Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-11. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:24:09Z : No. of bitstreams: 1 000836344.pdf: 1551165 bytes, checksum: 49d3df701c66be32f547fcbaebe0981c (MD5) / O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de cultivo com ácido linoleico e/ou catalase, em meio sem a adição de SFB, cultivados em atmosfera de baixa tensão de oxigênio sobre o desenvolvimento, qualidade e criotolerância de embriões bovinos. Em um grupo foi feita a suplementação com 100 μM de ácido linoleico (LA); 100UI de catalase (CAT) em um segundo, no terceiro grupo foram feitas as 2 suplementações (CAT+LA) e um quarto grupo sem suplementação (CONTROLE), durante todo o período de cultivo em atmosfera de 5%CO2, 7%O2 e 88%N2 em BAGS. As taxas de clivagem não diferiram (P>0,05) entre os grupos. Porém as taxas de produção de embriões em D7 e D8 diferiram (P<0,05), sendo que o controle obteve melhor resultado perante os 3 tratamentos e o grupo CAT+LA gerou a menor taxa de produção (30,7; 22,4; 19,8; 12,4%). Observou-se um atraso no desenvolvimento, sendo os blastocistos expandidos somente encontrados no D8. Na avaliação do conteúdo total de lipídios, houve uma redução significativa (P<0,05) nos 3 grupos tratados em relação ao controle. A medida dos níveis intracelulares de ROS não foi afetada nos 4 grupos (P>0,05). A quantidade de células totais foi significativamente menor (P<0,05) no grupo CAT+LA, e o grupo CAT foi o que apresentou maior porcentagem de células apoptóticas. Em relação à taxa de re-expansão às 24 horas (P<0,05), o grupo controle (50%) e o CAT (67,2%) apresentaram menores taxas que os grupos LA (71,7%) e o CAT+LA (76,7%). Às 48 horas, o grupo controle apresentou a menor taxa (35,7%), seguido pelo grupo CAT (47,5%). Já o grupo LA (56,5%) diferiu estatisticamente do controle mas não dos grupos CAT (47,5%) e CAT+LA (76,7%). O grupo CAT+LA diferiu estatisticamente dos grupos controle e CAT. Com base nestes resultados, embriões tratados com LA ou CAT+LA no cultivo in vitro, na ausêncio... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / The most commonly recommended way to obtain more resistant in vitro embryos during the cryopreservation process is to change these embryos, whether through removal of fetal bovine serum (FBS), addition of different supplements to the culture medium or changes in oxygen tension in the production process. The objective of this study was to assess the effects of supplementation of the culture medium with linoleic acid and/or catalase in medium without the addition of FBS, in low tension oxygen atmosphere on development, quality and cryotolerance of bovine embryos. In one group, the medium was supplemented with 100 μm of linoleic acid (LA); the second was supplemented with 100UI of catalase (CAT), a third group was supplemented with both, CAT+LA and a fourth group received no supplementation (control), during the entire culture period in an atmosphere of 5% CO2, 7% O2 and N2 88% in BAGS. Cleavage rates did not differ (P>0.05) between groups (72.7; 74.1; 72.1; and 72.0%, respectively). However, embryo production rates in D7 and D8 were different (P<0.05), where the control had the highest blastocyst rate of the treatments and the CAT+LA group presented the lowest rate of production (30.7; 22.4; 19.8; 12.4%). Expanded blastocysts were only foundon D8, indicating a delay in development. There was a significant reduction (P<0.05) of total lipids in the 3 treated groups when compared to the control group. There was no difference in the intracellular levels of ROS between the 4 groups (P>0.05).Total cell number was significantly lower (P<0.05) in the CAT+ LA and the CAT group showed the highest percentage of apoptotic cells. Considering the re-expansion rates in 24 hours (P<0.05), the control group (50%) and the CAT group (67.2%) presented lower rates than the LA group (71.7%) and CAT+LA group (76.7%). At 48 hours, the control group showed the worst rate (35.7%) followed by the CAT group (47.5%)...(Complete abstract eletronic access below)

