Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000431499-0.pdf: 9135185 bytes, checksum: f582813177d93f41d7f068b6594f67b4 (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / Objective: The purpose of this study was to analyze the effect of low level laser therapy (LLLT) in the process of bone incorporation of deep-frozen block allografts. Materials and Methods: A total of 14 rabbits: two rabbits as donors of bone tissue and 12 rabbits were performed as receivers bone blocks autografts and allografts in the calvária. They were divided into groups treated with low level laser therapy (allograft and autograft) and control groups (autograft and allograft) without irradiation. The animals were killed at 35 days (n = 6) and 70 days (n = 6). The energy parameters used were: application of diode laser (GaAlAs) - wavelength of 830 nm - 4 J/cm2 at four points on the blocks of grafts for a total of 16 J/cm2 per application. The total dose of treatment after eight applications was 128 J/cm2.Results: The allograft bone processed by deep-freezing associated with LLLT showed incorporation at the graft-host interface, bone remodeling moderate, partial filling of osteocytes lacunae, less inflammatory infiltrate in the early periods and higher collagen deposition than the control group. Conclusion: The allograft bone processed by deep-freezing associated with LLLT is suitable as an alternative for the treatment of bone defects. The processing of bone grafts by deep-freezing method maintains the structural and osteoconduction characteristics of bone tissue. / Objetivo: o objetivo deste estudo foi analisar o efeito da laserterapia de baixa potência no processo de incorporação óssea de aloenxertos em bloco com congelamento profundo. Materiais e Métodos: foram utilizados 14 coelhos: dois coelhos como doadores do tecido ósseo e 12 coelhos como receptores onde foram realizados aloenxertos e autoenxertos ósseos em bloco na calvária. Foram divididos em grupos com tratamento com laserterapia de baixa potência (aloenxerto e autoenxerto) e grupos controles (aloenxerto e autoenxerto) sem irradiação. Os animais foram mortos com 35 dias (n=6) e 70 dias (n=6). Os parâmetros de energia empregados foram: aplicação de laser de diodo (AsGaAl) – comprimento de onda de 830 nm - 4 J/cm2 em quatro pontos sobre os blocos de enxertos perfazendo um total de 16 J/cm2 por aplicação. A dose total do tratamento após as oito aplicações foi de 128 J/cm2.Resultados: o aloenxerto ósseo processado por congelamento profundo associado à laserterapia de baixa potência apresentou incorporação na interface com o hospedeiro, remodelação óssea moderada, preenchimento parcial das lacunas osteocíticas, menor infiltrado inflamatório nos períodos iniciais e maior deposição de fibras colágenas quando comparado ao grupo controle. Conclusão: o aloenxerto ósseo processado por congelamento profundo associado à laserterapia de baixa potência é adequado como uma alternativa para o tratamento de defeitos ósseos. O processamento do osso alógeno pelo método de congelamento profundo mantém as características estruturais e de osteocondução do tecido ósseo.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Passiflora ocorre principalmente em regiões de clima tropical, sendo o Brasil um importante centro de diversidade. Passiflora foetida L. é uma espécie silvestre que apresenta características de interesse ornamental e medicinal. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de sistemas de cultura de tecidos e criopreservação para P. foetida. Explantes caulinares foram excisados de culturas primárias obtidas a partir de plântulas derivadas da germinação in vitro. Para isso foram inoculados em meio MSM, suplementado com diferentes concentrações de ANA, PIC, TDZ e BAP utilizado isoladamente ou em combinação com ANA, e mantidos na presença ou ausência de luz. Foi observada a produção de brotos, calos e raízes adventícias, de acordo com o tipo e a concentração do regulador de crescimento testado e da condição de cultura utilizada. A produção de plantas ocorreu via organogênese direta e indireta em resposta a BAP, enquanto que a formação de calos não morfogênicos foi observada a partir de ambos explantes em resposta a PIC. A produção de raízes adventícias ocorreu em resposta a ANA. Tendo em vista a produção de raízes observada em meio sólido, segmentos internodais foram inoculados em meio líquido suplementado com diferentes auxinas e mantidos em imersão contínua ou sobre pontes de papel de filtro. A maior taxa de multiplicação de raízes foi observada a partir de entrenós mantidos no sistema de ponte de papel de filtro, em resposta a ANA. Segmentos radiculares excisados das culturas primárias também foram utilizados visando à produção de brotos e a multiplicação de raízes. Contudo, apenas foi observada a formação de gemas, sem posterior desenvolvimento de brotos. Além disso, a capacidade proliferativa dos segmentos radiculares inoculados em meio suplementado com ANA foi menor que a obtida a partir dos entrenós cultivados nas mesmas condições. Neste trabalho, foram também testados diferentes protocolos de criopreservação para ápices caulinares de P. foetida por meio de vitrificação e encapsulamento-vitrificação. A recuperação de plantas pós-congelamento foi observada unicamente a partir de ápices encapsulados e expostos à solução de vitrificação PVS2 por 120 minutos. Tendo em vista o potencial medicinal já descrito para P. foetida, através dos diferentes sistemas de cultura desenvolvidos neste trabalho serão obtidos materiais para a avaliação de diferentes atividades biológicas. / The genus Passiflora occurs mainly in tropical regions, and Brazil is