Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2016. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2016-04-27T12:15:35Z No. of bitstreams: 1 2016_SeverinoBernardinoDeSenaNetto.pdf: 838386 bytes, checksum: 5afb6bda32d890becbc877491dbd2376 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-04-27T14:25:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_SeverinoBernardinoDeSenaNetto.pdf: 838386 bytes, checksum: 5afb6bda32d890becbc877491dbd2376 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T14:25:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_SeverinoBernardinoDeSenaNetto.pdf: 838386 bytes, checksum: 5afb6bda32d890becbc877491dbd2376 (MD5) / Um dos fatores mais limitantes da produção in vitro de embriões (PIVE) é a criopreservação, pois além dos embriões serem mais sensíveis ao frio eles suportam melhor a vitrificação do que o congelamento lento. Mas a vitrificação requer a presença de um técnico especializado para a manipulação embrionária enquanto que o congelamento lento permite a transferência direta. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da substituição do SFB por BSA durante a maturação e cultivo embrionário na resposta à criopreservação utilizando o congelamento lento. Os CCOs obtidos de ovários de abatedouro foram distribuídos em 2 grupos: 1) controle: CCOs maturados e cultivados em meios suplementados com SFB, 2) CCOs maturados e cultivados em meios suplementados com BSA. Em D7 os embriões de cada grupo foram distribuídos em dois tratamentos, fresco e congelado. O experimento 1 avaliou o efeito da fonte proteica na PIVE e a resposta à criopreservação. Após o descongelamento os embriões foram avaliados às 24h e 48h quanto à expansão e eclosão. No experimento 2 foi quantificada a expressão dos genes KRT8, PLAC8, FOSL1, HSP1A1 e HSPA5 por qPCR e quanto ao número total de células e células apoptóticas. Os dados referentes ao desenvolvimento embrionário e taxa de células apoptóticas foram realizados pelo teste χ2 e número de células pela ANOVA e teste de Tukey. A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) entre os grupos, entretanto a taxa de blastocisto foi maior (P< 0,05) no grupo 1 (42,8±10,1%) do que no grupo 2 (27,9±8,5%). Às 24 horas pós-descongelamento o grupo SFB Fresco apresentou maior taxa de eclosão (P< 0,05) do que os demais. Entretanto, as 48 horas, a taxa de eclosão foi semelhante (P>0,05) entre os grupos SFB Controle (68,1±23.3%) e BSA Controle (70.0±31.0%) e SFB Congelado (39.2±27.1) e BSA Congelado (38,2±23,9). Não houve diferença (P>0.05) entre os grupos Frescos, e entre os grupos congelados quanto ao número total de células. A percentagem de células apoptóticas foi maior no grupo BSA Congelado do que grupo SFB Fresco, não diferindo (P< 0,05) dos demais grupos. A expressão do gene KRT8 foi maior (P< 0,05) no grupo SFB Congelado do que no BSA Congelado, mas foi semelhante (P>0.05) entre Congelados e Frescos dentro de cada grupo. O gene PLAC8 foi mais expresso no grupo BSA Fresco do que no grupo SFB Congelado (P< 0,05). Pode-se concluir que o uso de BSA em substituição ao SFB causou uma redução na produção de embriões, mas teve resposta semelhante na criopreservação. A expressão diferencial dos genes KRT8 e PLAC8 sugere que os embriões cultivados em BSA são de qualidade superior. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / One of the most limiting factors in vitro embryos (IVP) is cryopreservation, because besides the embryos are more sensitive to cold they support better vitrification than slow freezing. But vitrification requires the presence of a technical expert for embryo manipulation while slow freezing allows direct transfer. The objective of this study was to evaluate the effect of replacing SFB by BSA during maturation and embryo culture in response to cryopreservation using slow freezing. The COCs obtained from slaughterhouse ovaries were divided into 2 groups: 1) control: COCs matured and grown in media supplemented with SFB, 2) COCs matured and grown in media supplemented with BSA. D7 in the embryos of each group were divided into two treatments, fresh and frozen. Experiment 1 evaluated the effect of protein source in IVP and response to cryopreservation. After thawing the embryos were evaluated at 24 and 48 hours as the expansion and hatching. In experiment 2 was quantified the expression of genes KRT8, PLAC8, FOSL1, HSP1A1 and HSPA5 by qPCR and for the total number of cells and apoptotic cells. The χ2 test and the number of cells performed the data relating to embryonic development and cell apoptotic rate by ANOVA and Tukey test. Cleavage rate was similar (P> 0.05) between groups, however blastocyst rate was higher (P <0.05) in group 1 (42.8 ± 10.1%) than in group 2 (27.9 ± 8.5%). At 24 hours post-thaw SFB group Fresh showed the highest hatching rate (P <0.05) than the others. However, the 48 hours, the hatching rate was similar (P> 0.05) between SFB Control groups (68.1 ± 23.3%) and BSA control (70.0 ± 31.0%) and Frozen SFB (39.2 ± 27.1) and BSA Frozen (38.2 ± 23.9). There was no difference (P> 0.05) between groups Fresh, frozen and between groups regarding the total number of cells. The percentage of apoptotic cells was higher in the Frozen BSA group than group SFB Fresh, did not differ (P <0.05) from the other groups. The KRT8 gene expression was higher (P <0.05) in Frozen FBS group than in BSA Frozen, but was similar (P> 0.05) between frozen and fresh within each group. The PLAC8 gene was more expressed in the BSA Fresh group than in the Frozen SFB group (P <0.05). It can be concluded that the use of BSA replacing FBS caused a reduction in embryo production, but had similar response in cryopreservation. The differential expression of KRT8 and PLAC8 genes suggests that embryos cultured in BSA are top quality.