem. Além disso, avaliou-se o estresse oxidativo ocorrido nessas amostras. A concentração espermática observada para P. vimboides foi de 27,1±15,8 x 10 9 espermatozoides/mL e o volume seminal de 1,4±0,7 mL. Para P. lineatus foi observado concentração espermática de 20,4 ± 6,4 x 10 9 espermatozoides/mL e volume seminal de 2,0 ± 0,4 mL. No resfriamento, amostras diluídas em BTS preservaram a motilidade espermática acima de 30% por até 2 dias em temperaturas de 4-6oC para P. vimboides e até 5 dias para P. lineatus, sendo este diluidor o melhor entre os testados (P<0,05). No congelamento, amostras seminais diluídas nas criosoluções compostas por glicose 5%+Metilglicol, apresentaram as maiores motilidades espermáticas (60% ± 11,8%; P<0,05) para P. vimboides, pós-descongelamento. Também foi observado nessas amostras menores atividades de catalase e peroxidação lipídica (MDA; P<0,05) nas células espermáticas. Já em P. lineatus as amostras seminais diluídas nas criosoluções compostas por glicose 5%+DMSO (dimetilsufóxido) foram as que proporcionaram as maiores motilidades espermáticas (66,1%±4,0%; P<0,05) e menores atividades de SOD, catalase (CAT) e peroxidação lipídica (MDA; P<0,05). Portanto, o sêmen de P. vimboides pode ser resfriado por até 48 horas em solução diluidora de BTS 5% e criopreservado em criosolução composta por glicose 5% + Metilglicol. E o sêmen de P. lineatus pode ser resfriado por até 5 dias em solução de BTS 5% e criopreservado em criosolução composta por glicose 5% + DMSO, com sucesso. / The objective in this work was to develop a methodology of semen conservation of Prochilodus vimboides and Prochilodus lineatus, from Paraíba do Sul river basin, at short and long period. The experiments were realized in the station of fish culture of the project Piabanha/PESAGRO–RJ and in the experimental field EPAMIG from Leopoldina during the “piracemas” from 2013/2014 and 2014/2015. Specimes of Grumatã Prochilodus vimboides and Curimba Prochilodus lineatus were induced by pituitary extract from carp. After the semen was collected and their seminal characteristics were evaluated. In the cooling experiment, the semen was diluted in the proportion 1:9 (v/v, semen, diluting) in saline solutions of NaCl 0,9%, NaCl 1,2%, glucose 5%, BTS 5% or M III 6%. One semen aliquot was kept undiluted and was used as control. The sperm motility was activated with solution of NaCl 0,29% and subjectively evaluated after 0, 1, 2, 3, 4 and 5 days of storage at 4-6oC. In the semen cryopreservation, were used the same extenders tested in the cooling, however combined with three cryoprotectants (dimethyl sulphoxide – DMSO, methylglycol and ethylglycol), in the proportion of 1:8:1 (semen, extender, cryoprotectant). The seminal samples diluted were potted in containers of 0,5 mL, frozen in nitrogen liquid vapor container and then stored in liquid nitrogen. Sperm motility was subjectively evaluated after thawing at 60°C-water bath for 8 s. Beside this, was evaluated the oxidative stress in these samples. The spermatic concentration observed for P. vimboides was of 27,1±15,8 x 10 9 sperm/mL and the seminal volume of 1,4±0,7 mL. For P. lineatus was observed spermatic concentration of 20,4 ± 6,4 x 10 9 sperm/mL and the seminal volume of 2,0 ± 0,4 mL. In cooling, samples diluted in BTS maintained the spermatic motility above 30 % for as long as 2 days at 4-6oC for P. vimboides and as long as 5 days for P. lineatus, being this extender the better between those tested (P<0,05). In freezing, seminal samples diluted in the cryosolutions composed by glucose 5%+ Methylglycol, presented higher spermatic motility (60% ± 11,8%; P<0,05) for P. vimboides post-thaw. Was also observed in these samples low activity of catalase and lipid peroxidatiom (MDA; P<0,05) in the spermatic cells. In P. lineatus the seminal samples diluted in cryosolutions composed by glucose 5%+DMSO (dimethyl sulphoxide) were those that provided the higher spermatic motility (66,1%±4,0%; P<0,05) and lower activity of SOD, catalase (CAT) and lipid peroxidation (MDA; P<0,05). However, the semen of P. vimboides can be cooled for up to 48 hours in extender solution of BTS 5% and cryopreserved in cryosolution composed by glucose 5% + Methylglycol. The semen of P. lineatus can be cooled for up to 5 days in solution of BTS 5% and cryopreserved in cryosolution composed by glucose 5% +DMSO, with success.