na important diversity Center. Passiflora foetida L. is a wild species with ornamental and medicinal potential. The goal of this work was the establishment of tissue culture systems and cryopreservation for P. foetida. Stem explants were excised from primary cultures obtained from plantlets derived from in vitro germination. Nodal and internodal segments were inoculated on MSM medium supplemented with different concentrations of NAA, PIC, TDZ and BAP, used alone or in combination with NAA, and maintained in the presence or absence of light. The production of shoots, calluses and adventitious roots was observed, according to the type and concentration of growth regulator and the culture condition. Plant production occurred via direct and indirect organogenesis in response to BAP, whereas the formation of non-morphogenic calluses was observed from both explants in response to PIC. The production of adventitious roots occurred in response to NAA. In the view of root production on solid medium, internodal segments were inoculated on liquid medium supplemented with different auxins and maintained under continuous immersion or on filter-paper bridges. The highest root multiplication rate was observed from internodes maintained on filter-paper bridge in response to NAA. Root segments excised from primary cultures were also used aiming at shoot production and root multiplication. However, we only observed buds formation, without shoot development. In addition, proliferation capacity of root segments inoculated on medium supplemented with NAA was lower than the observed from internodes cultivated at the same conditions. In this work, we also tested different cryopreservation protocols for shoot tips of P. foetida through vitrification and encapsulation-vitrification. Post-freezing recovery was only observed from encapsulated explants which were exposed to the vitrification solution PVS2 for 120 minutes. In the view of the medicinal potential described for P. foetida, the different culture systems developed in this work will provide sources of material for the evaluation of distinct biological activities.

Resumo não disponível

O objetivo do experimento foi determinar as taxas de sobrevivência pós vitrificação de blastocistos murinos (experimento 1) expostos à duas associações de crioprotetores e envasados em micropipetas de quartzo (QMC) ou de vidro (GMP) e, (experimento 2) comparar as taxas de sobrevivência obtidas na vitrificação dos embriões envasados em QMC de dois diâmetros internos (0,1 mm ou 0,2 mm). No experimento 1, blastocistos murinos coletados no dia 4 de desenvolvimento foram selecionados morfologicamente e divididos aleatoriamente em seis grupos. Grupo 1 (Controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta. Grupo 2: embriões expostos a 10% PROH + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES1) por 1 min e em seguida expostos a 20% PROH + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS1) por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 3: idem ao Grupo 2 com envase em GMP. Grupo 4: embriões expostos a 10% DMSO + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES2) por 1 min e em seguida expostos a 20% DMSO + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS2), por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 5: idem ao grupo 4 com envase em GMP. Após a exposição às soluções de vitrificação, os capilares foram imediatamente imersos em N2 líquido. Grupo 6 (Controle 2): embriões não vitrificados colocados em cultivo somente após o final dos procedimentos dos grupos tratados. No segundo experimento, a exemplo do primeiro, foram formados os seguintes grupos: Grupo 1 (controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta; Grupo 2: embriões envasados em QCM de 0,1mm de diâmetro; Grupo 3: embriões envasados em QCM de 0,2mm de diâmetro; Grupo 4 (controle 2): embriões não vitrificados colocados somente após o término da vitrificação. Para vitrificação foi utilizado o tratamento 4 do experimento 1. Nos dois experimentos, os embriões vitrificados foram reaquecidos pela exposição a 0,25M de sacarose em PBSm, a 37°C, durante 5min para a retirada do crioprotetor. Após, os embriões foram transferidos para o cultivo in vitro em meio KSOM durante 72h. As taxas de eclosão dos blastocistos nos grupos do experimento 1 foram: G1: 83,07% (54/65), G2: 47,3% (23/49), G3: 38,4% (20/52), G4: 60,4% (29/48), G5: 41,1 (21/51), G6: 77,4% (55/71). No segundo experimento, as taxas de eclosão dos blastocistos foram: G1: 82,5% (33/40), G2: 55,3% (17/31), G3: 58,5% (22/38), G4: 82,0% (41/50). Os resultados observados nos experimentos mostraram que não houve diferença significativa na taxa de eclosão entre os grupos experimentais, entretanto, todos foram inferiores (P>0,05) aos controles. As soluçõesutilizadas, os GMP e os dois diâmetros do QCM testados permitiram que blastocistos murinos vitrificados apresentassem taxas de sobrevivência in vitro semelhantes entre si. / The aim of the experiment was to determine the survival rates after vitrification of mice blastocysts exposed to two different associations of cryoprotectants and loaded in quartz microcapillaries (QCM) or glass microcapillaries (GMP) and, later, to compare the embryo survival rates obtained with murine blastocysts loaded into QMC with two internal diameters (0.1 mm or 0.2 mm). In experiment 1, the murine blastocysts were collected on day 4 of development and morphologically selected and randomly divided into six groups. Group 1 (control 1): not vitrified blastocysts cultured into KSOM drops immediately after collection. Group 2: embryos exposed for 1 minute at 