Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-21T13:36:14Z No. of bitstreams: 1 Paulo Cesar Vasco de Albuquerque Peixoto.pdf: 344249 bytes, checksum: dd3eefd193ab58cfcdb099090c32ef23 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-21T13:36:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulo Cesar Vasco de Albuquerque Peixoto.pdf: 344249 bytes, checksum: dd3eefd193ab58cfcdb099090c32ef23 (MD5) Previous issue date: 2008-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In order to evaluate the effect of adding antioxidants Trolox and Glutathione reduced on the in vitro viability of dog cryopreserved sperm, semen samples were harvested from animals of the breeds French Bulldog (n=1), Basset Hound (n=2) e Rottweiler (n=1), through digital manipulation. Then proceeded to the evaluation macroscopic (color, appearance, volume) and microscopic (progressive motility, vigor, DNA, acrosome integrity and oxidative stress), followed by dividing the volume of semen on four aliquots, according to the experiments and experimental groups: Experimental 1 - G1 = Tris- Egg yolk (control group); G2 = Tris- Egg yolk + 200 uM of Trolox and G3 = Tris- Egg yolk + 300 uM of Trolox; Experimental 2 - G1 = Tris- Egg yolk (Control group); G2 = Tris- Egg yolk + 2 uM of GSH and G3 = Tris-Egg yolk + 5 uM of GSH; Experimental 3 - G1 = Tris- Egg yolk (control group); G2 = Tris- Egg yolk + 200 uM of Trolox; G3 = Tris- Egg yolk + 2 uM of GSH and G4 = Tris- Egg yolk + 200 uM of Trolox + 2 uM of GSH. The samples were packaged in straws (0.25 mL), cryopreserved in freezing machine (TK3000) and stored in liquid nitrogen (-196 oC). After thawing a 37 oC and incubation during 60 minutes, it was detected that MP, vigor and sperm with intact acrosomes had significant difference (P<0.05) only among incubation times, on the three experiments. In the Exp. 2, G2 and G3 groups had higher (P<0,05) percentage of sperm with oxidative stress. So, it can be concluded that the incubation time interfere on the in vitro viability of the sperm cells, independently of Trolox and GSH addition; and GSH, on the concentration of 2 and 5 uM, should be added to diluent of dog semen cryopreservation. / Com o objetivo avaliar o efeito da adição dos antioxidantes Trolox e Glutationa reduzida (GSH) na viabilidade in vitro de espermatozóides criopreservados de cães, amostras de sêmen foram colhidas de animais das raças Buldogue Francês (n=1), Basset Hound (n=2) e Rottweiler (n=1), através de manipulação digital. A seguir, procedeu-se à avaliação macroscópica (cor, aspecto, volume) e microscópica (motilidade progressiva, vigor, concentração, integridade do acrossoma e do DNA, e estresse oxidativo), e divisão do volume de sêmen em quatro alíquotas, de acordo com os experimentos e grupos experimentais. Experimento 1: G1 = Tris-gema (Grupo Controle); G2 = Tris-gema + 200uM de Trolox e G3 = Tris-gema + 300 uM de Trolox; Experimento 2: G1 = Tris-gema (Grupo Controle); G2 = Tris-gema + 2 uM de GSH e G3 = Tris-gema + 5 uM de GSH; Experimento 3: G1) Tris-Gema (Grupo Controle); G2) Tris-Gema + 200 uM de Trolox; G3) Tris-Gema + 2 uM de GSH; G4) Tris-Gema + 200 uM Trolox + 2 uM de GSH. As amostras foram envasadas em palhetas (0,25 mL), criopreservadas em máquina de congelação (TK 3000) e armazenadas em nitrogênio líquido (–196 oC). Após descongelação a 37 oC (0 min) e incubação durante 60 minutos, constatou-se que os resultados de MP, vigor e porcentual de espermatozóides com acrossomas íntegros evidenciaram diferença significativa (P<0,05) apenas entre os tempos de incubação, nos três experimentos. No Exp. II, os grupos experimentais (G2 e G3) apresentaram maior (P<0,05) porcentual de células sem estresse oxidativo. Conclui-se que o tempo de incubação interfere na viabilidade in vitro das células espermáticas, independente da adição de antioxidantes Trolox e/ou GSH; recomenda-se a adição do antioxidante GSH, nas concentrações de 2 uM e 5 uM, ao diluente utilizado para criopreservação do sêmen de cães.

