Sabe-se que a criopreservação do sêmen provoca uma perda significativa na qualidade espermática. Apesar de diversos estudos visando à melhora na qualidade do sêmen pós-descongelamento, é de consenso geral que a gema de ovo apresenta uma significante capacidade em evitar as crio-injúrias. No entanto, a grande variação na sua composição, assim como o risco potencial para a contaminação do diluidor, caso certos contaminantes estejam no produto in natura, são empecilhos para sua utilização para a exportação do sêmen, assim como sua utilização em humanos. Deste modo, estudos visando substituir a gema de ovo por produtos quimicamente definidos e de origem não-animal, são de extrema importância. Neste contexto, a lecitina da soja, por possuir uma fração de lipoproteína de baixa densidade semelhante à encontrada na gema de ovo, pode ser uma alternativa interessante. O presente estudo visa comparar diluidores a base de lecitina de soja e aqueles contendo gema de ovo utilizados rotineiramente para a refrigeração e criopreservação do sêmen canino. Para isto, foi utilizado o sêmen de 12 cães adultos, que foi refrigerado e criopreservado em diluidores a base de gema de ovo (OVO) e a base de lecitina de soja (LEC) em diferentes concentrações (0,01; 0,05 e 0,1%) e apresentações (FP40, 8160 e Solec F). O sêmen foi avaliado após refrigeração (2, 24, 48, 72, 96 e 120 horas; Experimento 1) e após criopreservação (pós refrigeração, pós glicerolização e pós descongelação; Experimento 2) através da análise convencional do sêmen (i.e., motilidade - CASA) e funcionais (i.e., integridade de membrana - eosina/nigrosina; integridade de acrossomo - Fast Green / Rosa Bengala; atividade mitocondrial - 3´3 Diaminobenzidina; fragmentação do DNA - SCSA; susceptibilidade ao estresse oxidativo - substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico). Os resultados do Experimento 1 indicaram que, semelhante ao ovo, todas as lecitinas na concentração 0,01% foram capazes de manter a motilidade em torno de 50% por até 72 horas. Após 96 horas, o diluidor Solec F apresentou melhor resultado em relação ao ovo na atividade mitocondrial, e após 120 horas a concentração 0,01%, apresentou maior motilidade do que o ovo (30,00 ± 10,69; 8,33 ± 1,84, respectivamente). No sêmen criopreservado (Experimento 2), as menores concentrações de lecitina apresentaram resultados semelhantes ao ovo tanto na motilidade quanto na atividade mitocondrial. Os resultados indicam que a lecitina pode ser uma boa alternativa à gema de ovo para a refrigeração e criopreservação do sêmen canino. / Semen cryopreservation, an essential step on biotechnologies applied to reproduction, is known to induce significant loss on sperm quality. Despite several studies aiming to improve post-thaw quality, it is generally agreed that egg yolk is the most effective in protecting sperm against cryo-injuries. However, the considerable variation on egg yolk composition as well as the potential risk of disseminating diseases when used in natura, are obstacles to semen exportation as well as the use in human. Therefore, studies aiming to substitute the egg yolk for chemically defined components or animal free products are extremely important. In this context, soy lecithin, which contains a fraction of low density lipoprotein, appears to be an interesting alternative. Thus, the present study aims to compare semen extenders containing soy lecithin or egg yolk on dog semen cryopreservation and refrigeration. Towards this aim, semen of 12 adult dogs were be refrigerated and cryopreserved in Tris-Fructose-Citric acid extenders with egg yolk (OVO) or soy lecithin (LEC; in different concentrations - 0,01; 0,05; 0,1% and presentations - FP40; 8160; Solec F). Semen was evaluated after chilling (2, 24, 48, 72, 96 and 120 hours; Experiment 1) and after cryopreservation (post refrigeration, post-glycerolization, and post-thaw; Experiment 2) for routine semen analysis (e.g., motility, CASA) and functional tests (e.g., membrane integrity - eosin/nigrosin; acrosome integrity - fast green/Bengal rose; mitochondrial activity - 3´3 diaminobenzidine; DNA fragmentation - SCSA; susceptibility to oxidative stress - thiobarbituric acid reactive substances). Results were statistically analyzed using the SAS System for Windows. Results of experiment 1 indicate that, similar to the egg yolk, all types of lecithin used in the 0.01% concentration, were able to maintain sperm motility around 50% for 72 h. After 96 h, the extender containing the lecithin Solec F showed better results regarding mitochondrial activity when compared to the egg yolk. Furthermore, after 120 h, the same extender with the 0.01% concentration, showed higher motility when compared to the egg yolk (30.00 ± 10.69 and 8.33 ± 1.84%, respectively). On the other hand, for the cryopreserved samples (Experiment 2), lower concentrations of lecithin showed similar results for mitochondrial activity and motility when compared to the egg yolk. Results found in the present study indicate that soy lecithin may be a good alternative to substitute the egg yolk for both refrigeration and cryopreservation of dog semen.

