Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2005 / Inclui bibliografia / Introdução. As células-tronco mesenquimais (CTM) são células encontradas na medula óssea. Tais células têm ocupado posição de destaque na pesquisa clínica, podendo ser utilizadas em transplante celular, pois possuem o potencial de regeneração tissular. Pr

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-10-16T11:25:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 566274 bytes, checksum: 435b70c31d30f285a894df8e6609cd67 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T11:25:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 566274 bytes, checksum: 435b70c31d30f285a894df8e6609cd67 (MD5) Previous issue date: 2015-06-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da adição de L-carnitina, um acelerador do metabolismo lipídico, e ácido linoléico conjugado (trans-10, cis-12) em diferentes fases da produção in vitro de embriões sobre o desenvolvimento e criotolerância embrionária. Em todos os experimentos, embriões foram produzidos in vitro utilizando-se complexos cumulos-oócitos (CCO) provenientes de ovários coletados em abatedouro. Foram calculadas as taxas de clivagem (dia 3 do cultivo), taxa de formação de blastocistos expandidos e blastocistos em estágio avançado de desenvolvimento (dia 7 do cultivo) em função do total de CCO inseminados. Embriões em estágio de blastocisto expandido foram coletados de cada tratamento no dia 7 do cultivo in vitro e submetidos ao congelamento lento. Avaliou-se a taxa de reexpansão e eclosão embrionária 24, 48 e 72 h após o descongelamento em função do total de embriões descongelados. No experimento 1, oócitos fertilizados foram incubados em meio de cultivo contendo diferentes concentrações de L-carnitina (0,00; 0,75; 1,50 ou 3,03 mM) suplementado ou não com 5 % de soro fetal bovino (SFB). A adição de L-carnitina ao meio de cultivo na concentração de 1,5 mM melhorou a taxa de formação de blastocistos em estágio avançado de desenvolvimento quando comparado ao grupo controle (15,2±2,0 vs. 11,2±1,5; P<0,05). A L-carnitina também apresentou efeito positivo sobre a reexpansão embrionária 24 e 48 h pós-descongelamento quando adicionada na concentração de 0,75 e 3,03 mM (77,4±4,5; 80,1±4,0 e 75,0±5,5; 78,0±4,2 vs. 64,0±4,7; 67,4±4,7) ao meio de cultivo (P<0,05). Não houve interação entre os efeitos da adição de L-carnitina e SFB ao meio de cultivo embrionário. Apesar da suplementação do meio de cultivo com SFB ter melhorado o desenvolvimento embrionário (27,2±1,1 vs. 19,4±0,9; P<0,01), houve uma redução das taxas de reexpansão 24, 48 e 72 h pós-descongelamento (65,8±2,9; 67,8±2,8; 66,0±3,0 vs. 78,1±3,8; 81,4±3,0; 79,1±3,5; P<0,01). No experimento 2, os embriões foram cultivados em meio contendo L-carnitina (0,75 mM) ou ácido linoleíco conjugado (CLA – 100 mM) durante as primeiras 96 h, últimas 72 h ou durante todo o cultivo in vitro. A suplementação do meio de cultivo com L-carnitina ou CLA durante diferentes vifases do cultivo in vitro não afetou o desenvolvimento e a criotolerância embrionária. No experimento 3, avaliou-se o desenvolvimento e a crioresistência embrionária quando oócitos foram maturados em meio suplementado com L-carnitina (3.03 mM) e/ou CLA (100 mM). L-carnitina e CLA não afetaram o desenvolvimento embrionário quando adicionados ao meio de maturação. Apesar da L-carnitina não ter afetado a a taxa de reexpansão embrionária pós-descongelamento, o CLA apresentou efeito negativo sobre a eclosão embrionária 72h pós-descongelamento (53,3±3,6 vs. 65,1±4,3; P<0,05) quando adicionado ao meio de maturação oócitaria. Como conclusão, a L- carnitina melhora a criotolerância de embriões produzidos in vitro quando adicionada à concentração de 0,75 mM ao meio de cultivo embrionário. Já o CLA apresenta efeito negativo sobre a sobrevivência embrionária após o descongelamento quando adicionado ao meio de maturação oócitaria. / High lipid content in embryo is associated with low freezing tolerance. This study assessed the effects of exogenous L-carnitine and trans-10, cis-12 (t10, c12) conjugated linoleic acid (CLA) on in-vitro development and cryotolerance of bovine embryos when added during different stages of in vitro production of embryos. For all experiments, embryos were produced in vitro using slaughterhouse cows oocytes. Cleavage rates on Day 3, blastocyst and advanced blastocyst (hatching/hatched blastocyst) formation rates on Day 7 were calculated from the total number of oocytes subjected to in vitro fertilization (IVF). Expanded blastocysts-stage embryos from each treatment were harvested on Day 7 and subjected to slow freezing. Embryo viability was assessed 24, 48 and 72 h after thawing. In experiment 1, fertilized oocytes were incubated with different L-carnitine concentrations (0.0, 0.75, 1.50 or 3.03 mM) in the presence or absence of fetal bovine serum (FBS). There was an improvement (P<0.05) on embryo development when 1.5 mM of L-carnitine was added to in vitro culture (IVC) medium. L-carnitine had also a positive effect (P<0.05) on post thaw embryo competence when supplemented at 0.75 and 3.03 mM during IVC. There was no interaction (P>0.05) between the effects of L-carnitine and FBS supplementation on IVC on embryo development and cryosurvival. Although FBS supplementation had increased blastocyst development (P<0.05), it reduced the reexpansion rates at 24, 48 and 72 h post thawing. In experiment 2, L-carnitine (0.75 mM) or CLA (100 mM) were supplemented during the first 96 h, last 72 h or throughout the entire IVC period. There was no effect of L-carnitine or CLA supplementation during different periods of IVC on embryo development and cryotolerance. In experiment 3, embryo development and cryosurvival were evaluated when oocytes were maturated in medium supplemented with L-carnitine (3.03 mM) or/and CLA (100 mM). No effect of L-carnitine and CLA supplementation during in vitro maturation (IVM) on IVP embryo development was detected. Although there was no effect (P>0.05) of L-carnitine supplementation on embryo cryotolerance, CLA showed a negative effect (P<0.05) on embryo cryosurvival when added during IVM. In conclusion, L-carnitine improved embryo cryosurvival viiiwhen added at 0.75 mM during IVC and CLA supplementation during IVM has a negative effect on post thaw embryo survival.