Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: Marco Antônio Alvarenga / Banca: Rubens Paes de Arruda / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficiência na congelabilidade e fertilidade da substituição da gema de ovo pela lecitina de soja no diluidor comercial Botu-Crio® (BC). Foram realizados dois experimentos laboratoriais e os respectivos testes de fertilidade. No experimento I comparou-se o diluente Botu-Crio® com o diluidor o Botu-Crio em que a gema de ovo foi substituída pela lecitina de soja numa concentração de 45g/L (BCLS45). Utilizou-se um ejaculado de 15 garanhões da raça Brasileiro de Hipismo (BH). Para o teste de fertilidade do Experimento I foi utilizado um garanhão da raça BH. Foram inseminados 12 éguas com o BC e 17 com o BCLS45. No experimento II comparou-se o diluente BC com o Botu-Crio sem gema de ovo (BCLS) acrescido de diferentes concentrações de lecitina de soja: 10,0; 12,5; 15,0; 17,5 e 20,0g/L (BCLS10; BCLS 12,5; BCLS15; BCLS17,5 e BCLS 20). Para tal, foram utilizados 1 ejaculado de 10 garanhões dde diferentes raças. Para o teste de fertilidade do experimento II utilizou-se um garanhão da raça Trakener e foram realizadas inseminações comparativas entre BC e BCLF20, sendo utilizadas 12 éguas com BC vs 10 éguas com BCLS20. Também comparou-se os diluente BC com o BCLS10, no qual foi utilizado um garanhão da raça Westfalen e foram inseminadas 8 éguas com BC vs 12 éguas com BCLS10. No Experimento I, os resultados de motilidade total, (61,4±16,2x61,4±15,9); motilidade progressiva, (27,0±9,8x26,7±10,6); íntegridade da membrana plasmática (IMP) (53,4±11,5x57,4±7,0); respectivamente para os diluidores Botu-Crio® e BCLS45, não havendo diferença entre os parâmetros espermáticos (p>0,05). No experimento II também não foram observadas diferenças entre os parâmetros avaliados, sendo para motilidade total BC (68,1±15,9) e BCLS10; BCLS12,5; BCLS15; BCLS17,5 e BCLS20 (65,8±13,5; 65,9±17,6; 67,6±11,2; 64,0±15,3 e 60,5±15,3)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of the present study was to verify the freezability and fertility of the BotuCrio without egg yolk extender where the egg yolk was replaced by soy been lecithin. Two experiments were performed on experiment 1 Botu-Crio® (BC) and Botu Crio without egg yolk containing 45g/L soy been lecithin (BCLS45) were compared. One ejaculated from 15 stallions from Braziliam Jump Horse Bred were used. On experiment 2, different concentrations of de soy bean lecithin: 10,0; 12,5; 15,0; 17,5 e 20,0g/L (BCLS10, BCLS12,5, BCLS17,5 e BCLS20) were compared. On the first fertility trial 12 mares were inseminated. With BC and 17 mares with Botu-Crio without egg yolk (BCLS45) using semen from only one stallion. On the second fertility trial 12 mares were inseminated with BC and another 10 mares with BCLS20. In another fertility trial 12 mares were inseminated with Botu-Crio vs and 8 mares with BCLS10 using frozen semen from a Westfalen stallion. No differences were observed on total motility (61.4 x 61.4); progressive motility, (27.0x26.7); plasmatic menbrane integrity (IMP) (53.4x57.4); between Botu-Crio® and Botu-Crio without egg yolk, (p>0,05). Also no differences were observed when different concentrations of soy been lecithin were used. The results were : For total motility BC (68,1±15,9) BCLS10, BCLS12,5, BCLS17,5 , BCLS20 (65,8±13,5; 65,9±17,6; 67,6±11,2; 64,0±15,3 ,60,5±15,3), for progressive motility: BC (28,8±9,2) and BCLS10, BCLS12,5, BCLS17,5 e BCLS20(29,8±9,8; 29,6±9,7; 31,4±8,2; 30,2±10,5 and 26,6±11,5) and IMP BC (50,7±10,3) and BCLS10, BCLS12,5, BCLS17,5 e BCLS20 (47,5±8,5; 46,6±12,2; 49,9±8,8; 46,1±10,3 and 43,6±10,9). The results of the fertility trials were: BC vs BCLS45 , 66,0 e 17% respectively (p<0,01); BC vs BCLS20 66,0 e 40,0% e BC vs BCLS10 75,0 e 41,0 respectively. In spite of similar laboratorial finds the fertility was different between... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Eunice Oba / Banca: Daniel Bartoli de Souza / Resumo: O sêmen ovino congelado e descongelado sofre alterações morfofuncionais que impossibilitam ou diminuem a eficiência na fecundação. Os métodos de seleção espermática visam melhorar a qualidade e viabilidade do material fecundante. Quatro métodos de seleção espermática utilizando duas soluções de sílica coloidal revestida por silano (silica coloidal-silano) ou por polivinilpirrolidona (silica coloidal-PVP), variando o volume de solução coloidal. Foram testados a cinética espermática no CASA e a recuperação espermática. Os protocolos utilizando silica coloidal-silano apresentaram maior motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e porcentagem de espermatozoides rápidos (%RAP) quando comparado aos métodos utilizando a silica coloidal-PVP e às amostras antes da seleção espermática. A silica coloidal-PVP teve maior recuperação espermática quando comparado à silica coloidal-silano. Somente o método utilizando 4mL de silica coloidal-PVP não foi eficiente na seleção de amostras com melhor qualidade quando comparado às amostras analisadas antes da seleção espermática. Os métodos utilizando menores volumes de solução coloidal não diferiram dos métodos de maior volume, sendo a silica coloidal-silano com 1 mL o método que apresentou os melhores resultados. Como conclusão os resultados encontrados no trabalho apontaram a maior eficiência da silica coloidal-silano em selecionar sêmen ovino congelado e descongelado quando comparado à seleção em silica coloidal-PVP. O método utilizando 1mL de silica coloidal-silano foi igualmente eficiente ao método com maior volume, sendo uma alternativa para processar amostras com baixa concentração espermática / Abstract: Frozen and thawed ovine semen undergo morphofunctional changes that prevent or decrease the efficiency of fertilization. Sperm selection methods have beneficial effects on the selected sperm, improving sperm quality and viability. Four methods of sperm selection were tested using two colloidal silica solutions coated with silane (silica colloid- silane) ou povinilpirrolidone (silica colloid-PVP), varying the volume of colloidal solution. Furthermore, analyses of sperm kinetics in CASA and sperm recovery were carried out. The protocols using silica colloid-silane resulted in greater MT, MP, and %RAP when compared to the methods using silica colloid-PVP and the semen before selection. Silica colloid-PVP had higher sperm recovery when compared to silica colloid-silane. Only the method using 4mL of silica colloid-PVP was not efficient in the selection of best quality samples when compared to the semen before selection. The methods using lower volumes of colloidal solutions did not differ from the methods with higher volumes, being the method with 1mL of silica collois-silane better than the 4mL method. In conclusion the results of the study indicate the superiority of silica colloid-silane in selecting frozen and thawed ovine semen when compared to silica colloid-PVP. The method using 1mL of silica colloid-silane was equally efficient to the standard method and has lower costs, being an interesting alternative to process samples with low sperm concentration / Mestre

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: José Antonio Dell'Aqua Junior / Banca: Eunice Oba / Banca: Alicio Martins Junior / Banca: Rubens Paes de Arruda / Resumo: O objetivo do estudo foi comparar a efetividade de três diluidores empregados para criopreservação e refrigeração do sêmen bovino em relação aos padrões de motilidade, integridade de membrana plasmática e acrossomal, índice de peroxidação lipídica e fertilidade nos programas de inseminação artificial em tempo-fixo (IATF). No Trabalho científico número 1 foi comparado a viabilidade e fertilidade pós-descongelação proporcionada pelos diluidores Tris-frutose (TRIS, Controle) e Botu-Bov® (BB), ambos contendo 20% de gema de ovo como fonte de lipoproteínas, frente à diluição em Botu- Bov®-Lecitina de Soja (meio BB-L) apresentando 1% de lecitina em substituição ao produto de origem animal. No Trabalho 2 foram avaliados os mesmos diluentes quando utilizados para a refrigeração do sêmen bovino por 48 horas a 5°C. Já no Trabalho número 3 foi avaliada a taxa de concepção na inseminação artificial (C/IA) proporcionada pelo sêmen bovino refrigerado por 24 horas em meio Botu-Bov® em comparação ao sêmen convencionalmente criopreservado no mesmo diluidor. Os meios TRIS e BB a base de gema de ovo foram mais efetivos na manutenção da viabilidade espermática pósdescongelação, conferindo melhores resultados de C/IA (P<0,05) em relação ao meio BBL. No entanto, quando utilizado o sêmen na forma líquida e refrigerado (Trabalho número 2) foi observada uma maior proteção contra o estresse oxidativo proporcionado pelo diluidor a base de lecitina de soja, resultando em maior probabilidade de prenhez quando comparado às amostras refrigeradas em TRIS ou BB, alcançando índice de concepção similar ao obtido com o sêmen congelado. A utilização do sêmen bovino refrigerado por 24 horas levou ao aumento da C/IA de vacas submetidas a IATF quando comparado ao sêmen congelado em meio Botu-Bov®. Conclui-se que embora a lecitina de soja