10% PROH, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES1) and after exposed to 20% PROH, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm (VS1) within 30 seconds, then loaded in QMC. Group 3: the same to group 2 however loaded in GMP. Group 4: exposed to 10% DMSO, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES2) and after exposed to 20% DMSO, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm(VS2), loaded in QMC. Group 5: the same to group 4 however loaded in GMP. After exposure to vitrification solutions, the capillaries were immediately immersed in LN2. Group 6 (Control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end of vitrification of the treated groups. The second experiment consisted of the following groups: Group 1 (control 1) embryos transferred to culture immediately after collection; Group 2: embryos loaded in QCM with 0.1 mm internal diameter, and Group 3: embryos loaded in QCM with 0.2 mm internal diameter diameter, and Group 4 (control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end vitrification procedures. Groups 2 and 3 were exposed to ES2 and VS2 and later loaded in QMC 0.1 or 0.2 mm in diameter, immediately immersed in LN2. Blastocysts were warmed by exposure to 0.25 M sucrose in PBSm at 37 °C for 5min to remove the cryoprotectant. After warming, the embryos were transferred to 100 μL drops of KSOM during 72 hours. Hatching rates were observed in groups of experiment 1 were: G1: 83.07% (54/65), G2: 47.3% (23/49), G3: 38.4% (20/52), G4: 60.4% (29/48), G5: 41.1 (21/51), G6: 77.4% (55/71). In the second experiment, the blastocyst hatching rates were: G1: 82.5% (33/40), G2: 55.3% (17/31), G3: 58.5% (22/38), G4: 82% (41/50). The results observed in both experiments showed no significant difference in embryo hatching rates among the experimental groups, but all were inferior (P>0.05) to controls. The vitrification solutions used, the GMP and the QCM at two diameters tested provided similar embryo survival rates.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-13T18:57:43Z No. of bitstreams: 1 2014_BrunoAlvarengadosSantos.pdf: 1158725 bytes, checksum: 3089de3267aeb5693a90073be70f3624 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-14T12:48:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_BrunoAlvarengadosSantos.pdf: 1158725 bytes, checksum: 3089de3267aeb5693a90073be70f3624 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-14T12:48:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_BrunoAlvarengadosSantos.pdf: 1158725 bytes, checksum: 3089de3267aeb5693a90073be70f3624 (MD5) / Este trabalho comparou seis cadáveres de cães, sem predileção por raça, idade ou sexo, com peso entre 2 e 10 kg, provenientes da Diretoria de Vigilância Ambiental do Distrito Federal, divididos em três grupos aleatórios, cujos sistemas vasculares foram limpos respectivamente com solução salina supersaturada, solução de Larssen modificada e água comum, seguido da conservação com solução de Larssen modificada na proporção de 10% de seu peso corporal,objetivando determinar a durabilidade como modelo para o treinamento cirúrgico. Após seis sucessivos congelamentos e descongelamentos, onde foram realizadas cirurgias visando avaliar a resistência, cor, odor, maleabilidade e grau de autólise tecidual através de análises histológicas de coração, fígado, baço, intestino e encéfalo, ficou determinado que todos os grupos apresentaram boa qualidade para treinamento cirúrgico, permitindo cirurgias de órgãos cavitários até o terceiro descongelamento, cirurgias da conjuntiva bulbar por até quatro descongelamentos e cirurgias ortopédicas por até seis descongelamentos, ficando inviáveis à partir deste ponto, devido ao elevado grau de autólise tecidual. O grupo conservado com solução salina supersaturada se destacou por quase não desprender odor desagradável, além do encéfalo e do coração serem os únicos órgãos que praticamente não apresentarem alterações macro e microscópicas nos três primeiros descongelamentos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study compared six dog cadavers, with no predilection for breed, age or sex, weighing between 2 and 10 kg, from the Environ mental Monitoring Directory of the Federal District, Brazil. Animals were divided into three random groups, whose vascular systems were cleaned with super saturated saline, modified Larssen solution and common water, respectively, followed by preservation with modified Larssen solution at 10% of body weight, aiming to determine the durability as a model for surgical training. Surgeries were performed in the period between six successive freezing and thawing cycles to evaluate the resistance, color, odor, flexibility and degree of tissue autolysis through histological analysis of heart, liver, spleen, intestine and brain. All the groups showed a good quality for surgical training, allowing cavity organs surgeries until the third thawing, bulbar conjunctiva surgeries until the fourth thawing, 2 orthopedic surgeries for up to the sixth thawing, becoming unworkable from this point, due to the high degree of tissue autolysis. The group of cadavers preserved with super saturated saline solution stood out by hardly giving off unpleasant smell, in addition to the brain and heart are the only organs that practically did not show macroscopic and microscopic changes in the first three thawing cycles.