Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-09-12T22:47:23Z No. of bitstreams: 1 2012_GabrieladeOliveiraFernandes.pdf: 299565 bytes, checksum: 80e9633654f78664cae4a8301e14ca67 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2012-09-13T17:57:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_GabrieladeOliveiraFernandes.pdf: 299565 bytes, checksum: 80e9633654f78664cae4a8301e14ca67 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-13T17:57:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_GabrieladeOliveiraFernandes.pdf: 299565 bytes, checksum: 80e9633654f78664cae4a8301e14ca67 (MD5) / Diversas bactérias são identificadas nas amostras de sêmen ovino e algumas podem apresentar efeitos negativos na sua qualidade. Assim, os objetivos deste trabalho foram: identificar e quantificar a microbiota do sêmen fresco ovino, avaliar o uso prévio do higienizante Kilol-L® e testar a sensibilidade das cepas bacterianas frente ao antibiograma; avaliar o efeito do uso dos antibióticos ceftiofur e gentamicina, em diferentes concentrações, no meio diluidor TRIS-gema-glicerol, nos parâmetros de avaliação do sêmen e da contaminação bacteriana; avaliar o efeito da adição de diferentes antibióticos e combinações no meio de criopreservação do sêmen, avaliando a qualidade e viabilidade do mesmo antes e depois da criopreservação. No capítulo 2 foram avaliados 24 ovinos machos da raça Santa Inês, aptos à reprodução, sendo eles agrupados em dois grupos de sistemas de criação, um a pasto (n=12) e outro em confinamento (n=12). Os resultados microbiológicos indicaram que do total de 120 ejaculados, 99 tiveram crescimento bacteriano correspondendo a 82,5% das amostras. Os gêneros bacterianos mais isolados foram Bacillus spp., Corynebacterium spp., Escherichia coli, Listeria spp., Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. Dos antibióticos testados, a gentamicina foi 100% eficaz para Bacillus spp. e E. coli. O Ceftiofur foi eficaz para todas as bactérias isoladas, exceto com a amostra de Rodococcus equi. O uso do antisséptico Kilol-L® na concentração 1:250 reduziu o número de unidades formadoras de colônias (UFC/ml) do ejaculado sem prejudicar a qualidade seminal. No capítulo 3, foram selecionados dois grupos: ceftiofur e gentamicina. Os tratamentos do grupo ceftiofur foram: sem antibióticos, 10μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml e 100μg/ml, e os tratamentos do grupo gentamicina foram: sem antibiótico, 50μg/ml, 100μg/ml, 250μg/ml e 500μg/ml. Não houve diferença entre os tratamentos nos dois grupos quanto à motilidade espermática, isolamento bacteriano e UFC/ml. A utilização dos antibióticos ceftiofur e gentamicina, em diferentes concentrações no meio de criopreservação, não diferiram do meio sem antibiótico nos parâmetros seminais e bacteriológicos. No capítulo 4, foi analisado o efeito da adição de diferentes antibióticos na criopreservação de sêmen ovino, avaliando-se a qualidade e viabilidade antes e depois da criopreservação. Os ejaculados foram submetidos aos seguintes tratamentos: sem antibiótico, associação de penicilina-estreptomicina (100.000UI-100mg/ml), ceftiofur (10μg/ml), gentamicina (50μg/ml) e a associação de gentamicina-tilosinalincomicina- espectinomicina (250-50-150-300μg/ml). Os tratamentos utilizados não apresentaram diferença (p>0,05) quando comparados com a quantidade total de bactérias presentes, cepas bacterianas isoladas e motilidade das células espermáticas. Os principais gêneros bacterianos isolados foram Bacillus spp., Corynebacterium spp., Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. Tais resultados indicam que a adição de antibióticos não é necessária, no meio diluidor, quando medidas higiênicas e de assepsia são previamente utilizadas ao processo de criopreservação do sêmen ovino. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Several bacteria are identified in semen samples and some present a negative effect on their quality. The objectives of this study were to identify and quantify the fresh semen sheep microbiota, evaluating the previous use of sanitizing Kilol-L® and test the bacterial strains against antibiogram; evaluate the effect of antibiotic therapy with ceftiofur and gentamicin, in different concentrations in the diluter medium with tris-gem-glycerol, in parameter of semen evaluation and bacterial contamination; evaluate the effect of addition different antibiotics and combinations in the semen cryopreservation medium, assessing the quality and viability of the sample before and after cryopreservation. In chapter 2 were evaluated 24 Santa Inês male sheep, able to reproduce, and they were grouped into two breeding systems, one on pasture (n = 12) and another confined (n = 12). The microbiological results indicated that the total of 120 ejaculates, 99 had bacterial growth representing 82.5% of the samples. The most frequently isolated bacterial genus were Bacillus spp., Corynebacterium spp., Escherichia coli, Listeria spp., Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. Both antibiotics tested, gentamicin was 100% effective for Bacillus spp. and E. coli. The Ceftiofur was effective for all isolates, except with the sample Rodococcus equi. The use of antiseptic Kilol-L® at a concentration of 1:250 