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-11-29Bitstream added on 2014-11-10T11:58:47Z : No. of bitstreams: 1 000790225.pdf: 849889 bytes, checksum: ea42408a16377fb6d95fbec0bcbb46cc (MD5) / O sêmen ovino congelado e descongelado sofre alterações morfofuncionais que impossibilitam ou diminuem a eficiência na fecundação. Os métodos de seleção espermática visam melhorar a qualidade e viabilidade do material fecundante. Quatro métodos de seleção espermática utilizando duas soluções de sílica coloidal revestida por silano (silica coloidal-silano) ou por polivinilpirrolidona (silica coloidal-PVP), variando o volume de solução coloidal. Foram testados a cinética espermática no CASA e a recuperação espermática. Os protocolos utilizando silica coloidal-silano apresentaram maior motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e porcentagem de espermatozoides rápidos (%RAP) quando comparado aos métodos utilizando a silica coloidal-PVP e às amostras antes da seleção espermática. A silica coloidal-PVP teve maior recuperação espermática quando comparado à silica coloidal-silano. Somente o método utilizando 4mL de silica coloidal-PVP não foi eficiente na seleção de amostras com melhor qualidade quando comparado às amostras analisadas antes da seleção espermática. Os métodos utilizando menores volumes de solução coloidal não diferiram dos métodos de maior volume, sendo a silica coloidal-silano com 1 mL o método que apresentou os melhores resultados. Como conclusão os resultados encontrados no trabalho apontaram a maior eficiência da silica coloidal-silano em selecionar sêmen ovino congelado e descongelado quando comparado à seleção em silica coloidal-PVP. O método utilizando 1mL de silica coloidal-silano foi igualmente eficiente ao método com maior volume, sendo uma alternativa para processar amostras com baixa concentração espermática / Frozen and thawed ovine semen undergo morphofunctional changes that prevent or decrease the efficiency of fertilization. Sperm selection methods have beneficial effects on the selected sperm, improving sperm quality and viability. Four methods of sperm selection were tested using two colloidal silica solutions coated with silane (silica colloid- silane) ou povinilpirrolidone (silica colloid-PVP), varying the volume of colloidal solution. Furthermore, analyses of sperm kinetics in CASA and sperm recovery were carried out. The protocols using silica colloid-silane resulted in greater MT, MP, and %RAP when compared to the methods using silica colloid-PVP and the semen before selection. Silica colloid-PVP had higher sperm recovery when compared to silica colloid-silane. Only the method using 4mL of silica colloid-PVP was not efficient in the selection of best quality samples when compared to the semen before selection. The methods using lower volumes of colloidal solutions did not differ from the methods with higher volumes, being the method with 1mL of silica collois-silane better than the 4mL method. In conclusion the results of the study indicate the superiority of silica colloid-silane in selecting frozen and thawed ovine semen when compared to silica colloid-PVP. The method using 1mL of silica colloid-silane was equally efficient to the standard method and has lower costs, being an interesting alternative to process samples with low sperm concentration

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-10Bitstream added on 2015-01-26T13:30:37Z : No. of bitstreams: 1 000793044_20160731.pdf: 99971 bytes, checksum: 8ad7de8362aa1813828c219bcb43b617 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-01T11:29:57Z: 000793044_20160731.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-01T11:30:55Z : No. of bitstreams: 1 000793044.pdf: 846665 bytes, checksum: 7b1e08d3b9f1e489fd31f5d654c44a76 (MD5) / As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos, e por isso são atrativas para a terapia celular, pois possuem alto potencial de diferenciação e proliferação, sendo assim, utilizadas na reconstrução tecidual. O presente experimento objetivou obter maior conhecimento sobre CTMs derivadas da membrana amniótica e cordão umbilical de cães, antes e após criopreservação, visando a formação de um banco de células. Assim, oito amostras de membrana amniótica e oito amostras de gelatina de Wharton foram obtidas de cesarianas, as quais foram submetidas a digestão enzimática, e cultivadas em meio basal. Uma porção celular, de cada amostra, foi criopreservada em 1ª passagem, de forma lenta, e armazenada por 4 semanas. As células antes e após a criopreservação foram submetidas à caracterização, onde foi observado características de adesão, proliferação, diferenciação e expressão de marcadores de superfícies utilizando-se citometria de fluxo, e imunocitoquímica. A partir destas avaliações, foi possível demonstrar que as células antes e após a criopreservação exibiram comportamento semelhante, quanto à proliferação e crescimento. A viabilidade celular da membrana amniótica apresentou 97,0% das células viáveis antes da criopreservação e 94,6% após, já a gelatina de Wharton 98,8 antes e 93,5% após a criopreservação. O potencial de diferenciação nas linhagens osteogênica e adipogênica foi mantido, no entanto foi necessário um tempo maior (p<0,05) para que as células de gelatina de Wharton se diferenciassem após a criopreservação. E ainda mantiveram a expressão de CD44, em níveis satisfatórios para que fossem consideradas positivas, onde a membrana amniótica