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Animais, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-04T13:47:00Z No. of bitstreams: 1 2014_ThiagoAntoniodeSouzaNascimentoSilva.pdf: 1265182 bytes, checksum: bc533b4f6609c21bd035b31047a5ae61 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-04T13:57:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ThiagoAntoniodeSouzaNascimentoSilva.pdf: 1265182 bytes, checksum: bc533b4f6609c21bd035b31047a5ae61 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-04T13:57:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ThiagoAntoniodeSouzaNascimentoSilva.pdf: 1265182 bytes, checksum: bc533b4f6609c21bd035b31047a5ae61 (MD5) / A qualidade do sêmen é influenciada por diversos fatores tais como os inerentes aos indivíduos, a frequência de coletas, o meio ambiente, a estação do ano, a temperatura, precipitação pluviométrica. Interferindo, diretamente, na qualidade das amostras criopreservadas com reflexos diretos nos índices de concepção das fêmeas inseminadas. Estudos têm demonstrado que o plasma seminal pode favorecer a viabilidade e heterogeneidade da membrana plasmática, motilidade e a fertilidade do sêmen ovino criopreservado. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar o perfil proteico do plasma seminal de carneiros com diferentes níveis de congelabilidade de sêmen e o efeito da adição de plasma seminal de carneiros de alta congelabilidade de sêmen no sêmen de carneiros de baixa congelabilidade de sêmen antes da criopreservação. No capitulo 2 observou-se uma superioridade (P<0,05) do carneiro 1 de alta congelabilidade de sêmen em relação ao carneiro 18 de baixa congelabilidade de sêmen após a descongelação e teste de termo resistência (TTR), baseado nos parâmetros de motilidade, integridade de membrana e integridade de acrossoma. Na avaliação do sêmen fresco não foi observada diferença (P>0,05) em nenhum dos parâmetros analisados entre os dois carneiros. Da mesma forma para a avaliação da fertilidade em monta natural não houve diferença (P>0,05) entre os dois carneiros. Selecionados os carneiros de alta e baixa congelabilidade de sêmen foram caracterizados os perfis proteicos do plasma seminal dos mesmos, determinado por eletroforese bidimensional e a identificação das proteínas foi realizada por espectrometria de massa. Com um total de 23 spots foram identificadas com sucesso. Proteínas como RSVP14, RSVP20, clusterina, glutationa peroxidase, albumina e lipocalina foram exclusivas ou mais expressas no carneiro de alta congelabilidade. Proteínas como as espermadesina Z13, bodesina 2 foram mais expressas no carneiro de baixa congelabilidade. Essas proteínas se apresentam como potenciais marcadores para qualidade do sêmen criopreservado. No capitulo 3 com o objetivo de avaliar a adição do plasma seminal de carneiro de alta congelabilidade no sêmen de carneiros de baixa congelabilidade antes da criopreservação, observou que a adição de plama seminal de carneiros de alta congelabilidade incrementou a qualidade do sêmen criopreservado nos carneiros de baixa congelabilidade (P<0,05), após a coleta do sêmen. Avaliou-se também a forma de adicionar o plasma seminal ao sêmen após a coleta, sua concentração e forma de sua obtenção. O melhor momento para adição do plasma seminal foi ao meio de pré-diluição. Independentemente da sua concentração adicionado ao sêmen, todas as concentrações utilizadas foram superiores (P<0,05) ao tratamento controle (sem adição de plasma seminal). Com relação à sua obtenção, quando adicionado o plasma seminal proveniente de carneiro vasectomizado no sêmen após a coleta, este se mostrou (P<0,05) melhor que o tratamento controle (sem adição de plasma seminal) e de plasma seminal de carneiro inteiro. Os dados apresentados nesse trabalho evidenciam a importância do plasma seminal na criopreservação do sêmen e servem referência para o avanço da criopreservação do sêmen ovino. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The seminal quality vary with many factors like individuality, collections frequency, environment, season of the year, temperature, rainfall. Interfering, directly, in the quality of cryopreserved samples with reflex at conception indices of inseminated females. Studies have demonstrated that seminal plasma can favor the viability and heterogeneity of plasmatic membrane, motility and fertility of cryopreserved ram semen. In this way, the aim of the present work was characterize the protein profile of seminal plasma of rams with different levels of semen congelability and the effect of the addition of seminal plasma of high freezability rams semen in the low freezability semen before cryopreservation. In chapter 2, was observed a superiority (P<0.05) of ram 1 of high freezability semen in relation with ram 18 of low freezbility semen after thawed and TRT, based at motility, membrane integrity and acrosomal integrity. In fresh semen evaluation wasn’t observed difference (P>0.05) in none of analyzed factors between two rams. In the same way to fertility with natural mating wasn’t difference (P>0.05) between the two rams. Selected rams of high and low freezability semen hade theirs characterized protein profile, determined by two-dimensional electrophoresis and the protein identified by mass spectrometry. A total of 23 spots were sucessfully identified. Proteins like RSVP14, RSVP20, clusterin, glutathione peroxidase, albumin e lipocalin were exclusively or more expressive in the high freezability rams semen. Proteins like espermadhesin Z13, bodhesin 2 were more expressive in the low freezability rams semen. Those proteins are like potencial markers to quality of frozen semen. In chapter 3 the aim was evaluate the addition of seminal plasma of high freezability ram semen in semen of low freezability rams semen before cryopreservation, observed that the addition of seminal plasma of high freezability semen increased the quality of cryopreserved semen of low freezability semen (P<0.05), after semen collection. Evaluated also how the seminal plasma was add to the semen after the collection, your concentration and how was obtained. The better moment to add the seminal plasma was at pre-dilution extender. Regardless of concentration, all concentration tested were higher (P<0.05) than control treatment (without seminal plasma). The seminal plasma when collected from vasectomized rams and added to semen after collection showed better (P<0.05) than control treatment (without seminal plasma) and seminal plasma from whole ram. The data presented in this work show the importance of seminal plasma in semen cryopreservation and serve as reference to advance at ram semen cryopreservation.