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-16T11:29:46Z No. of bitstreams: 2 texto completo.pdf: 542484 bytes, checksum: ce7405ee8e6a21702cc15252ef074236 (MD5) texto completo.pdf: 542484 bytes, checksum: ce7405ee8e6a21702cc15252ef074236 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-16T11:29:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 texto completo.pdf: 542484 bytes, checksum: ce7405ee8e6a21702cc15252ef074236 (MD5) texto completo.pdf: 542484 bytes, checksum: ce7405ee8e6a21702cc15252ef074236 (MD5) Previous issue date: 2015-07-24 / Um dos problemas mais importantes da indústria da inseminação artificial é a determinação do potencial de fertilidade do sêmen, pois, as metodologias convencionais utilizadas para avaliar a qualidade de sêmen não têm demonstrado boa correlação com fertilidade dos espermatozoides. Resultados de recentes estudos com sêmen congelado-descongelados quando submetidos a uma filtragem antes das avaliações espermáticas tem melhor correlação entre as características dos espermatozoides e a fertilidade in vivo. Além disso, a utilização de diferentes sondas fluorescentes nas análises do sêmen permitem avaliação ampla e individual dos espermatozoides, além de sua qualidade funcional, bioquímica e estrutural. Desde modo, o presente estudo teve como objetivo empregar diferentes testes complementares de avaliação espermática pré e pós-filtragem em solução coloidal de sêmen criopreservado e verificar sua correlação com a fertilidade in vivo. Foram utilizadas duas amostras (palhetas da mesma partida) de sêmen congelado de 18 touros doadores de sêmen, sendo 11 reprodutores da raça Nelore, cinco Composto Montana Tropical, um Senepol, e um Red Angus, escolhidos de acordo com os animais utilizados em programa de Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) imposto em um rebanho comercial. Os dados obtidos foram divididos de acordo com a fertilidade obtida após as inseminações, sendo fertilidade satisfatória (≥ 55 % de taxa de prenhez) e fertilidade insatisfatória (˂ 55 % de taxa de prenhez) Todas as fêmeas foram sincronizadas por uso de protocolos de sincronização e inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Os testes empregados para análise do sêmen foram motilidade e vigor espermático, análise quanto à integridade de membrana plasmática e acrossomal, produção de peróxido de hidrogênio intracelular, e organização da bicamada, por meio de sondas fluorescentes (IP, FITC-PSA, M540) empregando a Citômetria de fluxo. Houve efeito de touro sobre a taxa de prenhez (P<0,05) com máximo de 76 % (19/25) e mínimo de 15,6 % (5/32) sendo a média de 54,6 % (723/1325) de prenhez com uma inseminação. Quanto aos grupos de fertilidade houve diferença (P<0,05) entre as médias, sendo 62 % de prenhez para o grupo FERTILIDADE SATISFATÓRIA e 40,6 % para o grupo FERTILIDADE INSATISFATÓRIA. Na avaliação convencional do sêmen, o grupo de fertilidade satisfatória apresentou maior média de motilidade espermática progressiva retilínea (60,49%) que o grupo de fertilidade insatisfatória. Nas avaliações realizadas por citometria de fluxo, o grupo de fertilidade insatisfatória obteve maiores médias percentuais para populações celulares com membrana plasmática lesionada e membrana acrossomal intacta (7,18 %), para células com alto grau de peroxidação e lesão de membrana plasmática (25,5 %) e menor média percentual de populações celulares com membrana plasmática íntegra e estável (19,5 %) que diferiram (p<0,05) do grupo e fertilidade satisfatória. A centrifugação do sêmen em solução coloidal foi eficiente em reter as células com lesões na membrana plasmática e células com lesões na membrana acrossomal (16,8; 31,9 e 7,0 %); células com alta peroxidação intracelular (4,17; 64,3 e 15,0 %). Concluiu-se que as populações de espermatozóides com lesão na membrana acrossomal representam o maior percentual das células espermáticas em sêmen submetido ao processo de congelamento e relacionam-se com à alta taxa de fertilidade obtida em programa de inseminação artificial em tempo fixo (IATF); populações de espermatozóides com lesão de membrana plasmática e alta taxa de peroxidação intracelular estão relacionadas à baixa taxa de fertilidade em programas de inseminação artificial em tempo fixo (IATF); a seleção de espermatozoides com membranas acrossomal e espermática intactas é possível pela centrifugação associado ao uso de soluções coloidais (Androcoll®) e a avaliação da motilidade espermática progressiva retilina está relacionada a alta taxa de fertilidade em programa de inseminação artificial em tempo fixo. / One of the most important problems of the artificial insemination industry is the determination of semen fertility potential for the conventional methods used to assess the quality of semen have not shown good correlation with fertility of sperm. Results of recent studies with frozen-thawed semen when subjected to filtering before the spermatic reviews have better correlation between the characteristics of sperm and fertility in vivo. In addition, the use of different fluorescent probes in semen analysis allow for a wide and individual assessment of sperm, as well as its functional, biochemical and structural. In this way, the present study aims to employ different complementary tests pre sperm and post-filtering in colloidal solution and check its correlation with fertility in vivo semen. Two samples were used (vanes in the same match) frozen semen of 18 donor bulls semen, 11 breeding Nelore five Composite Montana Tropical, one Senepol, and Red Angus, chosen according to the animals used in program Fixed-Time Artificial insemination (FTAI). It was previously established that the data obtained would be divided into fertility group, being satisfactory (≥ 55% pregnancy rate) and unsatisfactory (˂ 55% pregnancy rate) All females were synchronized by using synchronization protocols and fixed-time artificial insemination (FTAI). For data analysis of semen were motility and sperm vigor, analysis of the integrity of plasma and acrosomal membrane of intracellular hydrogen peroxide production, and organization of the bilayer by means of fluorescent probes (IP FITC-PSA, M540) in flow cytometer. There was bull effect on the pregnancy rate (P<0.05) with a maximum of 76% (19/25) and a minimum of 15.6% (5/32) with a mean of 54.6% (723/1325 ) of pregnancy. As for fertility groups difference (P <0.05) between the average, 62% of pregnancy for SATISFACTORY group and 40.6% for UNSATISFACTORY group. In conventional