The analysis of sperm subpopulations is a relatively new approach that consists of evaluating the coexistence of different sperm grouped by similarity. This characterization allows us to explore the heterogeneity of existing sperm in a semen sample, so it is revealed your fertility potential. The aim of this study was to identify and characterize sperm subpopulations in semen tambaqui (C. macropomum) regarding the kinetics and evaluate its correlation with fertility, as well as analyzing the changes arising from the cryopreservation process in the distribution of sperm subpopulations. 59 767 sperm semen in natura and 50,680 of the thawed sperm of 61 fish through analysis in a computerized system (CASA) were evaluated. The kinetic data generated sperm were tabulated, analyzed, and evaluated relativized by the method of analysis of two-step cluster grouping. For correlation with fertilization, 15 animals with distinct sperm qualities were selected and evaluated for their performance in fertilization from seminal fresh samples. These procedures allowed the identification of three sperm subpopulations in semen in natura tambaqui, two of which are highly correlated with fertility. The first subpopulation corresponded to 28.81% of the total analyzed sperm and it was less abundant. Low values of curvilinear velocity - VCL: 58.92 mM / s, linearity - LIN: 23.15%, straightness - STR: 40.01% and beat cross frequency - BCF: 6.79 Hz characterized the sperm of this subpopulation as slow progressive non-linear and not, where no significant correlation was observed with fertility (r = 0.28). The second subpopulation represented 31.61% of the examined spermatozoa which were classified as rapid, non-linear, non-progressive and high beat cross frequency (LCV: 114.10 mM / s, LIN: 46.77% STR: BCF and 59.17%: 21.49 Hz), high positive correlation was observed with fertility (r = 0.93). Already a subpopulation 3, had a higher percentage of sperm analyzed (39.58%), characterized as fast, linear, progressive and high beat cross frequency (VCL: 134.11 mM / s, LIN: 81.41%, STR : BCF and 86.57%: 26.73 Hz), being also observed high positive correlation with fertility (r = 0.79). After thawing semen tambaqui, we could identify only two sperm subpopulations with distinct heterogeneity. The first subpopulation, representing 33.24% of the analyzed sperm which were characterized as slow, non-linear, non-progressive and low beat cross frequency (VCL: 52.96 mM / s, LIN: 20.70%, STR: and 41.70% BCF: 5,61Hz). The second subpopulation corresponded to 66.76% of the analyzed sperm which were characterized as fast, linear, progressive and high beat cross frequency (VCL: 121.57 mM / s, LIN: 69.02%, STR: 77, and 09% BCF: 26.00 Hz). It is concluded that semen tambaqui has three sperm subpopulations characterized by movement pattern, two of which are represented by rapid sperm directly related to fertility. The cryopreservation process reduces the number of sperm subpopulations and alters the pattern of linearity and progressivity of spermatozoa. / A analise de subpopulacoes espermaticas e uma abordagem relativamente nova que consiste na avaliacao da coexistencia de diferentes espermatozoides agrupados por similaridade. Essa caracterizacao permite explorar a heterogeneidade dos espermatozoides existentes em uma amostra seminal, de forma que seja revelado o seu potencial de fertilidade. O objetivo do presente estudo foi identificar e caracterizar as subpopulacoes espermaticas no semen de tambaqui (C. macropomum) quanto a cinetica e avaliar sua correlacao com a fertilidade, bem como analisar as alteracoes decorrentes do processo de criopreservacao na distribuicao das subpopulacoes espermaticas. Foram avaliados 59.767 espermatozoides do semen in natura e 50.680 espermatozoides do semen descongelado de 61 peixes por meio da analise em sistema computadorizado (CASA). Os dados de cinetica espermatica gerados foram tabulados, analisados, relativizados e avaliados pelo metodo de analise de agrupamento two-step cluster. Para a correlacao com a fertilizacao, 15 animais com qualidades espermaticas distintas, foram selecionados e avaliados quanto ao seu desempenho na fertilizacao a partir de amostras seminais in natura. Esses procedimentos permitiram a identificacao de tres subpopulacoes espermaticas no semen in natura de tambaqui, sendo duas delas, altamente correlacionadas com a fertilidade. A subpopulacao 1 correspondeu a 28,81% do total de espermatozoides analisados e foi a menos abundante. Baixos valores de velocidade curvilinear . VCL: 58,92 Êm/s, linearidade . LIN: 23,15%, retilinearidade . STR: 40,01% e de frequencia de batimento flagelar . BCF: 6,79 Hz caracterizaram os espermatozoides desta subpopulacao como lentos, nao lineares e nao progressivos, onde nao foi observada correlacao significativa com a fertilidade (r= 0,28). A subpopulacao 2, representou 31,61% do total de espermatozoides analisados os quais foram classificados como rapidos, nao lineares, nao progressivos e com alta frequencia de batimento flagelar (VCL: 114,10 Êm/s, LIN: 46,77%, STR: 59,17% e BCF: 21,49 Hz), sendo observada alta correlacao positiva com a fertilidade (r= 0,93). Ja a subpopulacao 3, apresentou maior percentual de espermatozoides analisados (39,58%), caracterizados como rapidos, lineares, progressivos e com alta frequencia de batimento flagelar (VCL: 134,11 Êm/s, LIN: 81,41%, STR: 86,57% e BCF: 26,73 Hz), sendo observada tambem alta correlacao positiva com a fertilidade (r= 0,79). Apos o descongelamento do semen de tambaqui, foi possivel identificar apenas duas subpopulacoes espermaticas com homogeneidades distintas. A subpopulacao 1, representou 33,24% dos espermatozoides analisados os quais foram caracterizados como lentos, nao lineares, nao progressivos e com baixa frequencia de batimento flagelar (VCL: 52,96 Êm/s, LIN: 20,70%, STR: 41,70% e BCF: 5,61Hz). A subpopulacao 2 correspondeu a 66,76% dos espermatozoides analisados os quais foram caracterizados como rapidos, lineares, progressivos e com alta frequencia de batimento flagelar (VCL: 121,57 Êm/s, LIN: 69,02%, STR: 77,09% e BCF: 26,00 Hz). Conclui-se que o semen de tambaqui possui tres subpopulacoes espermaticas caracterizadas pelo padrao de movimento, sendo duas delas, representadas por espermatozoides rapidos, diretamente relacionados com a fertilidade. O processo de criopreservacao reduz o numero de subpopulacoes espermaticas e altera o padrao de linearidade e progressividade dos espermatozoides.