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-11-03T11:20:58Z No. of bitstreams: 1 2006_Daniela Oliveira Brandao.pdf: 802866 bytes, checksum: b6d64ec9d9889cfa0f753bbc6743fa44 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-11-09T12:25:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Daniela Oliveira Brandao.pdf: 802866 bytes, checksum: b6d64ec9d9889cfa0f753bbc6743fa44 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-09T12:25:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Daniela Oliveira Brandao.pdf: 802866 bytes, checksum: b6d64ec9d9889cfa0f753bbc6743fa44 (MD5) Previous issue date: 2006-10-26 / Taxas de blastocisto aceitáveis são obtidas com os sistemas atuais de produção in vitro de embriões. Entretanto, o elevado índice de reabsorção embrionária e descontinuidade de gestação, bem como as variações dos resultados obtidos, diminuem de forma significativa a eficiência da técnica. Na tentativa de minimizar estes dois fatores foi focado nesta tese o desenvolvimento de novas formas de monitoramento dos embriões e simplificação da rotina diária. O primeiro trabalho, desenvolvido para o monitoramento do desenvolvimento embrionário, procura aprofundar o entendimento das perdas embrionárias no período de reconhecimento materno da gestação. Apesar de inúmeras investigações do desenvolvimento e caracterização embrionárias serem constantemente realizadas, estas estão restritas ao embrião até 7 dias de vida ou à gestação avançada. A maioria dos problemas, no entanto, está concentrada no período de reconhecimento materno, seguido da implantação no endométrio, sendo imprescindível a criação de métodos práticos e confiáveis que permitam o monitoramento do desenvolvimento embrionário pós-eclosão. Diante dessa necessidade, foi estabelecido um sistema de cultivo in vitro de embriões bovinos no período pós-eclosão denominado sistema PHD (post hatching development). Nele, embriões produzidos in vitro foram cultivados em túneis de gel de agarose em meio de cultivo modificado e os dados obtidos revelaram que o sistema de cultivo foi capaz de sustentar a diferenciação celular do embrião em trofoblasto, hipoblasto e epiblasto, inclusive com a formação da camada de Rauber, definindo assim o disco embrionário. Este sistema de cultivo representa o primeiro modelo experimental capaz de promover crescimento e diferenciação pós-eclosão in vitro, podendo ser utilizado com sucesso para monitorar o efeito tardio de tratamentos utilizados no sistema de cultivo. Dados preliminares de seu uso para monitorar substâncias tóxicas e expressão gênica foram obtidos e estão relacionados no corpo desta Tese. Adicionalmente ao sistema PHD, um segundo trabalho focou a simplificação e maior padronização da rotina da produção in vitro de embriões, sugerindo para isto, o congelamento e estoque de meios de cultivo prontos para uso. Os resultados obtidos com meios congelados em dois sistemas distintos de produção in vitro (DIAS-Dinamarca e Embrapa- Brasil), mostraram ser possível a produção de embriões em meios previamente congelados, sem que haja prejuízo nas taxas de blastocisto alcançadas. Além de facilitar a laboriosa rotina de produção de meios de cultivo, seu congelamento e estoque permitiram a existência de padronização entre manipulações, dado que a partida dos meios de cultivo utilizados é sempre a mesma. Em conclusão, os dois trabalhos desenvolvidos nesta Tese, um de contribuição científica e o outro aplicado, procuram contribuir em áreas pouco exploradas e deixam claro que existem lacunas a serem investigadas para melhoria dos sistemas atuais da produção in vitro de embriões. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Acceptable blastocyst rates are obtained with the actual systems of in vitro embryo production. However, the high rate of embryonic death and gestation interruption, as much as the broad variation in the obtained results, reduce significantly the technique efficiency. In a trial to minimize both factors, this thesis has focused on developing new monitoring systems and routine work simplification. The first work was developed for monitoring embryo development, in an effort to understand embryos loss in the maternal recognition of pregnancy period. Although several investigations have been focused in embryo development and characterization, these are restricted to the embryo up to 7 days, or to the late gestation. However, most of the problems are concentrated in the maternal recognition period, followed by endometrium implantation, so it is fundamental to create practical and trustable methods for monitoring the post-hatching embryo development. Considering this necessity, a post-hatching culture system denominated PHD (Post Hatching Development) system was established. In this system, in vitro produced embryos were cultured in agarose gel tunnels under a modified culture medium and the obtained data revealed that it was capable to sustain embryonic cell differentiation in trophoblast, hypoblast and