semen evaluation, the satisfactory group showed higher mean rectilinear motility (60.49%) than the poor group. In the assessments performed by flow cytometry, the UNSATISFACTORY group had higher average percentage for cell populations with damaged plasma membrane and intact acrosome membrane (7.18%; IP + PSA-) for cells with a high degree of peroxidation and plasma membrane injury (25.5%; DCFDA + PI +) and lower mean percentage of cell populations with full and stable plasma membrane (19.5% M540-6DCFDA +) that differed (p <0.05) SATISFACTORY group. The centrifugation of semen in colloidal solution was efficient in retaining the cells with lesions in the plasma membrane and cell injuries in the acrosome membrane (16.8% IP + PSA-; 31.9%, IP + PSA +, 7.0% IP-PSA +); cells with high intracellular peroxidation (4.17% DCFDA-PI +; 64.3% DCFDA + PI + 15.0%, + DCFDA PI). It was concluded that the populations of sperm with injury acrosome membrane represent the highest percentage of sperm cells in semen subjected to the freezing process and are related to the high fertility rate obtained in fixed-time artificial insemination (FTAI); sperm populations of plasma membrane damage and high intracellular peroxidation rate represent the highest percentages of sperm populations of cryopreserved semen, and are related to low fertility rate in fixed-time artificial insemination (FTAI); the selection of sperm with intact acrosome and sperm membranes is possible by centrifugation associated with the use of colloidal solutions (Androcoll®) and evaluation of sperm motility by light microscopy is related to high fertility rate in fixed-time artificial insemination (FTAI) program.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-08-15T13:29:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2391913 bytes, checksum: ace78f1e7c36b68481d8fc7ecf68fda5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-15T13:29:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2391913 bytes, checksum: ace78f1e7c36b68481d8fc7ecf68fda5 (MD5) Previous issue date: 2016-10-03 / O cultivo de plantas in vitro vem sendo amplamente utilizado, proporcionando produção em larga escala de diversas espécies de plantas, como também manutenção de banco de germoplasma, sendo, na maioria das vezes mais vantajoso que a produção e manutenção tradicional. Nesse sentido, a criopreservação é considerada o método mais eficaz e seguro para preservação, em longo prazo, de material biológico, tendo como principal vantagem sua aplicabilidade para diferentes espécies sem a necessidade de subcultivos. Dentre as espécies vegetais com potencial para a criopreservação está a Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, a qual apresenta grande interesse para a indústria farmacêutica devido às suas propriedades medicinais. Contudo a obtenção de plantas de P. glomerata para uso comercial está sendo realizada de forma indiscriminada e extrativista, podendo causar erosão genética e extinção dentre outros danos. Nesse contexto, esse trabalho vislumbrou o estabelecimento de um protocolo eficiente para criopreservação de genótipos de P. glomerata, testando diferentes soluções criogênicas combinadas à aclimatização sob técnicas de cultivo mínimo, adaptando baixas temperaturas combinadas com reguladores de crescimento (ABA e SA) com a finalidade de obter maiores níveis de regeneração de explantes após os processos de criopreservação. Por outro lado, o cultivo de plantas em biorreatores de imersão temporária, tem por finalidade aumentar a produção dos explantes, uma vez que ocorre o contato de curta duração entre o meio de cultura líquido e o explante, renovando o ambiente interno do equipamento e garantindo o fornecimento adequado de nutrientes. Da mesma forma, nesse sistema de cultivo, a utilização de reguladores de crescimento, em especial as citocininas, otimiza protocolos e maximiza a produção de várias espécies de plantas ornamentais. Nesse sentido, Zingiber spectabile vem sendo amplamente utilizada como planta ornamental, por ser possuidora de grande beleza, utilizada tanto como flores de corte como também em composições de paisagem. Sob cultivo in vitro, essa espécie apresenta elevado potencial de multiplicação, em especial quando utilizados reguladores de crescimento. Desse modo, o presente trabalho buscou compreender e desenvolver a condição ideal de cultivo em biorreatores de imersão temporária para a espécie utilizando concentrações variáveis de sacarose como também diferentes fontes de citocinina. / The in vitro cultivation of plants has been widely used, providing large-scale production of several plant species, as well as germplasm maintenance being often more advantageous than traditional production. In this sense, cryopreservation has been considered the most effective and safe method for long-term preservation of biological material, the main advantage of its applicability to different plant without the need of subcultures. Among the plant species with potential for cryopreservation is the Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, which shows great interest to the pharmaceutical industry due to medicinal properties. However, obtaining P. glomerata plants for commercial use has been carried out in an indiscriminate and extractivist way, which may lead to genetic erosion and even extinction, among other damages. In this context, this work presents the establishment of an efficient protocol for cryopreservation of P. glomerata accessions, evaluating various cryogenic solutions combined with acclimatization under minimum cultivation techniques growth regulators in order to obtain higher level explant regeneration after cryopreservation procedures. On the other hand, the cultivation of plants in a temporary immersion bioreactor, aiming to increase the yield of propagules by means of a quick contact between the liquid culture medium and the explant, renewing the internal culture environment and ensuring adequate supply of nutrients. Likewise, the use of growth regulators, particularly cytokinins, in this culture system has been optimizing protocols and maximizing the production of various species of ornamental plants. In this sense, Zingiber spectabile has been widely used as an ornamental plant, because it holds great beauty, both used as cut flowers as well as in scenery compositions. In in vitro culture, this species has a high potential for multiplication, especially when growth regulators are used. Thus, this study aim to understand and develop an ideal condition for the cultivation in temporary immersion bioreactors for the species using varying sucrose concentrations as well as different sources of cytokinin.