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao final CORRIGIDA POS DEFESA bruno.pdf: 1600495 bytes, checksum: cbb62e60517748529f04ae54537c61a1 (MD5) Previous issue date: 2009-03-30 / Considering the in vitro method of embryo production, field results have shown a lower resistance to cryopreservation for B. indicus, when compared to B. taurus embryos. A possible explanation for this is a great concentration of lipid droplets in the cytoplasm of cells from B. indicus embryos. The objective of this study was to compare two cryoprotectants (Propanediol and DMSO) to vitrification and evaluate the effect of adding 10&#956;M Forskolin to the SOF medium for embryo culture prior to cryopreservation. For all the experiments, ovaries from slaughtered Nelore Bos indicus donors were recovered and maintained at 30-35°C in NaCl solution until recovery of the cumulus-oocyte complexes. Embryos submmited to vitrification were expanded blastocysts at day seven of in vitro culture. In the first experiment embryos were first incubated in 10% Ethylene Glycol (EG) plus 10% DMSO dissolved in holding medium (TCM-Hepes with 20% calf serum) for 1 min and then transferred to droplet of 20% EG plus 20% DMSO in holding medium and 0.5M sucrose for 20 seconds before immersing in liquid nitrogen (n = 107; group EG+DMSO). For the group EG+Propanediol (EG+PRO; n = 96) blastocysts were placed in 10% EG plus 10% PRO in holding medium for 1 min, and then transferred to a droplet of 20% EG plus 20% PRO in holding medium and 0.5M sucrose for 20 seconds before immersing in liquid nitrogen. Both treatments were performed using the Cryotop system. Results were compared with embryos (n = 118) not submitted to cryopreservation. The evaluation was done by the hatching rate of blastocysts at Day 9, being higher (86.4%) for embryos not cryopreserved, when comparing to 77.1% for group EG+PRO and 72.9% for group EG+DMSO (P<0.05). In the second experiment, day 5 embryos obtained in vitro from Nelore donors were cultured using SOF medium with 10&#956;M Forskolin (n = 112) or not (control; n = 101), being all submitted to cryopreservation using Cryotop and the same vitrification method for group EG+DMSO. Results were compared with embryos cultured with SOF medium and not submitted to cryopreservation (n = 96). The evaluation was performed by considering hatching rate at Day 9, being higher - 85.4% - for not cryopreserved, when compared with 63.3% for control and 70.5% for Forskolin group (P<0.05). Considering embryos submitted to cryopreservation, the hatching rate was higher (P<0.05) for Forskolin group. / Os embriões bovinos de raças zebuínas produzidos in vitro (PIV) são mais sensíveis ao congelamento, devido, em parte, ao acúmulo de gotas lipídicas no citoplasma das células embrionárias. A criopreservação de embriões é um passo fundamental para a aplicação prática de outras técnicas de embriologia nos animais domésticos. Além disso, o sucesso da criopreservação de embriões Nelore PIV é fundamental para o desenvolvimento da comercialização de material genético nos mercados interno e externo. Neste trabalho, foram conduzidos dois experimentos: no primeiro, o objetivo foi avaliar a taxa de eclosão de embriões bovinos da raça Nelore PIV vitrificados no estágio de blastocisto expandido (Bx) empregando a metodologia CRYOTOP com o uso das soluções Etileno Glicol (EG) + Dimetil Sulfóxido (DMSO) e EG + 1,2 Propanediol (PRO). No segundo experimento, objetivou-se determinar a taxa de eclosão de embriões bovinos da raça Nelore PIV cultivados ou não em meio contendo 10 &#956;M do agente lipolítico forskolin, vitrificados no estágio de BX. No experimento 1, a taxa de eclosão dos embriões do grupo não vitrificado (G3) foi de 86,4%, superior (P<0,05) aos grupos vitrificados, os quais apresentaram taxas de eclosão de 77,1% e 72,9% nos grupos G1 (EG+PRO) e G2 (EG+DMSO), respectivamente. No experimento 2 observou-se maior viabilidade (P<0,05) do G3-F (grupo não vitrificado; 85,4%) em relação ao G1-F (cultivo com SOF controle; 63,3%) e ao G2-F (cultivo com forskolin; 70,5%). Entre os grupos vitrificados, os embriões cultivados com forskolin obtiveram taxa de eclosão superior ao grupo não tratado (P<0,05). Sendo assim, conclui-se que as soluções de EG+PRO e EG+DMSO apresentaram resultados semelhantes na vitrificação de embriões PIV de bovinos e o uso do agente lipolítico forskolin no cultivo de embriões PIV de bovinos da raça Nelore pode melhorar a criotolerância dos embriões.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-16T11:59:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andreia Alves da Costa Silveira - 2015.pdf: 2826814 bytes, checksum: a357e14569e4c8efffc2043f9809d45e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-16T12:02:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andreia Alves da Costa Silveira - 2015.pdf: 2826814 bytes, checksum: a357e14569e4c8efffc2043f9809d45e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T12:02:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andreia Alves da Costa Silveira - 2015.pdf: 2826814 bytes, checksum: a357e14569e4c8efffc2043f9809d45e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conventional micropropagation systems often use culture media supplemented with sucrose and sealed bottles. This system is called heterotófico as exogenous carbohydrates are the only source of energy for the plant. Mixotróficos systems, although still adding sucrose in half, have the differential to allow gas exchange between the internal and external environment of the culture flask. This ventilation brings many benefits to plant growth in vitro. By the constant loss of the Savannah area, it is necessary to improve micropropagation protocols and germplasm conservation of the species within it. Cryopreservation is considered the best for long-term preservation method and the encapsulation-dehydration technique have been promising for tropical species. The objectives were to compare the heterotrophic system in vitro propagation of Eugenia dysenterica (Mart.) DC. mixotrófico with a system, and get a method of germplasm storage dysenterica E. vitro by cryopreservation. Identified Gems' positions in the stem (closer to the root or the apex) were inoculated in tubes with or without gas exchange in WPM medium supplemented with 0,00μΜ, 0,54μM, 2,69μM, and 5,37μM, NAA, and 0,00μM, 4,44μM, 11,10μM and 17,76μM BAP in all possible combinations. For rooting was used WPM medium supplemented with IBA to 0,00μM, 9,84μM, 19,68μM, and 29,52μM. The system of gas exchange was greater in the number of sheets in most analyzed variables. The type of gem had little influence on the variables. The best treatment in heterotrophic and mixotrófico systems was 29.52 mM of IBA, with 33.33% and 16.66% respectively rooting. Acclimatization was performed successfully in both systems. For cryopreservation was used apexes obtained from plants grown in vitro. The apices were initially suspended in MS medium supplemented with 3% solution of sodium alginate, 0.4 M glycerol and 4,44μM BAP and dispensed in MS medium solution (free of calcium) supplemented with 0.1 M calcium chloride, 0.4 M glycerol and 4,44μM BAP. The summits were held in three exposure levels of sucrose (0.25M, 0.5M, and 0.75M) combined will three levels of desiccation (0 h, 1 h, 2 h) before being frozen in liquid nitrogen. There was no regeneration in cryopreserved apexes. The best treatment for non-cryopreserved apices consisted of 