A expansão desordenada do processo de urbanização e da malha rodoviária sem a construção de corredores ecológicos que permitam a transposição segura de várias espécies de animais silvestres contribui para os elevados índices de mortalidade observados na atualidade e constitui uma ameaça para o declínio populacional de espécies, como o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous). Estima-se que o número de animais vitimados por atropelamentos chegue a aproximadamente 450 milhões de animais/ano nas diversas espécies, sendo: 400 milhões de pequenos vertebrados, 3 milhões de grandes vertebrados e aproximadamente 47 milhões de vertebrados de médio porte, a partir do estabelecimento de uma taxa média de 1,7 milhões de quilômetros à malha rodoviária do território brasileiro, levando-se em consideração a ampla diferença entre rodovias e estradas de asfalto e terra, pertencentes às esferas federal, estadual, e municipal. Uma estratégia para a conservação ex situ é o estudo da biologia da reprodução da espécie Cerdocyon thous é a criopreservação de seu patrimônio genético através da formação de um Banco de Germoplasma Animal, onde se contemplou o estudo do sistema reprodutor feminino de cinco espécimes por descrição morfológica e ultraestrutural, cultivo e criopreservação celular (fibroblastos). Foram utilizadas 7 (sete) fêmeas de Cerdocyon thous, (n=7), das quais 2 (duas) eram vítimas de atropelamento (Km 215 da Rodovia Anhanguera, Pirassununga - SP), tendo seus sistemas reprodutores dissecados e analisados macroscopicamente. Os respectivos animais foram encontrados em datas distintas em período que compreende os meses de janeiro a julho do ano de 2015 com sinais de evisceração e um destes apresentava avançado estágio de decomposição. Foi realizado o estudo biométrico dos animais, onde se constatou que as fêmeas encontradas eram adultas. Os achados foram compilados por meio de técnicas histológicas (Hematoxilina-Eosina, Tricrômico de Massom, Reativo de Schiff ou \"PAS\" e Alcian Blue) e microscopia eletrônica de varredura. A partir da observação macroscópica do sistema reprodutor feminino da espécie em questão, constatou-se que o formato dos ovários apresenta forma similar a um grão de feijão e tubas uterinas com comprimentos variáveis entre 5 a 8 cm para os espécimes analisados. Constatou-se também, a presença de um útero bicornuado com aproximadamente 3 cm de comprimento e cornos uterinos compridos e estreitos (9 a 11 cm de comprimento); Como já observado em estudos realizados em outras espécies (domésticas e silvestres), a cérvix dos espécimes de Cerdocyon thous analisados faz comunicação entre o útero e a vagina. A vagina apresenta musculatura alongada e circular e a vulva uma conformação anatômica densa com clitóris bastante pronunciado. Microscopicamente, foram observados que os ovários apresentavam folículos primordiais formados por um ovócito e por células foliculares achatadas, bem como a presença de folículos primários unilaminares, este último constituído por um ovócito envolvido por uma camada de células da granulosa. A análise por microscopia eletrônica de varredura evidenciou a superfície ovariana, com característica irregular. As tubas uterinas apresentaram-se com epitélio de revestimento constituído de células ciliadas e células secretoras não ciliadas. Através de análise por microscopia eletrônica de varredura, foi possível verificar que parte da parede da tuba uterina apresentou uma mucosa intensamente \"pregueada\". Microscopicamente, o útero apresentou uma parede relativamente espessa e, externamente uma camada serosa, constituída de mesotélio e tecido conjuntivo e, dependendo da porção do órgão (adventícia), constituída de tecido conjuntivo sem revestimento de mesotélio e microscopia eletrônica de varredura que evidenciou a superfície luminal, ilustrando a disposição dobrada do endométrio e a presença de fibras de músculo liso. A cérvix se apresentou com epitélio colunar simples, secretor de muco e por análise de microscopia eletrônica de varredura, foram observadas poucas fibras de músculo liso. Quanto à vagina, foi observado epitélio pavimentoso estratificado sobre um tecido conjuntivo denso, onde se constatou por microscopia eletrônica de varredura, a região de transição entre a cérvix e a vagina, onde se evidenciou a lâmina própria da mucosa vaginal, constituída por um tecido conjuntivo frouxo e, mais externamente, uma parede densa, constituída por uma camada muscular composta de fibras musculares lisas. A vulva e o clitóris foram observados recobertos por um epitélio pavimentoso estratificado com uma delgada camada de células queratinizadas na superfície. No que diz respeito à criação de uma linhagem celular (fibroblastos) para o enriquecimento de banco de germoplasma, os resultados demonstraram que as células de Cerdocyon thous apresentaram uma baixa capacidade clonogênica, especialmente quando comparadas ao cão doméstico. Por serem espécimes silvestres de histórico desconhecido (idade, hábitos alimentares), tais fatores poderiam implicar no tamanho dos telômeros das células (fibroblastos) e, consequentemente, ser um impedimento para uma satisfatória proliferação celular. Assim, o presente