represente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to compare three different extenders used for cryopreservation of bovine semen, based on the results obtained during the cooling storage and post-thaw evaluation for motility patterns, integrity of plasmatic and acrossomal membranes, lipid peroxidation rate, as well as conception rate after fixed-time artificial insemination (FTAI). In Paper.1, the efficiency of Tris-Fructose extender (TRIS, control group), Botu-Bov® extender (BB), both containing 20% of egg yolk, and Botu-Bov®-Lecithin extender (BBL), which has 1% of soy lecithin instead of egg yolk, were compared in cryopreservation of bovine semen. In Paper.2, ejaculates from different bulls were cooled to 5°C for 48 hours using the same extenders of Paper.1. In Paper.3 the fertility trial was conducted either with frozen-thawed semen or cooled semen for 24 hours in the BB extender. The egg yolk extenders, TRIS and BB, demonstrated significant differences on the viability and the fertility of frozen-thawed bovine semen when compared to BB-L (P<0.05). However, the use of lecithin instead of egg yolk on semen extender resulted in a greater protection against oxidative stress; moreover, this extender improved the conception rates, reaching the results obtained in FTAI programs with frozen-thawed semen. The use of cooled bovine semen at 5°C for 24 hours improves the conception rate of Nelore cows submitted to FTAI. Although soy lecithin is an interesting alternative source of phospholipids in the elaboration of chemically defined extenders and decrease the risk of microbiological contamination, the egg yolk semen extenders are more effective in preserving the viability and fertility of frozen-thawed bovine semen. However, there was a higher production of free radicals in cooled semen with the use of egg yolk based extenders, resulting in lower conception rates when compared to frozen-thawed... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Antonio Dell'Aqua Junior / Banca: Frederico Ozanam Papa / Banca: André Maciel Crespilho / Resumo: A inseminação artificial com sêmen refrigerado é uma biotecnia imprescindível para os programas reprodutivos de equinos. Entretanto, durante a refrigeração o espermatozoide pode sofrer danos irreversíveis que irão prejudicar os índices de fertilidade. A incorporação de colesterol ligado a ciclodextrina (CLC) é uma estratégia de aumentar a resistência espermática em baixas temperaturas. No entanto, estudos anteriores tem sugerido que o colesterol presente em altos níveis na membrana plasmática pode interferir no processo de capacitação e consequentemente de fertilização. Para isso, foi realizado um trabalho dividido em cinco experimentos. No experimento 1 o objetivo foi determinar a concentração mais adequada de CLC para a utilização na refrigeração de espermatozoides equinos. No experimento 2 o objetivo foi comparar as temperaturas de 15º C e 5º C para refrigeração de espermatozoides equinos tratados com CLC. No experimento 3 o objetivo foi verificar a influência da adição de CLC sobre a qualidade do sêmen refrigerado de garanhões bad cooler e good cooler. No experimento 4 o objetivo foi avaliar a influência da adição de CLC sobre a ocorrência de reação acrossomal. O objetivo do experimento 5 foi avaliar a fertilidade de espermatozoides refrigerados de garanhões bad cooler (BC) e good cooler (GC) tratados com CLC. No experimento 1 foram utilizados dois ejaculados de 24 garanhões. Após a diluição com Botu-Sêmen® na concentração de 50 x 106 espermatozoides/mL, cada ejaculado foi dividido em quatro grupos: controle (C) e tratado com 1 mg (CLC-1), 1,5 mg (CLC-1,5) e 2 mg (CLC-2) de CLC/120 x 106 de espermatozoides e refrigerado por 48 horas a 5º C. Para o experimento 2 foram utilizados dois ejaculados de 12 garanhões. Cada ejaculado foi diluído conforme o experimento 1, dividido em quatro grupos: C e CLC-1,5 refrigerados a 15º C e a 5 º C por 24 horas. Para o experimento 3 foram utilizados ... / Abstract: Artificial insemination with cooled semen is an invaluable biotechnique for equine reproductive programs. However, the cooling process may cause irreversible damage to spermatozoa, thus reducing fertility rates. The incorporation of cholesterol-loaded cyclodextrin (CLC) to the plasmatic membrane is an strategy to increase sperm resistance to low temperatures. However, previous studies have suggested that high levels of cholesterol may interfere with capacitation process and, consequently, with fertilization. To this end, a study was performed in five experiments. In experiment 1, the aim was to determine