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-25T16:41:27Z No. of bitstreams: 1 2018_AdalmyrMoraisBorges.pdf: 5438238 bytes, checksum: d936e356826ef0abd06970160cde3b2b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-31T19:17:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AdalmyrMoraisBorges.pdf: 5438238 bytes, checksum: d936e356826ef0abd06970160cde3b2b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-31T19:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AdalmyrMoraisBorges.pdf: 5438238 bytes, checksum: d936e356826ef0abd06970160cde3b2b (MD5) Previous issue date: 2018-07-25 / O estudo buscou avaliar diferentes alternativas para o congelamento do sêmen de jundiá amazônico e de pintado e a melhoria da qualidade pos-descongelamento, contribuindo para o desenvolvimento de protocolos para as duas espécies. Entre as abordagens avaliadas foram: (1) a caracterização morfológica dos espermatozoides de jundiá amazônico com o uso de microscopia eletrônica de varredura e de transmissão; (2) a utilização de diferentes agentes crio protetores, para o jundiá amazônico: metanol, dimetilsulfoxido e etilenoglicol a 10%, associados a solução de glicose a 5% e para o pintado: metanol, dimetilsulfoxido e dimetilacetamida a 5%, 7,5% e 10%, associados a solução de BTS a 5%; e (3) a adição de substancias antioxidantes nos meios de congelamento para o pintado: trealose 100 mM, acido ascórbico 1 mM e α-tocoferol 0,1 mM. Para ambas espécies, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 mL e congelado em vapor de nitrogênio, utilizando botijão dry shipper, e descongelado a 40oC por 12 segundos. No jundiá amazônico, o espermatozoide apresentou o comprimento total de 25,46 } 2,54 μm, cabeça esférica (1,51 } 0,18 μm) ausência de acrossoma, peca intermediaria de formato cônico, ligeiramente assimétrica com presença de vesículas, e comprimento de 0,93 } 0,17 μm, e flagelo com arranjo típico e comprimento de 21,48 } 2,45 μm. O sêmen descongelado apresentou valores mais altos (p<0,05) para duração, vigor e taxa de mobilidade espermática com os crio protetores metanol 10% e dimetilsulfoxido 10% quando comparado com o etilenoglicol 10%. No pintado, o sêmen criopreservado com metanol 7,5% e 10% apresentou valores para duração e taxa de mobilidade maiores (p<0,05) comparado com o dimetilsulfoxido e dimetilacetamida. O tratamento com os três antioxidantes associados proporcionou taxa de mobilidade maior (p<0,05) em relação ao tratamento sem antioxidantes. Para os parâmetros de duração e taxa de mobilidade foi observada interação significativa (p<0,05) entre o acido ascórbico e o α-tocoferol. Assim, os resultados obtidos na criopreservação de sêmen de jundiá amazônico não foram suficientes para estabelecer um protocolo para a espécie. Na criopreservação de sêmen de pintado e recomendado o uso do metanol a 7,5% associado a solução de BTS a 5%, e a adição conjunta dos antioxidantes trealose (100mM), acido ascórbico (1mM) e α-tocoferol (0,1mM). / This study aimed to evaluate different alternatives for the semen freezing of amazon catfish and spotted catfish, contributing to the development of protocols for both species increasing the process efficiency in both species. Among the approaches used are (1) morphological characterization of amazon catfish spermatozoa using scanning and transmission electron microscopy; (2) use of different cryoprotectant agents, 10% methanol, dimethylsulfoxide and ethyleneglycol, associated 5% glucose solution in amazon catfish, and 5%, 7,5% e 10%, methanol, dimethylsulfoxide and dimethyacetamide, associated 5% BTS solution in spotted catfish; and (3) addition of antioxidants in the freezing media, trehalose (100 mM), ascorbic acid (1 mM) and α- tocopherol (0.1 mM) in spotted catfish. In both especies, semen samples were loaded in 0.25 mL plastic straws, frozen in nitrogen vapour (dry shipper) and thawed at 40oC for 12 seconds. In the amazon catfish, fresh spermatozoon was 25.46 } 2.54 μm long, head was spherical (1.51 } 0.18 μm) with no acrosome, midpiece was coneshapped with presence of vesicles, slightly asymmetric, 0.93 } 0.17 μm long and the single fagellum was 21.48 } 2.45 μm long with the typical arrangement. Postthawed semen presented higher values (p<0.05) for duration, vigor and sperm motility rate with cryoprotectants 10% methanol and 10% DMSO, when compared to 10% ethyleneglycol. In the spotted catfish, the cryopreserved semen with 7,5% and 10% methanol presented higher values (p<0.05) for latency time and motility rate compared to dimethylsulfoxide and dimethyacetamide. The treatment with associated antioxidants provided a higher motility rate (p<0.05) compared to the antioxidant-free treatment. For the parameters of latency time and motility rate, a significant interaction (p<0.05) was observed between ascorbic acid and α-tocopherol. In conclusion, the results observed in semen cryopreservation of amazon catfish were not satisfactory to establish a protocol for the specie. For the semen cryopreservation of spotted catfish, it is recommended the use of 7.5% methanol with the 5% BTS solution and the addition of the antioxidants trehalose (100 mM), ascorbic acid (1 mM) and α-tocopherol (0.1 mM).