Introdução: a alta prevalência do câncer e o aumento significativo da sobrevivência em longo prazo geraram interesse quanto à preservação da fertilidade em mulheres jovens expostas a quimioterapia e radioterapia. Neste sentido estudos de congelamento de tecido ovariano para posterior transplante, abriram uma nova perspectiva de aplicação no tratamento e prevenção da infertilidade feminina. Objetivos: comparar dois protocolos de congelamento de tecido ovariano, um lento não automatizado e um por vitrificação, com o intuito de avaliar a viabilidade dos tecidos para posterior transplante autólogo. Método: Foram utilizadas 30 camundongos fêmea CF1 com aproximadamente 8 semanas e pesando 29,29g±2,9. •Os ovários extraídos foram vitrificados ou congelados, mantidos em nitrogênio líquido por 30 dias e descongelados. Após o descongelamento, o ovário esquerdo foi destinado às análises histológicas e caracterização por imuno histoquímica para o marcador mouse vasa homologue (MVH) e o ovário direito foi utilizado para os testes de viabilidade celular com exclusão por azul de trypan. Resultados: Nas análises de Hematoxilina e Eosina (HE) foram contados folículos primordiais, primários, pré-antrais e antrais. Não houve diferença significativa na proporção de folículos primordiais, primários e pré-antrais após descongelamento entre os grupos testados. A contagem de folículos antrais foi significativamente maior no grupo de vitrificação (p = 0,004). No ensaio de imunohistoquímica para o marcador MVH, folículos MVH + e MVH- foram contados e comparados com o número total de folículos. O grupo congelamento lento apresentou maior número de células não marcadas (p = 0,012). Conclusão: Embora ambos os protocolos tenham apresentado resultados semelhantes na análise histológica das contagens foliculares, o protocolo de vitrificação foi significativamente melhor para preservar a população de células tronco ovarianas. / Introduction: The high prevalence of cancer and the significant increase in long-term survival have generated interest as the preservation of fertility in young women exposed to chemotherapy and radiotherapy. Experimental techniques have been tried in an attempt to reverse the ovarian failure induced by these treatments. In this regard studies of ovarian tissue freezing for subsequent transplantation disclose a new application perspective in the treatment and prevention of female infertility. Objective: two ovarian tissue freezing protocols were tested, a non-automated slow-freezing and by vitrification, in order to assess the viability of the tissues for subsequent autologous transplantation. Methods: as ovaries donors, were used 30 female CF1 mice approximately 8 weeks and weighing 29,29g±2,9. • The ovaries were vitrified or frozen, stored in liquid nitrogen for 30 days and thawed. After thawing, the left ovary was intended for histological and immunohistochemical characterization by histochemical marker for MVH and right ovary was used for the tests with cell viability by trypan blue exclusion. Results: In HE slides was counting primordial, primary, pre antral and antral follicles. No significant difference was found in the proportion of high-quality primordial, primary and pre antral follicles after thawing/warming in the slow-freezing and vitrification group, respectively. The antral follicle counting was significant higher in vitrification group (p=0,004). In immunohistochemistry assay for MVH Antibody , MVH+ and MVH- follicles were counted and compared with the total number of follicles and slow freeze group had a higher number of not marked cells (p=0,012). Conclusion: Although both protocols showed similar results in the histological analysis for follicular counts, the vitrification protocol was significantly better for preserve the ovarian stem cell population.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:54Z : No. of bitstreams: 1 Publico-113%20arquivo%20Dulce.pdf: 1322221 bytes, checksum: 16eb879c6a92f69315090709beff3068 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Transplante de Medula Óssea Autólogo (TMOA) é uma terapia consolidada para tratamento de doenças hematológicas como linfomas, mielomas e leucemias. As células-tronco hematopoéticas (CTHs) podem ser obtidas diretamente da medula óssea (MO) ou do sangue periférico por meio de estímulo com quimioterapia e fatores de crescimento. Frequentemente pacientes submetidos a este procedimento mobilizam as CTHs de forma insatisfatória. O microambiente medular e a hematopoese estão intimamente relacionados com o sucesso deste tipo de tratamento, uma vez que a ontogênese da hematopoese depende de estímulos produzidos pelas células do microambiente medular. Os processos relacionados à adesão celular, as alterações do estroma e da matriz extracelular podem estar danificados em pacientes com MO inicialmente comprometida por células clonais, submetidos a esquemas de quimioterapia e radioterapia convencionais. Estudos relacionados à estrutura e funcionalidade do estroma medular e das CTHs foram realizados para elucidar os possíveis danos causados ao microambiente hematopoético e sua correlação com a recuperação hematológica de curto e longo prazo após os transplantes de medula óssea. Neste estudo, avaliou-se o potencial proliferativo, a capacidade de sustentação da hematopoese e os efeitos da criopreservação em amostras de MO de portadores de doenças onco-hematológicas submetidos ao TMOA. Foram avaliados 22 pacientes, com idade variando entre 16 e 60 anos (média de 37,2 anos). Destes, 5 eram portadores de Linfoma Não-Hodgkin (LNH), 6 de Linfoma de Hodgkin (LH), 4 de Mieloma múltiplo (MM) e 7 de leucemias. Os controles foram provenientes de 10 doadores normais de transplante de medula óssea alogênico com idade variando entre 26 e 45 anos. Foram empregadas culturas de medula