the best CLC concentration for the purpose of cooling equine spermatozoa. In experiment 2, the aim was to compare the temperatures of 15 ºC and 5 ºC for cooling equine semen treated with CLC. In experiment 3, the aim was to assess the influence of CLC addition for cooled semen quality of bad cooler (BC) and good cooler (GC) stallions. In experiment 4, the aim was to evaluate the influence of CLC addition for the occurrence of acrosome reaction. The aim of experiment 5 was to evaluate the fertility of cooled CCL-treated semen from BC and GC stallions. In experiment 1, two ejaculates from 24 stallions were used. After dilution with Botu-Sêmen® to a concentration of 50 x 106 cells/mL, each ejaculate was divided into four groups: control (C) and treated with 1 mg (CLC-1), 1.5 mg (CLC-1.5) and 2 mg (CLC-2) and 2 mg (CLC-2) of CLC/120 x 106 cells, and cooled for 48 hours at 5 ºC. For experiment 2, two ejaculates from 12 stallions were used. Each ejaculated, after dilution according to experiment 1, was divided into 4 groups: C and CLC-1.5 cooled at 15 ºC and 5 ºC for 24 hours. For experiment 3, two ejaculates from nine GC and nine BC stallions were used. The ejaculates were diluted according to the previous experiments and divided into two groups: C and CLC-1.5 cooled at 5 ºC for 48 hours. In experiments 1, 2 and 3, sperm ... / Mestre

Orientador: José Antônio Dell'Aqua Júnior / Banca: Frederico Ozanam Papa / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Banca: Rubens Paes de Arruda / Banca: André Maciel Crespilho / Resumo: Os equinos e asininos pertencem à família Equidae e género Equus, por este motivo são considerados similares e tratados de forma equivalente em relação à fisiologia reprodutiva. A membrana plasmática do espermatozoide funciona como uma barreira física ao ambiente externo e a sua integridade estrutural está diretamente relacionada ao tipo e quantidade de lipídios que a compõem. Desta forma, este estudo teve como objetivos comparar perfil lipídico dos espermatozoides de jumentos e cavalos e comparar o perfil lipídico da membrana dos espermatozoides de jumentos antes e após os processos de criopreservação. No Experimento 1 comparamos o perfil lipídico da membrana espermática de jumentos e cavalos e foram identificados 101 íons lipídicos em cavalos e 105 em jumentos. Os asininos apresentaram maior abundância relativa em 18 íons. No Experimento 2 foram avaliadas as alterações do perfil lipídico da membrana espermática de jumentos durante o processo de criopreservação e observou-se perda de 14 íons lipídicos e 16 novos íons surgiram após os processos de criopreservação. De acordo com os resultados obtidos podemos concluir que a composição lipídica da membrana do espermatozoide de jumentos é diferente de cavalos e os processos de criopreservação levam a alterações na composição de fosfolipídeos da membrana plasmática de espermatozoides de jumentos / Abstract: The horses and donkeys belong to the Equidae family and genus Equus, for this reason are considered similar and treated equivalently with respect to reproductive physiology. The plasma membrane of the sperm works as a physical barrier to the external environment and its structural integrity is directly related to the type and quantity of lipids that comprise it. Thus, this study aimed to compare the lipid profile of sperm donkeys and horses and compare the lipid membrane of the donkey sperm before and after cryopreservation processes. In Experiment 1 compared the lipid profile of the donkeys and horses sperm membrane and 101 lipid ions were identified in horses and 105 donkeys in. The donkeys had higher relative abundance in 18 ions. In Experiment 2 were evaluated changes in the lipid profile of the donkeys sperm membrane during the cryopreservation process and there was loss of 14 lipid ions and 16 new lipid ions arose after the cryopreservation processes. According to the obtained results we can conclude that the lipid composition of donkey sperm membrane is different from horses and cryopreservation processes lead to changes in the phospholipid composition of the plasma membrane of sperm donkeys / Doutor