expressou 85,6% antes e 67,8% após a criopreservação e a gelatina de Wharton expressou 86,0% antes e 82,1% após a criopreservação e a ausência de expressão ... / Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in most of adult tissues, and are therefore attractive for cell therapy. Because of their high potential for differentiation and proliferation, they are being used in tissue reconstruction. This experiment aimed to enrich knowledge of canine MSCs derived from umbilical cord and amniotic membrane before and after cryopreservation regarding the formation of a cell bank. Thus, eight samples of amniotic membrane and eight samples of Wharton’s jelly were obtained from dogs at birth, which were subjected to enzymatic digestion and basal medium culture. Slow freezing of a sample from each culture was held at the first passage and stored for four weeks. Before and after freezing cells were subjected to characterization being observed adhesion, proliferation, differentiation and expression of surfaces markers using flow cytometry and immunocytochemistry. Based on these analyses it was demonstrated that the cells before and after cryopreservation exhibited similar behavior for proliferation and cell growth. Cell viability of amniotic membrane showed 97.0% of viable cells before freezing and 94.6% after, and the Wharton’s jelly 98.8% before and 93.5% after cryopreservation. The potential of the osteogenic and adipogênica differentiation as well as maintained, however it required a longer time (p <0.05) for the cells from Wharton's jelly to differentiate themselves after freezing. And still maintained the expression of CD44, at satisfactory levels to be considered positive, where the amniotic membrane expressed 85.6% before and 67.8% after freezing and Wharton’s Jelly expressed 86.0% before and 82.1% after cryopreservation and absence of expression of CD34 and MHC II. A peculiar feature observed was that before and after freezing spontaneous differentiation in both lineages (osteogenic and adipogenic) occurred in the controls that were not induced to differentiation. We conclude that ...

O desenvolvimento de protocolos eficientes para a vitrificação de embriões mamíferos ainda é um desafio para os especialistas em reprodução. Soluções crioprotetoras de baixa toxicidade associadas a técnicas seguras de envase são fatores fundamentais, para proporcionarem uma eficiente identificação e controle sanitário das amostras. Dois experimentos foram realizados para determinar a taxa de sobrevivência de embriões Mus domesticus domesticus envasados em palhetas convencionais (0,25 mL), na presença de uma haste metálica de ouro, empregando soluções crioprotetoras descritas para a vitrificação em microvolume. No experimento 1, avaliou-se a toxicidade da solução de desidratação (SD: PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0,5 M sacarose), expondo-se os embriões por diferentes tempos: 1 (T1), 3 (T2) ou 10 min (T3). A toxicidade da solução de vitrificação (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) foi determinada pela exposição dos embriões durante 25, 60 ou 180 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. No experimento 2, avaliou-se a utilização do macrovolume (palhetas com a haste de ouro) e microvolume (micropipetas de vidro - GMP) na vitrificação dos blastocistos expostos à SV por 25 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. Os dados foram analisados pelo teste Qui-Quadrado (P<0,05). No experimento 1, não foi observada diferença estatística entre as taxas de eclosão dos embriões desidratados: T1=68,0% (38/56), T2=72,0% (36/50), T3=71,0% (39/55) e o grupo controle, (74,0% - 48/65). No entanto, houve diferença significativa (P<0,05) na taxa de eclosão em relação ao tempo de exposição dos embriões à SV. Os embriões desidratados por 1 ou 3 min e expostos à SV por 25 seg proporcionaram maiores taxas de re-expansão (79,0% vs 84,0%) e de eclosão (58,0% vs 72,0%), em relação aos tempos de exposição de 60 e 180 seg. No experimento 2, após a vitrificação dos embriões envasados nas palhetas com a haste de ouro, a taxa de eclosão dos blastocistos previamente desidratados por 1 min foi de 16,0% (10/64) e de 4,0% (2/57) quando previamente desidratados por 3 min. Por outro lado, os embriões envasados nas GMP, e previamente desidratados por 3 min, foram os que apresentaram maior taxa de eclosão (60,0% - 52/86). A vitrificação de embriões utilizando soluções crioprototetoras descritas para microvolume não foi eficiente na crioproteção dos blastocistos envasados em palhetas convencionais com a haste de ouro. / The development of efficient vitrification protocols for mammalian embryos still is a challenge for reproductive biologists. Low toxicity cryoprotectant solutions