Made available in DSpace on 2018-07-27T18:26:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-30. Added 1 bitstream(s) on 2018-07-27T18:30:18Z : No. of bitstreams: 1 000866601.pdf: 1192960 bytes, checksum: b230a294adc85fc16f62c1b42c3673a6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi verificar o efeito de diferentes meios e tempos de refrigeração sobre o desenvolvimento e expressão gênica de embriões bovinos produzidos in vitro. Para tanto, blastocistos D7 foram divididos em três grupos: controle, embriões mantidos em meio SOFaa, em incubadora de CO2, por 6 e 48h; refrigerados, embriões mantidos a 5 °C, em Meio 199, por 24 (M199-24h) e 48h (M199-48h) ou em meio BotuEmbryo®, por 24 (BE-24h) e 48h (BE-48h). Após a refrigeração, os embriões foram cultivados sob as mesmas condições do grupo controle para avaliação da viabilidade embrionária às 6 e 48h, e das taxas de reexpansão e eclosão, às 24 e 48h, respectivamente. Às 6h de cultivo parte dos embriões foi retirada e armazenada para posterior análise de qPCR e TUNEL. Menor porcentagem (P<0,05) de blastocistos viáveis, às 6 e 48h, foi observada no grupo M199-48 em relação ao grupo controle. A taxa de reexpansão não diferiu entre os embriões refrigerados e o grupo controle, porém, menor (P<0,05) taxa de eclosão foi observada nos grupos M199-48h e BE-48h do que no grupo controle. Maior (P<0,05) porcentagem de células apoptóticas foi observada no grupo BE-48h do que nos grupos controle e BE-24h. Os meios e tempos utilizados não alteraram a expressão dos genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 e SLC2A1. Portanto, de modo geral, o meio e o tempo de refrigeração não promoveram efeito potencial adverso sobre a viabilidade embrionária, taxa de reexpansão e eclosão, número de células apoptóticas e expressão gênica, sugerindo o emprego do meio BotuEmbryo®, o qual é disponível comercialmente / This study was carried out to investigate the effects of different media and cooling times on the development and gene expression of in vitro-derived bovine embryos. Therefore, blastocysts D7 were divided into three groups: control, embryos kept in SOFaa medium, under CO2 incubation, for 6, 24 and 48 hours; cooled embryos, kept in Medium 199, for 24 (M199-24h) and 48 hours (M199-48h) or in BotuEmbryo® medium, for 24 (BE-24h) and 48 hours (M199-48h). After cooling, the embryos were cultured under the same conditions used for the control group for evaluation of embryo viability at 6 and 48 hours, and of re-expansion and hatching rates, at 24 and 48 hours, respectively. At 6h of culture part of the embryos was removed and stored for later analysis of qPCR and TUNEL. Low percentage (P<0.05) of viable blastocysts, at 6 and 48 hours, was observed in group M199-48h than for control group. Re-expansion rate did not differ between cooled embryos and control group, however, lower (P<0.05) hatching rate was observed in M199-48h and BE-48h groups than for control group. Higher (P<0.05) percentage of apoptotic cells was found in BE-48h compared with control and BE-24h groups. Media and cooling times used did not alter the expression of genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 and SLC2A1. Thus, overall, medium and cooling time did not promoted potential adverse effect on the embryonic viability, re-expansion and hatching rate, number of apoptotic cells and gene expression, suggesting the use of BotuEmbryo® medium, which is commercially available / FAPESP: 13/15905-9

Orientador: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: A membrana espermática é caracterizada por uma significativa quantidade de lipídios relacionados com funções específicas da célula, tais como fusogenicidade e permeabilidade, necessárias para o espermatozoide alcançar e fundir-se ao oócito. O perfil lipídico dos espermatozoides difere entre as espécies e indivíduos da mesma espécie, o que pode conferir maior ou menor manutenção da integridade plasmática e crioresistência, uma vez que a exposição desta célula a baixas temperaturas modifica a composição e a organização lipídica da membrana, diminuindo a longevidade e consequentemente sua capacidade fecundante. A presença e a quantidade de lipídios específicos, como as fosfatidilcolinas, esfingomielinas, seminolipídios, plasmalogênios e ácidos graxos com diferentes graus de saturação, além do colesterol exercem importantes funções associadas aos processos de capacitação, motilidade, viabilidade e preservação da integridade da membrana espermática. Assim, um maior estudo sobre a composição lipídica do sêmen e a influência destas macromoléculas sobre a qualidade espermática após a criopreservação possibilitará desenvolver novas estratégias para tornar a célula espermática mais resistente frente ao processo de criopreservação. / Doutor