0.25M sucrose and 1 h of drying. The null regeneration of cryopreserved apices which indicates that the stress is related to desiccation stress freezing. / Sistemas convencionais de micropropagação, geralmente usam meios de cultura suplementados com sacarose e frascos vedados. Este sistema é denominado heterotófico pois os carboidratos exógenos são a única fonte de energia para o vegetal. Sistemas mixotróficos, embora continuem adicionando sacarose ao meio, possuem o diferencial de permitir trocas gasosas entre o meio interno e externo do frasco de cultura. Esta ventilação traz inúmeras vantagens ao crescimento vegetal in vitro. Pela constante perda de área do Cerrado, torna-se necessário o aprimoramento de protocolos de micropropagação e também de conservação de germoplasma das espécies deste domínio. A criopreservação é o considerada o melhor método de conservação à longo prazo e a técnica de encapsulamento-desidratação têm sido promissora para espécies tropicais. Os objetivos do trabalho foram comparar o sistema heterotrófico de propagação in vitro de Eugenia dysenterica (Mart.) DC. com um sistema mixotrófico, e, obter um método de conservação de germoplasma de E. dysenterica in vitro por criopreservação. Gemas identificadas quanto à posição no caule (mais próximas à raíz ou ao ápice), foram inoculados em tubos de ensaio com ou sem troca gasosa em meio WPM suplementado com 0,00μΜ, 0,54μM, 2,69μM, e 5,37μM, de ANA, e, 0,00μM, 4,44μM, 11,10μM, e 17,76μM de BAP em todas as combinações possíveis. Para o enraizamento utilizou-se meio WPM suplementado com AIB à 0,00μM, 9,84μM, 19,68μM, e 29,52μM. O sistema de trocas gasosas foi superior quanto ao número de folhas na maioria das variáveis analizadas. O tipo de gema pouco influenciou nas variáveis. O melhor tratamento nos sistemas heterotrófico e mixotrófico foi de 29,52 μM de AIB, com 33,33% e 16,66% de enraizamento respectivamente. A aclimatização foi procedida com sucesso em ambos os sistemas. Para a criopreservação utilizou-se ápices caulinares obtidos de plantas desenvolvidas in vitro. Os ápices foram inicialmente suspendidos em solução de meio MS suplementado com 3% de alginato de sódio, 0,4M de glicerol, e 4,44μM de BAP e dispensados em solução de meio MS (livre de cálcio) suplementado com 0,1 M de cloreto de cálcio, 0,4M de glicerol, e 4,44μM de BAP. Os ápices foram mantidos sob três níveis de exposição de sacarose (0,25M, 0,5M, e 0,75M) combinados á três níveis de dessecação (0 h, 1 h e 2 h) antes de serem congelados em nitrogênio líquido. Não se observou regeneração em ápices criopreservados. O melhor tratamento para ápices não criopreservados constituiu de 0,25M de sacarose e 1 h de dessecação. A taxa de regeneração nula de ápices criopreservados o que indica que o estress de dessecação está relacionado ao stress de congelamento.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-11T19:23:04Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jane Porfírio Rocha - 2004.pdf: 370129 bytes, checksum: b81520b5ddabb24c93613beb9a4564e1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-12T09:28:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jane Porfírio Rocha - 2004.pdf: 370129 bytes, checksum: b81520b5ddabb24c93613beb9a4564e1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-12T09:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jane Porfírio Rocha - 2004.pdf: 370129 bytes, checksum: b81520b5ddabb24c93613beb9a4564e1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2004-03-01 / Studied in this work maturation in vitro oocytes collected from ovaries obtained from a slaughterhouse, without any hormonal stimulation and, comparing these data at different stages of maturation between heifers and old cows. The culture medium used for maturation was the In Vitro Fertilization (Scandinavian IVF Science AB. Sweden), where similar results were observed for the two age, presenting a significant correlation (r = 0.9991 and p <0.0001) for stages of maturation, despite the maturing rate for new cows have better 50.5%, and for the old cows of 31.3%, there was no statistical difference. The same is repeated for the fertilization of young cows to 98.1% and 86% for old cows. For the blastocyst formation rate, 17.14% to 22.58% and old cows to young cows. We tested two types of cryopreservation for embryos in the blastocyst stage, the ultra-fast freezing, using dimethyl sulfoxide-cryoprotector (DMSO), and the computerized slow freezing with cryo chambers - Australian, using glycerol as cryoprotector. Embryos at the new cows DMSO showed a 14% survival rate and 73% glycerol, and the old cows were 31% DMSO and 63% glycerol. The rehydration rate of re-expansion of blastocysts after thawing was 15% with 15% DMSO and 38% glycerol for old cows and 14% DMSO and 55% glycerol for new cows. Spontaneous Hatching was observed only for the embryos thawed freezing with glycerol for young cows. In the statistical calculation was no significance between the results of survival, to total frozen and thawed embryos, between the slow freezing methods and the ultra-fast slow cryopreservation method using glycerol as a cryoprotector. / Estudou-se neste trabalho a maturação de oócitos in vitro, coletados de ovários obtidos em abatedouro, sem qualquer tipo e estimulação hormonal, comparando estes dados em seus diferentes estágios de maturação entre novilhas e vacas velhas. O meio de cultura utilizado para a maturação foi o In Vitro Fertilization (Scandinavian IVF Science AB. Sweden), onde se observou resultados similares para as duas idades, apresentando uma correlação significativa (r = 0,9991 e p < 0,0001) para os estágios de maturação, apesar da taxa de maturação para as vacas novas se apresentarem melhores 50,5%, e para as vacas velhas de 31,3%, não houve diferença estatística. O mesmo se repete para a taxa de fertilização de 98,1% para vacas novas e 86% para vacas velhas. Para a taxa de formação de blastocisto, 17,14% para vacas velhas e 22,58% para vacas novas. Foram testados dois tipos de criopreservação para embriões em estágio de blastocisto, o congelamento ultra-rápido, usando o crioprotetor dimetil-sufóxido (DMSO), e o congelamento lento computadorizado com criocâmara - Australiana, usando glicerol como crioprotetor. Os embriões das vacas novas pelo DMSO apresentaram uma taxa de sobrevida de 14% e com glicerol de 73%, e para as vacas velhas foram de 31% com DMSO e 63% com glicerol. As taxas de reidratação de re-expansão do blastocisto pós-descongelamento foram de 15% com 15% com DMSO e 38% com glicerol para vacas velhas e 14% com DMSO e 55% com glicerol para vacas novas. O Hatching espontâneo foi observado apenas para os embriões descongelados do congelamento com glicerol para vacas novas. No calculo estatístico houve significância entre os resultados de sobrevida, para o total de embriões congelados e descongelados, entre os métodos de congelamento lento e o ultra-rápido método de criopreservação lento, usando o glicerol como crioprotetor.