and safe vitrifications procedures that allow sample identification and sanitary control are fundamental factors. Two experiments were conducted to determine the survival rate of vitrified Mus domesticus domesticus embryos loaded into straws containing a metallic piece (manufactured in gold), using cryoprotectant solutions described for microvolume vitrification procedures. In Experiment 1, the toxicity of the dehydratation solution (SD: PBSm +10% EG + 10% PROH + 0,5 M sucrose) was evaluated using three different embryo exposure times: 1 (T1), 3 (T2) or 10 min (T3), in addition as well as the toxicity of the vitrification solution (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) was also tested upon embryo exposure for 25, 60 or 180 sec, previously dehydration for 1 or 3 min. In Experiment 2, the use of macrovolume (straw with a stem of gold) or microvolume (glass micropipettes – GMP) was evaluated for the vitrification of blastocysts after exposure to SV for 25 sec and previous dehydration for 1 or 3 min. Data were analized by the Chi-square test (P<0,05). In Experiment 1, statistical differences were not observed between hatching rates of dehydrated embryos: T1=68.0% (38/56), T2=72.0% (36/50), T3=71.0% (39/55) and control group embryos, (74.0% - 48/65). However, a significant difference (P <0,05) was observed between hatching rates after embryos exposure to the SV. Embryos dehydrated for 1 or 3 min and exposed for 25 sec to the SV showed higher re-expansion (79.0% vs. 84.0%) and hatching rates (58.0% vs. 72.0%) than embryos exposed to SV for 60 or 180 sec. In Experiment 2, after vitrification of the embryos loaded into straws containing a metallic piece showed a hatching rate of 16.0% (10/64) when previouslly dehydrated for 1 min, and 4.0% (2/57) when for 3 min. On the other hand, embryos loaded into GMP, previouslly dehydrated for 3 min, showed a higher hatching rate, (60.0% - 52/60). Embryo vitrification using a cryoprotectant solution described as suitable for microvolume was not efficient to cryoprotect blastocysts loaded into macrovolume straws containing a metallic piece.

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen eqüino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas, pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu- Crio® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio® ,isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico. / During semen cryopreservation, sperm cells were submitted to some deleterious events leading to membrane damage which result in fertility decrease. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing rates and the use of two commercial extenders as cryoprotectants (FR-5® and Botu-Crio®) on the total and progressive motility, integrity and functionality of spermatic membranes during the cryopreservation of equine semen. Twenty ejaculates were analyzed. The total and progressive motility of fresh and postthawing semen samples were evaluated by the patterns assays. The function of plasmatic membrane was measured by the hipoosmotic swelling test. The integrity of plasmatic membrane was evaluated using CFDA/PI fluorescent probes. There were significant differences between the two freezing techniques and/or between cryoprotectants for all assessed parameters. The combined used between Botu-Crio® and automated curves showed better results in total and progressive post-thawing motility. The extender Botu-Crio®, alone, showed better results in order to preserve the membrane integrity and function.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-10T21:23:06Z No. of bitstreams: 1 2017_LigianedeOliveiraLeme.pdf: 1254618 bytes, checksum: 056b35332f8c0d914e9ba088b6e79b03 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-26T15:37:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LigianedeOliveiraLeme.pdf: 1254618 bytes, checksum: 056b35332f8c0d914e9ba088b6e79b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T15:37:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LigianedeOliveiraLeme.pdf: 1254618 bytes, checksum: 056b35332f8c0d914e9ba088b6e79b03 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / O sucesso da criopreservação de embriões bovinos é essencial para melhor aproveitamento de embriões produzidos em excesso, para o estabelecimento de bancos de germoplasma e para comercialização de genética. Neste estudo, foi analisada a alteração na expressão de genes induzida pelo procedimento de vitrificação por Cryotop em blastocistos bovinos usando lâminas de microarranjo EmbryoGENE. Embriões bovinos produzidos in vitro em estágio de blastocisto (144 a 156 horas pós-inseminação) foram vitrificados com Cryotop e não vitrificados (controle). Após 4 horas de cultivo, embriões que re-expandiram ou evoluíram para