Submitted by Camila Mário Gorricho (caca_gorricho@hotmail.com) on 2018-06-11T14:49:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado CAMILA-pdf.pdf: 8792668 bytes, checksum: 9bb5046361adcc4ccac3ed73c1d189c4 (MD5) / Rejected by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: O arquivo PDF submetido ao repositório encontra-se no formato de foto não possibilitando que o bibliotecário responsável pelo aceite possa copiar dados caso necessária a correção de algum metadado da submissão. Favor colocar o arquivo PDF no formato correto conforme informações contidas no item 13 do tutorial. (link para tutorial https://portal.biblioteca.unesp.br/portal/arquivos/tutorial-para-o-autoarquivamento-de-dissertacoes-e-teses-2.0.pdf) Upload do arquivo 13. Para enviar o arquivo contendo sua dissertação ou tese é necessário que:  o arquivo esteja no formato Portable Document Format (PDF);  o arquivo não esteja protegido;  o trabalho (dissertação ou tese) esteja reunido em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos. Agradecemos a compreesão. on 2018-06-11T19:09:42Z (GMT) / Submitted by Camila Mário Gorricho (caca_gorricho@hotmail.com) on 2018-06-11T19:31:48Z No. of bitstreams: 3 Dissertação Mestrado CAMILA-pdf.pdf: 8792668 bytes, checksum: 9bb5046361adcc4ccac3ed73c1d189c4 (MD5) dissertação definitiva pdf.pdf: 1088332 bytes, checksum: 9d68fd0007c9e0e89bccdefeb0133280 (MD5) Pré texto definitivo pdf.pdf: 180404 bytes, checksum: 18ac04bfbd469a476993165dbf5b3af6 (MD5) / Rejected by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Prezada Camila o arquivo PDF submetido ao repositório deve estar desbloqueado permitindo que possa ocorrer seleção no mesmo pois precisamos fazer correções no repositório e pelo fato do mesmo estar scaneado como foto não podemos fazer as mesmas. Vc mandou os arquivos separadamente, mas teria que ser em um arquivo só e também nas páginas pré textuais é necessário que se tenha a ficha catalográfica e também o certificado de aprovação. Se puder juntar os arquivos que enviou separadamente (texto dissertação (1.037Mb) e pré texto (176.1Kb)) inserindo a ficha catalográfica e o certificado de aprovação então o arquivo para o repositório estará correto. Espero que tenha entendido. Ver tutorial no seguinte link: https://portal.biblioteca.unesp.br/portal/arquivos/tutorial-para-o-autoarquivamento-de-dissertacoes-e-teses-2.0.pdf. Prestar bastante atenção no item 13 do mesmo que fala a respeito do arquivo. Agradecemos a compreensão. on 2018-06-12T17:27:35Z (GMT) / Submitted by Camila Mário Gorricho (caca_gorricho@hotmail.com) on 2018-06-12T18:02:09Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO.pdf: 1249420 bytes, checksum: a08e5269e74646dc42ccc6e450d66936 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-06-13T17:09:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gorricho_cm_me_jabo.pdf: 1249420 bytes, checksum: a08e5269e74646dc42ccc6e450d66936 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-13T17:09:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gorricho_cm_me_jabo.pdf: 1249420 bytes, checksum: a08e5269e74646dc42ccc6e450d66936 (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / A criopreservação de ovário ou tecido ovariano permite a preservação do material genético de qualquer espécie animal que seja submetido à gonadectomia por indicação preventiva, terapêutica ou, até mesmo, por morte inesperada. O objetivo do presente trabalho foi avaliar se o tamanho do fragmento ovariano influencia ou não a resistência aos crioprotetores. Para tanto, os ovários foram colhidos de 34 gatas domésticas (várias raças, 1-5 anos de idade) por ovariectomia de rotina, transportados ao laboratório e depois seccionados em fragmentos de diferentes tamanhos (3 x 3 x 3mm, 5 x 3 x 3mm e 7 x 3 x 3mm) e destinados aleatoriamente aos grupos de controle (GC3, GC5 e GC7, respectivamente) ou vitrificados (GV3, GV5 e GV7, respectivamente). Os fragmentos vitrificados-aquecidos foram avaliados por histomorfologia e imunohistoquímica (para taxas de apoptose utilizando a caspase-3 clivada). A avaliação histológica demonstrou que 72,97% dos folículos presentes em GV3 e 72,58% nos fragmentos do grupo GV5 eram normais, enquanto que nos fragmentos do GV7 essa taxa foi de apenas 42,86%. A principal alteração morfológica foi o desprendimento das células epiteliais da membrana basal presentes em todos os grupos. Da mesma forma, a avaliação imunohistoquímica, utilizando a caspase 3, revelou uma pequena proporção de células apoptóticas nos fragmentos do grupo GV3 (53%), enquanto que no grupo GV7, 43,58% das células expressaram a caspase 3 clivada. Esses achados indicam que fragmentos seccionados em 3 x 3 x 3mm (27mm³) são mais adequados para a perfusão do crioprotetor, sem causar danos celular após o descongelamento. / Cryopreservation of ovary or ovarian tissue allows preservation of genetic material of any animal species that is submitted to gonadectomy for preventive, therapeutic or even by unexpected death. The aim of the present study was to investigate whether or not the size of the ovarian fragment influence its resistance to cryostorage. For that purpose, ovaries were collected from 34 queens (various breeds, age 1-5 y) by routine ovariectomy, transported to the laboratory and then sectioned in different sizes (3 x 3 x 3 mm, 5 x 3 x 3 mm and 7 x 3 x 3 mm) and randomly assigned to a control (GC3, GC5 and GC7, respectively) or vitrified (GV3, GV5 and GV7, respectively) groups. Vitrified-warmed fragments were evaluated by histomorphology and immunohistochemistry (for apoptotic rates by using cleaved caspase-3). Histological examination reveal that 72.97% of the follicles in GV3 and 72.58% in GV5 were normal while only 42.86% of the follicles in GV7. The main morphological alteration presented in all groups was a detachment of the epithelial cells by basement membrane. Similarly, immunohistochemistry evaluation using caspase 3 revealed a small proportion of apoptotic cells in GV3 (53%) while in GV7 43.58% of the cells expressed cleaved caspase-3. These findings indicate that fragments sectioned in 3 x 3 x 3 mm (27mm3) seems more adequate for perfusion of the cryoprotectant, causing less damage to the cell after vitrification-warming.