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-01T14:05:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916458 bytes, checksum: 3ba31258a09fab456ccb755153420074 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-01T14:05:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916458 bytes, checksum: 3ba31258a09fab456ccb755153420074 (MD5) Previous issue date: 2015-12-07 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Esta tese compreende quatro capítulos. Todos os estudos aqui relatados foram executados na Colorado State University (CSU), em Fort Collins-CO/USA. Foram utilizados sêmen de seis garanhões com idade entre 15 e 21 anos, das raças Puro-Sangue Inglês, Quarto de Milha e Árabe; estabulados no Laboratório de Reprodução Equina da CSU. Capítulo 1: dividido em três experimentos. Experimento 1: objetivou-se avaliar efeito do tratamento com 2 mg de ciclodextrina carregada com colesterol e estigmastanol (CCC , CCE); 1, 2 e 3 mg de ciclodextrina carregada com óleo de salmão (S1, S2 e S3) e com óleo de semente de linho (L1, L2 e L3) nas motilidades total (MT) e progressiva (MP) dos espermatozóides após descongelamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos (p>0,05). Experimento 2: objetivou-se avaliar MT e MP do sêmen tratado com diferentes fontes de lipídeos sonicados em meio Whitten’s Modificado (MW), após congelamento convencional e congelamento precedido por choque pelo frio; e avaliar efeito do tratamento com 2 mg de CCC e CCE sobre motilidades após choque pelo frio. Os tratamentos usando lipídeos foram: 3 e 6 mg de óleo de salmão (S3 e S6), de óleo de semente de linho (L3 e L6), de gema de ovo de galinha (G3 e G6), de óleo fígado de bacalhau (B3 e B6) e de óleo de açafrão (A3 e A6). Nenhum dos tratamentos utilizando lipídeos melhorou motilidade após congelamento convencional (p>0,05). Para o sêmen submetido a 0 oC por 30 minutos, os tratamentos G6, CCC e CCE melhoraram MT e MP (p<0,05). Experimento 3: utilizou-se cromatografia gasosa para avaliar eficiência dos tratamentos em alterar o perfil de ácidos graxos da membrana espermática. Os tratamentos foram: 6 μg de óleo de semente de linho diluído em etanol (L1); 2 mg de ciclodextrina carregada com óleo de semente de linho (L2) e 6 mg de óleo de semente de linho sonicado em MW (L3). Nenhum dos tratamentos foi capaz de alterar o perfil de ácidos graxos da membrana espermática (p>0,05). Capítulo 2: objetivou-se mensurar quantidade de colesterol e estabelecer a relação colesterol:fosfolipídeos na membrana plasmática de células espermáticas tratadas com diferentes quantidades de CCC (0, 2, 4, 6 e 8 mg). Foram utilizados kit comercial (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) para mensuração do colesterol e ensaio de ferrotiocianato de amônio para mensuração dos fosfolipídeos totais. A quantidade de colesterol encontrada nas células tratadas com 0, 2, 4, 6 e 8 mg de CCC foram respectivamente 0,22; 0,58; 0,77; 0,91 e 1,07 μg/10 6 de espermatozóides, e a relação colesterol:fosfolipídeos para os mesmos tratamentos foram 0,39; 0,72; 1,0; 1,16 e 1,36. A quantidade de colesterol na membrana foi maior a partir do uso de 2 mg de CCC (p<0,05), e a relação colesterol:fosfolipídeos a partir do tratamento com 4 mg de CCC (p<0,05). Capítulo 3: neste estudo o objetivo foi avaliar o comportamento do sêmen sem tratamento (CT) ou tratado com 20% de plasma seminal (PS) e 40 μM de PC-12 (PC) em eventos ligados à capacitação espermática durante incubação por 30 minutos (avaliações foram feitas no tempo 0 – T0, 5 – T5, 15 – T15 e 30 minutos – T30). Para isso cada um dos tratamentos foi submetido a quatro diferentes corantes: 1- CoroNa Green, que quantifica sódio intracelular (CG); 2- Fluo-3, que quantifica cálcio intracelular (Fluo); 3- FITC-PNA, que quantifica reação acrossômica (FP) e 4- Merocianina, que caracteriza fluidez/desorganização da membrana plasmática (Mero). Yo-Pro-1 ou iodeto de propídeo foram utilizados para avaliar integridade de membrana plasmática. As amostras foram lidas em citometria de fluxo. O tratamento com PC-12 aumentou o percentual de células com acrossoma reagido, detectada na avaliação aos 30 minutos. Este percentual, de 33%, foi maior que o dos demais tratamentos no mesmo tempo (CT: 13% e PS: 4%) e superior aos percentuais para o próprio PC-12 nos tempos 0 (7%), 5 (9%) e 15 minutos (16%). Com relação à fluidez da membrana plasmática não houve diferença no percentual de células com merocianina elevada entre os diferentes tratamentos, nem entre um mesmo tratamento ao longo do tempo (p>0,05). O estudo revelou efluxo de sódio das células espermáticas equinas viáveis após 15 minutos de incubação, sendo que nos tempos 15 e 30 minutos o percentual de celulas positivas para CG foram menores para tratamento com plasma seminal (8,8 e 4,8%) e maiores para tratamento com PC-12 (36 e 15,4%), em relação ao controle (23,6 e 11,8%, p<0,05). Após 15 minutos de incubação o sêmen dos três tratamentos apresentou percentual de células positivas para Fluo superior ao tempo 0, porém o plasma seminal retardou a entrada deste íon nas células, visto que, no T15 percentual de células Fluo+ foi menor que nos outros tratamentos (CT: 87%; PS: 59% e PC: 95%, p<0,05), voltando a se igualar no tempo 30 minutos (CT: 98%%; PS: 85% e PC: 97%, p>0,05). O meio MW utilizado foi capaz de induzir efluxo de sódio e influxo de cálcio, alterações que caracterizam capacitação espermática. Capítulo 4: os objetivos aqui foram avaliar eficiência de diluidores a base de gema de ovo (Lactose-EDTA) ou gema de ovo associada a leite em pó (FR5 modificado – FR5M) e eficiência do glicerol (GLI) ou da combinação deste com metilformamida (MF) em manter MT e MP dos espermatozóides após congelamento usando diferentes protocolos (0: congelamento sem resfriamento; 20: resfriamento em palhetas por 20 minutos a 5 oC antes do congelamento; 120T: resfriamento do sêmen em tubos por 120 minutos a 5 oC; 120P: resfriamento do sêmen em palhetas por 120 minutos a 5 oC). O FR5M preservou melhor a MP de células espermáticas em todos os protocolos de congelamento utilizados, mostrando benefício da combinação da gema de ovo com leite em pó no diluente