Tendo em vista a possibilidade de que a adição de ácidos graxos ao meio de cultivo embrionário aumente a sobrevivência ao congelamento, a proposta deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de quatro ácidos graxos isoladamente ao meio de cultivo, dois do grupo ômega 6 (ácido linoléico e ácido linoléico conjugado) e dois do grupo ômega 3 (ácido eicosapentaenóico e ácido docosahexaenóico), na produção de embriões, no número de células, na quantidade de lipídeos, na taxa de re-expansão da blastocele após 48 horas de cultivos pós-descongelamento, na taxa de eclosão pósdescongelamento e na taxa de gestação. Para tal, os oócitos bovinos colhidos de ovários de vacas abatidas foram maturados, fecundados e cultivados in vitro em atmosfera de 5% CO2 em ar, à 38,8°C e máxima umidade. No cultivo, foi adicionado isoladamente um destes ácidos graxos, e foram avaliadas a taxa de clivagem, e a produção de embriões no sétimo e oitavo dia de cultivo. No sétimo dia, os blastocistos expandidos foram congelados com 1,5M de etileno glicol. Eles permaneceram nesta solução por 9 minutos antes de serem envasados e seguirem para a maquina de congelamento numa taxa de resfriamento de 0,5°C/minuto até chegarem à temperatura de -32°C. Dos embriões que foram congelados, alguns seguiram para o descongelamento e voltaram para o cultivo in vitro para avaliação da reexpansão e taxa de eclosão pós-descongelamento. Outros foram transferidos para receptoras sincronizadas para avaliação da taxa de gestação. Outros grupos de embriões permaneceram até o oitavo dia de cultivo e foram corados com Hoechst 33342 para contagem dos núcleos, e corados com Nile Red para avaliação do conteúdo total de lipídeos. Em geral, a adição isolada de ácidos graxos do grupo ômega 6 (CLA e LA) na produção in vitro de embriões bovinos aumentou a taxa de sobrevivência ao congelamento (criotolerância), no entanto, não houve um aumento no número de células, nem diferença no conteúdo total de lipídeos nos embriões analisados. A taxa de gestação também não diferiu estatisticamente entre os grupos testados in vivo, porém foi observado um aumento de 200% na taxa de gestação dos embriões cultivados na presença de CLA. Novos estudos devem ser desenvolvidos para comprovar o efeito do aumento da criotolerância e melhorias nas taxas de gestações dos embriões, além de estudos da composição de lipídeos nos embriões e membranas. / In the view of the possibility that the addition of fatty acids in the embryo growing medium increase the survival rate after cryopreservation, this study was proposed to evaluate the effect of the addition of four fatty acids in culture medium, two of the omega 6 group (linoleic acid and conjugated linoleic acid) and two of the omega 3 group (eicosapentainoic acid and docosahexaenoic acid), in the rate of production of blastocysts, blastocyst cell number, blastocyst amount of lipids , re-expansion of blastocele rate after 48 hours of culture post-thaw, post-thaw hatching rate and pregnancy rate. The oocytes obtained by punction of slaughterhouse cows were matured in vitro, fertilized in vitro and cultured in vitro in an atmosphere of 5% CO2 in air, to 38,8°C and maximum moisture. Fatty acids were supplemented individually and cleavage rate and production of embryos in the seventh and eighth days of culture were assessed. On seventh day, the expanded blastocysts were frozen with 1.5M of ethylene glycol. They remained in this solution for nine minutes before introduction in a straw followed and then in a freezing machine with a chilling rate of 0,5°C/minute until temperature of -32°C. Frozen embryos were then divide in two groups: one was thawed and returned to in vitro culture in other to assess the reexpansion and post-hatching rate, and other was transferred to synchronized recipients to assess the pregnancy rate. Another unfreezed group of embryos were stained with Hoechst 33342 for counting the nuclei, or stained with Nile Red to estimate the lipids contents. In general, the addition of fatty acids omega 6 group (LA and CLA) increased the survival rate to the freezing (cryotolerancy), however, there was no increase in the number of cells, or difference in the lipids contents. In the CLA treated embryos, the pregnancy rate of the freezed embryos did not differ from groups tested in vivo, but there was a 200% increase in the pregnancy rate. Further studies should be developed to prove the improvements in the rates of pregnancies of omega 6 treated embryos, besides a study of the composition of lipids of embryos and membranes should be conducted.