Submitted by LUIS FERNANDO MERCES CHAVES SILVA null (luisfernando.mchaves@gmail.com) on 2016-06-02T00:52:25Z No. of bitstreams: 1 TESE MESTRADO VERSÃO FINAL (LUIS FERNANDO M. C. SILVA).pdf: 2997186 bytes, checksum: 711036d97c3d4d1e8cce675ab6ad1477 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-06-06T14:47:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_lfmc_me_bot.pdf: 2997186 bytes, checksum: 711036d97c3d4d1e8cce675ab6ad1477 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T14:47:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_lfmc_me_bot.pdf: 2997186 bytes, checksum: 711036d97c3d4d1e8cce675ab6ad1477 (MD5) Previous issue date: 2016-04-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O surgimento das biotecnologias aplicadas ao sêmen equino, como a refrigeração e congelação, representaram um grande avanço para equinocultura, principalmente por permitir um melhor aproveitamento do ejaculado, otimizando a utilização de animais considerados geneticamente superiores. Entretanto a aplicação dessas técnicas imprime estresse térmico às células espermáticas, resultando em injúrias físicas e químicas, dentre elas uma elevação significativa na produção de espécies reativas do oxigênio (EROs). Quando em excesso, estes agentes instáveis são capazes de reagir e promover lesão às enzimas, lipídeos de membrana e ácidos nucleicos, reduzindo a viabilidade dos espermatozoides criopreservados. Desta maneira surge a necessidade de se introduzir elementos que desempenhem função antioxidante nos meios de refrigeração e congelação. A quercertina, um polifenol do grupo dos flavonoides, é considerada um poderoso antioxidante por reduzir o surgimento das principais EROs, quelar íons metálicos formadores de radicais livres e estabilizar a peroxidação lipídica. Apesar disto, a eficiência da aplicação deste antioxidante sobre o ejaculado equino durante o processo de criopreservação ainda é controversa e pouco referenciada, sendo necessário mais estudos para que se determine a influência de sua utilização no ejaculado de garanhões durante a refrigeração e congelação. / The emergence of biotechnologies applied to the equine semen as cooling and freezing process represented a major breakthrough for Equine, especially for allowing a better use of the ejaculate, optimizing the use of genetically superior animals. However the application of these techniques induces thermal stress on sperm cells, resulting in physical and chemical injuries, among them a significant rise in the production of reactive oxygen species (ROS). These unstable agents when in excess, are able to react and promote damage to enzymes, lipid membrane and nucleic acids, thereby reducing the viability of cryopreserved sperm. Thus is required to introduce elements that perform antioxidant function in cooling and freezing extenders. The quercertina, a polyphenol of the flavonoids group, is considered a potent antioxidant by reducing the emergence of the main ROS, chelate metal ions producers of free radicals and stabilize the lipid peroxidation. Despite this, the efficiency of application of this antioxidant on the equine ejaculate during the process of cryopreservation is still controversial and poorly referenced, requiring further studies in order to determine if there is influence of their use in the ejaculate of stallions during cooling and freezing. / FAPESP: 2014/01681-4

Made available in DSpace on 2016-07-01T13:10:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-20. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:13:44Z : No. of bitstreams: 1 000866927.pdf: 585944 bytes, checksum: 976b997ede2e6fb1c664f9142a6fcbaf (MD5) / Muitos garanhões não respondem de forma satisfatória frente ao processo de criopreservação sendo vários os fatores envolvidos nessa intolerância. Visando elucidar resultados superiores de alguns animais aos processos de criopreservação espermática, foram realizados dois experimentos. No experimento I, o objetivo foi avaliar a ação do estresse oxidativo e as consequências no sêmen de garanhões resistentes e sensíveis ao processo de congelação espermática, verificando também a influência do fator racial frente ao processo de congelação espermática. No experimento II, o objetivo foi avaliar a influência da presença do plasma seminal sobre a resistência espermática no sêmen refrigerado de garanhões considerados bad e good coolers. Para avaliação das amostras seminais foi realizada análise computadorizada de cinética espermática (CASA, Thorne Research - HTMA IVOS), análise e quantificação do estresse oxidativo pela mensuração das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), análise da fragmentação do DNA espermático (HALOMAX) e análises de translocação de fosfolipídios da membrana, índice de caspase ativada e quantificação de espécies reativas de oxigênio pela citometria de fluxo. No experimento I, não houve influência racial com relação à qualidade espermática, além disso, os garanhões bad freezer, que apresentaram maior perda de qualidade seminal após a congelação espermática, revelaram maiores níveis de estresse oxidativo e fragmentação do DNA espermático. No experimento II, os garanhões sensíveis à refrigeração apresentaram melhora da qualidade espermática ao retirarmos o plasma seminal. Já nos good coolers houve uma manutenção da qualidade espermática na presença do plasma seminal e uma diminuição da qualidade sem o plasma seminal. Além disso, observamos ao submeter as amostras ao teste-desafio, que as análises espermáticas se tornam mais confiáveis... / A significant number of stallions do not respond in a satisfactory way to the cryopreservation process and that there are many factors involved. In order to elucidate the reasons why some animals have superior results in the spermatic cryopreservation processes, two experiments were conducted. In experiment I, the goal was to evaluate the action of oxidative stress and the consequences in the semen of stallions that were resistant and susceptible to the spermatic freezing process. The influence of the racial factor to the spermatic freezing process was also verified. In experiment II, the goal was to evaluate the influence of the seminal plasma presence on spermatic resistance in cooled semen of stallions considered as bad and good coolers. To evaluate seminal samples, computer analysis of the spermatic cinetic was done (CASA, Thorne Research - HTM IVOS), oxidative stress levels were assessed by thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), sperm DNA fragmentation (HALOMAX) and analysis of the translocation of membrane phospholipids, activated caspase indices and quantification of ROS with flow cytometry were done. In experiment I, there was no influence of the breed factor in relation to the sperm quality of the analyses that were done. Furthermore, the bad freezers stallions, that showed the most loss of seminal quality after spermatic freezing, presented higher rates of oxidative stress and spermatic DNA fragmentation. In experiment II, the stallions that were considered sensitive showed improvement of the sperm quality as the SP was removed. Furthermore, in the good coolers we observed the preservation of sperm quality in the presence of SP and a quality decrease in the samples without the SP. Additionally, we also observed the importance of the test challenge for the evaluation of the sperm analysis, because when submitted to stressful situations, the differences were evident. Keywords: Semen, cryopreservation, oxidative stress...

Submitted by JOÃO ALEXANDRE MATOS CARNEIRO (alexandre.med.vet@gmail.com) on 2017-07-27T10:18:47Z No. of bitstreams: 1 Tese João Alexandre Doutorado (2).pdf: 1015783 bytes, checksum: a8142e8dcbc1e5f6fb8d5b95daac3758 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-07-31T16:52:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carneiro_jam_dr_bot.pdf: 1015783 bytes, checksum: a8142e8dcbc1e5f6fb8d5b95daac3758 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-31T16:52:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carneiro_jam_dr_bot.pdf: 1015783 bytes, checksum: a8142e8dcbc1e5f6fb8d5b95daac3758 (MD5) Previous issue date: 2017-07-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Entre as vantagens da criopreservação seminal, destacam-se a otimização do uso de garanhões com comprovada superioridade genética, pela possibilidade do armazenamento de sêmen mesmo fora da estação de monta e a quebra das barreiras geográficas, que torna possível a remessa deste material para qualquer parte do mundo. Contudo, o processo de congelação de sêmen causa danos à célula espermática, sendo a peroxidação lipídica e o estresse oxidativo, ocasionada pela produção anormal de espécies reativas de oxigênio (EROs), as principais injúrias. Desta maneira, para se obter uma melhor qualidade seminal após a descongelação, é necessário adicionar aos diluentes seminais elementos que desempenhem função antioxidante, visando conter o aumento dos níveis dos agentes oxidantes. Coenzima Q10 (CoQ10) é um agente lipossolúvel promotor de energia, tendo como principal função transportar prótons e elétrons no processo de síntese de ATP na membrana mitocondrial interna, através da cadeia de transporte de elétrons. Ainda, a CoQ10 atua como um potente antioxidante em diversos sistemas biológicos, tais como, lipoproteínas e membranas, protegendo-os contra a oxidação, inibindo a formação de hidroperóxidos e, consequentemente, prevenindo a peroxidação lipídica. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a ação da coenzima Q10 (CoQ10) no espermatozoide de garanhões resistentes (RC) e sensíveis (SC) a congelação. Cada ejaculado (n=24) foi dividido em nove tratamentos e submetido à congelação, sendo a CoQ10 adicionada ao diluente de centrifugação, nas concentrações de 25 μmol/L (CE25), 50 μmol/L (CE50), 75 μmol/L (CE75) e 100 μmol/L (CE100), ou ao de congelação nas mesmas concentrações, 25 μmol/L (FE25), 50 μmol/L (FE50), 75 μmol/L (FE75) e 100 μmol/L (FE100). No grupo controle não houve adição da CoQ10 em nenhum dos meios diluentes. O processo de descongelação foi realizado à 37ºC/30 segundos (T0) e, para avaliação após estresse térmico, 37ºC/30minutos (T30). Posteriormente, as células espermáticas foram avaliadas quanto a cinética, integridade da membrana plasmática (IMP), desestabilização da membrana (NCAP), produção de espécies reativas ao oxigênio (H2O2 e O2 -), atividade mitocondrial e peroxidação lipídica. De acordo com os resultados, não houve diferença significativa entre os grupos, tanto no momento T0 quanto no momento T30, para os garanhões classificados como RC (p>0,05), com exceção da peroxidação lipídica, que em ambos os momentos, os grupos tratados apresentaram valores menores quando comparados ao controle (p<0,05). Já para os animais classificados como SC, houve uma superioridade das células espermáticas tratadas com a CoQ10 (p<0,05), com exceção da concentração de O2 - e potencial mitocondrial no T0, em que não apresentaram diferença entre os grupos (p>0,05). As células espermáticas do grupo CE75 se mostraram superiores aos parâmetros avaliados em relação aos demais grupos. Podemos concluir que a CoQ10 promove uma diminuição do estresse oxidativo e maior viabilidade ao espermatozoide de garanhões sensíveis ao processo de congelação espermática. / Among the advantages of seminal cryopreservation, the optimization of using stallions with proven genetic superiority, the possibility of storing semen even outside the breeding season and the breaking of geographical barriers, which makes it possible to send this material to any part of the world can de highlighted. However, the process of semen freezing causes damage to the sperm cell, and the abnormal production of reactive oxygen species is caused by lipid peroxidation of the sperm membrane, which is a major cause of such injury. Thus, in order to obtain a better seminal quality after thawing, it is necessary to add to the diluents substances that play an antioxidant function, limiting levels of the oxidizing agents increase. Coenzyme Q10 is a liposoluble energy-promoting agent, whose main function is to transport protons and electrons in the process of ATP synthesis in the internal mitochondrial membrane, through the electron transport chain. Furthermore, CoQ10 (ubiquinol) acts as a potent antioxidant in several biological systems, such as lipoproteins and membranes, protecting them against oxidation, inhibiting the hydroperoxides formation and, consequently, preventing lipid peroxidation. In this way, the objective of this study was to discuss how CoQ10 may help reducing the oxidative stress caused by seminal cryopreservation process. This form, the objective of this study was to evaluate the antioxidant action of coenzyme Q10 (CoQ10) on spermatozoa from good freezers (GF) and bad freezers (BF) stallions. Each ejaculate (n=15) was divided into nine treatments and subject to freezing process. The CoQ10 was added to centrifugation extender at concentrations 25 μmols/L (CE25), 50 μmols/L (CE50), 75 μmols/L (CE75) and 100 μmols/L (CE100), or at the freezer extender at the same concentrations, 25 μmols/L (FE25), 50 μmols/L (FE50), 75 μmols/L (FE75) and 100 μmols/L (FE100). In the control group there was no addition of CoQ10 in any of the extenders. The thawing process was performed at 37ºC/30 seconds (T0) and at 37ºC/30 minutes (T30). Posteriorly, sperm cells were evaluated for kinetics, plasma membrane integrity (PMI), membrane desestabilization (NCAP), reactive oxygen species production (H2O2 and O2 -), mitochondrial activity and lipid peroxidation. According to the results, there was no significant difference between the groups, as well T0 moment as T30 moment, for good freezer stallions (p>0.05). However for bad freezer stallions, there was a superiority of the sperm cells that came into contact with CoQ10 (p <0.05), except for the O2 - concentration and mitochondrial potential (T0) in which there was no significant difference between the Groups (p> 0.05). The sperm cells of the CE75 group were superior in the evaluated parameters in relation to the other groups. We can conclude that CoQ10 promotes a reduction of oxidative stress and greater viability to the spermatozoa from bad freezer stallions at the freezing process.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-05Bitstream added on 2014-06-13T18:39:01Z : No. of bitstreams: 1 zorzetto_mf_me_botfmvz.pdf: 1249993 bytes, checksum: b41bc94bf30e1281fc157ffc76b1e023 (MD5) / Os programas que visam aumentar a incorporação de biotecnologias reprodutivas a fim de se obter um incremento genético dos rebanhos bubalinos, visando aumentar a produtividade dos mesmos. No entanto, a melhoria do sistema produtivo e reprodutivo será possível mediante a utilização de tecnologias que viabilizem o melhor aproveitamento dos animais, como a congelação de sêmen. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a qualidade das amostras seminais de búfalos diluídas em três meios diferentes: Botu-bov® (BB), água de coco em pó (ACP-111) e Tris-gema antes e após a criopreservação utilizando o mesmo protocolo. No presente estudo foram utilizados 4 touros bubalinos para colheitas seminais utilizando vagina artificial, os ejaculados foram diluídos com BB, Tris-gema e ACP-111. O sêmen fresco foi analisado quanto ao seu volume, aspecto, cor, concentração (câmara de Neubauer), morfologia realizada por microscopia de interferência diferencial (DIC), cinética pelo sistema CASA e pela microscopia de epifluorescência. Na pós-congelação as amostras foram avaliadas pelo CASA, citometria de fluxo (membrana plasmática, acrossoma, lesões semelhantes à capacitação e fragmentação do DNA) e pela microscopia de epifluorescência. Os diluentes BB e Tris-gema apresentaram melhores resultados para congelação do sêmen de búfalos, em relação ao meio ACP-111 (BB 58,59%; Tris-gema 52,64% e ACP-111 36,94% para MT). Porém o diluente BB demonstrou superioridade em relação à motilidade progressiva espermática (MP para BB, Tris-gema e ACP-111, 47,56%; 40,39% e 29,59% respectivamente), menor porcentagem de índice de fragmentação de DNA (0,85%) e de espermatozoides lesados (24,97%). Assim sendo, mediante o protocolo do presente estudo deduz-se que o BB apresenta superioridade na congelação de sêmen de búfalos, sendo este a melhor opção de diluente para essa biotecnologia / These programs aim to increase the incorporation of reproductive biotechnologies in order to obtain a genetic increment