epiblast, including the Rauber´s layer formation, defining the embryonic disc. This represents the first complete experimental model to promote rapid growing and post-hatching differentiation in vitro, able to be successfully used to monitor the late effect of treatments in the culture system. Preliminary data of its use to monitor toxic substances and gene expression were obtained and are described in this thesis. Additionally to the PHD system, a second work focused on the simplification and pattern of in vitro embryo production. For that, we suggested the freezing and stocking of ready-to-use medium. The results obtained in two different systems (DIAS-Dinamarca and Embrapa- Brasil) have shown that it is possible to produce embryos in previously frozen medium without affecting embryo rates. Besides facilitating the laborious routine of medium production, freezing aliquots has allowed to create a pattern among different manipulations, considering that the medium batch was always the same. In conclusion, both works developed in this thesis, one more scientific and the other more applied, try to contribute in non explored areas and clearly show that there are gaps to be investigated for enhancing the results in in vitro embryo production.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-19T17:38:36Z No. of bitstreams: 1 2009_EmilyNobregaBorges_orig.pdf: 8024064 bytes, checksum: 49b3d2c0d8fbc875089d66f5ede59c83 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-03-22T14:39:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_EmilyNobregaBorges_orig.pdf: 8024064 bytes, checksum: 49b3d2c0d8fbc875089d66f5ede59c83 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-22T14:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_EmilyNobregaBorges_orig.pdf: 8024064 bytes, checksum: 49b3d2c0d8fbc875089d66f5ede59c83 (MD5) Previous issue date: 2009 / O presente trabalho teve como objetivo testar diferentes crioprotetores na criopreservação de tecido ovariano suíno. Ovários suínos (n=3) foram coletados em abatedouro local. De cada ovário foram retiradas 10 fatias do córtex ovariano, sendo uma imediatamente fixada (controle) e outra submetida ao cultivo in vitro (Controle CIV). As outras 8 amostras foram criopreservadas, em pares, usando 4 diferentes crioprotetores: DMSO (1,5 M), etilenoglicol (EG 1,5 M), glicerol (GLY 10%) ou propanoglicol (PROH 1,5M) adicionados de 0,4% de sacarose. As amostras foram congeladas pelo método lento e estocadas em nitrogênio líquido por 7 dias. Posteriormente, o tecido ovariano foi descongelado, o crioprotetor foi removido por lavagens sucessivas em meio contendo concentrações decrescentes dos crioprotetores em questão e 0,4% de sacarose. Após a remoção do crioprotetor uma amostra de cada tratamento foi imediatamente fixada e a outra colocada em cultivo in vitro (CIV) com duração de 2 horas e em seguida fixada. As amostras foram processadas para histologia e microscopia eletrônica de transmissão. A porcentagem de folículos morfologicamente normais (FMN) após a criopreservação utilizando DMSO (67,0±4,9), EG (81,8±1,4) e PROH (55,9±9,9) foi significativamente menor (P<0,05) do que a observada no controle fresco (97,7±1,2). Quando o tecido ovariano foi criopreservado com GLY, nenhum folículo morfologicamente normal foi encontrado (0%). Depois do CIV, o tecido criopreservado com PROH (40,1±2,9) apresentou a menor porcentagem de FMN quando comparado aos outros tratamentos e ao controle (85,1±3,3 DMSO CIV; 84,6±3,4 EG CIV; 97,5±1,2 controle CIV). Em geral, a ultraestrutura dos folículos criopreservados com DMSO ou EG, antes e após o cultivo in vitro, foi similar. Apesar de sua ultraestrutura não ter sido muito diferente do controle, algumas alterações leves puderam ser observadas. Em conclusão, a criopreservação de tecido ovariano suíno utilizando DMSO ou EG permite a preservação de um grande número de folículos pré-antrais com morfologia normal. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work aimed to test different cryoprotectants on cryopreservation of pig ovarian tissue. Pig ovaries (n=3) were collected at a local slaughterhouse. From each ovary 10 cortex slices were taken, and one was immediately fixed (control) and another placed in in vitro culture (IVC control). The other 8 samples were cryopreserved, in pairs, using 4 different cryoprotectants: DMSO (1.5 M), etilene glycol (EG - 1.5 M) glycerol (GLY - 10%) or propanediol (PROH - 1.5 M) with 0.4% sucrose. Samples were slow cooled and stored in liquid nitrogen for 7 days. After thawing and cryoprotectant removing, one sample from each treatment was immediately fixed and the other was placed in in vitro culture (IVC) for 2h and then fixed. Samples were processed for histology and transmission electron microscopy. The percentages of morphologically normal follicles (MNF) in cryopreserved tissue using DMSO (67.0±4.9), EG (81.8±1.4) and PROH (55.9±9.9) were significantly lower (P<0.05) than the observed in fresh control tissue (97.7±1.2). When ovarian tissue was cryopreserved with GLY no morphologically normal follicle could be found (0%). After IVC, PROH (40.1±2.9) presented significantly lower percentage of MNF compared to all other treatments and to the control (85.1±3.3 DMSO IVC; 84.6±3.4 EG IVC; 97.5±1.2 control IVC). In general, the ultrastructure of follicles cryopreserved with DMSO or EG, before and after in vitro culture, was similar. Although their ultrastructure was not very different from control follicles, some alterations could be observed. Signs of advanced degeneration were not observed. In conclusion, the cryopreservation of pig ovarian tissue using DMSO or EG allows a good number of MNF.