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Carlos Eduardo Ambrósio / Resumo: As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos, e por isso são atrativas para a terapia celular, pois possuem alto potencial de diferenciação e proliferação, sendo assim, utilizadas na reconstrução tecidual. O presente experimento objetivou obter maior conhecimento sobre CTMs derivadas da membrana amniótica e cordão umbilical de cães, antes e após criopreservação, visando a formação de um banco de células. Assim, oito amostras de membrana amniótica e oito amostras de gelatina de Wharton foram obtidas de cesarianas, as quais foram submetidas a digestão enzimática, e cultivadas em meio basal. Uma porção celular, de cada amostra, foi criopreservada em 1ª passagem, de forma lenta, e armazenada por 4 semanas. As células antes e após a criopreservação foram submetidas à caracterização, onde foi observado características de adesão, proliferação, diferenciação e expressão de marcadores de superfícies utilizando-se citometria de fluxo, e imunocitoquímica. A partir destas avaliações, foi possível demonstrar que as células antes e após a criopreservação exibiram comportamento semelhante, quanto à proliferação e crescimento. A viabilidade celular da membrana amniótica apresentou 97,0% das células viáveis antes da criopreservação e 94,6% após, já a gelatina de Wharton 98,8 antes e 93,5% após a criopreservação. O potencial de diferenciação nas linhagens osteogênica e adipogênica foi mantido, no entanto foi necessário um tempo maior (p<0,05) para que as células de gelatina de Wharton se diferenciassem após a criopreservação. E ainda mantiveram a expressão de CD44, em níveis satisfatórios para que fossem consideradas positivas, onde a membrana amniótica expressou 85,6% antes e 67,8% após a criopreservação e a gelatina de Wharton expressou 86,0% antes e 82,1% após a criopreservação e a ausência de expressão ... / Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in most of adult tissues, and are therefore attractive for cell therapy. Because of their high potential for differentiation and proliferation, they are being used in tissue reconstruction. This experiment aimed to enrich knowledge of canine MSCs derived from umbilical cord and amniotic membrane before and after cryopreservation regarding the formation of a cell bank. Thus, eight samples of amniotic membrane and eight samples of Wharton's jelly were obtained from dogs at birth, which were subjected to enzymatic digestion and basal medium culture. Slow freezing of a sample from each culture was held at the first passage and stored for four weeks. Before and after freezing cells were subjected to characterization being observed adhesion, proliferation, differentiation and expression of surfaces markers using flow cytometry and immunocytochemistry. Based on these analyses it was demonstrated that the cells before and after cryopreservation exhibited similar behavior for proliferation and cell growth. Cell viability of amniotic membrane showed 97.0% of viable cells before freezing and 94.6% after, and the Wharton's jelly 98.8% before and 93.5% after cryopreservation. The potential of the osteogenic and adipogênica differentiation as well as maintained, however it required a longer time (p <0.05) for the cells from Wharton's jelly to differentiate themselves after freezing. And still maintained the expression of CD44, at satisfactory levels to be considered positive, where the amniotic membrane expressed 85.6% before and 67.8% after freezing and Wharton's Jelly expressed 86.0% before and 82.1% after cryopreservation and absence of expression of CD34 and MHC II. A peculiar feature observed was that before and after freezing spontaneous differentiation in both lineages (osteogenic and adipogenic) occurred in the controls that were not induced to differentiation. We conclude that ... / Mestre

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Coorientador: Marini Melo / Coorientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Marco Antonio Alvarenga / Banca: Ian Martin / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição da asolctina de soja ou da fosfatidilcolina de soja em diluente à base de gema de ovo sobre os parâmetros espermáticos e índices de fertilidade de sêmen congelado de garanhões. No Experimento I, dezenove ejaculados de três garanhões foram submetidos ao processo de criopreservação utilizando três diluentes de congelação: Botu-Crio® (BC), Botu-Crio® adicionado de asolctina de soja (BC+Ac) e Botu-Crio® adicionado de fosfatidilcolina de soja (BC+Fc), para posterior avaliação dos parâmetros de cinética espermática e integridade de membrana plasmática. No Experimento II, comparou-se a taxa de fertilidade referente aos três meios de congelação por meio de inseminação artificial das éguas com "pool" de espermatozoides dos três garanhões. Não houve diferença significativa no que se refere aos parâmetros espermáticos (P<0,05) de motilidade total (69,16±9,28; 64,63±11,05; 68,47±7,92), motilidade progressiva (25,00±5,43; 