of buffalo herds to increase their productivity. However, improving the productive and reproductive system will be possible through the use of technologies that enable the best use of animals, such as semen freezing. Therefore, this study aimed to evaluate the quality of semen samples of buffalo diluted in three different extenders: Botu-bov ® (BB), powdered coconut water (ACP-111) and Tris-yolk before and after cryopreservation using the same protocol. In the present study was used four buffalo bulls for seminal collection using artificial vagina. The ejaculates were diluted with BB, Tris-yolk and ACP-111. The fresh semen was analyzed for volume, appearance, color, concentration (Neubauer chamber), morphology performed by differential interference microscopy (DIC), the kinetic by CASA system and membrane integrity by epifluorescence microscopy. In the post-freeze moment the samples were evaluated by CASA, flow cytometry (plasma membrane, acrosome, lesions similar to capacitation and DNA fragmentation) and by epifluorescence microscopy. The extenders BB and Tris-yolk showed superior results for semen freezing of buffalo in relation to the ACP-111 (BB 58,59%; Tris-yolk 52,64% e ACP-111 36,94% for MT). However the diluent BB demonstrated superiority for progressive sperm motility (MP for BB, Tris-yolk and ACP-111, 47,56%; 40,39% e 29,59% respectiblely), lower percentage of DNA fragmentation (0,85%) and lower percentage of damaged sperm (24,97%). Thus, through the protocol of this study it shows that the BB has superiority in semen freezing of buffalo, appearing to be the best option of extender for this biotechnology

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-20Bitstream added on 2014-06-13T19:38:28Z : No. of bitstreams: 1 guardieiro_mm_me_botfmvz.pdf: 504146 bytes, checksum: 07979740dad67abc78d3a31a2e3dde43 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo do presente trabalho foi avaliar a resposta superovulatória, a produção embrionária e a resistência à criopreservação através de congelação ou vitrificação de embriões de novilhas Nelore suplementadas com gordura protegida ruminal (Megalac-E®). Foram utilizadas 40 novilhas da raça Nelore mantidas a pasto, divididas em dois grupos experimentais de acordo com o tipo de suplementação fornecido (G = concentrado com gordura protegida ruminal e C = suplementação controle, sem adição de gordura). Os suplementos foram formulados para serem isoenergéticos e isoprotéicos. O delineamento foi do tipo cross-over com 67 (primeira repetição) e 70 d (segunda repetição) de duração. Após 50 d de suplementação dietética, foi realizada a sincronização da emergência da onda para iniciar o protocolo de superovulação. Os embriões colhidos foram congelados ou vitrificados e avaliação de desenvolvimento embrionário in vitro foi realizada posteriormente. Não houve diferença (P > 0,10) entre os Grupos G e C em relação à resposta superestimulatória, ao número total de estruturas, embriões congeláveis, degenerados e ovócitos não fecundados colhidos. Apesar do grupo C ter mostrado maior reposta superovulatória que o G (15,7 ± 1,2 vs 18,0 ± 1,3 CL; P = 0,06), os embriões do Grupo C apresentaram maior taxa de eclosão, independentemente do método de criopreservação, às 48 h (33,1 ± 4,0%; n = 148 vs 17,3 ± 3,3%; n = 137; P = 0,009) e às 72 h (44,3 ± 4,2%; n = 148 vs 30,9 ± 4,0%; n = 137; P = 0,04) de cultivo do que os do grupo G. Além disso, os embriões vitrificados e congelados apresentaram taxas similares de eclosão (P > 0,10). Nas condições do presente estudo, o suplemento composto com gordura protegida não afetou a resposta superestimulatória e a produção de embriões, e os embriões do Grupo Controle foram mais tolerantes à criopreservação. / The aim of the current study was to evaluate the superovulatory response and embryo production, as well as embryo resistance to cryopreservation through freezing or vitrification of embryos from Nellore heifers supplemented with rumen-protected fat, Megalac-E®. Forty heifers kept in pasture were randomly divided into two experimental groups according to supplement source (G = supplement with rumen-protected fat and C = Control, without fat supplementation). The supplements were formulated to be isocaloric and isoproteic. Each female underwent both treatments in a cross-over design with approximately 67 d (first replicate) and 70 d (second replicate). After 50 d of feeding, the emergence of the wave was synchronized with the aid of hormones to iniciate the superovulation protocol. The embryos recovered were frozen or vitrified and subsequently in vitro embryo development evaluation was accomplished. There was no difference between G and C groups (P > 0.10) regarding superstimulatory response, number of total embryos/ova, viable embryos, degenerate embryos, or unfertilized oocytes recovered. However, group C had a greater superovulatory response than G (15.7 ± 1.2 vs 18.0 ± 1.3 CL; P = 0.06). Group C embryos presented greater hatching rate, independently of the cryopreservation method, at 48 h (33.1 ± 4.0%; n = 148 vs 17.3 ± 3.3%; n = 137; P = 0.009) and at 72 h (44.3 ± 4.2%; n = 148 vs 30.9 ± 4.0%; n = 137; P = 0.04) of in vitro culture. Moreover, vitrified and frozen embryos had similar hatching rate (P > 0.10). Under the conditions of the present study, supplementation with protected fat did not affect superstimulatory response, quantity or quality of embryos. However embryos from the Control group were more tolerant to cryopreservation.