reduced the number of colony forming units (CFU/ml) of the ejaculate without affecting the semen quality. In chapter 3, we selected two groups: ceftiofur and gentamicin. The ceftiofur treatments groups were: without antibiotics, 10μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml and 100μg/ml, and gentamicin treatments group were: without antibiotic, 50μg/ml, 100μg/ml, 250μg/ml and 500μg / ml. There was no difference between treatments in the two groups in terms of sperm motility, bacterial isolation and CFU/ml. The use of the ceftiofur antibiotic and gentamicin at different concentrations in the cryopreservation medium not differ from the antibiotic-free medium in semen and bacteriological parameters. In chapter 4, we analyzed the effect of different antibiotic addition in the cryopreservation of ram semen, evaluating the quality and viability before and after cryopreservation. The ejaculates were submitted to the following treatments: no antibiotic, combination of penicillin-streptomycin (100.000UI-100mg/ml), ceftiofur (10μg/ml), gentamicin (50μg/ml) and combination of gentamicin, tylosin, lincomycin-spectinomycin (250 -50-150-300μg/ml). The treatments showed no difference (p> 0.05) when compared with the total amount of bacteria, bacterial strains isolated and sperm cells motility. The major bacterial strains isolated were Bacillus spp., Corynebacterium spp., Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. These results indicate that the addition of antibiotics is not necessary in the diluter medium, when hygienic and aseptic measures are previously used in the sheep semen cryopreservation process.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T18:00:32Z No. of bitstreams: 1 2010_LucianaDalcin.pdf: 2588317 bytes, checksum: 8bbe50d0353dec811bc355d0696e1a41 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T18:01:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_LucianaDalcin.pdf: 2588317 bytes, checksum: 8bbe50d0353dec811bc355d0696e1a41 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-17T18:01:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_LucianaDalcin.pdf: 2588317 bytes, checksum: 8bbe50d0353dec811bc355d0696e1a41 (MD5) / A criopreservação de embriões ovinos tem sido amplamente difundida, porém seus índices de sobrevivência e prenhez têm mostrado grande variação. Neste estudo, embriões produzidos in vivo foram congelados ou vitrificados e reaquecidos para avaliação ultraestrutural e determinação do padrão de atividade mitocondrial e integridade do citoesqueleto. Os embriões foram colhidos de ovelhas superovuladas, classificados e selecionados para criopreservação. Embriões submetidos à congelação lenta (n=22) foram exposto à solução de 0,75M de etilenoglicol (EG) por 10 minutos, 1,5M de EG por 10 minutos, acondicionados em palhetas de 0,25mL e submetidos a curva de congelação programável (-1°C/min, seeding a -7°C, 0,3°C/min até -35°C) com posterior imersão em nitrogênio líquido. Embriões vitrificados (n=24) foram submetidos à solução de 10% de EG+10% de DMSO por 1 minuto e 30 segundos, passando para a solução de 20% de EG+20% de DMSO com 0,5M de sacarose por 30 segundos acondicionados em OPS e mergulhados em nitrogênio líquido. Os embriões descongelados/reaquecidos foram cultivados por 1 hora, reclassificados em estereomicroscópio e subdivididos para avaliação. Os embriões criopreservados mostraram variável grau de desorganização de citoesqueleto e ausência de marcação para atividade mitocondrial. Foi possível correlacionar os achados anteriores com a ultraestrutura e distribuição das organelas pelo citoplasma. Embriões congelados mostraram características ultraestruturais semelhantes a embriões frescos de mesma qualidade. Embriões vitrificados apresentaram maior frequência de grandes vesículas de digestão. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cryopreservation of sheep embryos has been widespread, but their survival rate and pregnancy have shown great variation. After in vivo production sheep embryos were frozen or vitrified and processed for ultrastructural evaluation and determining the pattern of mitochondrial activity and integrity of the cytoskeleton. Embryos were collected from superovulated ewes, classified and selected for cryopreservation. Embryos subjected to slow freezing (n = 22) were exposed to 0.75 M ethylene glycol (EG) for 10 minutes, 1.5M EG for 10 minutes, packed in 0.25mL straws and subjected to programmable freezing (-1 ° C / min, seeding at -7 ° C, 0.3 ° C / min to -35 ° C) followed by immersion in liquid nitrogen. Vitrified embryos (n = 24) were placed in 10% EG +10% DMSO solution for 1 minute and 30 seconds, then in 20% EG +20% DMSO solution with 0,5M sucrose for 30 seconds packed in OPS and dipped in liquid nitrogen. The cryopreserved embryos were warmed, cultured for 1 hour, reclassified and subdivided for evaluation. Cryopreserved embryos showed variable degree of cytoskeleton disorganization and no marker for mitochondrial activity. It was possible to correlate these findings with the ultrastructure and distribution of the organelles. Frozen embryos showed ultrastructural features similar to fresh embryos of the same quality. Vitrified embryos showed a higher frequency of large digestion vesicles.

Na espécie equina, ao contrário do obtido com ruminantes, as técnicas de criopreservação de sêmen progridem lentamente, mas apesar das barreiras técnicas o emprego da inseminação artificial com sêmen congelado vem crescendo. Este experimento foi dividido em três etapas: na primeira comparou-se a utilização de diferentes diluentes e técnicas de congelação; determinação da eficiência do criotubo para envase do sêmen para a criopreservação; e na terceira determinou-se as taxas de prenhez das éguas artificialmente inseminadas com sêmen congelado envasado em criotubo. Seis garanhões foram submetidos à coleta do sêmen e doze éguas foram inseminadas artificialmente no primeiro estro da estação reprodutiva. As amostras foram diluídas em INRA82 ou Nagase, contendo 5% de glicerol, com concentração de 200 x 106 espermatozóides/ml. Parte do sêmen diluído foi envasado em palhetas (0,5ml), das quais uma parte foi imediatamente congelada. As palhetas restantes foram resfriadas previamente da temperatura ambiente (24ºC) até 5ºC antes do congelamento. As amostras foram descongeladas em banho-maria a 37ºC por 30seg. O mesmo protocolo de congelamento com resfriamento prévio foi realizado com as amostras envasadas em criotubos, sendo estas amostras descongeladas a 50ºC por 100seg em banho-maria. A eficiência in vivo do sêmen criopreservado, foi determinada através da inseminação artificial. O diagnóstico de prenhez foi realizado 20 dias após a inseminação artificial através de exame ultrassonográfico. Após a análise dos dados verificou-se que não houve diferença significativa entre os diluentes testados na motilidade progressiva e vigor dos espermatozóides. As médias da motilidade espermática após o aquecimento das amostras foram de: 43,32% e 26,66%, para o sêmen diluído com INRA82 submetido ao resfriamento ou não antes do congelamento, respectivamente, e para o sêmen diluído com Nagase revelou motilidade espermática de 41,08% e 24,44%, respectivamente. De acordo com esses resultados, os grupos experimentais submetidos ao resfriamento prévio apresentaram taxas de motilidade espermática superiores aos grupos que foram congelados diretamente. Não se verificou diferenças quanto ao vigor, motilidade e defeitos espermáticos entre os diluentes testados e os tipos de envase. As éguas inseminadas com criotubo apresentaram taxa de prenhez de 50% (3/6), já com as éguas do grupo controle (palheta) observou-se 16,66% (1/6), provando a viabilidade do congelamento do sêmen envasado em criotubo. / In the horse industry, unlike obtained with catle, the development of sperm cryopreservation techniques are very slow but despite the technical barriers the artificial insemination with frozen semen is growing. This experiment was divided into three steps. The first one compared the use of different diluents and freezing techniques. The other two stages were the use of cryogenic tubes for filling the semen and the determination of mare pregnancy rates that were artificially inseminated with frozen semen packaged in cryogenic tubes. Six stallions were submitted to semen collection and twelve mares were artificially inseminated at first estrus of the breeding season. The samples were diluted in INRA82 or Nagase, containing 5% glycerol, with a concentration of 200 x 106 sperm / ml. A fraction of the diluted semen was stored in straws (0.5 ml), some of those straws were immediately frozen. The remaining straws were cooled from room temperature (24ºC) to 5º C before freezing. The samples were thawed in a water bath at 37° C during 30sec. The same protocol with cooling prior to freezing was performed with samples filled into cryogenic tubes, and these samples were thawed in a water bath at 50° C during 100seg. The in vivo efficiency of cryopreserved semen was determined through artificial insemination. The diagnosis of pregnancy was performed after 20 days by ultrasound examination. After analyzing the data it was found that there was no significant difference in sperm motility and vigor among the tested diluents. Motility was INRA82: 43.32% / 26.66% and Nagase: 41.08% / 24.44%, when the semen was previously cooled or frozen directly, respectively. According to these results, the experimental groups subjected to cooling prior freezing showed better motility rates than the groups that were frozen directly. There were no differences regarding the vigor, motility and sperm defects among the diluents and the semen containers. The mares inseminated with cryotubes showed 50% (3/6) pregnancy rate, and 16.66% (1/6) pregnancy rate was observed in the group of mares inseminated with straws.

O objetivo deste trabalho foi comparar a utilização de diluentes comerciais à base de gema de ovo de galinha com os mesmos diluentes, nos quais se substituiu a gema de galinha pela de ovo de ema (Rhea americana). Foram utilizados Seis garanhões da raça Crioula, comprovadamente férteis e no período fora da estação de monta e utilizados seis ejaculados de cada garanhão. O sêmen foi avaliado macroscopicamente quanto ao volume, aspecto e coloração, a seguir avaliou-se a motilidade progressiva e total. Posteriormente o sêmen foi dividido em quatro alíquotas e diluído na proporção 1:1 com o diluente, Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares) para centrifugação. Para adição do diluente de congelamento foram utilizados: diluente A (FR-5, Nutricell Nutrientes Celulares) e diluente B (Botu-crio, Biotech Botucatu S.A.) adicionados de 20 % de gema de ovo de ema, ou de 20 % de gema de ovo de galinha. As amostras foram envasadas, identificadas e submetidas a congelamento conforme o protocolo. As palhetas foram descongeladas, após um período mínimo de 7 dias e examinadas para os seguintes quesitos: motilidade total e progressiva, e integridade física e funcional da membrana plasmática do espermatozoide. Os diluentes comerciais com ou sem adição de gema de ovo de ema não apresentaram diferenças em relação à motilidade total e progressiva, porém observou-se diferença nos parâmetros quando comparados os diluentes comerciais. Houve diferença na funcionalidade da membrana apenas quando comparado diluente A e B com gema de ovo de ema. No quesito integridade de membrana não foi observado diferença estatística. Estes resultados demonstram que a gema de ovo de ema (Rhea americana) pode ser uma alternativa para produção de diluentes para congelamento de sêmen de equinos. / The aim of this study was to compare the use of two commercial extenders using chicken egg yolk with the same extenders, to which ema (Rhea americana) egg yolk was added. Six Criollo breed stallions were used during the off-breeding season period. Six collections per stallion were used. The ejaculate aspect, total and progressive motility were evaluated with a microscope; concentration was determined with a Neubauer counting chamber. After evaluation, semen samples were divided in two aliquots and diluted 1:1 in each of the centrifugation extender Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares). For freeze that semen we used two commercial extenders: A (extender with glycerol) or B (extender with methylformamide) and was added 20% rhea egg yolk or 20% chicken egg yolk . Semen samples were examined at least 1 week after freezing, for total and progressive motility, physical and functional membrane integrity (HOST test and CFDA-PI fluorescence) (Lagares et al. 1998; Harrison & Vickers, 1990). The extenders of a given brand with or without rhea egg yolk had no significant difference according to total and progressive motility, although there was difference (p = 0,05) between extenders when different brands were compared, no matter if they were added Rhea egg yolk or not. Membrane functionality showed difference only when compared Extender A and B with Rhea egg yolk. Membrane integrity had no significant difference between all the treatments. These results show that Rhea egg yolk might be an alternative to making an equine semen extender.

O desenvolvimento de protocolos eficientes para a vitrificação de embriões mamíferos ainda é um desafio para os especialistas em reprodução. Soluções crioprotetoras de baixa toxicidade associadas a técnicas seguras de envase são fatores fundamentais, para proporcionarem uma eficiente identificação e controle sanitário das amostras. Dois experimentos foram realizados para determinar a taxa de sobrevivência de embriões Mus domesticus domesticus envasados em palhetas convencionais (0,25 mL), na presença de uma haste metálica de ouro, empregando soluções crioprotetoras descritas para a vitrificação em microvolume. No experimento 1, avaliou-se a toxicidade da solução de desidratação (SD: PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0,5 M sacarose), expondo-se os embriões por diferentes tempos: 1 (T1), 3 (T2) ou 10 min (T3). A toxicidade da solução de vitrificação (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) foi determinada pela exposição dos embriões durante 25, 60 ou 180 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. No experimento 2, avaliou-se a utilização do macrovolume (palhetas com a haste de ouro) e microvolume (micropipetas de vidro - GMP) na vitrificação dos blastocistos expostos à SV por 25 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. Os dados foram analisados pelo teste Qui-Quadrado (P<0,05). No experimento 1, não foi observada diferença estatística entre as taxas de eclosão dos embriões desidratados: T1=68,0% (38/56), T2=72,0% (36/50), T3=71,0% (39/55) e o grupo controle, (74,0% - 48/65). No entanto, houve diferença significativa (P<0,05) na taxa de eclosão em relação ao tempo de exposição dos embriões à SV. Os embriões desidratados por 1 ou 3 min e expostos à SV por 25 seg proporcionaram maiores taxas de re-expansão (79,0% vs 84,0%) e de eclosão (58,0% vs 72,0%), em relação aos tempos de exposição de 60 e 180 seg. No experimento 2, após a vitrificação dos embriões envasados nas palhetas com a haste de ouro, a taxa de eclosão dos blastocistos previamente desidratados por 1 min foi de 16,0% (10/64) e de 4,0% (2/57) quando previamente desidratados por 3 min. Por outro lado, os embriões envasados nas GMP, e previamente desidratados por 3 min, foram os que apresentaram maior taxa de eclosão (60,0% - 52/86). A vitrificação de embriões utilizando soluções crioprototetoras descritas para microvolume não foi eficiente na crioproteção dos blastocistos envasados em palhetas convencionais com a haste de ouro. / The development of efficient vitrification protocols for mammalian embryos still is a challenge for reproductive biologists. Low toxicity cryoprotectant solutions and safe vitrifications procedures that allow sample identification and sanitary control are fundamental factors. Two experiments were conducted to determine the survival rate of vitrified Mus domesticus domesticus embryos loaded into straws containing a metallic piece (manufactured in gold), using cryoprotectant solutions described for microvolume vitrification procedures. In Experiment 1, the toxicity of the dehydratation solution (SD: PBSm +10% EG + 10% PROH + 0,5 M sucrose) was evaluated using three different embryo exposure times: 1 (T1), 3 (T2) or 10 min (T3), in addition as well as the toxicity of the vitrification solution (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) was also tested upon embryo exposure for 25, 60 or 180 sec, previously dehydration for 1 or 3 min. In Experiment 2, the use of macrovolume (straw with a stem of gold) or microvolume (glass micropipettes – GMP) was evaluated for the vitrification of blastocysts after exposure to SV for 25 sec and previous dehydration for 1 or 3 min. Data were analized by the Chi-square test (P<0,05). In Experiment 1, statistical differences were not observed between hatching rates of dehydrated embryos: T1=68.0% (38/56), T2=72.0% (36/50), T3=71.0% (39/55) and control group embryos, (74.0% - 48/65). However, a significant difference (P <0,05) was observed between hatching rates after embryos exposure to the SV. Embryos dehydrated for 1 or 3 min and exposed for 25 sec to the SV showed higher re-expansion (79.0% vs. 84.0%) and hatching rates (58.0% vs. 72.0%) than embryos exposed to SV for 60 or 180 sec. In Experiment 2, after vitrification of the embryos loaded into straws containing a metallic piece showed a hatching rate of 16.0% (10/64) when previouslly dehydrated for 1 min, and 4.0% (2/57) when for 3 min. On the other hand, embryos loaded into GMP, previouslly dehydrated for 3 min, showed a higher hatching rate, (60.0% - 52/60). Embryo vitrification using a cryoprotectant solution described as suitable for microvolume was not efficient to cryoprotect blastocysts loaded into macrovolume straws containing a metallic piece.

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen eqüino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas, pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu- Crio® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio® ,isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico. / During semen cryopreservation, sperm cells were submitted to some deleterious events leading to membrane damage which result in fertility decrease. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing rates and the use of two commercial extenders as cryoprotectants (FR-5® and Botu-Crio®) on the total and progressive motility, integrity and functionality of spermatic membranes during the cryopreservation of equine semen. Twenty ejaculates were analyzed. The total and progressive motility of fresh and postthawing semen samples were evaluated by the patterns assays. The function of plasmatic membrane was measured by the hipoosmotic swelling test. The integrity of plasmatic membrane was evaluated using CFDA/PI fluorescent probes. There were significant differences between the two freezing techniques and/or between cryoprotectants for all assessed parameters. The combined used between Botu-Crio® and automated curves showed better results in total and progressive post-thawing motility. The extender Botu-Crio®, alone, showed better results in order to preserve the membrane integrity and function.

O zebrafish (Danio rerio) tem se destacado na pesquisa biomédica por sua homologia fisiológica e genética aos humanos. No entanto, há poucos relatos sobre a criopreservação ovariana desta espécie. Assim, pesquisamos a utilização de um recipiente de metal na vitrificação de tecido ovariano de zebrafish. O objetivo foi avaliar a sobrevivência e o desenvolvimento in vitro de folículos de zebrafish após a vitrificação de fragmentos ou ovários inteiros usando a cápsula de metal. Primeiro, testamos quatro soluções de vitrificação (VS1 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol; VS2 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO; VS3 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol + 0,5 M sacarose; VS4 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose) e cinco estágios de desenvolvimento folicular utilizando o teste de coloração supravital iodeto de propídio combinado com diacetato de fluoresceína. Estes resultados mostraram que os folículos em estágio I, imaturos, apresentaram as maiores taxas de sobrevivência celular e que VS1 foi a melhor solução em termos de viabiidade. No Experimento 2, utilizou-se VS1 para vitrificar o tecido ovariano em diferentes dimensões (fragmentos ou ovários inteiros) e em dois diferentes recipientes (palheta de plástico ou cápsula de metal). Para avaliar a sobrevivência e o crescimento folicular dos folículos em estádio I, o diâmetro dos folículos foi mensurado antes e depois de cultivo in vitro por 24 horas. A morfologia folicular foi analisada por microscopia de luz após vitrificação utilizando a cápsula de metal. Os dados mostraram que a morfologia de folículos imaturos foi bem preservada após a criopreservação. A taxa de sobrevivência folicular foi maior (P <0,05) em fragmentos vitrificados, quando comparados com a vitrificação de ovários inteiros. Não houve diferenças significativas na sobrevivência e crescimento folicular entre os dois recipientes de vitrificação, palheta de plástico ou cápsula de metal. No entanto, a cápsula de metal diminui os riscos de contaminação, pois é hermeticamente fechada evitando contato com nitrogênio líquido e poder ser esterilizada, em vista que é manufaturada em aço inoxidável. Por essas razões, acreditamos que a cápsula de metal tem um uso potencial em reprodução humana para a vitrificação em grau clínico de tecido ovariano. / Zebrafish (Danio rerio) has excelled in biomedical research for its physiological and genetic homology to humans. However, there are few reports on ovarian cryopreservation of this specie. Thus, we studied the use of a metal capsule to vitrify zebrafish ovarian tissue. The aim of this study was to assess the survival and in vitro development of zebrafish follicles after vitrification of fragmented or whole ovaries using the metal capsule. First, we tested four vitrification solutions (VS1 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol; VS2 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO; VS3 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose; VS4 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO + 0.5 M sucrose) and five follicular developmental stages using fluorescein diacetate and propidium iodide supravital staining test. These results showed that immature follicles, stage one, presented the highest survival rates and VS1 the best vitrification solution in terms of viability. In Experiment 2, we used VS1 to vitrify ovarian tissue in different dimensions (fragments or whole ovaries) and tested two different carriers (plastic straw or metal capsule). To evaluate follicular survival and growth of stage I, we measured follicle diameter before and after twenty-four-hour in vitro culture. The follicular morphology was analyzed by light microscopy after vitrification using the metal capsule. Data showed that the immature follicles morphology was well preserved after cryopreservation. Follicular survival rate was higher (P<0.05) on vitrified fragments, when compared to whole ovaries. There were no significant differences on follicular survival and growth between the two vitrification devices, plastic straw or metal capsule. However, the metal capsule being tightly sealed and manufactured in stainless steel avoids contact with liquid nitrogen and can be sterilized reducing contamination risk. These reasons lead us to believe that the metal capsule has a potential use in human reproduction for the clinical grade vitrification of ovarian tissue.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-06-13T14:10:30Z No. of bitstreams: 1 Ellen Cordeiro Bento da Silva.pdf: 1569026 bytes, checksum: 6366a64f83b2fc475c8cead9d8dc65aa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-13T14:10:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ellen Cordeiro Bento da Silva.pdf: 1569026 bytes, checksum: 6366a64f83b2fc475c8cead9d8dc65aa (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / It was aim to evaluate the effect of different concentrations of phenolic antioxidants on freezability of goats sperm, as well as their action during centrifugation in continuous Percoll density gradients and after selected semen freezing. Six goat semen pools were used for each of the three experiments. In the first two experiments, each semen pool was processed and diluted in the skimmed milk based extender (7 % glycerol), with or without antioxidants, according to experiment and experimental group [1 Experiment: 0, 15, 25, 50, 75 or 100 μM catechin or epigallocatechin gallate (EGCG); Experiment 2: 0, 15, 25, 50, 75 or 100 μM resveratrol or quercetin]. In Experiment 3, each semen pool was centrifugated in continuous Percoll density gradients and frozen (with or without antioxidants) according to experimental groups (NS=non selected; S= selected; SC75= selected with 75 μM catechin; SE100= selected with 100 μM EGCG; SQ25=selected with 25 μM quercetin; SR25=selected with 25 μM resveratrol; SR75=selected with 75 μM resveratrol). In Experiment 1, immediately after thawing, the straight linear velocity (VSL) and average path velocity (VAP) were greater (P<0.05) in 15 μM catechin than in 50 and 100 μM; wobble (WOB) was higher (P<0.05) in catechin 0, 15 and 25 μM than in 100 μM; beat cross frequency (BCF) was higher (P<0.05) in 75 and 100 μM catechin than in 0 μM. Progressive motility (PM) was greater (P<0.05) with 0 and 15 μM EGCG than with 50 and 75 μM; and linearity (LIN) was higher with 0 μM EGCG than with 100 μM. In Experiment 2 WOB was higher (P<0.05) in 0 and 25 μM resveratrol or 0 μM quercetin than 100 μM, immediately after thawing. In Experiment 3, immediately after sexing, PM, LIN, straightness (STR) and WOB from sexed groups were higher (P<0.05) than those from NS; SC75, VSL was higher (P<0.05) in SR25 and SR75 than in NS; amplitude of lateral movement of the head (ALH) was higher (P<0.05) in the NS than in other groups. SQ25 reduced (P<0.05) the mitochondrial membrane potential, compared to other groups. After thawing, PM, LIN, WOB, VSL and VAP were higher (P<0.05) in sexed groups than in NS, except to SE100 and SQ25; SC75 had greater (P<0.05) STR than NS; ALH was lower (P<0.05) in S, SC75, SR25 and SR75 than in NS; BCF was lower (P<0.05) in S than in NS; plasma membrane integrity was higher (P<0.05) in sexed groups than in NS, except to SE100; the percentage of intact and not dead cells was greater (P<0.05) in sexed groups than in NS. We concluded that, under the experimental conditions used, high concentrations (50 to 100 μM) of catechin inhibit the kinematics of frozen goat sperm in transitory way, and that resveratrol does not have any influence on goat semen freezability. Moreover, sex selection in continuous Percoll density gradients is feasible methodology to goats and compatible with freezing process; independent of antioxidant therapy used. / Objetivou-se avaliar o efeito de diferentes concentrações de antioxidantes fenólicos sobre a congelabilidade de espermatozoides caprinos, bem como a ação destes durante a centrifugação em gradientes contínuos de densidade de Percoll e após congelação do sêmen selecionado. Foram utilizados seis pools de sêmen caprino por experimento. Nos dois primeiros experimentos cada pool de sêmen foi processado e diluído em meio à base de leite desnatado (7% glicerol), acrescido ou não de antioxidantes, de acordo com o experimento e o grupo experimental [Experimento 1: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100 μM de catequina ou de epigalocatequina galato (EGCG); Experimento 2: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100 μM de resveratrol ou de quercetina]. No terceiro experimento, cada pool de sêmen foi centrifugado em gradiente contínuo de densidade de Percoll e congelado, de acordo com o grupo experimental (NS=não selecionado; S=selecionado; SC75=selecionado com 75 μM de catequina; SE100=selecionado com 100 μM de EGCG; SQ25=selecionado com 25 μM de quercetina; SR25=selecionado com 25 μM de resveratrol; SR75=selecionado com 75 μM de resveratrol). No Experimento 1, imediatamente após a descongelação, as velocidades linear progressiva (VSL) e média da trajetória (VAP) foram superiores (P<0,05) no grupo tratado com 15 μM de catequina do que com 50 e 100 μM; a oscilação (WOB) foi maior (P<0,05) com 0, 15 e 25 μM de catequina do que com 100 μM; e o batimento flagelar cruzado (BCF) foi maior (P<0,05) com 75 e 100 μM de catequina do que com 0 μM. A motilidade progressiva (MP) foi maior (P<0,05) com 0 e 15 μM de EGCG do que com 50 e 75 μM e a linearidade (LIN) foi maior (P<0,05) com 0 μM de EGCG do que com 100 μM. No Experimento 2, a WOB foi maior (P<0,05) com 0 e 25 μM de resveratrol ou 0 μM de quercetina do que com 100 μM, imediatamente após a descongelação. Para o Experimento 3, a MP, LIN, retilinearidade (STR) e WOB dos grupos selecionados em gradientes de Percoll foram maiores (P<0,05) do que as do NS; nos grupos SC75, SR25 e SR75 a VSL foi maior (P<0,05) do que no NS; a amplitude de deslocamento lateral de cabeça (ALH) foi maior (P<0,05) no grupo NS do que nos demais e o SQ25 reduziu (P<0,05) o potencial de membrana mitocondrial, em relação aos demais grupos. Após descongelação do sêmen, a MP, LIN, WOB, VSL e VAP foram maiores (P<0,05) nos grupos selecionados do que no NS, com exceção do SE100 e SQ25; o SC75 teve maior (P<0,05) STR do que o NS; a ALH foi menor (P<0,05) nos grupos S, SC75, SR25 e SR75 do que no NS; e o BCF foi menor no S do que no NS. A integridade de membrana plasmática foi maior (P<0,5) nos grupos selecionados do que no NS, com exceção do SE100; a porcentagem de células intactas e de não mortas foi maior (P<0,05) nos grupos selecionados do que no NS. Conclui-se que altas concentrações (50 a 100 μM) de catequina e EGCG inibem a cinética de espermatozoides congelados de caprinos, em caráter transitório, e que o resveratrol e a quercetina não têm qualquer influência sobre a congelabilidade do sêmen caprino. Por outro lado, a seleção de espermatozoides em gradientes contínuos de densidade de Percoll é uma metodologia viável para a espécie caprina e compatível com o processo de congelação; independente da terapian antioxidante usada.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-06-17T12:51:11Z No. of bitstreams: 1 Maria da Conceicao Carvalho.pdf: 3109620 bytes, checksum: 2f7f0bd4b88adbfe9f8dee53321968f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-17T12:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria da Conceicao Carvalho.pdf: 3109620 bytes, checksum: 2f7f0bd4b88adbfe9f8dee53321968f7 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Canids are part of the large number of endangered species. The survival of these species depends on the conservation of existing biodiversity. The use of gamete preservation techniques associated with reproductive technologies such as artificial insemination (AI), in vitro fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) were developed to help propagate and preserve the genetic potential of canídeos.A testicular tissue cryopreservation might be a method used when ejaculate freezing techniques is not possible. This work set in two experimentos congelamento and vitrificaçãoin vitro, comparing different cryoprotectants (glycerol, dimetisufóxido (DMSO) and trehalose) in testicular tissue of domestic dogs (Canis familiaris). Fragments of 9 adult dogs testes were subjected to a cooling with 4 cryopreservation protocols: slow freezing with glycerol, dimethylsulfoxide (DMSO) or solid surface vitrification using glycerol or DMSO. Fragments of 3mm testicular parenchyma were separated into groups: control, subjected to slow freezing and vitrification. Histological evaluations of the fragments were performed before, after freezing and thawing by light and electron microscopy. Based on morphology and ultrastructure, the testicular tissue of slow freezing, there was no difference between the cryoprotectants. Among the vitrified groups, exposure to DMSO produced a greater structural integrity and architecture when compared to the glycerol group. Comparison of slow freezing and vitrification have shown that vitrification samples revealed more area consisting of tubular compartment, tubular lumen, seminiferous epithelium and conserved membrane. Furthermore, the intertubular compartment Leydig cells showed normal morphology and had characteristics typical of steroidogenic cells. From the results, it was concluded that vitrification DMSO is the most effective method for criopresevar testicular tissue of adult dogs, and can be used as a routine procedure. / Os canídeos fazem parte do grande número de espécies ameaçadas de extinção. A sobrevivência destas espécies depende da conservação da biodiversidade existente. O uso de técnicas de preservação de gametas associadas às tecnologias reprodutivas tais como, inseminação artificial (IA), fertilização in vitro (FIV) e injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) foram desenvolvidas para ajudar a propagar e preservar o potencial genético dos canídeos.A criopreservação de tecido testicular pode vir a ser um método utilizado quando técnicas de congelação do ejaculado não é possível. A presente dissertação configurou-se em dois experimentoscongelamento e vitrificaçãoin vitro, comparando diferentes crioprotetores (glicerol, dimetisufóxido (DMSO) e trealose) em tecido testicular de cães domésticos (Canis familiaris). Fragmentos de testículos de 9 cães adultos foram submetidos a um arrefecimento com 4 protocolos de criopreservação: congelamento lento com glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), ou vitrificação superfície sólida, utilizando glicerol ou DMSO. Os Fragmentos de 3mm do parênquima testicular foram separados em grupos: controle, submetido ao congelamento lento e vitrificação. As avaliações histológicas dos fragmentos foram realizadas antes, após congelação e descongelação por microscopia óptica e eletrônica. Com base na morfologia e ultraestrutura, o tecido testicular de congelação lenta, não houve diferença entre os crioprotetores. Entre os grupos vitrificados, a exposição ao DMSO produziu maior integridade da estrutura e arquitetura quando comparado ao grupo de glicerol. A comparação do congelamento lento e vitrificação demonstraram que a vitrificação revelou amostras com mais área composta por compartimento tubular, luz tubular, epitélio seminífero e membrana conservada. Além disso, o compartimento intertubular mostrou células de Leydig tinham morfologia normal e características típicas de células esteroidogênicas. Diante dos resultados concluiu-se que a vitrificação com DMSO é o método mais eficaz para criopresevar tecido testicular de cães adultos, podendo ser utilizado como procedimento de rotina.