de congelamento (15%, 21%, 26% e 25% para 0, 20, 120T e 120P, respectivamente, vs. 9%, 14%, 19% e 17%, para lactose-EDTA, p<0,05). A utilização de Lactose-EDTA 5%GLI apresentou resultados superiores para MT e MP se comparado ao mesmo diluidor com 3%MF + 2%GLI, o que mostra que o glicerol é um crioprotetor que pode ser utilizado em diferentes protocolos de congelamento (MT para Lactose-EDTA 5%GLI = 33%, 45%, 56% e 53% para 0, 20, 120T e 120P vs. 20%, 30% 35% e 36% para Lactose-EDTA 3%MF+ 2%GLI, p<0,05; MP para Lactose-EDTA 5%GLI = 19% e 17% para 120T e 120P vs. 11% e 10% para Lactose-EDTA 3%MF+ 2%GLI, p<0,05). O resfriamento do sêmen antes do congelamento pode ser realizado tanto em tubos quanto em palhetas de 0,5 mL, sem prejuízos às motilidades total e progressiva do sêmen após congelamento. / This thesis is compounded by four chapters. All work reported here were performed at Colorado State University (CSU), located in Fort Collins, CO / USA. Six stallions between 15 and 21 years old (Thoroughbred, Quarter Horse and Arabian breeds) and stabled at Equine Reproduction Laboratory at CSU were used in all experiments. Chapter 1: comprised by three experiments. Experiment 1: aimed to evaluate the effects on total motility (TM) and progressive motility (PM) after semen thawing from treatments with 2 mg of cyclodextrin-loaded-cholesterol and 2 mg of cyclodextrin-loaded-stigmastanol (CLC, CLS); 1, 2 and 3 mg of cyclodextrin-loaded-salmon oil (S1, S2 and S3); and 1, 2 and 3 mg of cyclodextrin- loaded-flax seed oil (F1, F2, and F3). No differences among treatments were detected (p>0.05). Experiment 2: aimed to evaluate TM and PM of semen treated with different sonicated lipids into Modified Whitten’s Medium (MW), after conventional freezing and freezing preceded by cold shock, and assess the effect of treatment with 2 mg of CLC and CLS on motility after cold shock. Treatments using lipids were: 3 and 6 mg of salmon oil (S3 and S6); 3 and 6 mg of flax seed oil (F3, F6); 3 and 6 mg of egg yolk (E3 and E6); 3 and 6 mg of cod liver oil (C3 and C6), 3 and 6 mg of safflower oil (SF3 and SF6). None of the lipid treatments improved motility after conventional freezing (p>0.05). For semen subjected to 0 °C for 30 minutes, TM and PM increased in semen treated with E6, CLC and CLS (p<0.05). Experiment 3: gas chromatography was used to evaluate effectiveness of treatments in altering the sperm membrane fatty acid profile. The treatments were: 6 μg of flax seed oil diluted with ethanol (F1); 2 mg of cyclodextrin-loaded- flax seed oil (F2) and 6 mg of flax seed oil sonicated in MW (F3). None of the treatments was able to change fatty acid profile in the sperm membrane (p>0.05). Chapter 2: aimed to measure the amount of cholesterol and to establish the cholesterol:phospholipids ratio in plasma membrane of fresh equine sperm cells treated with different amounts of CLC (0, 2, 4, 6 and 8 mg). A commercial kit was used to measure cholesterol (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) and an ammonium ferrothiocyanate assay for total phospholipids measurement. Amount of cholesterol found for cells treated with 0, 2, 4, 6 and 8 mg CLC were, respectively, 0.22; 0.58; 0.77; 0.91 and 1.07 micrograms/10 6 sperm, and cholesterol:phospholipids ratios to the same treatments were 0.39; 0.72; 1.0; 1.16 and 1.36, respectively. Increase in cholesterol amount was observed when 2 mg of CLC was used (p<0.05), and cholesterol:phospholipids ratio was higher with 4 mg of CLC (p<0.05). Chapter 3: in this study the objective was to evaluate the response of fresh equine semen without treatment (CT) or treated with 20% of seminal plasma (SP) and 40 μM PC-12 (PC) in events related to sperm capacitation during incubation for 30 minutes (evaluations made at time 0 - T0, 5 - T5, 15 – T15 and 30 minutes - T30). Each treatment was subjected to four different dyes: 1- CoroNa Green, which measures intracellular sodium (CG); 2- Fluo-3, which measures intracellular calcium (Fluo); 3- FITC-PNA, which measures acrosome reaction (FP) and 4- Merocyanine, which characterizes plasma membrane fluidity/destabilization (Mero). Yo-Pro-1 or propidium iodide were used to assess cell membrane integrity. Samples were read in flow cytometry. An increased percentage of cells with reacted acrosome was observed in semen treated with PC-12 at T30. This proportion (33%) was higher than the other treatments at the same time (CT: 13% and SP: 4%) and higher than the proportion for PC-12 at T0 (7%), T5 (9%) and T15 (16%). There was no difference in the percentage of cells with high merocyanine between different treatments or between the same treatment over time (p>0.05). The study showed sodium efflux after 15 minutes incubation, and at times 15 and 30 minutes the percentage of positive cells for GC were lower in SP treatment (8.8 and 4.8%) and higher for PC-12 (36 and 15.4%) compared to the CT (23.6 and 11.8%, p <0.05). At T15 the semen of all treatments showed higher proportion of Fluo positive cells than T0, but seminal plasma delayed entry of the ion into the cells, since at T15 Fluo proportion of positive cells was lower than the other treatments (CT: 87%; SP: 59% and PC: 95%, p<0.05) and became similar at T30 (CT = 98%, SP= 85% and PC=97%, p> 0.05). The semen extender used was able to inducing sodium efflux and calcium influx, changes characterizing sperm capacitation. Chapter 4: the objectives were to evaluate efficiency of an egg yolk–based medium (lactose-EDTA) or egg yolk associated with powdered milk (modified FR5 - MFR5), and efficiency of glycerol (GLY) or a combination between GLY and dimethylformamide (MF) to maintain TM and PM sperm after freezing using different protocols (0: no cooling; 20: cooling straws for 20 minutes at 5 °C before freezing; 120T: cooling in tubes for 120 minutes at 5 °C; and 120P: cooling in straws for 120 minutes at 5 °C). MFR5 preserved PM in all freezing protocols, showing the benefit of the combination of egg yolk with powdered milk for freezing diluent (15%, 21%, 26% and 25% for 0, 20, 120T and 120P, respectively, vs. 9%, 14%, 19% and 17% for lactose-EDTA, p<0.05). The use of lactose-EDTA 5%GLY showed superior results for TM and PM if compared to the same medium with 3%MF + 2%GLY, indicating that glycerol is a cryoprotectant that can be used in several different freezing protocols (TM for Lactose-EDTA 5%GLY = 33%, 45%, 56% and 53% for 0, 20, 120T and 120P vs. 20% 30% 35% and 36% for LactoseEDTA 3%MF + 2%GLY, p <0.05; MP for Lactose-EDTA 5%GLY = 19% and 17% at 120T and 120P vs. 11% and 10% for Lactose-EDTA 3%MF + 2%GLY, p<0.05). The cooling before freezing can be performed either in tubes as in 0.5 mL straws for 120 minutes, without damage to total and progressive motility of thawed semen.