estudo teve caráter preservacionista, visando à conservação em longo prazo dos recursos genéticos desta espécie pertencente aos biomas brasileiros, sendo de grande relevância e os achados aqui contidos, um ponto de partida para a realização e continuidade de novas pesquisas com abordagem sobre a espécie em questão. / The disorderly expansion of the urbanization process and the road network without building ecological corridors that allow for the safe implementation of various species of wild animals contributes to the high mortality rates observed today and is a threat to the population decline of species such as the Creb-eating fox (Cerdocyon thous). It is estimated that the number of animals victims of road kill reach approximately 450 million animals / year in different species, of which: 400 million small vertebrates, 3 million of large vertebrates and approximately 47 million medium-sized vertebrates, from establishment of an average rate of 1.7 million kilometers of road network of Brazil, taking into account the wide difference between highways and asphalt roads and land belonging to the federal, state, and municipal. A strategy for ex situ conservation is the study of Cerdocyon thous species reproductive biology is cryopreservation of their genetic heritage through the formation of an Animal Germplasm Bank, where he contemplated the study of the female reproductive system of five specimens for morphological description and ultrastructural, cell culture and cryopreservation (fibroblasts). They used seven (7) female Cerdocyon thous (n = 7), of which two (2) were victims of running over (Km 215 of Anhanguera Highway, Pirassununga - SP) and their reproductive systems dissected and analyzed macroscopically. Their animals were found on different dates in a period comprising the months of January to July 2015 with evisceration signals and one of these had advanced stage of decomposition. biometric study of animals, which demonstrated that adult females were found, was performed. The findings were compiled by histological techniques (hematoxylin-eosin, Masson\'s Trichrome, Schiff Reactive or \"PAS\" and Alcian Blue) and scanning electron microscopy. From macroscopic observation of the female reproductive system of the species concerned, it was found that the shape of the ovaries features similar to a grain of beans and uterine tubes with lengths ranging from 5-8 cm for the analyzed specimens. It was also found the presence of a bicorn uterus approximately 3 cm and narrow uterine horns (9-11 cm); as noted in studies in other species (domestic and wild), the cervix of Cerdocyon thous specimens analyzed is communication between the uterus and vagina. The vagina has lengthened and circular muscle and the vulva a dense anatomical conformation quite pronounced clitoris. Microscopically, it was observed that the ovaries had primordial follicles formed by a flattened oocyte and follicular cells, as well as the presence of unilaminares primary follicles, the latter consisting of an oocyte surrounded by a layer of granulosa cells. Analysis by scanning electron microscopy revealed the ovarian surface with irregular feature. The oviducts presented with epithelium composed of ciliated and non-ciliated secretory cells. Through analysis by scanning electron microscopy, we found that part of the oviduct wall showed a mucosa intensely \"pleated\". Microscopically, the uterus showed a relatively thick wall and externally a serous layer consisting of mesothelium and connective tissue and, depending on the body portion (adventitious), composed of connective tissue without mesothelium coating and scanning electron microscopy which showed the surface luminal illustrating the folded disposition of the endometrium and the presence of smooth muscle fibers. The cervix is presented with simple columnar epithelium, mucus secreting and analytical scanning electron microscopy; a few smooth muscle fibers were observed. As the vagina was observed stratified squamous epithelium on a dense connective tissue, where it was found by scanning electron microscopy, the transition region between the cervix and the vagina, where it showed the lamina propria of the vaginal mucosa, consisting of a connective tissue loose and more externally a thick wall consisting of a muscular layer composed of smooth muscle fibers. The vulva and clitoris were observed covered by a stratified epithelium with a thin layer of keratinized cells on the surface. As regards the establishment of a cell line (fibroblasts) to the genebank enrichment, the results showed that cells had a lower Cerdocyon thous clonogenic capacity, especially when compared to the domestic dog. Being wild specimens of unknown history (age, diet), such factors could lead to the size of the telomeres of cells (fibroblasts) and thus be a hindrance to a satisfactory cell proliferation. Thus, the present study was preservationist character, aiming at long-term conservation of genetic resources of the species belonging to the Brazilian biomes, being of great importance and the findings contained herein, the starting point for the implementation and continuity of new research approach the species in question.

OBJETIVO: Comparar dois meios de congelamento para sêmen: o comercialmente disponível Meio de Congelamento TEST Yolk Buffer-Irvine Scientific - USA (TYB) e o crioprotetor sintético suplementado com fosfatidilcolina (PC) e antioxidante L-acetil-carnitina (ANTIOXPC - delineado pela Invitra Tecnologia de Reprodução Assistida - Brasil) em relação a motilidade progressiva (PR) e índice de fragmentação do DNA (IFD) em amostras de sêmen obtidas de homens com parâmetros seminais alterados. DESENHO: Ensaio clínico de nãoinferioridade. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram incluídas amostras de sêmen com parâmetros seminais alterados (astenozoospermia) de 58 voluntários no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. As amostras de sêmen foram submetidas à análise antes e após a criopreservação. A motilidade dos espermatozoides foi avaliada pelo espermograma e a fragmentação do DNA espermático foi analisada pela técnica transferase-mediated dUTP nick-end labelling (TUNEL). Antes da criopreservação, todas as amostras de sêmen foram divididas e randomizadas para receber os crioprotetores TYB ou ANTIOX-PC, congelados no período mínimo de 30 dias e descongelados. Uma análise exploratória dos dados foi realizada através de medidas de posição central e dispersão. O teste t pareado foi usado para comparar os grupos. Comparações entre os dois meios, ANTIOX-PC e TYB, e sêmen fresco foram realizadas através de contrastes ortogonais, utilizando o modelo de regressão linear de efeitos mistos. Este modelo foi implementado no programa SAS 9.3 considerando o PROC MIXED. RESULTADOS: A motilidade PR (P = 0,78) e o IFD (P = 0,06) não foram diferentes quando comparados os meios ANTIOX-PC (12,40 ± 11,49 e 13,33 ± 10,54) e o TYB (12,09 ± 11,11 e15,83 ± 11,04), respectivamente. Esses dados mostraram que o crioprotetor sintético delineado não foi inferior na proteção dos espermatozoides comparado com o meio TYB. Além disso, o ANTIOX-PC reteve taxas mais altas de motilidade total43,36 ± 26,77) do que o TYB (34,79 ± 22,86; P <0,0001) e reduziu significativamente as taxas de espermatozoides imóveis (56,64 ± 26,77; P <0,0001) em relação ao TYB (65.00 ± 23.00).CONCLUSÃO: O meio ANTIOX-PC não pode ser considerado menos efetivo que o TYB em relação à motilidade PR e ao IFD. Parâmetros cinéticos observados em espermatozoides pósdescongelamento do diluente ANTIOX-PC demonstraram o impacto positivo do tratamento com fosfolipídios/antioxidantes na criotolerância espermática humana na ausência de aditivos animais. / OBJECTIVE: To compare two sperm freezing media: commercially available Freezing Medium TEST Yolk Buffer-Irvine Scientific - USA (TYB) and a synthetic cryoprotectant supplemented with phosphatidylcholine (PC) and antioxidante L-acetyl-carnitine (ANTIOXPC - designed by Invitra Assisted Reproduction Technology - Brazil) in relation to progressive motility and sperm DNA fragmentation index (DFI) in sêmen samples obtained from men with altered seminal parameters. DESIGN: Non-inferiority clinical trial. MATERIALS AND METHODS: Were included semen samples with altered seminal parameters (asthenospermia) from 58 volunteers at the Clinical Hospital of Ribeirao Preto Medical School, University of São Paulo. Semen samples were subjected to analysis both before and after cryopreservation. The sperm motility was evaluated by the spermogram and the sperm DNA fragmentation was analyzed by the transferase-mediated dUTP nick-end labeling technique (TUNEL). Before cryopreservation, all semen samples were divided and randomized to receive the cryoprotectants TYB or ANTIOX-PC, frozen and thawed after 30 days. An exploratory data analysis was carried out through measures of central position and dispersion. The paired t-test was used to compare the groups. Comparisons between the two media ANTIOX-PC and TYB, and fresh semen were performed through orthogonal contrasts using the mixed effects linear regression model. This model was implemented in the SAS 9.3 program considering PROC MIXED. RESULTS: Progressive motility (P = 