Dada a importância do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), a necessidade de uma eficiente caracterização bacteriológica dos focos como ponto fundamental do sistema de vigilância e as dificuldades encontradas pelos laboratórios quanto aos métodos de isolamento de Mycobacterium bovis fizeram crescer o interesse do meio científico por estudos, sobretudo moleculares, de isolados M. bovis. Para a realização dessas técnicas moleculares, é necessária abundância de massa bacilar, obtida através da manutenção dos isolados em laboratório e repiques em meios de cultura. Entretanto o crescimento fastidioso do M. bovis em meios de cultura traz grandes dificuldades para essas operações. Assim sendo, o presente estudo teve por objetivos: 1º) Comparar três métodos de descontaminação para homogeneizados de órgãos, etapa que precede a semeadura em meios de cultura, onde 60 amostras de tecidos com lesões granulomatosas, provenientes de abatedouros bovinos do Estado de São Paulo, foram colhidas e imersas em solução saturada de Borato de Sódio e transportadas para o Laboratório de Zoonoses Bacterianas do VPS-FMVZ-USP, onde foram processadas até 60 dias após a colheita. Essas amostras foram submetidas a três métodos de descontaminação: Básico (NaOH 4%), Ácido (H2SO4 12%) e 1- Hexadecylpyridinium chloride a 1,5% (HPC) e o quarto método foi representado pela simples diluição com solução salina (controle). Os resultados foram submetidos à comparação de proporções, pelo teste de &#967;², na qual verificou-se que o método HPC foi o que apresentou menor proporção de contaminação (3%) e maior proporção de sucesso para isolamento de BAAR (40%). 2º) Comparar três diferentes meios criopreservates para M. bovis, foram utilizados 16 isolados identificados pela técnica de spoligotyping. Cada um desses isolados foi solubilizado em três meios (solução salina, 7H9 original e 7H9 modificado), e armazenado em três diferentes temperaturas (-20ºC, -80ºC e -196ºC), sendo descongelado em três diferentes tempos (45, 90 e 120 dias de congelamento). Antes do congelamento e após o descongelamento foram feitos cultivos quantitativos em meios de Stonebrink Leslie. Os porcentuais de redução de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) nas diferentes condições foram calculados e comparados entre si através de métodos paramétricos e não-paramétricos. Os resultados obtidos foram: na análise da variável tempo, em 90 dias de congelamento foi observada uma maior proporção de perda de M. bovis, quando comparado ao tempo 120 dias (p=0,0002); na análise da variável temperatura, foi observada uma diferença estatística significativa entre as proporções de perda média nas temperaturas de -20ºC e -80ºC (p<0,05); na análise da variável meio, foi observada uma diferença significativa (p=0,044) entre os meios A e C, para 45 dias de congelamento e -20ºC de temperatura de criopreservação. Embora as medianas dos porcentuais de perdas de UFC terem sido sempre inferiores a 4,2%, permitiram sugerir que o melhor protocolo de criopreservação de isolados de M. bovis é solubilizá-los em 7H9 modificado e mantê-los à temperatura de -20ºC / In the context of the National Program of Control and Eradication of Brucellosis and Tuberculosis (PNCEBT), the necessity of an efficient bacteriologic characterization of the infected herds as a cornerstone of the monitoring system and the difficulties faced by the laboratories regarding the methods for Mycobacterium bovis isolation led to a growing interest for scientific studies, especially molecular, of M. bovis isolates. To use these molecular techniques it is necessary to have an abundant bacillary mass, obtained through the maintenance of isolates in laboratory and replication in culture media. However the fastidious growth of M. bovis in culture media brings out great difficulties for these activities. Thus, the present study has the following objectives: First, to compare three decontamination methods for organ homogenates, phase that precedes the sowing in culture media, 60 samples of tissues with granulomatosis injuries, proceeding from bovine slaughterhouses in the State of São Paulo, were obtained, immersed in sodium borato saturated solution and transported to the Laboratório de Zoonoses Bacterianas of the VPS-FMVZ-USP, where they were processed up to 60 days after the sampling. These samples were submitted to three methods of decontamination: Basic NaOH 4%, Acid (H2SO4 12%) and 1- Hexadecylpyridinium chloride (HPC) 1.5% and a simple dilution with saline solution (control method). The results were analysed by means of the &chi test to compare proportions, and it was verified that HPC method presented the smallest proportion of contamination (3%) and the greatest proportion of success for M. bovis isolation (40%). Second, to compare three different cryopreservation media for M. bovis, 16 isolates identified by the technique of spoligotyping were used. Each one of these isolates was solubilized in three media (original saline solution, 7H9 and 7H9 modified), and stored in three different temperatures (-20ºC, -80ºC and -196ordm;C), and defrosted in three different time periods (45, 90 and 120 days of freezing). Before the freezing and after the unfreezing, quantitative cultivations in Stonebrink Leslie media were carried out. The proportions of Colony-Forming Units (CFU) loss in the different conditions were calculated and compared with one another through parametric and non-parametric methods. The results obtained were: in the analysis of the variable time, at 90 days of freezing a bigger proportion of CFU loss was observed when compared to 120 days (p=0,0002); in the analysis of the variable temperature, a statistically significant difference was observed between the average proportions of CFU loss for the temperatures of -20ºC and -80ºC (p<0,05); in the analysis of the variable media, a significant difference was observed (p=0,044) between the media A and C, for 45 days of freezing and -20ºC of cryopreservation temperature. Althougth the medium ones of the proportion of losses of CFU to always have been inferior 4,2%, had allowed to suggest that the best protocol for cryopreservation of M. bovis isolates is to solubilize them in 7H9 modified medium and to keep them at a temperature of -20ºC