23,26±5,63; 26,16±5,50), integridade de membrana plasmática (39,37±8,82; 39,95±9,52; 41,63±9,24) e índice de concepção (46,7%, 13,3%, 37,5%) entre os meios BC, BC+Ac e BC+Fc, respectivamente. Entretanto, existiu uma tendência a maior (P>0,05) taxa de fertilidade do diluente Botu-Crio® quando comparado ao meio adicionado de asolctina de soja. Diante dos resultados encontrados, conclui-se que tanto a adição da asolctina de soja quanto da fosfatidilcolina de soja ao diluente Botu-Crio® apresenta a mesma eficácia que o diluente Botu-Crio® convencional na criopreservação de sêmen equino / Abstract:The aim of this study was to evaluate the effect of addition of soybean asolectin and phosphatidylcholine in an egg yolk-based extender on sperm parameters and fertility rates of frozen stallion semen. In Experiment I, nineteen ejaculates from three stallions were submitted to cryopreservation process using three freezing extenders: Botu-Crio™ (BC), Botu-Crio™ with soybean asolectin (BC+Ac) and Botu-Crio™ with soybean phosphatidylcholine (BC+Fc), for further evaluation of kinetic parameters and sperm plasma membrane integrity. In Experiment II, the fertility rates from the three freezing extenders were compared through artificial insemination in mares using a sperm "pool" of three stallions. No significant differences were found on sperm parameters (P<0.05) of total motility (69.16±9.28; 64.63±11.05; 68.47±7.92); progressive motility (25.00±5.43; 23.26±5.63; 26.16±5.50); plasma membrane integrity (39.37±8.82; 39.95±9.52; 41.63±9.24) and fertility rates (46.7%, 13.3%, 37.5%), for the BC, BC+Ac and BC+Fc groups, respectively. However, the tendency toward higher (P>0.05) fertility rates in Botu-Crio™ (BC) freezing extender than the freezing extender containing soybean asolectin (BC + Ac). Based in these results, it is concluded that the both addition of soybean asolectin and phosphatidylcholine to Botu-Crio™ freezing extender has the same effectiveness as the conventional Botu-Crio™ used in the cryopreservation of equine semen / Mestre

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Gilson Hélio Toniollo / Banca: Marcus Antônio Rossi Feliciano / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Banca: Felipe Perecin / Resumo: Com o intuito de aperfeiçoar os resultados da criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV), este estudo foi conduzido com o objetivo principal de avaliar o impacto da suplementação do meio de maturação in vitro (MIV) com ácido linolênico (ALA), associado ou não à L-carnitina (L-car), sobre a maturação e qualidade do oócito, especialmente no que se refere ao metabolismo lipídico, e sobre o desenvolvimento e resistência à criopreservação dos embriões produzidos. Para tanto, em uma primeira etapa (Experimentos I e II) foram realizados experimentos de dose-resposta para determinar as concentrações ideais de ALA (0, 10, 50 ou 100 µM) e L-car (0, 1, 5 ou 10 mM) a serem adicionadas ao meio de MIV, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) ou 0,6% de albumina sérica bovina (BSA). Foram avaliados os efeitos do ALA e L-car sobre a maturação nuclear e citoplasmática (avaliação mitocondrial, acúmulo lipídico intracelular e produção de espécies reativas de oxigênio intracelulares (ROS) em oócitos bovinos) e o subsequente desenvolvimento embrionário. No Experimento I, a adição de 100 µM de ALA em meio de MIV suplementado com SFB resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático e do acúmulo intracelular de ROS, assim como aumento (P<0,05) do potencial de membrana mitocondrial (PMM), em relação às demais concentrações de ALA. No entanto, nenhum desses efeitos prejudicou (P>0,05) a maturação oocitária e o subsequente potencial de desenvolvimento embrionário. No Experimento II, a suplementação do meio de MIV com L-car resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático, na presença de SFB. Somados os efeitos da concentração de 10 mM de L-car na presença de SFB sobre a redução (P<0,05) do PMM e elevação (P<0,05) do conteúdo de ROS e, do efeito negativo (P<0,05) da suplementação do meio de MIV com... / Abstract: In order to improve the results of cryopreservation of bovine in vitro produced (IVP) embryos, this study was conducted with the main objective to assess the impact of in vitro maturation medium (IVM) supplementation with linolenic acid (ALA), associated or not with L-carnitine (L-car), on oocyte maturation and quality, specially regarding to lipid metabolism and on development and cryoresistance of produced embryos. Therefore, in a first step (Experiments I and II) were