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-08-10T10:28:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 475943 bytes, checksum: 4700679733e56fffafeea553d2dd1f56 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-10T10:28:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 475943 bytes, checksum: 4700679733e56fffafeea553d2dd1f56 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este estudo foi realizado com o objetivo de verificar se a ação antioxidante da melatonina influencia na viabilidade in vitro pós-descongelamento dos espermatozoides caprinos, bem como verificar o potencial uso deste antioxidante em diferentes concentrações de espermatozoides caprinos criopreservados. Foram utilizados dois machos adultos da raça Alpina e dois machos adultos da raça Saanen. Para as coletas de sêmen foi utilizada vagina artificial onde se obteve seis ejaculados por animal. Após a coleta, fez-se a avaliação das características macro e microscópicas. Em seguida, o sêmen foi diluído com os seguintes tratamentos : T1 40 X 10^6 espermatozoides sem antioxidante (Controle); T2 40 X 10^6 espermatozoides com antioxidante; T3 80 X 10^6 espermatozoides sem antioxidante; T4 80 X 10^6 espermatozoides com antioxidante; T5 100 X 10^6 espermatozoides sem antioxidante e T6 100 X 10^6 espermatozoides com antioxidante.Após as diluições finais, foram avaliados a motilidade progressiva e vigor espermático de cada tratamento. O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25mL, as palhetas foram resfriadas a cinco graus celsius, durante uma hora em refil plástico contendo álcool etílico. O pré-congelamento foi realizado em vapor de nitrogênio líquido durante 15 minutos. Após esse período, as palhetas foram imersas no nitrogênio para o congelamento do sêmen. As partidas foram descongeladas em banho-maria a 37 °C por 30 segundos, acondicionadas em microtubos e homogeneizadas para a análise imediata de motilidade e vigor espermático, teste hiposmótico e teste de termorresistência. As amostras foram avaliadas mediante patologia espermática e por meio de citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e acrossomal, potencial mitocondrial e produção de peróxido de hidrogênio intracelular No sêmen fresco, as características físicas estavam dentro dos parâmetros normais. O melhor resultado obtido no TTR foi referente aos tratamento 100μM (p<0,05), manteve a maior média de motilidade espermática total após cinco minutos de incubação a 37°C. O potencial mitocondrial sofreu alteração frente aos tratamentos com uma concentração de 40 X 10^6 sptz/dose (p<0,05). Em relação à raça, foi observado maior viabilidade celular com presença de peróxido de hidrogênio intracelular na raça saanen comparada a raça alpina (p<0,05). Em relação à concentração espermática, foi observado maior proporção de células viáveis com presença de peróxido de hidrogênio intracelular nos tratamentos com concentração espermática de 40 e 80 x 10^6 espermatozoide/mL, enquanto a menor proporção foi observada no tratamento com 100 x 10^6 espermatozoide/mL (p<0,05). Os resultados obtidos quanto à ação da Melatonina não foram satisfatórios, porém as concentrações utilizadas neste experimento mantiveram a viabilidade seminal de acordo com as características preconizadas pelo CBRA, mas não foram superior ao tratamento controle. / The aim of this study was to evaluate the antioxidant effect of melatonin on the viability in vitro post-thaw sperm of goats, as well as to investigate the potential use of this antioxidant in different concentrations of sperm cryopreserved goats. Four Billy goats were used and six samples were colleted from each and their semen was cryopreserved in commercial diluent Botubov ® . After each collection, the semen was diluted and analyzed, and then distributed along nine experimental treatments: T1 (control) – 40 X 10^6 spermatozoa without melatonin; T2 - 40 X 10^6 spermatozoa with 1μM melatonin; T3 - 40 X 10^6 spermatozoa with 100μM melatonin; T 4 - 80 X 10 6 spermatozoa with without melatonin; T5 - 80 X 10^6 spermatozoa with 1μM melatonin; T6 - 80 X 10^6 spermatozoa with 100μM melatonin; T7 - 100 X 10^6 spermatozoa without melatonin; T8 - 100 X 10^6 spermatozoa with 1μM melatonin; T9 - 100 X 10^6 spermatozoa with 100μM melatonin. After dilutions, the semen was coled to 5°C, kept in a three- hour period of equilibrium, and then stored in previously identified and sealed 0,25mL straws. The straws were frozen in a liquid nitrogen vapor for 15 minutes, submerged in nitrogen, and then stored in cryogenic cylinder. The doses of semen in the treatments were thawed at 37°C for 30 seconds and subjected to in vitro tests: motility, vigor, morphology, membrane functionality by hypoosmotic test and thermoresistance test (TRT) at 37°C for three hours and by flow cytometry as to integrity of plasma and acrosomal membrane, mitochondrial potential and intracellular peroxide hydrogen production. The results related to Melatonin were not satisfactory, revealing with it the need for new studies about its optimal concentration and effects on semen freezing goats. The best result obtained in TTR was referring to 100μM treatment (p <0.05), maintained the highest average total sperm motility after five minutes of incubation at 37°C. Mitochondrial potential was altered to the treatments with a concentration of 40 X 10^6 sperm / dose (p <0.05). In regard to race, greater cell viability was observed with the presence of intracellular hydrogen peroxide in the Alpine compared Saanen (p <0.05). Regarding the sperm concentration was observed a higher proportion of viable cells in presence of intracellular hydrogen peroxide in treatments with sperm concentration of 40 to 80 x 10^6 sperm / ml, while the smaller proportion was observed in the treatment with 100 x 10^6 sperm / ml (p <0.05). The results obtained as to the action of melatonin were not satisfactory, however the concentrations used in this experiment maintained seminal viability according to the features prescribed by the CBRA, but not higher than the control treatment.