O objetivo deste trabalho foi determinar o protocolo mais eficiente de criopreservação de tecido ovariano utilizando o sistema automático de congelação, que requer rampas de resfriamento gradativo, modelo Freeze Control®, para comparar a integridade do tecido ovariano congelado através de duas diferentes curvas de congelação combinadas com dois diferentes crioprotetores: dimetilsulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG). Para a realização do trabalho foram utilizadas 20 ratas Wistar que foram submetidas à oofarectomia bilateral. Os ovários foram divididos em duas partes, uma parte foi criopreservada em DMSO 1,5M e a outra em EG 1,5M. Ainda, foram analisadas duas curvas de congelamento (curva lenta com duração de 1h e 50min, e uma curva rápida com duração de 35 min). As amostras de tecido, após congelação, foram descongeladas, fixadas e processadas para a coloração com hematoxilina e eosina para a análise da integridade dos oócitos. Finalmente fez-se a análise e quantificação dos folículos íntegros versus os não íntegros, como também o dano tecidual. Para a análise folicular foi utilizado o microscópio óptico em aumento de 400x e realizou-se a classificação dos folículos pré-antrais de acordo com o estágio de desenvolvimento em primordiais e primários. Os resultados foram submetidos à ANOVA e as comparações entre as médias feitas pelo teste de Tukey com (P<0,05). Nos resultados foi observado que no tecido criopreservado os folículos que persistiram íntegros em cada ovário foram os primordiais em 79% e primários em 29%. Já no tecido não congelado (controle) foram encontrados todos os tipos foliculares, primordiais, primários, secundários, pré-antrais e antrais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se vacuolizacão citoplasmática e contorno irregular. Quanto às alterações irreversíveis foi encontrado picnose. Concluindo, no tecido ovariano criopreservado, foram encontrados apenas folículos primordiais e primários apresentando alterações histológicas reversíveis e irreversíveis. Além disso, o crioprotetor EG promoveu uma melhor preservação destes folículos, comparado com o DMSO. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa, na preservação dos folículos, quando se comparou as duas curvas de congelação. / The aim of this study was to determine the most efficient protocol of cryopreservation of ovarian tissue using authomatic freezing system. This system requires Freeze Control® ramps of gradative cooling to compare the integrity of frozen ovarian tissue through two different freezing curves together with two different cryoprotectants: dimethilsulphoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG). In this work 20 Wistar female rats were submitted to bilateral oophorectomy. The ovaries were divided in two parts, one part was cryopreserved in DMSO 1,5M and the other in EG 1,5M. Two frozen curves (a slow curve lasting 1h and 50min and a rapid curve lasting 35min) were analyzed. The tissue samples were frozen and after defrosted, fixed, and processed to hematoxylin and eosin staining to analyse oocyte. The analysis and quantification of integrated follicles, non-integrated, and tissue damage was performed. In the follicular analysis it was used 400x optical microscope and performed the classification of pre-antral follicles in primordial and primary according to their stage of development. The results were submitted to ANOVA and the comparasions between the averages were done using the Tukey test (P<0,05). It was observed that in the cryopreserved tissue the follicles remaining integrated in each ovary were 79% primordial and 29% primary. In the non-frozen tissue (control) were found all kinds follicular primordial, primary, secondary, preantral and antral follicles. Cytoplasmic vacuolization and irregular cell outline were identified among reversible alterations. Picnosis was found as an irreversible alteration. To conclude only primordial and primary follicles were enconutered in the ovarian tissue cryopreserved and there are revisable and irreversible histological alterations. Furthermore, the crioprotectant EG was more efficient then DMSO in other to preserve a higher number of primordial and primary viable folicules. No statistical significant difference was detected when we compare the two curves of cryopreservation system.