Os ácidos graxos poliinsaturados garantem a fluidez à membrana plasmática do espermatozóide. No entanto, as duplas ligações presentes, os tomam mais susceptíveis aos efeitos nocivos da peroxidação lipídica que produz grande quantidade de radicais livres. A adição do antioxidante Glutationa reduzida (GSH) poderia conferir proteção aos espermatozóides de ovinos submetidos a criopreservação contra danos, em membranas plasmáticas, acrossomais, DNA e atividade mitocondrial causados pelo estresse oxidativo. O objetivo do presente experimento foi: avaliar se a GSH protege os espermatozóides ovinos criopreservados contra danos causados pelo estresse oxidativo. Foram colhidos ejaculados de quatro carneiros adultos. As amostras foram avaliadas após a criopreservação (TI). As análises convencionais foram: concentração, motilidade, vigor e morfologia. As análises funcionais foram: integridade de membrana, integridade acrossomal, integridade de cromatina e atividade mitocondrial. O sêmen foi criopreservado utilizando o diluidor Tris-gema-critrato suplementado com GSH (controle, 1, 5 e 10mM). Uma alíquota de cada amostra foi submetida ao protocolo de peroxidação lipídica induzida e subseqüente quantificação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico(TBARS). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Sistema SAS para Windows. Os resultados indicam que não houve efeito do tratamento com GSH sobre as variáveis avaliadas pelos testes convencionais. A GSH diminuiu a proporção de acrossomas íntegros. Amostras tratadas com 5mM de GSH apresentaram menor percentual de células com membranas íntegras quando comparadas com as amostras controle e aquelas tratadas com 10 mM; , o percentual de células sem atividade mitocondrial foi influenciado pela GSH também não houve de efeito nas TBARS. As amostras do grupo controle foram mais susceptíveis à desnaturação da cromatina. Em conclusão, a adição do antioxidante Glutationa reduzida (GSH) confere proteção ao DNA e à atividade mitocondrial de espermatozóides de ovinos. / It is well known that sperm is extremely susceptible to the oxidative stress. This occurs especially due to the high content of poly-unsaturated fatty acids (PUF As) in its plasma membrane. The PUF As provide the necessary fluidity to the plasma membrane, which allows the sperm to move. However the double bonds present in those fatty acids are more susceptible to the oxidative stress. Therefore, sperm is highly dependent of the extra-celluIar environment antioxidant protection. Studies in human indicate that cryopreservation may lead to damages to the sperm due to the oxidative stress. The objective of this experiment was to study if the antioxidant glutathione (GSH) may protect ovine cryopreserved sperm against the damages caused by the oxidative stress. Semen samples of four rams were collected using an artificial vagina. Samples were then cryopreserved using Tris-egg yolk extender supplemented with different concentrations of reduced glutathione (control, 1, 5 and 10 mM). After thawing, samples were evaluated using conventional (motility and vigor) and functional tests (membrane integrity and mitochondrial activity). An aIiquot of each thawed sample was submitted to the protocol of induced lipid peroxidation using ascorbate (20 mM) and ferrous sulphate (4 mM), with the further measurement of the tiobarbituric acid reactive substances (TBARS), as an index of oxidative stress. This technique aims to evaIuate sperm oxidative status by its susceptibility to the lipid peroxidation. Statistical analysis was performed using SAS system for Windows. The results indicate that there was no effect of GSH on the variables assessed by conventional tests. GSH decreased the proportion of intact acrosomes. Samples treated with 5 mM GSH showed a lower percentage of cells with intact membranes when compared with control sampIes and those treated with 10 mM, the percentage of cells with mitochondriaI activity was affected by GSH and there was also no effect on TBARS. Samples from the control group were more susceptible to denaturation of chromatin. In conclusion, the addition of the antioxidant Glutathione (GSH) offers protection to DNA and mitochondrial activity of ovine sperm.

Sabe-se que a criopreservação do sêmen provoca uma perda significativa na qualidade espermática. Apesar de diversos estudos visando à melhora na qualidade do sêmen pós-descongelamento, é de consenso geral que a gema de ovo apresenta uma significante capacidade em evitar as crio-injúrias. No entanto, a grande variação na sua composição, assim como o risco potencial para a contaminação do diluidor, caso certos contaminantes estejam no produto in natura, são empecilhos para sua utilização para a exportação do sêmen, assim como sua utilização em humanos. Deste modo, estudos visando substituir a gema de ovo por produtos quimicamente definidos e de origem não-animal, são de extrema importância. Neste contexto, a lecitina da soja, por possuir uma fração de lipoproteína de baixa densidade semelhante à encontrada na gema de ovo, pode ser uma alternativa interessante. O presente estudo visa comparar diluidores a base de lecitina de soja e aqueles contendo gema de ovo utilizados rotineiramente para a refrigeração e criopreservação do sêmen canino. Para isto, foi utilizado o sêmen de 12 cães adultos, que foi refrigerado e criopreservado em diluidores a base de gema de ovo (OVO) e a base de lecitina de soja (LEC) em diferentes concentrações (0,01; 0,05 e 0,1%) e apresentações (FP40, 8160 e Solec F). O sêmen foi avaliado após refrigeração (2, 24, 48, 72, 96 e 120 horas; Experimento 1) e após criopreservação (pós refrigeração, pós glicerolização e pós descongelação; Experimento 2) através da análise convencional do sêmen (i.e., motilidade - CASA) e funcionais (i.e., integridade de membrana - eosina/nigrosina; integridade de acrossomo - Fast Green / Rosa Bengala; atividade mitocondrial - 3´3 Diaminobenzidina; fragmentação do DNA - SCSA; susceptibilidade ao estresse oxidativo - substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico). Os resultados do Experimento 1 indicaram que, semelhante ao ovo, todas as lecitinas na concentração 0,01% foram capazes de manter a motilidade em torno de 50% por até 72 horas. Após 96 horas, o diluidor Solec F apresentou melhor resultado em relação ao ovo na atividade mitocondrial, e após 120 horas a concentração 0,01%, apresentou maior motilidade do que o ovo (30,00 ± 10,69; 8,33 ± 1,84, respectivamente). No sêmen criopreservado (Experimento 2), as menores concentrações de lecitina apresentaram resultados semelhantes ao ovo tanto na motilidade quanto na atividade mitocondrial. Os resultados indicam que a lecitina pode ser uma boa alternativa à gema de ovo para a refrigeração e criopreservação do sêmen canino. / Semen cryopreservation, an essential step on biotechnologies applied to reproduction, is known to induce significant loss on sperm quality. Despite