o estágio de blastocisto expandido foram usados para análises do microarranjo e para quantificação em reação de cadeia de polimerase em tempo real (qPCR). As análises da expressão global revelaram 43 genes diferencialmente expressos em embriões vitrificados comparados aos do grupo controle (p<0,05). Um total de 9 genes foram validados por qPCR, dos quais o FOSL1, envolvido no processo de apoptose, mostrou expressão diferencial (p<0,05) para ambos os métodos, estando super-expresso em embriões vitrificados. Os resultados sugerem que a apoptose tem um papel fundamental na resposta de embriões ao processo de vitrificação. Considerando que a resposta à vitrificação está muito relacionada à qualidade do embrião, levantou-se a hipótese de que a seleção dos embriões para a vitrificação poderia influenciar também a diferença na proporção macho:fêmea, devido a velocidade de desenvolvimento e tolerância ao estresse. Por isso, na segunda etapa deste estudo, foi avaliado o efeito de touros na cinética do desenvolvimento embrionário e na resposta dos embriões à criopreservação. Para isso foram utilizados 5 touros e comparou-se além da produção de embriões, a resposta à criopreservação pelo método Cryotop dos embriões produzidos. Inicialmente, embriões em estágio de blastocisto foram vitrificados (144 a 156 horas pós-inseminação), para avaliação da criotolerância relativa aos touros; enquanto que embriões em estágio de blastocisto expandido foram removidos do cultivo no D6, D7 e D8, e sexados, para avaliação da cinética de desenvolvimento. Na segunda etapa, embriões em estágio de blastocisto expandido foram vitrificados (168 horas pós-inseminação). Todos os embriões (re-expandidos, evoluídos para o estágio de blastocisto eclodido e degenerados), de ambos tratamentos, com 24 horas de cultivo pós-vitrificação foram usados para sexagem. Os resultados sugerem que a escolha do touro, apesar de não interferir na cinética de desenvolvimento embrionário (p>0,05), afeta a produção de blastocistos e também a resposta à criopreservação (p<0,05). E ainda, que os touros que produzem embriões mais crioresistentes nem sempre são os que produzem maior taxa de embriões PIV. Além disso, embriões macho e fêmea têm a mesma capacidade de resposta à vitrificação por Cryotop. / The cryopreservation success of bovine embryos is essential for the better use of excess produced embryos, for the establishment of germplasm banks and genetics commercialization. In this study, gene expression alteration induced by the Cryotop vitrification procedure in bovine blastocysts using EmbryoGENE microarray slides was analyzed. Bovine in vitro produced embryos at blastocyst stage (144 to 156 hours postinsemination) were vitrified with Cryotop and non-vitrified (control). After 4 hours of culture, re-expanded or expanded blastocyst stage embryos were submitted to microarray analyzes and real time polymerase chain reaction (qPCR) quantification. Global gene expression analysis revealed 43 differentially expressed genes in vitrified embryos compared to control group (p <0.05). Nine genes in total were evaluated by qPCR, of which FOSL1, involved in apoptosis process, showed differential expression (p <0.05) for both methods, being overexpressed in vitrified embryos. The results suggest that apoptosis plays a key role in embryos response of vitrification process. Considering that vitrification response is closely related to embryo quality, it was hypothesized that embryos selection for vitrification could also influence the difference in male:female ratio due to developmental speed and stress tolerance. Therefore, in the second stage of this study, the bull´s influence on embryo developmental kinetics and embryo response to cryopreservation was evaluated. For this, five bulls were taken and embryos cryopreservation by Cryotop method was compared in addition to embryo production. Initially, blastocyst stage embryos were vitrified (144 to 156 hours post-insemination), to evaluate the cryotolerance relative to the bulls; while expanded blastocyst stage embryos were removed from culture at D6, D7 and D8, then sexed for developmental kinetics. As a second experiment, expanded blastocyst stage embryos were vitrified (168 hours post-insemination). All embryos (re-expanded, hatched blastocyst stage e, and degenerated) of both treatments, with 24 hours post-vitrification culture were used for sexing. The results suggest that sire´s choice, although not interfering in embryonic development kinetics, affects the blastocysts rates and the cryopreservation response. Besides, bulls producing more cryoresistent embryos are not always the ones that produce the highest IVP embryo rate. In addition, male and female embryos have the same Cryotop vitrification response.