óssea de longa-permanência, ensaios clonogênicos e análise histopatológica da MO em dois momentos distintos, pré e pós-mobilização com o intuito de observar se a quimioterapia associada ao fator de crescimento causaria algum dano nas CTHs ou no estroma medular. Observou-se diminuição da formação da camada estromal após a mobilização nas amostras dos controles (p =0,03), sugerindo que a medula óssea normal seja mais afetada pelo efeito imediato do G-CSF, ou que ocorra migração mais expressiva das células progenitoras hematopoéticas da MO para o sangue periférico. As amostras de pacientes apresentaram menor capacidade de formação da camada estromal em relação aos controles, indicando danos ao microambiente medular causados pelo tratamento quimioterápico prévio. Não foram detectadas diferenças funcionais nas amostras de pacientes durante o período de mobilização, não se relacionando a capacidade de formação do estroma com a terapêutica citotóxica empregada na mobilização. A presença de fibrose, infiltração e celularidade diminuída na MO contribuíram em parte para a diminuição da capacidade de formação da camada estromal sugerindo fortemente que os danos maiores estão relacionados ao estroma medular possivelmente causados pelo tratamento quimioterápico prévio. Nos ensaios clonogênicos apenas os estromas obtidos de amostras de pacientes pós-mobilização e co-cultivados com células CD34+ apresentaram atividade proliferativa nestes ensaios, com exceção do controle normal co-cultivado com célula CD34+ autóloga. Em relação ao processo de criopreservação não foi observada diferença entre as fases pré e pós-mobilização nas amostras de pacientes e controles, o que pode sugerir que este procedimento não afete a funcionalidade do estroma. Entretanto, as amostras de controles apresentaram diminuição significativa na formação da camada estromal na fase pós-mobilização em relação às amostras de pacientes, principalmente nas amostras a fresco, podendo-se sugerir que a situação do estroma medular de pacientes com doenças onco-hematológicas anteriores à mobilização possa apresentar um efeito protetor aos agentes criopreservadores. Estes achados sugerem que a existência de um estroma doente torna-o menos suscetível ao processo de mobilização e criopreservação. / Autologous hematopoietic stem cell transplantation (auto-HSCT) has proved efficient to treat hematopoietic malignancies such as lymphomas, leukemia and multiple myeloma. Stem cells can be obtained directly from bone marrow or be recruited to enter in the blood stream in response to chemotherapy and hematopoietic growth factors. However, some patients fail to show adequate yield of mobilized HSCs lowering the chances for a successful auto-HSCT. For definitive hematopoiesis to occur, HSCs must interact with a suitable microenvironment, including stromal cells, extracellular matrix and soluble factors. A large number of groups have been trying to elucidate the mechanisms related to mobilization, structural and functionality of marrow stroma and HSC were done to elucidate possible damage caused on marrow microenvironment and their correlation with the short and long time hematological recovery. In this study, it was evaluated proliferate potential, capacity of hematopoiesis support and the cryopreservation effects in bone marrow samples from patients with hematological malignancies submitted to auto-HSC. Were evaluated 22 patients diagnosed with hematological malignancies, aged 16 to 60 (37,2 average) years, including 5 non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) , 6 Hodgkin’s disease (HD), 4 multiple myeloma (MM), 5 acute myeloid leukemia (AML), 1 acute lymphoblastic leukemia (ALL) and 1 chronic lymphocytic leukemia (CLL). Ten allogeneic bone marrow donors were the control group with 26 to 45 years old. Were used long-term bone marrow cultures, clonogenical assays and bone marrow histopathology analysis at pre and post mobilization, with the purpose to observe if chemotherapy with growth factor will cause some damage to the hematopoietic stem cells or marrow stroma. It was observed stromal layer formation decreased at control samples after mobilization (p =0, 03), suggesting that normal bone marrow was more affected by G-CSF effect , or hematopoietic progenitor cells from bone marrow migrate expressively for the whole blood. Patients’ samples showed lower stromal layer formation in the control group, showing marrow microenvironment damage caused by previous chemotherapy or disease. It was not detected functional differences in patients’ samples during mobilization, no relation with capacity of stroma formation during the citotoxic therapy used in mobilization. Fibrosis, infiltration and cell decrease in bone marrow contribute to reduce the stromal layer formation capacity, suggesting that the main damages are related to marrow stroma. About the clonogenical assays only the obtained stromal layers by post-mobilization patients and CD 34+ co-cultivate cells, showing proliferative activity in these assays, with exception of the autologous CD 34+ co-cultivate control group cells. Related to cryopreservation process, it was not observed difference between pre and post phases at control and patients’ samples, which suggest that this procedure not affect marrow stroma functionality. However, the control samples showed significant decrease in stromal layer formation at the post-mobilization phase in relation to the patients’ sample, mainly in fresh samples, can suggest that the situation of marrow stroma patient with hematological malignancies before the mobilization can show one effective protection to cryopreserved agents. This finding suggests that have sick stromas that make it less susceptible to mobilization and cryopreservation process. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações