A criação de equinos tem se desenvolvido ativamente no Brasil. Assim, o interesse dos proprietários em biotecnologias reprodutivas equinos vem aumentando. Entretanto, o sêmen equino tem baixa tolerância à criopreservação comparada com outras espécies, sendo o estresse oxidativo um entrave por seus efeitos deletérios sobre a célula espermática. Neste contexto, o plasma seminal possui antioxidantes que promovem um papel importante na proteção do espermatozoide. Porém o, durante o processo de criopreservação, o plasma seminal é retirado. Em estudo anterior verificamos que, na ausência do plasma seminal os espermatozoides equinos tornam-se mais susceptíveis ao estresse oxidativo, principalmente causado pelo malondialdeído (MDA), subproduto da oxidação de lipídeos. Um dos motivos para este resultado seria a retirada da carnosina, um dos principais antioxidantes responsáveis pela proteção contra o acúmulo de MDA e seus efeitos deletérios, presente no plasma seminal. O objetivo do presente estudo é identificar e quantificar carnosina no plasma seminal de garanhões e comparar as características seminais em diferentes grupos de bons e maus refrigeradores e congeladores, baseando-se na análise da motilidade posterior ao processo de refrigeração e congelação. Foram colhidos dois ejaculados de quarenta garanhões (idades entre 4 e 16 anos de idade). As variáveis analisadas foram cinética espermática pelo sistema CASA, avaliação funcional (coloração de eosina-nigrosina para membranas, fast-green/rosa bengala para acrossomos, coloração 3-3diaminobenzidina para atividade mitocondrial e SCSA™ para susceptibilidade a denaturação de cromatina) e avaliação do índice de peroxidação lipídica (TBARS) do espermatozoide e do plasma seminal. Também foram realizadas análises da integridade de membranas plasmática e acrossomal, e potencial de atividade mitocondrial pelas sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox. A carnosina do plasma seminal foi mensurada utilizando kit de ELISA Biomatik® comercial. Foram comparados os grupos bons e maus refrigeradores, e bons e maus congeladores (p≤0,05). Verificamos uma maior concentração de carnosina nos bons refrigeradores em relação aos que refrigeraram mau. Isso pode ter ocorrido pela maior concentração de TBARS no plasma seminal destes animais, possivelmente por um efeito fisiológico de reações de oxidação. Além disto, os bons refrigeradores apresentaram porcentagens significativamente maiores de células com alta atividade mitocondrial, acrossomo intacto e membrana intacta sugerindo um efeito benéfico da carnosina. Em relação ao efeito da congelação do sêmen, não foi observada diferença na concentração de carnosina entre os que congelaram bem ou não. Este resultado era esperado uma vez que, durante o processo de criopreservação do sêmen equino o plasma seminal é retirado. De fato, a maior porcentagem de células com lesão mitocondrial, de membrana e DNA lesado nos maus congeladores e as correlações entre as lesões e o estresse oxidativo pode indicar um mecanismo mitocondrial de geração de estresse oxidativo e consequente lesão das estruturas celulares. Conclui-se que a carnosina apresentou efeito protetor durante a refrigeração espermática protegendo contra injúrias causadas pela mesma e consequentemente é um dos fatores que melhora a qualidade espermática após 24 horas de refrigeração. / Equine breeding has been actively developing in Brazil, leading to increased interest in reproductive biotechnology. However, there is a limitation due to a tolerance of some stallions to cryopreservation, especially when compared to other species. In this context, oxidative stress represents an obstacle due to its deleterious effects on equine sperm. To counterattack such effect, seminal plasma has antioxidants that play an important role in protecting the sperm. However, during the cryopreservation process, the seminal plasma is withdrawn. In a previous study we verified that, in the absence of seminal plasma, equine spermatozoa are more susceptible to oxidative stress, mainly caused by malondialdehyde (MDA), a product of lipid oxidation. One of the reasons for this result would be the removal of carnosine present in the seminal plasma, one of the main antioxidants responsible for protection against the MDA accumulation and its deleterious effects. The objective of the present study was to identify and quantify carnosine in the seminal plasma of stallions and to compare the seminal characteristics in different groups of sperm samples with high and low tolerance to the cryopreservation or cooling, based on analysis of total motility after these processes. Two ejaculates of forty stallions (N= 80; ages between 4 and 16 years old) were collected. Each ejaculate was divided into two aliquots, one submitted to a 24h cooling and the other submitted to cryopreservation. The variables analyzed were: Computer Assisted Sperm Analysis (CASA system), functional evaluation (eosin-nigrosin stain for membranes, fast-green/rose bengal for acrosomes, 3-3\'diaminobenzidine staining for mitochondrial activity and SCSA™ for susceptibility to chromatin denaturation) and lipid peroxidation index (TBARS assay) of sperm and seminal plasma. Furthermore, plasma and acrossomal membranes integrities and mitochondrial membrane potential were also analyzed using the fluorescence probes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA, JC-1 and ROS detection by CellRox fluorescent probes. Carnosine from the seminal plasma was measured using commercial Biomatik® ELISA kit. Thus, samples with high and low tolerance were compared (p≤0.05). We found a higher concentration of carnosine in good cooler compared to those showing low motility. This may have occurred in response to the higher concentration of TBARS in the seminal plasma of these animals, possibly due to a physiological effect of oxidation reactions. In addition, good coolers presented significantly higher percentages of cells with high mitochondrial activity, intact acrosome and intact membrane suggesting a beneficial effect of carnosine. Regarding the effect cryopreservation, no difference was observed between those with high and low post-thaw motility. This result was expected since, during the cryopreservation process of equine semen, the seminal plasma is removed. In fact, the higher percentage of cells with mitochondrial lesions, damaged membrane and fragmented DNA in bad freezers and the correlations between lesions and oxidative stress may indicate a mitochondrial mechanism of oxidative stress generation and consequent lesion of cellular structures. In conclusion, carnosine had a protective effect during sperm cooling, protecting against damages being probably one of the factors that improves sperm quality after 24 hours of refrigeration.

As espécies reativas de oxigênio (ROS) podem ser responsáveis por causar danos às membranas dos espermatozoides, fragmentação de DNA, entre outros fatores, influenciando assim na fertilidade principalmente no processo de criopreservação do sêmen. A melatonina (MEL) e o ácido ferúlico (AF) são potentes agentes antioxidantes que poderiam atuar no controle da produção de ROS no sêmen equino. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito dos antioxidantes AF e MEL na criopreservação do sêmen equino. Foram utilizados 5 ejaculados de 4 garanhões. Dentre os tratamentos aplicados, foram utilizadas duas concentrações de cada antioxidante (AF 0,5mM, AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1µM) além do controle (diluidor de congelação convencional BotuCrio®), totalizando 5 tratamentos. As variáveis analisadas foram cinética espermática pelo sistema CASA (programa SCA - Sperm Class Analyser), morfologia, integridade de membranas plasmática, acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, com o uso das sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox Deep Red®. Comparações entre os tratamentos foram realizadas pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3) e as diferenças entre eles foram localizadas através do teste de Duncan. A probabilidade de P0,05 foi considerada como diferença significativa. Os resultados para características da motilidade tiveram diferença significativa em alguns aspectos, porém nenhum tratamento foi superior ao controle. Houve diminuição no percentual de defeitos maiores nas amostras tratadas com AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1µM comparadas ao grupo controle. No que diz respeito à integridade de membranas, o tratamento MEL 1µM apresentou porcentagens significativamente melhores nas células com membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de membrana mitocondrial, quando comparadas ao grupo controle. As células em estresse oxidativo não se diferenciaram entre os tratamentos. O uso da sonda fluorescente CellRox Deep Red® foi validado para espermatozoides de equinos. Foram utilizados 4 ejaculados de 4 garanhões aos quais eram submetidos aos tratamentos T0 (fração do ejaculado não submetida à indução do estresse oxidativo), T50 (50% da amostra não induzida e 50% induzida ao estresse oxidativo) e T100 (amostra induzida ao estresse oxidativo). Os dados de porcentagem de células positivas (com estresse oxidativo) foram submetidos à análise de regressão polinomial pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3). O valor do coeficiente de determinação (R2) foi igual a 0,88 e a probabilidade de P0,05 foi considerada significativa. Pode-se concluir que o tratamento MEL 1µM contribui para a preservação da integridade de membranas espermáticas durante o processo de criopreservação do sêmen equino e que a sonda fluorescente CellRox Deep Red® é eficiente na detecção de espécies reativas de oxigênio no espermatozoide de garanhões. / Reactive oxygen species (ROS) can be responsible for causing damage to the membranes of sperm, DNA fragmentation, among other factors influencing fertility especially in cryopreservation. Melatonin (MEL) and ferulic acid (FA) are potent antioxidants that could act in the control of ROS production in equine semen. This study aimed to evaluate the effect of antioxidants AF and MEL in cryopreservation of equine semen. Five ejaculates from four stallions were used. Among the treatments, we used two concentrations of each antioxidant (AF 0.5mM, AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1µM) beyond the control (conventional freezing extender BotuCrio®), totaling five treatments. The parameters analyzed were sperm kinetics with the CASA system (SCA program - Sperm Class Analyzer), morphology, plasma and acrossomal membrane integrity mitochondrial membrane potential, using fluorescent probes PI, Hoechst 33342, FITC-PSA and JC- 1 over production ROS by the sperm with the fluorescent probe CellRox Deep Red®. Comparisons between treatments were performed by generalized linear model (PROC GLM) of SAS (version 9.3) and the differences between them were located with the Duncan test. The probability of P0.05 was considered significant. The results for the motility characteristics were significant differences in some aspects, but no treatment was superior to the control. There was a decrease in the percentage of major defects in the samples treated with AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1µM compared to the control group. Regarding to membrane integrity, treatment MEL 1µM showed significantly better in percentages of cells with intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential compared to the control group. Cells with oxidative stress not differ between treatments. The fluorescent probe CellRox Deep Red® was validated for equine sperm previously. Was used ejaculates of 4 stallion which were subjected to the treatments T0 (fraction of the ejaculate not subjected to induction of oxidative stress), T50 (50% sample uninduced and 50% induced to oxidative stress) and T100 (sample induced to oxidative stress). The data of percentage of positive cells (with oxidative stress) were submitted to polynomial regression analysis based on generalized linear model (GLM PROC) of SAS (version 9.3). The value of the coefficient of determination (R2) was 0.88 and a probability of P0.05 was considered significant. It can be conclude that the treatment MEL 1µM contributes to the preservation of the integrity of sperm membranes during the equine sperm cryopreservation process and the fluorescent probe CellRox Deep Red® is efficient in the detection of reactive oxygen species in stallions sperm.

Um dos fatores responsáveis pela diminuição expressiva da qualidade espermática pós-criopreservação seria um maior índice de estresse oxidativo, provocado por uma maior produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), não compensada pela proteção antioxidante. O presente experimento visa estudar o efeito do tratamento antioxidante com glutationa (GSH) e vitamina E, adicionados ao diluidor, na qualidade do espermatozóide pós-criopreservação em cães. Para isso, o sêmen de 12 cães foi dividido em mixes constituídos dos ejaculados provenientes de 3 cães com no mínimo 70% de motilidade. O mix de sêmen foi então dividido em 7 alíquotas e diluídas em extensor a base de gema de ovo e ácido círtrico suplementadas com 0, 1, 5 e 10 mM de GSH e 1, 5 e 10 mM de vitamina E. Após o período de refrigeração as amostras foram analisadas quanto a motilidade e vigor espermáticos. As amostras foram então descongeladas e avaliadas quanto à motilidade, vigor, porcentagem de espermatozóides com membrana (eosina/nigrosina) e acrossomo (Coloração simples) íntegros, atividade mitocondrial (coloração diaminobenzidina) e susceptibilidade das células ao estresse oxidativo (TBARS). Os resultados foram analisados através do SAS System for Windows. Verificou-se que as amostras tratadas com 1 mM de GSH apresentaram maior porcentagem de células com membrana íntegra quando comparadas ao controle (11,21 ± 2,84 e 6,21 ± 1,16, respectivamente; p<0,05). A concentração de 5 mM de GSH apresentou melhores resultados em relação à atividade mitocondrial. Para as amostras tratadas com vitamina E, não houve efeito significativo com exceção da porcentagem de células DAB III, em que amostras tratadas com 1 mM apresentaram melhores resultados em comparação ao controle (5,61 ± 0,7 e 8,62 ± 1,05, respectivamente; p<0,05). Os resultados do presente experimento indicam que o tratamento antioxidante de amostras criopreservadas de cães com GSH e vitamina E apresentaram efeitos benéficos para a atividade mitocondrial dos espermatozóides. / One of the main factors known to impair post thaw semen quality is oxidative stress (i.e., higher production of reactive oxygen species not compensated by improved antioxidant protection). The present experiment aimed to evaluate the effects of antioxidant treatment with glutathione (GSH) and vitamin E on the quality of dogs cryopreserved semen. Towards this aim, semen of twelve dogs was divided into mixes constituted of the ejaculate of three dogs with at least 70% motility. Each mix was then divided into 7 extender treatment groups as follows: Control, Vitamin E 1, 5, 10 mM, and GSH 1, 5 and 10 mM. O mix de sêmen foi então dividido em 7 alíquotas e diluídas em extensor a base de gema de ovo e ácido círtrico suplementadas com 0, 1, 5 e 10 mM de GSH e 1, 5 e 10 mM de vitamina E. After cooling, motility and vigor were assessed. Cryopreserved samples were thawed and evaluated for motility, vigor, percentage of sperm showing intact membrane (eosin/nigrosin) and acrosome (Simple stain), mitochondrial activity (diaminobenzidine) and susceptibility to oxidative stress (TBARS). Statistical analyses was performed using the SAS system for Windows. Samples treated with 1 mM of GSH showed higher percentage of intact membrane sperm when compared to the control (11.21 ± 2.84 and 6.21 ± 1.16, respectively; p<0.05). Treatment with 5 mM of GSH showed better results regarding mitochondrial activity. Effect of vitamina E treatment was observed only for the percentage of DAB III cels (i.e., cells with severe compromised mitochondrial activity), in which samples treated with 1 mM showed better results when compared to the control group (5.61 ± 0.7 and 8.62 ± 1.05, respectively; p<0.05). Results of the present study indicate that treatment with GSH and vitamin E to cryopreserved sperm samples of dogs improve post-thaw mitochondrial activity.

Durante o processo de criopreservação o espermatozóide passa por mudanças estruturais nas membranas que resulta em diminuição da fertilidade. Este estudo foi realizado para comparar os efeitos de duas técnicas de congelação (técnica convencional e técnica automatizada), curvas de congelação e o uso de três crioprotetores (glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida) sobre a motilidade, vigor e integridade das membranas espermáticas (plasmática, acrossomal e mitocondrial) do sêmen bovino. Foram utilizados cinco touros da raça Simental, coletados semanalmente por seis semanas. O semên foi avaliado e diluído em tris-gema (fração única), preparado previamente com os seguintes crioprotetores:- dimetilformamida (3%), etilenoglicol (7%) ou glicerol (7%). A metade das doses foi congelada pela técnica convencional (TC), da seguinte maneira:- seis quilogramas de gelo moído foi colocado em uma de uma caixa de isopor de 15 litros, quando então as palhetas a serem congeladas foram colocadas sobre um suporte, na posição horizontal, por 90 minutos (curva de resfriamento, -0,55°C/min). Imediatamente após, o suporte com as palhetas foi transferido para outra caixa de isopor onde as palhetas permaneceram em vapor de nitrogênio (3cm), por 15 minutos (curva de congelação, -19,1°C/min). A outra metade das palhetas foi criopreservada pela técnica automatizada (TA), utilizando-se um aparelho programável portátil de controle eletrônico (TK2000), com taxa de resfriamento de -0,23°C/minuto e taxa de congelação de -15,5°C/minuto. Após a congelação as palhetas foram mantidas em botijões criogênicos e descongeladas para avaliação da motilidade (%) e vigor (1-5) por microscopia óptica. A integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial foi avaliada utilizando-se o iodeto de propídio (PI); aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceína (FITC-PSA) e MitoTracker Green FM (MITO), respectivamente, por microscopia de epifluorescência. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Programa StatView® (SAS Institute, Cary, NC, USA). Não houve diferenças significativas entre as técnicas e nem interação entre crioprotetor e técnica de congelação (P>0,05) para os parâmetros avaliados. Houve diferença entre os crioprotetores (P<0,05), sendo que o glicerol preservou melhor a motilidade, o vigor e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozóides quando comparado ao etilenoglicol e a dimetilformamida. O etilenoglicol foi superior à dimetilformamida para as avaliações da motilidade e da integridade das membranas plasmática e mitocondrial (P<0,05). Uma vez que, 85% dos espermatozóides apresentaram algum grau de lesão, isto nos conduz a inferir que pesquisas são necessárias para que se obtenha melhoria nos resultados após a criopreservação do sêmen bovino / During cryopreservation, spermatozoa undergo many changes leading to membrane damage which result in decreased fertility. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing curves and the use of three cryoprotectants (glycerol, ethylene glycol and dimethylformamide) on the motility, vigor and integrity of spermatic membranes (plasmatic, acrosomal, and mitochondrial) of bovine semen. Five Simmental bulls ranging from 24 to 36 months age were submitted one a week to semen collection for six weeks. Semen samples were evaluated and diluted in TRIS-yolk medium (one step). Each semen collection dilutors were prepared previously with each of following cryoprotectants:- glycerol (7%), ethylene glycol (7%) or dimethylformamide (3%). Half of the amount of straws (0.5 mL) was frozen by a conventional manual technique (TC), as in following protocol:- six kilograms of ground ice were placed in the bottom of a thermal box (15 L), straws were cooled on a grid placed horizontally for 90 minutes (cooling rate, -0.55°C/min), immediately transferred to another thermal box and frozen in static liquid nitrogen vapor (15 min) on the same grid placed 3 cm above the liquid nitrogen (freezing rate, -19.1°C/min). The other half of straws was frozen by automated technique (TA). TA was performed using an electronic controlled programmed machine (TK2000) which cooling rate was -0.23°C/min and freezing rate was -15.5°C/min. Straws were plunged into liquid nitrogen and stored at -196°C. The motility (%) and vigor (1-5) were assessed using optic microscopy. The integrity of plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes were evaluated using propidium iodide (PI), fluorescein conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and MitoTracker Green FM (MITO), respectively, by fluorescence microscopy. Effects of treatment were analyzed by StatView® Program, (SAS Institute, Cary, NC, USA). There were no significant differences (P>0.05) between the two freezing techniques and no interaction among cryoprotectant and freezing techniques for all assessed parameters. Glycerol showed better results (P<0.05) than other two cryoprotectants for motility, vigor, and integrity of plasmatic, acrosomal and mitocondrial membranes. Ethylene glycol was superior (P<0.05) than dimethylformamide in preserve motility, and integrity of plasmatic and mitochondrial membranes. Because 85% of spermatozoa showed some kind of post thawing injury, further studies are required to improve cryopreservation techniques used routinely for bovine semen

Ao longo da vida reprodutiva dos machos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonialstemcells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a preservação da linhagem germinativa, porém os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento e exige a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. A literatura científica ainda não definiu uma metodologia que seja eficaz na congelação das SSCs. O presente estudo teve por objetivo avaliar duas metodologias de vitrificação de tecido testicular de murinos. Para testar esse objetivo, testículosde camundongos da linhagem C57BL6 GFP+ com 8 a 10 dias de idade foramsubmetidos a dois protocolosde vitrificação de tecido testicular descritos na literatura (Protocolo EG+Sacarose e ProtocoloEG+DMSO+BSA). Após 4 a 12 semanas, os testículos vitrificados foram descongelados e as células testiculares dissociadas para avaliação da viabilidade e concentração. As SSCs foram selecionadas por meio de separação celular por \"beads\" magnéticas (MACS) com anticorpoThy1.2 e transplantadas para testículos de camundongos adultos da linhagem C57BL6 previamente tratados com o quimioterápico busulfan. Após seis semanas, os testículos destes animais foram coletados e os túbulos seminíferos dissociados para avaliação da formação de colônias pelas SSCs transplantadas. Houve diferença estatística (p<0,0001) na viabilidade das células entre o Protocolo EG+Sac e Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 74,4% e 82,8%, respectivamente. Também houve diferença estatística (p<0,0001) na concentração de células obtidas entre o Protocolo EG+Sace Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 0,43x106 e 1,35x106, respectivamente. Colônias formadas pelas SSCs transplantadas foram encontradas nos testículos dos animais transplantadas para os dois protocolos de vitrificação. De forma descritiva, podemos relatar queo número de colônias observadas para as células do Protocolo EG+DMSO+BSA foi maior comparado ao Protocolo EG+Sac. Portanto, conclui-se que os protocolos de vitrificação de tecido testicular de camundongos estudados foram capazes de preservar a viabilidade de células-tronco espermatogoniais possibilitando a formação de colônias por estas, sendo que o ProtocoloEG+DMSO+BSA de vitrificação foi mais eficiente. / Throughout the reproductive life of males, spermatozoa are formed by spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for preservation of the germ line, but the protocols require the addition of growth factors and require the maintenanceof these cells for a prolonged time, making of the SSCs cryopreservation an alternative for this problem. The scientific literature has not yet defined a methodology that is effective in the freezing of SSCs. The present study aimed to evaluate two methodologies of vitrification of murine testicular tissue. To test this aim, testes of mice of the C57BL6 GFP + strain with 8 to 10 days old were submitted to two protocols of testicular tissue vitrification(Protocol EG+Sucrose and EG+DMSO+BSA). After 4 to 12 weeks, the vitrified testes were thawed and the testicular cells dissociated for viability and concentration assessment. The SSCs were selected by magnetic-activated cell sorting (MACS) using Thy1.2 antibodyand transplanted to testes of adult mice of the C57BL6 strainpreviously treated with thequimioterapicbusulfan. After six weeks, the testes of these animals were collected and seminiferous tubules dissociated to evaluate the formation of colonies by transplanted SSCs. There was a statistical difference (p<0.0001) in cell viability between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 74.4% and 82.8%, respectively. There was also a statistical difference (p<0.0001) in the concentration of cells obtained between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 0.43x106 and 1.35x106, respectively. Colonies formed by the transplanted SSCs were found in the testes of the transplanted animals for the two vitrification protocols. In a descriptive way, we can report that the number of colonies observedfor Protocol EG+DMSO+BSA cells was higher compared to the Protocol EG+Suc. Therefore, it is concluded that the mice testicular tissue vitrification protocols studied were able to preserve the viability of spermatogonial stem cellsallowing the formation of colonies by these cells and the vitrification ProtocolEG+DMSO+BSA was more efficient.

A espécie Callithrix jacchus pode ser utilizada como modelo experimental para outras espécies de primatas neotropicais, principalmente Callithriquídeos. Colheu-se sêmen desta espécie com os objetivos de otimizar a colheita de sêmen por vibro estimulação peniana, validar técnicas de avaliação espermática que possam ser utilizadas a campo, comparar as características seminais de indivíduos de duas colônias (Brasil e Alemanha), testar diferentes protocolos de congelação espermática e avaliar a atividade citoquímica mitocondrial (DAB) e a fragmentação de DNA de espermatozóides congelados. As técnicas de coloração para avaliação espermática utilizadas foram: eosina-nigrosina, coloração dupla trypan-blue giemsa, coloração simples para acrossoma, FITC-PSA, SpermOscan®, Spermac®, coloração com 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) e ensaio Cometa alcalino. A congelação foi realizada com 100 µL de sêmen com meio TEST-Gema de ovo clarificado com glicerol 4% em palhetas 0,25 mL, e os protocolos de congelação testados foram: 1) fase de equilíbrio com curva de resfriamento (25°C-4°C) em 2 horas, 10 minutos no vapor de nitrogênio e finalmente imersão em nitrogênio líquido; 2) como Protocolo 1, mas sem fase de equilíbrio/resfriamento; e 3) diretamente no nitrogênio líquido. As palhetas foram descongeladas em água a 37°C por 5-10 segundos. A técnica de colheita resultou em 83,33% dos procedimentos com ejaculação. A coloração simples para acrossomo foi eficiente e pôde ser validada para utilização a campo. Não houve diferença significante (p<0,05) nas características seminais avaliadas entre as colônias do Brasil e da Alemanha. As análises pós-descongelação demonstraram queda nas variáveis motilidade e integridade da membrana plasmática com discreta superioridade no Protocolo 1, não houve diferença significante (p<0,05) entre os protocolos para a atividade citoquímica mitocondrial e o Protocolo 2 apresentou a menor taxa de fragmentação de DNA. / The Callithrix jacchus can be used as a model species for other Neotropical primates species, mainly Callithriquids, for reproductive studies. Semen samples were collected with the following objectives: to improve the penile vibrostimulation technique, validate sperm evaluation techniques for field work, analyse the semen characteristics from animals at 2 colonies (Brazil and Germany), use 3 different freezing protocols in common marmosets sperms, evaluate a cytochemical technique for mitochondrial activity demonstration and evaluate DNA damage in frozen-thawed sperms. The staining techniques used in this work were: Eosin-nigrosin, Trypan-blue Giemsa, simple staining for acrosome, FITC-PSA, SpermOscan®, Spermac®, demonstration of cytochrome c oxidase activity in situ by the oxidation of 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) and the Comet assay. Freezing was done in 100 µL semen with TESt-Yolk clarified medium plus 4% glycerol using 0.25 mL straws. The freezing protocols tested were: 1) straws at equilibrium phase with a 25°C to 4°C curve in 2 hours, 10 minutes at nitrogen vapour and finally into liquid nitrogen; 2) same as Protocol 1 without the equilibrium phase; and 3) straws directly into liquid nitrogen. All attempts resulted in 83,33% ejaculates. The simple staining technique for acrosome was validated and resulted in an obvious differentiation of the intact acrosome. Semen characteristics evaluation showed no difference between the 2 colonies. Post-thaw evaluation showed all protocols had negative effects on motility and plasmatic membrane integrity with a slightly superiority on Protocol 1. There was no difference between protocols in the mitochondrial activity demonstration and Protocol 2 presented the lowest DNA damage.

A criopreservação, como já conhecido, causa danos da função celular podendo, com isso, apresentar redução da fertilidade. O desenvolvimento de técnicas para avaliar a viabilidade espermática, que visam aperfeiçoar o processo de avaliação seminal tem sido meta de muitas pesquisas. Este trabalho foi dividido em dois experimentos. O experimento 1 foi realizado para o desenvolvimento e validação de técnicas práticas e de alta repetibilidade para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial de espermatozóides bovinos pela associação de sondas fluorescentes. O experimento 2 foi realizado para avaliar os efeitos que a criopreservação pode causar sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial (pela técnica desenvolvida no experimento 1) e estrutura da cromatina de espermatozóides bovinos frente a dois diluidores diferentes, bem como verificar a existência de correlações entre alterações nas membranas e características de motilidade em espermatozóides bovinos criopreservados. No experimento 1 as associações das sondas iodeto de propídio (PI, para avaliar integridade da membrana plasmática) e aglutinina de Pisum sativum conjugada a isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA, para avaliar a integridade acrossomal), foram divididas em quatro protocolos, nos quais foram testadas diferentes sondas para avaliar a função mitocondrial. Rodamina 123 (R123, protocolo 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocolo 2), CMXRos ou MitoTracker red (protocolo 3) e no: iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro-1,1’,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1, protocolo 4). Estes protocolos foram testados e validados. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância, teste de Fisher e à análise de regressão linear pelo programa Stat-View&reg; (SAS Institute, Inc. 1998). O protocolo 1 não apresentou resultados satisfatórios, não sendo possível validar, enquanto, os protocolos 2, 3 e 4 foram validados e apresentaram resultados bastante consistentes. O protocolo 4 foi escolhido para a utilização no experimento 2. Para o experimento 2 foram realizadas sete colheitas de sêmen de oito touros puros da raça Simental. Após a colheita, o sêmen foi avaliado quanto ao volume, concentração, motilidade e vigor visualmente, motilidade por sistema computadorizado (CASA), características morfológicas por microscopia de interferência diferencial, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial, pela associação de FITC-PSA, PI e JC-1, e integridade da estrutura da cromatina, pela técnica da acridina laranja. Após as análises, o sêmen foi dividido em duas alíquotas, sendo uma das alíquotas diluída com o diluidor Bioxcell&reg; e a outra com o diluidor Botu-Bov&reg;, envasado em palhetas e submetido a congelação com um sistema automatizado. Duas palhetas cada tratamento foram descongeladas e o sêmen foi avaliado quanto a motilidade e vigor visualmente, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial e estrutura da cromatina. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 1985), os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey. Foram calculadas correlações lineares de Pearson. O nível de significância foi fixado em 5%. Foram observados efeitos da criopreservação e do diluidor sobre motilidade e vigor visual, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial. De forma que, após a criopreservação houve aumento dos danos nas estruturas espermática e o diluidor Botu-Bov&reg; apresentou a maioria das características melhores quando comparado ao diluidor Bioxcell&reg; / The process of cryopreservation causes damages in the sperm cellular function which may lead to a reduction in fertility. New techniques to evaluate sperm viability may improve the process of semen evaluation. The present work was divided in two experiments. Experiment 1 aimed the development and validation of practical techniques with high repetibility for simultaneous evaluation of integrity of plasmatic and acrosomal membrane and mitochondrial function of bovine spermatozoa by the strategic association of fluorescent probes. Objective of experiment 2 was to validate the effects of cryopreservation using two differents diluents on sperm motility, plasmatic, acrosomal, mitochondrial membranes integrity and chromatin structure of bovine spermatozoa. A second objective was to verify the correlations between alterations in membranes and motility characteristics in cryopreserved bovine spermatozoa. In experiment 1 propidium iodide (PI, to evaluate plasmatic membrane integrity) and the Pisum sativum agglutinin conjugated with fluorescein isothicyonate- (FITC-PSA, to evaluate acrosomal integrity). Probes were associated to evaluate mitochondrial function in four protocols: Rhodamine 123 (R123, Protocol 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocol 2), CMXRos or MitoTracker red (protocol 3), and 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1, protocol 4). Results were submitted to analysis of variance, Fisher’s test and linear regression analysis by the program Stat-View&reg; ( SAS Institute, Inc.1998). It was not possible to validate protocol 1, while the protocols 2, 3 and 4 were validated and showed consistent results. Protocol 4 was used in experiment 2. For experiment 2 seven ejaculates were collected from eight Simental bulls. Volume, concentration, motility and vigour of semen were evaluated subjectively, motility by computer system (CASA), morphological characteristics by differential interference microscopy, plasmatic and acrosomal membranes integrity and, mitochondrial function with FITC-PSA, PI and JC-1 association, and chromatin integrity by acridine orange technique. Then, semen was divided in two aliquots. One was diluted with Bioxcell&reg; and the other with Botu-Bov&reg; diluent, packaged in 0.5 mL straws and frozen using na automated system. Two straws of sêmen from each treatment were thawed and the semen parameter evaluated, as described above. The statistical analysis was performed using the Statistical Analysis System program (SAS Institute Inc., 1985). Data were submitted to analysis of variance and Tukey’s test. Pearson’s linear correlations were calculated. Cryopreservation increased damages in spermatic structures. Botu-Bov&reg; diluent was better in preserve the motility and membrane integrity (P&it;0,05) when compared to Bioxcell&reg; diluent

O presente estudo teve como objetivos comparar o sêmen de cães jovens e senis, por avaliação morfo-funcional, estresse oxidativo e quantificação de produtos avançados de glicação (AGEs); comparar a congelabilidade seminal de cães jovens e senis e verificar a ação dos produtos avançados de glicação, oxidação proteica e estresse oxidativo na criopreservação seminal de cães senis. Foram selecionados 22 cães, alocados em dois grupos experimentais de acordo com a idade: Grupo Jovem (n=11) e Grupo Senil (n=11). Os grupos foram adicionalmente subdivididos em Grupo Sêmen Fresco e Grupo Sêmen Criopreservado. A divisão etária foi realizada de acordo com o porte dos animais, sendo porte pequeno considerado senil a partir de 8 anos de idade, porte médio a partir de 7 anos de idade e porte grande acima de 6 anos de idade. Independentemente do porte, os cães jovens em idade reprodutiva foram considerados entre 1 e 5 anos de idade. O Grupo Fresco foi submetido a avaliações seminais imediatas, incluindo volume, cor, aspecto do ejaculado, concentração espermática e análise computadorizada da motilidade (CASA). Logo após, foram realizadas avaliações morfo-funcionais, incluindo atividade mitocondrial dos espermatozoides, estresse oxidativo lipídico, estresse oxidativo proteico, dosagem de produtos avançados de glicação e dosagem de concentração proteica, citometria de fluxo utilizando as sondas fluorescentes para a avaliação espermática da integridade de membrana plasmática e acrossomal e de potencial de membrana mitocondrial e análise de fragmentação de DNA. O Grupo Congelado foi submetido ao protocolo de congelação em uma etapa e após, no mínimo uma semana, as amostras foram descongeladas a 37ºC por 30 segundos e, então, avaliadas quanto à concentração espermática, análise computadorizada da motilidade (CASA) e as mesmas avaliações morfo-funcionais realizadas para o Grupo Jovem. Como resultados, os machos do Grupo Jovem apresentaram maior escore de libido, parâmetros da motilidade espermática, alta atividade mitocondrial dos espermatozoides e menores valores de atividade mitocondrial média, defeitos espermáticos totais, defeitos espermáticos maiores e gota citoplasmática proximal. No sêmen fresco, o Grupo Jovem obteve maiores valores de integridade da membrana acrossomal dos espermatozoides e baixo potencial de membrana mitocondrial, assim como menores valores de integridade da membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial. No sêmen descongelado, o Grupo Jovem apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal dos espermatozoides. No sêmen de cães jovens, o Sub-grupo Fresco obteve maiores valores de integridade de membrana acrossomal e integridade de membrana acrossomal com lesão de membrana plasmática. No sêmen de cães senis, o Sub-grupo Fresco apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal, integridade de membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial, assim como menor porcentagem de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial. Na comparação entre os sub-grupos, houve maiores valores para parâmetros da motilidade espermática, integridade de membrana plasmática com lesão de acrossomo, médio potencial de membrana mitocondrial, integridade de membrana plasmática, alta atividade mitocondrial e estresse oxidativo no Sub-grupo Descongelado, além de maiores valores de amplitude de deslocamento lateral da cabeça, espermatozoides estáticos, lesão de membrana acrossomal e plasmática, média atividade mitocondrial e concentração de proteínas no pellet de espermatozoides. A partir de tais resultados, é possível concluir que o sêmen de cães senis apresenta qualidade inferior ao de cães jovens, bem como reduzida congelabilidade. Nos cães senis, possivelmente, a falha na eliminação da gota citoplasmática dos espermatozoides promova disfunções mitocondriais, culminando na alteração da motilidade espermática. Por fim, as avaliações de parâmetros oxidativos não se mostram acuradas para a avaliação do impacto da senescência reprodutiva. / This study aimed to compare the semen of young and senile dogs, through the evaluation of morphological and functional attributes, oxidative stress and quantification of advanced glycation ending products (AGEs); compare the seminal freezability of young and senile dogs and evaluate the effects of advanced glycation ending products, oxidation protein and oxidative stress on seminal cryopreservation of senile dogs. Twenty two dogs were selected and allocated into two experimental groups according to their age: Young Group (n=11) and Senile Group (n=11). These groups were additionally divided into Fresh Semen Group and Frozen Semen Group. Age distribution was performed according to the size of the animals, being small animals considered senile from 8 years of age onwards, medium size from 7 years old and large size over 6 years old. Regardless of the body size, dogs were considered young if they were at reproductive maturity from 1 to 5 years old. The Fresh Group was subjected to immediate seminal assessments, including volume, color, aspect of the ejaculate, sperm concentration and computer analysis of sperm motility (CASA). Then morpho-functional assessments were carried out, including sperm mitochondrial activity, lipid oxidative stress, protein oxidative stress, dosage of advanced glycation ending products and of protein concentration, flow cytometry using fluorescent probes to evaluate plasmatic and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation analysis. The semen from the Frozen Group was submitted to one step freezing protocol and samples were thawed after not less than 1 week at 37°C for 30 seconds and evaluated for sperm concentration, motility computerized analysis (CASA) and same the morpho-functional analysis performed for the Young Group. Male dogs from the Young Group presented higher libido score, parameters of sperm motility, percentage of sperm with high mitochondrial activity and lower percentage of sperm of medium mitochondrial activity, total spermatic defects, major spermatic defects and proximal cytoplasmic droplet. For the fresh semen of the Young Group, higher values of acrosomal membrane integrity and low mitochondrial membrane potential, as well as lower values of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential were noticed. In the post-thaw semen, the Young Group showed higher values of spermatic acrosomal membrane integrity. For the semen of young dogs, the Fresh Group had higher values of acrosomal membrane integrity and acrosomal membrane integrity with plasma membrane damage. In the semen of senile dogs, the Fresh Group presented higher values of acrosomal membrane integrity, plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential, as well as lower percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential. Comparing sub-groups, higher values for sperm motility parameters, plasma membrane integrity with acrosome injury, medium mitochondrial membrane potential, plasmatic membrane integrity, high mitochondrial activity and oxidative stress was noticed for the Thawed group, as well as greater values of lateral displacement amplitude of the sperm head, static spermatozoa, acrosomal and plasmatic membrane lesions, medium mitochondrial activity and protein concentration in the spermatozoa pellet. Based on the present results, it is possible to conclude that the semen of senile dogs presents inferior quality compared to young dogs, as well as less freezability. The possible failure to eliminate the sperm cytoplasmic droplet in senile dogs sperm promotes mitochondrial dysfunctions, culminating to alterations on sperm motility. Finally, the evaluation of oxidative parameters is not feasible for the impact evaluation of reproductive senescence.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade da refrigeração do sêmen bovino comparada com a criopreservação. Este estudo foi realizado em dois experimentos. No primeiro experimento foram comparados os efeitos in vitro do sêmen refrigerado em três meios diluidores comerciais a 5&deg; C por até 48 horas, e criopreservado em dois meios. Para este experimento foram utilizados ejaculados de 10 touros da raça Nelore. Cada ejaculado foi dividido em três alíquotas, sendo diluídas nos meios Botubov&reg;, Steridyl&reg; e Bovidyl&reg;. Após a diluição o sêmen foi envasado em palhetas e refrigerado nos três diluidores e criopreservado utilizando somente os meios Botubov&reg; e Steridyl&reg;. A refrigeração do sêmen foi realizada a 5&deg; C por até 48 horas em sistema passivo de refrigeração BotuFlex&reg; e a criopreservação realizada em sistema automatizado TK 4.000&reg;. O sêmen foi avaliado nos tempos 0, 24, 36 e 48 horas após a refrigeração e após a descongelação, para cada diluidor. Foram realizadas análises dos padrões de cinética espermática pelo sistema computadorizado de análise espermática (CASA, programa SCA - Sperm Class Analyser), integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e estresse oxidativo por sondas fluorescentes, sob microscopia de epifluorescência e morfologia espermática por microspcopia de contraste de interferência diferencial (DIC). Notou-se efeito de tempo de refrigeração para os três diluidores para de 0 para 24h, se mantendo semelhante até 48 h. Os diluiores Botubov&reg; e Steridyl&reg; preservaram as características espermáticas de forma semelhante até 48 horas de refrigeração diferindo apenas na variável de velocidade curvilianear; no entanto, ambos foram superiores ao diluidor Bovidyl&reg;, para as variáveis, motilidade total, motilidade progressiva, células rápidas, velocidade curvilinear, velocidade progressiva, velocidade do trajeto, retilinearidade, integridade da membrana plasmática, alto potencial de mitocondrial e espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial. O segundo experimento foi realizado, baseado nos resultados do primeiro experimento, para avaliar os efeitos da refrigeração e da criopreservação do sêmen sobre a fertilidade in vivo. Foram utilizados ejaculados de três touros das raças Brangus, Braford e Angus, com idade entre 5 e 7 anos. O sêmen foi colhido por meio de vagina artificial, o ejaculado foi dividido em três alíquotas, sendo duas alíquotas para refrigeração e uma para criopreservação. Para a refrigeração o sêmen foi diluído nas concentrações de 15x106 (R15) e 30x106 (R30) espermatozoides/palheta e para a criopreservação diluído na concentração de 30x106 espermatozoides/palheta (CRIO). Para todas as diluições foi utilizado o meio Botubov&reg; e o sêmen armazenado em palhetas de 0,5 mL. A refrigeração foi realizada a temperatura de 5&deg; C por 48 horas em sistema passivo de refrigeração BotuFlex&reg; e a criopreservação em sistema automatizado TK&reg;. Foram sincronizadas 552 vacas da raça Brangus em programas de inseminação artificial em tempo fixo. Os resultados da taxa de prenhez para os grupos de vacas inseminadas foram de 49,4% para R15, 43,38% para R30 e 47,59% para o sêmen criopreservado. Pode-se concluir que a refrigeração do sêmen a 5&deg; C por 48 horas resulta em taxa de prenhez semelhante às obtidas com o sêmen criopreservado, sendo que esses resultados indicam que a refrigeração por até 48 horas pode ser uma opção de uso para IATF. / The objective of the present study was to evaluate the viability of cooling bovine semen compared to cryopreservation. This study was carried out in two experiments. In the first experiment, the in vitro effects of cooled semen were compared in three commercial extenders at 5&deg; C for up to 48 hours, and cryopreserved in two extender. For this experiment were used ejaculates of 10 Nellore bulls. Each ejaculate was divided into three aliquots, being diluted in the Botubov&reg;, Steridyl&reg; and Bovidyl&reg; extenders. After dilution, the semen was cooled into three extenders and cryopreserved using the Botubov&reg; and Steridyl&reg;. Semen refrigeration was performed at 5&deg; C for up to 48 hours in BotuFlex&reg; passive refrigeration system and cryopreservation performed in TK 3.000&reg; automated system. Semen was evaluated at 0, 24, 36 and 48 hours after refrigeration and after thawing, for each diluent. The sperm kinetics of the spermatic kinetics (CASA, SCA - Sperm Class Analyzer), plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential and oxidative stress by fluorescent probes were analyzed under epifluorescence microscopy and sperm morphology By Differential Interference Contrast Microscopy (DIC). The Botubov&reg; and Steridyl&reg; diluents were very similar after 48 hours of cooling differing significantly only in the Curvilianear Velocity (VCL) 106.04 m/s and 124.56 m/s. The Bovidyl&reg; diluent yielded results significantly lower than the 48 hours of refrigeration for the variables: total motility (MT), progressive motility (MPRO), fast cells (RAP), curvilinear velocity (VCL), progressive velocity (AP), plasma membrane integrity (PI), high mitochondrial potential (AP), and spermatozoa with intact plasma and acrosomal membranes and high mitochondrial potential (PIAIA). The second experiment was carried out, based on the results of the first experiment I, to evaluate the effects of cooled and cryopreservation of semen on in vivo fertility. We used ejaculates of three bulls of the Brangus, Braford and Angus breeds of a IA center, aged between 5 and 7 years. The semen was collected by artificial vagina, the ejaculate was divided into three aliquots, two aliquots for refrigeration and one for cryopreservation. For cooling, the semen was diluted in the concentrations of 15x106 (R15) and 30x106 (R30) spermatozoa/straw, for cryopreservation diluted in the concentration of 30x106 spermatozoa / vane (CRIO). For all dilutions, the Botubov&reg; medium and the semen stored in 0.5 mL vial were used. Refrigeration was carried out at a temperature of 5&deg; C for 48 hours in BotuFlex&reg; passive refrigeration system and cryopreservation in an automated TK&reg; system. 552 Brangus cows were synchronized in fixed-time artificial insemination programs. The results of the pregnancy rate for the groups of inseminated cows were 49.4% for R15, 43.38% for R30 and 47.59% for cryopreserved semen. It can be concluded that the cooling of the semen at 5&deg; C for 48 hours results in pregnancy rate similar to those obtained with cryopreserved semen, and these results indicate that refrigeration for up to 48 hours may be an option of use for FTAI.

O presente experimento teve por objetivos comparar a adição de diferentes concentrações de glutationa reduzida (GSH) no diluidor para criopreservação do sêmen de cães, considerando-se as características morfofuncionais pós-descongelação; e verificar os índices de gestação e número de filhotes por ninhada obtidos a partir da inseminação artificial intra-uterina, por cateterização cervical endoscópica, com sêmen criopreservado contendo diferentes concentrações de glutationa. Na primeira fase do experimento, foram realizadas duas colheitas seminais de 11 reprodutores com intervalo mínimo de uma semana entre os procedimentos. Foram empregadas três concentrações diferentes de glutationa reduzida (0, 10 e 20 mM) ao meio de congelação tris-gema-citrato. O sêmen fresco, refrigerado, glicerolizado e descongelado foram avaliados por citometria de fluxo com uso de sondas específicas para determinar a integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e fragmentação de DNA. Também foi realizada dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar os níveis de estresse oxidativo. Na segunda fase do experimento, foram inseminadas 6 fêmeas, alocadas em dois grupos: inseminação intra-uterina com sêmen congelado em diluidor contendo 10 mM (IA-GSH10, n=3) e sem a adição de glutationa (IA-GSH0, n=3). O acompanhamento do ciclo estral foi realizado por citologia vaginal, vaginoscopia, dosagem de progesterona e LH. Foram realizadas duas inseminações no 5o e 6o dias após pico de LH e a gestação diagnosticada aos 30 dias. A adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação promoveu queda na motilidade espermática nas amostras descongeladas, sendo o maior prejuízo observado na concentração de 20 mM. Foi detectada maior porcentagem de acrossomos íntegros nos grupos tratados. A glicerolização e, principalmente, a exposição do espermatozóide ao nitrogênio líquido e posterior descongelação foram responsáveis pela diminuição da motilidade espermática, em consequência ao prejuízo da função mitocondrial promovida pela produção de radicais livres durante o processamento seminal. A gestação foi diagnosticada em duas fêmeas do grupo IA-GSH10 e duas do grupo IA-GSH0. Em conclusão, a adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal não promoveu os efeitos protetores esperados na espécie canina, sendo a concentração de 20 mM responsável por maiores prejuízos à amostra seminal. A adição de 10 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal na espécie canina manteve o índice de fertilidade semelhante ao obtido com sêmen criopreservado sem a suplementação antioxidante. / The present experiment aimed to compare the addition of different concentrations of reduced glutathione (GSH) on frozen-thawed canine semen, considering the morphofunctional characteristics; and to verify the pregnancy rate and number of puppies per litter obtained from intrauterine insemination by endoscopic catheterization of the cervix, with frozen-thawed semen containing different concentrations of glutathione. During the first phase of the experiment, two seminal samples collected weekly from 11 mature dogs were used. Three different concentrations of reduced glutathione (0, 10 and 20 mM) were supplemented in a tris-citrate egg yolk extender. The fresh, chilled, glycerolized and post-thawed semen were assessed by flow cytometry using specific probes to determine plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay was also performed to assess the occurrence of oxidative stress. In the second phase of the experiment, six canine females were allocated into two groups: intrauterine insemination with frozen-thawed semen containing 10 mM GSH (IA-GSH10, n = 3) and without the addition of glutathione (IA-GSH0, n = 3). Bitches were monitored by vaginal cytology, vaginoscopy, progesterone and LH assays. Two inseminations were performed on days 5 and 6 post LH peak. We verified that the addition of 10 and 20 mM of GSH to semen extender promoted a decrease in post-thaw sperm motility, as well as a higher damage degree at the 20 mM concentration. We also detected a higher percentage of acrossomal integrity in treated groups. At glycerolization and moreover, the sperm exposure to liquid nitrogen and further thawing, were responsible for the decrease in sperm motility, due to the loss of mitochondrial function through the free radicals production. Gestation was diagnosed in two female from IA-GSH10 group and two bitches of the IA-GSH0 group. In conclusion, we did not observe the expected protective effects of the addition of 10 and 20 mM GSH to semen extender. Furthermore, the concentration of 20 mM was responsible for the more extreme damage to semen sample. The supplementation of 10 mM GSH to semen extender for cryopreservation maintained the fertility rates similar to the ones observed for cryopreservation without antioxidant supplementation in dogs.