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-14T15:47:28Z No. of bitstreams: 1 Lawrence de Oliveira Barros.pdf: 277797 bytes, checksum: 1f959a5c506b9c509d884cc0aa17f644 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-14T15:47:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lawrence de Oliveira Barros.pdf: 277797 bytes, checksum: 1f959a5c506b9c509d884cc0aa17f644 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / The cryopreservation of equine semen represents an important applied reproductive biotechnology of this species. When exposed to low temperatures, spermatozoa suffer structural modifications, occurring oxidative stress when there is imbalance between the production of reactive oxygen species (- ROS) and the amount of antioxidants present in seminal plasma. The objective of this study was to analyze the effect of the addition of different concentrations of the antioxidants glutathione peroxidase (GPx) and cysteine in equine frozen semen medium. Five Quarter Horse stallions, with proven fertility were used. Semen samples were collected with artificial vagina and diluted in Botu Crio added with antixodants: G1= Control (without antioxidants); G2= 0.5 mM of N-Acetil-Cysteine; G3= 1 mM of N-Acetil-Cysteine; G4 = 1 U of Glutathione Peroxidase (GPx) and G5= U of Glutathione Peroxidase (GPx). Semen samples were packed straws (0.5 mL; 150 x 106 concentration of spermatozoa/straw), frozen in automated method and stored in liquid Nitrogen (– 196 °C). Semen samples were thawed (37 °C per 30 seconds) and submitted to sperm analyses (kinematic, plasma membrane and acrosome integrity, and potential of mitocondrial membrane), immediately after thawing (T0) and after 60 minutes (T60). Semen samples supplemented with GPx 5 U and cysteine 0.5 mM did not show difference (P>0.05) on the percentage of sperms with high percentage of potential of mitocondrial membrane, as well as with intact acrosome and plasma membrane between T0 and T60 times. Frozen samples with cisteine 1 mM showed high (P<0.05) of gametes with intact acrosome than those of GPx 1 and 5 U and cisteine 0.5mM. Spermatozoa with higher percentage of potential of mitocondrial membrane was founded in T60 (P<0.05) in stallion 5 than stallions 1 and 2. The sperm kinematic evidenced a high values of VCL and VAP (P<0.05) in control samples, in T0 than T60. In general, the stallion 4 presented high values (P<0.05) of kinematic parameters than other stallions. It can be concluded that addition of cysteine (1mM) in equine frozen semen medium preserved better the acrosome integrity and that the individual response of each stallion influence significantly the results of the sperm analysis. / A criopreservação de sêmen equino representa uma importante biotécnica aplicada ao manejo reprodutivo desta espécie. Quando exposto a baixas temperaturas, os espermatozoides sofrem modificações estruturais, ocorrendo estresse oxidativo quando há desequilíbrio entre a produção de ROS e a quantidade de substâncias antioxidantes presentes no plasma seminal. Objetivando-se analisar o efeito da adição de diferentes concentrações de glutationa peroxidase (GPx) e cisteína ao diluidor de congelação do sêmen de eqüinos, foram utilizados cinco garanhões da raça Quarto-de-Milha, com fertilidade comprovada. Amostras de sêmen foram colhidas com vagina artificial e diluídas em Botu Crio, acrescido de antioxidantes: G1= Controle (Sem antioxidantes); G2= 0,5 mM de N-Acetil-Cisteina; G3= 1 mM de N-Acetil-Cisteina; G4 = 1 U de Glutationa Peroxidase (GPx) e G5= 5 U de Glutationa Peroxidase (GPx). A seguir, as amostras de sêmen foram envasadas em palheta (0,5 mL; na concentração de 150 x 106 espermatozóides/palheta), congeladas utilizando o método automatizado e armazenadas em botijão criogênico à – 196°C. As amostras foram descongeladas (37 °C por 30 segundos) e submetidas às análises espermáticas (cinética, integridade de membrana plasmática, integridade de acrossoma e potencial de membrana mitocondrial), imediatamente após a descongelação (T0) e após 60 minutos (T60). Amostras de sêmen suplementadas com GPx 5 U e cisteína 0,5 mM não apresentaram diferenças (P>0,05) na porcentagem de espermatozóides com alto potencial de membrana mitocondrial, assim como com acrossomas e membrana plasmática íntegras, entre os tempos T0 e T60. Amostras congeladas com cisteína 1 mM apresentaram maior (P<0,05) porcentual de gametas com acrossomas íntegros do que os de GPx 1 e 5 U e cisteína 0,5 mM. Espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial foram encontrados no T60 em maior (P<0,05) porcentual no garanhão 5 em relação aos garanhões 1 e 2. A cinética espermática evidenciou maiores (P<0,05) valores de VCL e VAP nas amostras controle, no T0 do que no T60. De maneira geral, o cavalo 4 apresentou maiores (P<0,05) valores cinéticos que os demais animais. Conclui-se que a adição de cisteína 1mM preservou melhor a integridade de acrossoma espermático, e que a resposta individual de cada garanhão influencia significativamente os resultados dos parâmetros analisados.