performed dose-response experiments to determine the optimal concentrations of ALA (0, 10, 50 or 100 μM) and L-car (0, 1, 5 or 10 mM) to be added to IVM medium, supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) or 0.6% bovine sérum albumin (BSA). The effects of ALA and L-car on nuclear and cytoplasmic maturation [mitochondrial evaluation, intracellular lipid accumulation and intracellular production of reactive oxygen species (ROS)] and subsequent embryonic development were evaluated. In Experiment I, the IVM supplementation with 100 mM of ALA in FCS-supplemented medium resulted in reduction (P<0.05) of cytoplasmic lipid and intracellular ROS accumulation, as well as, increased (P<0.05) mitochondrial membrane potential (MMP), relative to the other ALA concentrations. However, none of these effects damaged (P<0.05) oocyte maturation and the subsequent embryo development potential. In Experiment II, the IVM medium supplementation with L-car resulted in significant reduction (P<0.05) of cytoplasmic lipid content even in the FCS presence. Combined effects of 10 mM L-car in FCS-supplemented medium on MMP reduction (P<0.05), ROS production increase (P<0.05), and the negative effect (P<0.05) on embryonic development of BSA IVM medium supplementation, we can conclude that concentration of 5 mM L-car in the presence of FCS exceeded the results of the other groups. Based on previous experiments results, in a second step (Experiment III) ... / Doutor

Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Banca: Marcelo Rezende Luz / Banca: Maricy Apparício Ferreira / Resumo: Objetivou-se com este estudo comparar os efeitos da congelação lenta vs vitrificação sobre a viabilidade, ultraestrutura e expressão gênica de blastocistos caninos produzidos in vivo. A coleta dos embriões foi realizada por lavagem uterina 12 dias após a primeira IA. A congelação lenta foi realizada em máquina programável e a vitrificação pela técnica do cryotop. O cultivo in vitro (CIV) foi realizado por 24 horas, em meio SOFaa acrescido de 20% de soro fetal bovino. A reexpansão embrionária foi avaliada 24 horas após a CIV e a viabilidade embrionária avaliada com o uso das sondas Hoscht 33342 e Iodeto de propídeo. A extração e amplificação do RNA foram realizadas segundo recomendações do fabricante. Foram utilizados 70 blastocistos separados nos grupos Co, Co24, Cg, Cg24, Vi e Vi24. No experimento I foram utilizados 34 embriões. Não foi evidenciada reexpansão da blastocele após 24 horas de CIV nos grupos Cg24 e Vi24, já no grupo Co24, 100% dos embriões reexpandiram. Não foi verificada diferença na intensidade da fluorescência do Hoescht entre os grupos Co, Cg e Vi, em ambos os momentos de avaliação, 0 e 24 horas. Quando comparada a intensidade do iodeto de propídeo (IP) foi observada diferença significativa entre o grupo Co em relação aos grupos Cg e Vi, independente da metodologia de criopreservação. Observou-se uma redução na quantidade de gotas lipídicas após 24 horas de CIV comparando-se os grupos Co e Co24. No grupo Vi foram observadas mitocôndrias alongadas, integridade da membrana dos blastômeros e nuclear, reticulo endoplasmático liso, vesículas de digestão, microvilosidades, junções do tipo tight e desmossomas. No Experimento II, foram utilizados 36 embriões para a avaliação da expressão gênica. Todos os genes estudados, com excessão do LIF, foram expressos. Entretanto, não houve diferença na expressão dos genes BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 e ... / Abstract: The purpose of this study was to compare the effects of slow freezing versus vitrification in canine embryo produced in vitro: viability, ultra structure and gene expression. Embryos collection was performed using uterus flush technique 12 days after the first AI. For slow freezing protocol we used a programmed machine and vitrification was performed using cryotop. In vitro culture (IVC) was conducted for 24 hours using SOFaa added with 20% of fetal bovine serum. Embryo expansion was evaluated 24 hours after in vitro culture (IVC) and embryo viability was evaluated using Hoscht 33342 and iodine propidium (PI). Extraction and amplification of the RNA was performed according to manufacturer recommendations. We used 70 blastocysts divided in groups: Co, Co24, Cg24, Vi and Vi24. In experiment I 34 embryos were used. No blastocoele expansion was observed after 24 hr of IVC in groups Cg24 and Vi24, however 100% of embryos expanded in Co24. No difference was observed in Hoescht staining intensity between Co, Cg and Vi groups, which were observed at the 0 and 24 hr periods. The