A presente tese aborda os principais aspectos da biologia do vírus Epstein-Barr (EBV), suas relações com doenças, seu potencial uso como ferramenta para a biologia celular e a reprodutibilidade desta célula para o auxílio no diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM) através da medida de atividades de hidrolases lisossômicas. Os objetivos deste trabalho foram investigar as alterações celulares e morfológicas nos linfócitos B infectados com EBV, afim de confirmar a transformação celular nos 12 dias de cultura, para certificação do protocolo empregado; determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180, 365 e 730 dias de criopreservação em nitrogênio líquido, das enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a- glicosidase e a-iduronidase em Linhagens Celulares Linfoblastóides (LCL) transformados com EBV de indivíduos normais e determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180 dias de criopreservação das enzimas β-glicosidase, a-galactosidase e a- iduronidase em LCLs transformados com EBV de pacientes com doenças de Gaucher e Fabry e Mucopolissacaridose tipo I. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo EBV através das 3 ferramentas utilizadas: imunohistoquímica, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia confocal. Foram observados, através destes instrumentos, o aparecimento de clusters celulares, vacúolos citoplasmáticos, binucleação e aumento no conteúdo de organelas, o que é esperado em células infectadas por EBV. Foi observado também que as células cultivadas por 12 dias com EBV apresentavam a atividade da β-glicosidase e da a-iduronidase diferente significativamente daquela de linfócitos não infectados. Após 6 meses, 1 e 2 anos de criopreservação das células transformadas com EBV, em nitrogênio líquido, as enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a-glicosidase e a-iduronidase mantiveram suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. O mesmo ocorreu quando utilizamos amostras de pacientes com doença de Gaucher, Fabry e Mucopolissacaridose tipo I após 6 meses de criopreservação. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo vírus Epstein Barr e que uma vez congeladas até pelo menos 1 ano em nitrogênio líquido, todas as enzimas analisadas mantém suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. / The present study addresses the main aspects of the biology of the Epstein-Barr virus (EBV) and its relationships with diseases, its potentials as a tool in cell biology, and the reproducibility of EBV-infected cells to assist in the diagnosis of Inborn errors of metabolism (IEM) using a measure of the activities of lysosomal hydrolases. The objectives of this study were (i) to investigate the cellular and morphological changes in B-lymphocytes infected with EBV to confirm cell transformation within the 12-day culturing period in order to verify the applicability of the method; (ii) to determine the activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-iduronidase, α-galactosidase and α- glucosidase in lymphoblastoid cell lines at the moment of collection (12-day culturing) and immediately after 180, 365 and 730 days in lymphoblastoid cell lines (LCLs) transformed with EBV of normal individuals frozen in liquid nitrogen and (iii) to determine the activities of the enzymes β-glucosidase, α- galactosidase and α-iduronidase at the moment of collection (12 days of culturing) and immediately after 180 days in LCLs transformed by the EBV of patients with Gaucher and Fabry diseases and with muccopolysaccharidosis type I frozen in liquid nitrogen. The results showed that the protocol was efficient to transform B-lymphocytes by EBV using three tools: immunohistochemistry, transmission electron microscopy and confocal microscopy. The technique afforded to observe the emergence of clusters, cytoplasm vacuoles, binucleatoon and increased organelle contents, which are expected in EBV-infected cells. Also, it was observed that cells cultured with EBV for 12 days presented β-glucosidase and α-iduronidase significantly different from that of non-infected lymphocytes. Activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-galactosidase. α-glucosidase and α- iduronidase measured after 180, 635 and 730 days in cryopreservation of EBVtransformed cells in liquid nitrogen were similar to that of samples after 12-day culturing of cells. The same was observed when we used samples from patients with Gaucher, Fabry and muccopolysaccharidosis type I after a 6-month cryopreservation period. This study shows that the protocol was efficient in transforming B-lymphocytes by EBV and that the activities of all enzymes frozen for at least one year in liquid nitrogen remained similar to that of samples collected after 12-day culturing.

Orientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Maria Inês Lenz Souza / Banca: Rubens Paes de Arruda / Banca: César Roberto Esper / Banca: Maria Denise Lopes / Resumo: Várias pesquisas foram desenvolvidas visando a melhoria da congelabilidade do sêmen ovino. Contudo, ainda não houve progressos significativos na fertilidade do sêmen congelado após a inseminação artificial cervical. Diversos sistemas de análise computadorizada do movimento espermático (CASA) têm sido propostos e aplicados na tentativa de quantificar características específicas do movimento espermático, podendo ainda determinar a presença e a cinética das subpopulações de espermatozóides. Muitos testes para avaliar a função espermática foram desenvolvidos, permitindo analisar simultaneamente diferentes aspectos da função espermática. Análise da função mitocondrial oferece uma maneira de acessar a motilidade espermática. Foram objetivos otimizar o sistema CASA na avaliação do sêmen congelado; determinar parâmetros da cinética espermática que expressem analogia com as características da avaliação das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial (IP, FITC-PSA e JC-1; MITO; R-123) e utilizar conjuntamente os parâmetros fornecidos pelo sistema CASA e pelas sondas fluorescentes para agrupar as amostras de maneira qualitativa. Vinte e seis amostras de sêmen congelado de diferentes carneiros foram estudadas pelo CASA obtendo-se para os parâmetros VCL, VAP, VSL, ALH, BCF, LIN, STR, ELONG dados médios e individuais para cada espermatozóide e por sondas fluorescentes para a avaliação simultânea da integridade de membrana plasmática, reação acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. Estatisticamente aplicou-se a análise exploratória de técnicas multivariadas obtendo-se três fatoriais sendo o primeiro fator F1 positivo e alto para as variáveis VAP, VSL, STR e LIN, que é interpretado com um fator relacionado à progressividade. Para o segundo fator F2, associam as variáveis VCL, ALH e MT, que representam um fator de deslocamento...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Many researches were developed to improve the ram semen criopreservation. However, no significant advances in the fertility rates with the frozen semen were observed with cervical artificial insemination. Several computer-assisted motility assessments (CASA) systems have been considered and applied in the attempt to quantify specific characteristics of the sperm motion and still them being able to determine the spermatozoa presence and subpopulations kinematics. A large number of sperm functions evaluation had been developed, making it possible to analyze different aspects of the sperm function simultaneously. Analysis of the mitochondrial function offers a way to have access the sperm motility. The aim of this study was to optimize the CASA system in the evaluation of the ram frozen semen; determine parameters of the sperm kinematics that express analogy with the characteristics of the evaluation of plasmatic, acrossomal and mitochondrial membranes (PI, FITC-PSA and JC-1; MITO; R-123) and use CASA parameters together with the fluorescent probes to group samples in a qualitative way. Twenty and six frozen semen samples of different rams were evaluated by CASA system for mean and individual sperm motion parameters VCL, VAP, VSL, ALH, BCF, LIN, STR, ELONG and for fluorescent probes leads for the simultaneous evaluation of the integrity of plasmatic, acrossomal membranes and membrane mitochondrial potential. The statistic applied was multivariate analysis getting to three different factorials. The first factor was positive and high (F1 factor) for variables VAP, VSL, STR and LIN, that were interpreted with the forward displacement. For F2 factor, there were associate variables VCL, ALH and MT that represent the displacement. The F3 factor, whose interpretation has to do with available energy, was associated with variables BCF, MITO and ELONG...(Complete abstract, click electronic address below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:48:51Z : No. of bitstreams: 1 lopes_ts_me_jabo.pdf: 688516 bytes, checksum: 27e94cbe3ca54f1add6bd864e9eea47c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo do trabalho foi acompanhar os efeitos durante o resfriamento, em quatro estádios de desenvolvimento embrionário de pacu, Piaractus mesopotamicus, em dois tempos de estocagem, seis e 10 horas. Embriões em quatro estádios de desenvolvimento (blastoderme, 64 células - 1,4-horas pós-fertilização, hpf; 25% do movimento de epibolia - 5,2-hpf; fechamento do blastóporo – 8-hpf e; aparecimento da vesícula óptica - 13,3-hpf) foram expostos a uma solução crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M). A seguir, os embriões passaram por curva de resfriamento de 1°C por minuto até -8°C, onde foram mantidos nos dois períodos de estocagem. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, as taxas de eclosão dos embriões foram avaliados para cada tratamento, com seis repetições, comparando-se com o controle que não foi resfriado. O número total de larvas estimadas para as duas primeiras fases do desenvolvimento ontogenético (1,4- e 5,2- hpf) foi estatisticamente menor que nas demais fases. Entretanto, os estádios de 8 e 13,3- hpf não diferiram entre si (49,90%±6,71 e 55,24%±6,71), respectivamente, encontrando-se mais próximas ao controle (90,67%±6,56). Além disso, a permeabilidade das membranas, estimada através do diâmetro dos embriões, variou estatisticamente do controle para seis e 10 horas de estocagem, quando utilizado os estádios de 1,4 e 5,2-hpf, enquanto para os demais não houve diferença. Da mesma forma, pode-se verificar que houve correlação negativa entre o número total de larvas e o diâmetro do embrião. Sendo assim, a utilização dos estádios embrionários de 8 e 13,3-hpf são os mais recomendados para o resfriamento de embriões de pacu estocados até 10 horas, a -8°C. / The objective of this research was to verify the effects of cooling of embryos of pacu, Piaractus mesopotamicus, in four stages of development, for two stocking periods. The stages of embryo development were: at blastoderm, ~64 cells - 1.4 hours after fertilization (haf); at 25% of the epiboly movement - 5.2 haf; at blastoporous closing - 8.0 haf; and at optical vesicle appearing - 13.3 haf. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution containing methanol (10%) and sucrose (0.5M). After that, embryos were submitted to a cooling curve (-1oC/min) until -8oC and then kept at -8oC for six or ten hours. Also, for each stage of embryo development a control group with not cooled embryos was used to compare the eclosion rates. The total number of larvae estimated for the first two stages of ontogenetic development (1.4 and 5.2-haf) was lower compared to the other stages. There was no difference for the total number of larvae between the stages 8.0 e 13.3-haf (49.90%±6.71 and 55.24%±6.71, respectively). Therefore, the utilization of the embryonary stages of 8.0 and 13.3-haf are recommended for cooling pacu embryos stored up to 10 hours at -8 ° C.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-09-04Bitstream added on 2014-06-13T20:50:08Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_gtnm_me_araca.pdf: 473953 bytes, checksum: f471fe3fe294467c9ef7539797d814f9 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivo: avaliar a aplicação clínica do implante da membrana amniótica canina criopreservada associada ou não ao transplante de limbo e do recobrimento conjuntival 360º no tratamento de úlceras de córnea profundas. Métodos: quinze cães com ulceração corneal clínica profunda foram alocados em três grupos: GI= recobrimento conjuntival 360º (n=5); GII= implante no bordo da úlcera de membrana amniótica associada ao recobrimento com a terceira pálpebra (n=5) e GIII= implante de membrana amniótica associado ao transplante de limbo córneoescleral autólogo e ao recobrimento com a terceira pálpebra (n=5). Os parâmetros clínicos avaliados foram: blefarospasmo, secreção ocular, vascularização corneal, defeito epitelial, opacificação corneal e qualidade cicatricial em seis momentos (inicial, 1, 3, 7, 15 e 30 dias de posoperatório). Resultados: no GI, não se observou aderência do recobrimento conjuntival 360º na úlcera (n=2), deiscência da sutura do recobrimento conjuntival (n=2), sinéquia anterior (n=2) e intensa quemose (n=1). Nos GII e GIII não foram observadas estas complicações. Os animais do GII e GIII apresentaram cicatrização epitelial no M15 e o GI somente M30 (p<0,05). Com relação aos outros parâmetros oftálmicos, a diferença foi significante entre momentos inicial e final no mesmo grupo (blefarospasmo, secreção ocular, vascularização). A cicatriz corneal apresentouse de maneira mais intensa, densa e desorganizada no GI. Conclusão: o implante da membrana amniótica associada ou não ao transplante de limbo demonstrou ser mais eficaz no tratamento de úlceras profunda de córnea, quando comparado ao recobrimento conjuntival 360º / Purpose: to evaluate the clinical application of implant of the canine cryopreserved amniotic membrane (DMEM plus DMSO 1:1) with or without limbal transplantation and 360° conjunctival flap in the treatment of progressive corneal ulceration. Methods: 15 dogs of the different breeds, males and females, aging four months to four years old with deep corneal ulceration and different clinical progression were divided in two groups: GI=360° conjunctival graft (n=5); GII=implant of amniotic membrane, sutured at the edge of the ulcer with epithelial side facing up, associated with the third eyelid flap (n=5) and GIII=implant of amniotic membrane associated with the transplantation of autologous limbal cornealscleral and covering with the third eyelid flap (n=5). The comparative analysis between groups was: complications of the technique used, blepharospasm, ocular secretion, corneal vascularization, epithelial defect and corneal opacification in six moments (first emergency care, surgery and 3, 7, 15 and 30 days of postoperative). It was used a score scale for subjective quantified of the ocular signs. Results: in GI, it was observed the non adherence of the conjunctival graft to the ulcer (n=2), dehiscence of the suture (n=2), anterior synechia (n=2) and intense chemosis (n=1). In GII and GIII, it was not observed these complications. GII and GIII showed epithelial healing in M15 and GI only M30 (p<0,05). The other ophthalmic parameters, the difference was significant between initial and final in the same group (blepharospasm, ocular discharge, vascularization). The corneal scar presented in a more intense, dense and disorganized in GI. Conclusions: According to the clinical results, the cryopreserved amniotic membrane implant or not in association with transplantation of limbo showed to be more effective in the treatment of deep corneal ulcers compared to the 360° conjunctival flap