O objetivo do experimento foi determinar as taxas de sobrevivência pós vitrificação de blastocistos murinos (experimento 1) expostos à duas associações de crioprotetores e envasados em micropipetas de quartzo (QMC) ou de vidro (GMP) e, (experimento 2) comparar as taxas de sobrevivência obtidas na vitrificação dos embriões envasados em QMC de dois diâmetros internos (0,1 mm ou 0,2 mm). No experimento 1, blastocistos murinos coletados no dia 4 de desenvolvimento foram selecionados morfologicamente e divididos aleatoriamente em seis grupos. Grupo 1 (Controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta. Grupo 2: embriões expostos a 10% PROH + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES1) por 1 min e em seguida expostos a 20% PROH + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS1) por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 3: idem ao Grupo 2 com envase em GMP. Grupo 4: embriões expostos a 10% DMSO + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES2) por 1 min e em seguida expostos a 20% DMSO + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS2), por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 5: idem ao grupo 4 com envase em GMP. Após a exposição às soluções de vitrificação, os capilares foram imediatamente imersos em N2 líquido. Grupo 6 (Controle 2): embriões não vitrificados colocados em cultivo somente após o final dos procedimentos dos grupos tratados. No segundo experimento, a exemplo do primeiro, foram formados os seguintes grupos: Grupo 1 (controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta; Grupo 2: embriões envasados em QCM de 0,1mm de diâmetro; Grupo 3: embriões envasados em QCM de 0,2mm de diâmetro; Grupo 4 (controle 2): embriões não vitrificados colocados somente após o término da vitrificação. Para vitrificação foi utilizado o tratamento 4 do experimento 1. Nos dois experimentos, os embriões vitrificados foram reaquecidos pela exposição a 0,25M de sacarose em PBSm, a 37°C, durante 5min para a retirada do crioprotetor. Após, os embriões foram transferidos para o cultivo in vitro em meio KSOM durante 72h. As taxas de eclosão dos blastocistos nos grupos do experimento 1 foram: G1: 83,07% (54/65), G2: 47,3% (23/49), G3: 38,4% (20/52), G4: 60,4% (29/48), G5: 41,1 (21/51), G6: 77,4% (55/71). No segundo experimento, as taxas de eclosão dos blastocistos foram: G1: 82,5% (33/40), G2: 55,3% (17/31), G3: 58,5% (22/38), G4: 82,0% (41/50). Os resultados observados nos experimentos mostraram que não houve diferença significativa na taxa de eclosão entre os grupos experimentais, entretanto, todos foram inferiores (P>0,05) aos controles. As soluçõesutilizadas, os GMP e os dois diâmetros do QCM testados permitiram que blastocistos murinos vitrificados apresentassem taxas de sobrevivência in vitro semelhantes entre si. / The aim of the experiment was to determine the survival rates after vitrification of mice blastocysts exposed to two different associations of cryoprotectants and loaded in quartz microcapillaries (QCM) or glass microcapillaries (GMP) and, later, to compare the embryo survival rates obtained with murine blastocysts loaded into QMC with two internal diameters (0.1 mm or 0.2 mm). In experiment 1, the murine blastocysts were collected on day 4 of development and morphologically selected and randomly divided into six groups. Group 1 (control 1): not vitrified blastocysts cultured into KSOM drops immediately after collection. Group 2: embryos exposed for 1 minute at 10% PROH, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES1) and after exposed to 20% PROH, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm (VS1) within 30 seconds, then loaded in QMC. Group 3: the same to group 2 however loaded in GMP. Group 4: exposed to 10% DMSO, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES2) and after exposed to 20% DMSO, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm(VS2), loaded in QMC. Group 5: the same to group 4 however loaded in GMP. After exposure to vitrification solutions, the capillaries were immediately immersed in LN2. Group 6 (Control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end of vitrification of the treated groups. The second experiment consisted of the following groups: Group 1 (control 1) embryos transferred to culture immediately after collection; Group 2: embryos loaded in QCM with 0.1 mm internal diameter, and Group 3: embryos loaded in QCM with 0.2 mm internal diameter diameter, and Group 4 (control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end vitrification procedures. Groups 2 and 3 were exposed to ES2 and VS2 and later loaded in QMC 0.1 or 0.2 mm in diameter, immediately immersed in LN2. Blastocysts were warmed by exposure to 0.25 M sucrose in PBSm at 37 °C for 5min to remove the cryoprotectant. After warming, the embryos were transferred to 100 μL drops of KSOM during 72 hours. Hatching rates were observed in groups of experiment 1 were: G1: 83.07% (54/65), G2: 47.3% (23/49), G3: 38.4% (20/52), G4: 60.4% (29/48), G5: 41.1 (21/51), G6: 77.4% (55/71). In the second experiment, the blastocyst hatching rates were: G1: 82.5% (33/40), G2: 55.3% (17/31), G3: 58.5% (22/38), G4: 82% (41/50). The results observed in both experiments showed no significant difference in embryo hatching rates among the experimental groups, but all were inferior (P>0.05) to controls. The vitrification solutions used, the GMP and the QCM at two diameters tested provided similar embryo survival rates.

Resumo não disponível

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Passiflora ocorre principalmente em regiões de clima tropical, sendo o Brasil um importante centro de diversidade. Passiflora foetida L. é uma espécie silvestre que apresenta características de interesse ornamental e medicinal. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de sistemas de cultura de tecidos e criopreservação para P. foetida. Explantes caulinares foram excisados de culturas primárias obtidas a partir de plântulas derivadas da germinação in vitro. Para isso foram inoculados em meio MSM, suplementado com diferentes concentrações de ANA, PIC, TDZ e BAP utilizado isoladamente ou em combinação com ANA, e mantidos na presença ou ausência de luz. Foi observada a produção de brotos, calos e raízes adventícias, de acordo com o tipo e a concentração do regulador de crescimento testado e da condição de cultura utilizada. A produção de plantas ocorreu via organogênese direta e indireta em resposta a BAP, enquanto que a formação de calos não morfogênicos foi observada a partir de ambos explantes em resposta a PIC. A produção de raízes adventícias ocorreu em resposta a ANA. Tendo em vista a produção de raízes observada em meio sólido, segmentos internodais foram inoculados em meio líquido suplementado com diferentes auxinas e mantidos em imersão contínua ou sobre pontes de papel de filtro. A maior taxa de multiplicação de raízes foi observada a partir de entrenós mantidos no sistema de ponte de papel de filtro, em resposta a ANA. Segmentos radiculares excisados das culturas primárias também foram utilizados visando à produção de brotos e a multiplicação de raízes. Contudo, apenas foi observada a formação de gemas, sem posterior desenvolvimento de brotos. Além disso, a capacidade proliferativa dos segmentos radiculares inoculados em meio suplementado com ANA foi menor que a obtida a partir dos entrenós cultivados nas mesmas condições. Neste trabalho, foram também testados diferentes protocolos de criopreservação para ápices caulinares de P. foetida por meio de vitrificação e encapsulamento-vitrificação. A recuperação de plantas pós-congelamento foi observada unicamente a partir de ápices encapsulados e expostos à solução de vitrificação PVS2 por 120 minutos. Tendo em vista o potencial medicinal já descrito para P. foetida, através dos diferentes sistemas de cultura desenvolvidos neste trabalho serão obtidos materiais para a avaliação de diferentes atividades biológicas. / The genus Passiflora occurs mainly in tropical regions, and Brazil is na important diversity Center. Passiflora foetida L. is a wild species with ornamental and medicinal potential. The goal of this work was the establishment of tissue culture systems and cryopreservation for P. foetida. Stem explants were excised from primary cultures obtained from plantlets derived from in vitro germination. Nodal and internodal segments were inoculated on MSM medium supplemented with different concentrations of NAA, PIC, TDZ and BAP, used alone or in combination with NAA, and maintained in the presence or absence of light. The production of shoots, calluses and adventitious roots was observed, according to the type and concentration of growth regulator and the culture condition. Plant production occurred via direct and indirect organogenesis in response to BAP, whereas the formation of non-morphogenic calluses was observed from both explants in response to PIC. The production of adventitious roots occurred in response to NAA. In the view of root production on solid medium, internodal segments were inoculated on liquid medium supplemented with different auxins and maintained under continuous immersion or on filter-paper bridges. The highest root multiplication rate was observed from internodes maintained on filter-paper bridge in response to NAA. Root segments excised from primary cultures were also used aiming at shoot production and root multiplication. However, we only observed buds formation, without shoot development. In addition, proliferation capacity of root segments inoculated on medium supplemented with NAA was lower than the observed from internodes cultivated at the same conditions. In this work, we also tested different cryopreservation protocols for shoot tips of P. foetida through vitrification and encapsulation-vitrification. Post-freezing recovery was only observed from encapsulated explants which were exposed to the vitrification solution PVS2 for 120 minutes. In the view of the medicinal potential described for P. foetida, the different culture systems developed in this work will provide sources of material for the evaluation of distinct biological activities.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-09. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:14Z : No. of bitstreams: 1 000848324.pdf: 1288416 bytes, checksum: 27f2c10c6c420dc8e778806bfa51bc2e (MD5) / O Haemonchus contortus se destaca como a principal verminose dos ovinos. Esse mostra-se mais propenso ao desenvolvimento de resistência aos antihelmínticos, provavelmente, devido ao seu alto potencial biótico e a sua grande variabilidade genética. A criopreservação possibilita a manutenção de linhagens com características desejáveis por um longo período de tempo a um baixo custo, somado a uma redução drástica no número de animais mantidos em laboratórios. O presente estudo visou comparar diferentes técnicas de criopreservação, considerando os melhores resultados quanto à taxa de sobrevida, motilidade e manutenção da infectividade de larvas L3 de Haemonchus contortus. A diferença entre cada técnica se deu através da alternância entre três etapas distintas, a manutenção ou remoção das bainhas das larvas L3 de Haemonchus contortus com Hipoclorito de Sódio, a utilização ou não de Etileno Glicol como crioprotetor e a velocidade de congelamento, lento ou ultrarrápido. O estudo identificou etapas estratégicas na criopreservação de larvas L3 de Haemonchus contortus, entre essas, a ausência de bainha e o congelamento lento se mostraram imprescindíveis para obtenção de alguma taxa de sobrevida após o descongelamento. Já o uso do Etileno Glicol como crioprotetor não se mostrou imprescindível, entretanto, apresentou benefícios a técnica, elevando as taxas de sobrevida e motilidade significativamente para um período maior de congelamento / The Haemonchus contortus stands out as the main worms in sheep. This seems to be more likely to the development of resistance to antihelmintics, probably due to its high biotic potencial and genetic variability. The cryopreservation allows lineage maintenance with desirable characteristics for a long period of time, added to a drastic decrease in the number of animals kept in laboratories. The present study aimed at comparing different cryopreservation techniques, considering the best results regarding survival rate, motility and infectivity maintenance of Haemonchus contortus L3 larvae. The difference between each technique occurred through the alternation between three distinct stages, the conservation or removal of the sheaths of Haemonchus contortus L3 larvae with Sodium Hypochlorite, the use or not of Ethylene Glycol as a cryoprotector and the freezing speed, slow or ultrafast. The study identified strategic stages on the cryopreservation of Haemonchus contortus L3 larvae, among these, the absence of sheath and slow freezing proved to be essential for obtaining any survival rate after the defrosting. Instead, the use of Ethylene Glycol as cryoprotector was not indispensable, however presented technical benefits, significantly increasing the survival rates and motility for a longer period of freezing