O objetivo do experimento foi determinar as taxas de sobrevivência pós vitrificação de blastocistos murinos (experimento 1) expostos à duas associações de crioprotetores e envasados em micropipetas de quartzo (QMC) ou de vidro (GMP) e, (experimento 2) comparar as taxas de sobrevivência obtidas na vitrificação dos embriões envasados em QMC de dois diâmetros internos (0,1 mm ou 0,2 mm). No experimento 1, blastocistos murinos coletados no dia 4 de desenvolvimento foram selecionados morfologicamente e divididos aleatoriamente em seis grupos. Grupo 1 (Controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta. Grupo 2: embriões expostos a 10% PROH + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES1) por 1 min e em seguida expostos a 20% PROH + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS1) por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 3: idem ao Grupo 2 com envase em GMP. Grupo 4: embriões expostos a 10% DMSO + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES2) por 1 min e em seguida expostos a 20% DMSO + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS2), por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 5: idem ao grupo 4 com envase em GMP. Após a exposição às soluções de vitrificação, os capilares foram imediatamente imersos em N2 líquido. Grupo 6 (Controle 2): embriões não vitrificados colocados em cultivo somente após o final dos procedimentos dos grupos tratados. No segundo experimento, a exemplo do primeiro, foram formados os seguintes grupos: Grupo 1 (controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta; Grupo 2: embriões envasados em QCM de 0,1mm de diâmetro; Grupo 3: embriões envasados em QCM de 0,2mm de diâmetro; Grupo 4 (controle 2): embriões não vitrificados colocados somente após o término da vitrificação. Para vitrificação foi utilizado o tratamento 4 do experimento 1. Nos dois experimentos, os embriões vitrificados foram reaquecidos pela exposição a 0,25M de sacarose em PBSm, a 37°C, durante 5min para a retirada do crioprotetor. Após, os embriões foram transferidos para o cultivo in vitro em meio KSOM durante 72h. As taxas de eclosão dos blastocistos nos grupos do experimento 1 foram: G1: 83,07% (54/65), G2: 47,3% (23/49), G3: 38,4% (20/52), G4: 60,4% (29/48), G5: 41,1 (21/51), G6: 77,4% (55/71). No segundo experimento, as taxas de eclosão dos blastocistos foram: G1: 82,5% (33/40), G2: 55,3% (17/31), G3: 58,5% (22/38), G4: 82,0% (41/50). Os resultados observados nos experimentos mostraram que não houve diferença significativa na taxa de eclosão entre os grupos experimentais, entretanto, todos foram inferiores (P>0,05) aos controles. As soluçõesutilizadas, os GMP e os dois diâmetros do QCM testados permitiram que blastocistos murinos vitrificados apresentassem taxas de sobrevivência in vitro semelhantes entre si. / The aim of the experiment was to determine the survival rates after vitrification of mice blastocysts exposed to two different associations of cryoprotectants and loaded in quartz microcapillaries (QCM) or glass microcapillaries (GMP) and, later, to compare the embryo survival rates obtained with murine blastocysts loaded into QMC with two internal diameters (0.1 mm or 0.2 mm). In experiment 1, the murine blastocysts were collected on day 4 of development and morphologically selected and randomly divided into six groups. Group 1 (control 1): not vitrified blastocysts cultured into KSOM drops immediately after collection. Group 2: embryos exposed for 1 minute at 10% PROH, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES1) and after exposed to 20% PROH, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm (VS1) within 30 seconds, then loaded in QMC. Group 3: the same to group 2 however loaded in GMP. Group 4: exposed to 10% DMSO, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES2) and after exposed to 20% DMSO, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm(VS2), loaded in QMC. Group 5: the same to group 4 however loaded in GMP. After exposure to vitrification solutions, the capillaries were immediately immersed in LN2. Group 6 (Control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end of vitrification of the treated groups. The second experiment consisted of the following groups: Group 1 (control 1) embryos transferred to culture immediately after collection; Group 2: embryos loaded in QCM with 0.1 mm internal diameter, and Group 3: embryos loaded in QCM with 0.2 mm internal diameter diameter, and Group 4 (control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end vitrification procedures. Groups 2 and 3 were exposed to ES2 and VS2 and later loaded in QMC 0.1 or 0.2 mm in diameter, immediately immersed in LN2. Blastocysts were warmed by exposure to 0.25 M sucrose in PBSm at 37 °C for 5min to remove the cryoprotectant. After warming, the embryos were transferred to 100 μL drops of KSOM during 72 hours. Hatching rates were observed in groups of experiment 1 were: G1: 83.07% (54/65), G2: 47.3% (23/49), G3: 38.4% (20/52), G4: 60.4% (29/48), G5: 41.1 (21/51), G6: 77.4% (55/71). In the second experiment, the blastocyst hatching rates were: G1: 82.5% (33/40), G2: 55.3% (17/31), G3: 58.5% (22/38), G4: 82% (41/50). The results observed in both experiments showed no significant difference in embryo hatching rates among the experimental groups, but all were inferior (P>0.05) to controls. The vitrification solutions used, the GMP and the QCM at two diameters tested provided similar embryo survival rates.