iodine propidium (PI) intensity in Co was different when compared to Cg and Vi, independent of the cryopreservation method used. A reduction in the quantity of lipid drops was observed after 24 hr of IVC when comparing groups Co and Co24. In group Vi, elongated mitochondria, membrane and nuclear integrity of blastomere, smooth endoplasmic reticulum, vesicle digestion, microvilli, tight junctions and types of desmosomes were observed. In experiment II, 36 dog embryos were used for gene expression evaluation. All studied genes, except LIF were expressed. However no difference between gene expression of BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 and LIFr were observed at 0 and 24h in all groups. We concluded that the vitrification technique was the best method to cryopreserve canine embryo when we observe ultrastructure. However, it was not possible ... / Doutor

Orientador: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Cláudia Valéria Seullner Brandão / Banca: Flávia Rezende Eugênio / Resumo: Objetivo: avaliar a aplicação clínica do implante da membrana amniótica canina criopreservada associada ou não ao transplante de limbo e do recobrimento conjuntival 360º no tratamento de úlceras de córnea profundas. Métodos: quinze cães com ulceração corneal clínica profunda foram alocados em três grupos: GI= recobrimento conjuntival 360º (n=5); GII= implante no bordo da úlcera de membrana amniótica associada ao recobrimento com a terceira pálpebra (n=5) e GIII= implante de membrana amniótica associado ao transplante de limbo córneoescleral autólogo e ao recobrimento com a terceira pálpebra (n=5). Os parâmetros clínicos avaliados foram: blefarospasmo, secreção ocular, vascularização corneal, defeito epitelial, opacificação corneal e qualidade cicatricial em seis momentos (inicial, 1, 3, 7, 15 e 30 dias de posoperatório). Resultados: no GI, não se observou aderência do recobrimento conjuntival 360º na úlcera (n=2), deiscência da sutura do recobrimento conjuntival (n=2), sinéquia anterior (n=2) e intensa quemose (n=1). Nos GII e GIII não foram observadas estas complicações. Os animais do GII e GIII apresentaram cicatrização epitelial no M15 e o GI somente M30 (p<0,05). Com relação aos outros parâmetros oftálmicos, a diferença foi significante entre momentos inicial e final no mesmo grupo (blefarospasmo, secreção ocular, vascularização). A cicatriz corneal apresentouse de maneira mais intensa, densa e desorganizada no GI. Conclusão: o implante da membrana amniótica associada ou não ao transplante de limbo demonstrou ser mais eficaz no tratamento de úlceras profunda de córnea, quando comparado ao recobrimento conjuntival 360º / Abstract: Purpose: to evaluate the clinical application of implant of the canine cryopreserved amniotic membrane (DMEM plus DMSO 1:1) with or without limbal transplantation and 360° conjunctival flap in the treatment of progressive corneal ulceration. Methods: 15 dogs of the different breeds, males and females, aging four months to four years old with deep corneal ulceration and different clinical progression were divided in two groups: GI=360° conjunctival graft (n=5); GII=implant of amniotic membrane, sutured at the edge of the ulcer with epithelial side facing up, associated with the third eyelid flap (n=5) and GIII=implant of amniotic membrane associated with the transplantation of autologous limbal cornealscleral and covering with the third eyelid flap (n=5). The comparative analysis between groups was: complications of the technique used, blepharospasm, ocular secretion, corneal vascularization, epithelial defect and corneal opacification in six moments (first emergency care, surgery and 3, 7, 15 and 30 days of postoperative). It was used a score scale for subjective quantified of the ocular signs. Results: in GI, it was observed the non adherence of the conjunctival graft to the ulcer (n=2), dehiscence of the suture (n=2), anterior synechia (n=2) and intense chemosis (n=1). In GII and GIII, it was not observed these complications. GII and GIII showed epithelial healing in M15 and GI only M30 (p<0,05). The other ophthalmic parameters, the difference was significant between initial and final in the same group (blepharospasm, ocular discharge, vascularization). The corneal scar presented in a more intense, dense and disorganized in GI. Conclusions: According to the clinical results, the cryopreserved amniotic membrane implant or not in association with transplantation of limbo showed to be more effective in the treatment of deep corneal ulcers compared to the 360° conjunctival flap / Mestre