several studies aiming to improve post-thaw quality, it is generally agreed that egg yolk is the most effective in protecting sperm against cryo-injuries. However, the considerable variation on egg yolk composition as well as the potential risk of disseminating diseases when used in natura, are obstacles to semen exportation as well as the use in human. Therefore, studies aiming to substitute the egg yolk for chemically defined components or animal free products are extremely important. In this context, soy lecithin, which contains a fraction of low density lipoprotein, appears to be an interesting alternative. Thus, the present study aims to compare semen extenders containing soy lecithin or egg yolk on dog semen cryopreservation and refrigeration. Towards this aim, semen of 12 adult dogs were be refrigerated and cryopreserved in Tris-Fructose-Citric acid extenders with egg yolk (OVO) or soy lecithin (LEC; in different concentrations - 0,01; 0,05; 0,1% and presentations - FP40; 8160; Solec F). Semen was evaluated after chilling (2, 24, 48, 72, 96 and 120 hours; Experiment 1) and after cryopreservation (post refrigeration, post-glycerolization, and post-thaw; Experiment 2) for routine semen analysis (e.g., motility, CASA) and functional tests (e.g., membrane integrity - eosin/nigrosin; acrosome integrity - fast green/Bengal rose; mitochondrial activity - 3´3 diaminobenzidine; DNA fragmentation - SCSA; susceptibility to oxidative stress - thiobarbituric acid reactive substances). Results were statistically analyzed using the SAS System for Windows. Results of experiment 1 indicate that, similar to the egg yolk, all types of lecithin used in the 0.01% concentration, were able to maintain sperm motility around 50% for 72 h. After 96 h, the extender containing the lecithin Solec F showed better results regarding mitochondrial activity when compared to the egg yolk. Furthermore, after 120 h, the same extender with the 0.01% concentration, showed higher motility when compared to the egg yolk (30.00 ± 10.69 and 8.33 ± 1.84%, respectively). On the other hand, for the cryopreserved samples (Experiment 2), lower concentrations of lecithin showed similar results for mitochondrial activity and motility when compared to the egg yolk. Results found in the present study indicate that soy lecithin may be a good alternative to substitute the egg yolk for both refrigeration and cryopreservation of dog semen.

A ausência de trabalhos verificando a melhor concentração de espermatozoides para se congelar o sêmen de cachaços em palhetas de 0,5 mL, gerou a necessidade deste estudo. Foi proposto, por meio deste expererimento, encontrar uma quantidade ideal, ou seja, uma concentração em que se consiga congelar o maior número de espermatozoides por palheta, sem aumentar os danos já causados pelo processo de criopreservação dos espermatozoides de cachaços. Diante disso, foram realizadas 5 coletas de 5 cachaços (n=25), utilizando apenas a fração rica do ejaculado. Estes foram divididos em cinco concentrações espermáticas diferentes, a saber: 100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL e congelados em palhetas de 0,5mL. Após o processo de criopreservação, realizado por um sistema automatizado, as plalhetas foram acondicionadas em botijão criogênico. Para as análises, 2 palhetas de cada concentração foram descongeladas em banho maria (37ºC por 30 segundos) e submetido às avaliações das características de motilidade por meio do CASA, citometria de fluxo para a análise da integridade das membranas acrossomal e plasmática, potencial mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez da membrana espermática (capacitação), além da morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial de fase. As variáveis avaliadas foram submetidas à análise de variância e ao teste de média PDDIF, ao nível de 5%. O aumento da concentração espermática, na palheta de 0,5mL, afetou significativamente (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade progressiva, velocidade de trajeto, linearidade, retilinearidade, frequência de batimento flagelar e hiperativação. O aumento do número de espermartozoides na palheta não alterou (p>0,05) a porcentagem de células que apresentavam simultaneamente a integridade das membranas plasmática e acrossomal e com potencial mitocondrial (MIAIAP), o aumento não influenciou (p>0,05) as variáveis peroxidação lipídica, capacitação e morfologia espermática. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a congelação de até 300x106 espermatozoides/mL, na palheta de 0,5 mL, sem maiores danos à motilidade e integridade das membranas espermáticas. / The lack of studies veryfing the best concentration of sperm to freeze the boar semen in 0.5 ml straws, bring forth necessity for this study. The experiment proposed to find an optimal amount, in other words a concentration that is possible to freeze the higher number of spermatozoa per straw without increasing the damage already caused by the process of cryopreservation of boar spermatozoa. Therefore, there were 5 semen collections of 5 boars (n = 25) using only the rich fraction of the ejaculate. They were divided into five different sperm concentrations, namely 100, 200, 300, 600 and 800x106 sperm/mL and frozen in 0.5 mL straw. After the cryopreservation process, carried out by an automated system, straws were placed in cryogenic cylinders. For the analysis, two straws of each concentration were thawed in water bath (37°C for 30 seconds) and subjected to evaluations of motility characteristics through CASA, flow cytometry to analyze the integrity of the acrosome and plasma membrane, mitochondrial potential, peroxidation and lipid fluidity of sperm membrane (capacitation), and the sperm morphology by phase differential interference contrast microscopy. The variables were subjected to analysis of variance and the average test PDDIF, at 5%. The increased sperm concentration, in the 0.5mL straw, affected significantly (p <0.05) total and progressive motility, progressive velocity, path velocity, linearity, straightness, flagellar beat frequency and hyperactivation. The increase in the spermatozoa number, in 0,05 mL straw, did not change (p> 0.05) the percentage of cells that simultaneously showed the integrity of plasma and acrosomal membranes and with high mitochondrial potential (MIAIHM), the increase did not affect (p> 0.05) the lipid peroxidation variables, training and sperm morphology. Based on the results, it can be suggested to freeze with 300x106 spermatozoa/mL, in 0.5 mL straw, without major damage to the integrity and motility of the sperm membrane.