0.78) and DFI (P = 0.06) were not different when comparing ANTIOX-PC (12.40 ± 11.49; and 13,33 ± 10.54) and TYB (12.09 ± 11.11 and 15.83 ± 11.04), respectively. These data showed that the synthetic cryoprotectant designed was not inferior in sperm protection compared to the TYB medium. In addition, ANTIOX-PC retained higher rates of overall motility (43.36 ± 26.77)than TYB (34.79 ± 22.86; P<0,0001) and significantly reduced the immotile sperm rates (56.64 ± 26.77; P<0,0001) when compared with TYB (65.00 ± 23.00). CONCLUSION: ANTIOX-PC medium can not be considered less effective than TYB relative to progressive motility and IFD. Kinetic parameters observed in post-thaw sperm from ANTIOX-PC extender demonstrated the positive impact of the phospholipid/antioxidant treatment on human sperm cryotolerance in the absence of animal aditives.

Submitted by Helena Bejio (helena.bejio@unioeste.br) on 2019-03-23T00:12:41Z No. of bitstreams: 2 Dissertação EDER FINAL (2019).pdf: 778784 bytes, checksum: 5ae23ac0d1024f4f386fe5958b48a297 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2019-03-23T00:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação EDER FINAL (2019).pdf: 778784 bytes, checksum: 5ae23ac0d1024f4f386fe5958b48a297 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-08-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of this study was to evaluate the effects of the inclusion of crude glycerin on the diet of jundia (Rhamdia quelen) on growth, seminal and spermatic characteristics, blood parameters and tissue composition. The animals were distributed in completely randomized experimental design, consisting of five treatments and four replications. The treatments consisted of isoproteic and isoenergetic rations containing 30 % of digestible protein (PD) and 3.000 kcal of digestible energy (ED).kg-1 of ration and five levels of inclusion of crude glycerin in the proportions of 0, 4, 8, 12 and 16 %. 12 months after the beginning of the experiment, the reproductive parameters of the males were evaluated, as well as the integrity of the sperm DNA by the comet assay method. Eight males from each experimental unit were submitted to blood collection for quantification of levels of calcium, triglycerides, plasma glucose, total proteins, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, alkaline phosphatase, total cholesterol erythrocyte DNA integrity. Afterwards, all males were submitted to euthanasia for dissection and individual measurement of weights of the liver, gonads and viscera to evaluate the zootechnical, somatic parameters and analysis of organ and tissue centesimal composition. There was an increase (p < 0,05) in the concentration of spermatozoa in the animals fed the rations containing the highest level of crude glycerin. The other seminal and sperm parameters were not influenced. Among the blood parameters, levels of total cholesterol, total protein and calcium were influenced (p < 0,05), total cholesterol and total protein presented higher values with 8 % inclusion of crude glycerin in the diet, whereas calcium decreased with 16 % inclusion of crude glycerin. Zootechnical performance was not influenced. In the evaluation of centesimal composition, there was influence (p < 0,05) on muscle dry matter, muscle ashes and crude protein of the muscle, viscera and gonads. Dry matter and muscle ashes, gross protein of the viscera and gonads increased the concentrations with the addition of crude glycerin in the rations, whereas the crude protein concentration of the muscle decreased with the presence of crude glycerin in the diets. Therefore, it is recommended to use this by-product as a substitute for maize in the diet of jundia breeders, since it does not present negative effects and still benefits their reproductive performance. / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da inclusão da glicerina bruta nas rações de reprodutores de jundiá (Rhamdia quelen) sobre o crescimento, características seminais e espermáticas, parâmetros sanguíneos e composição centesimal de tecidos. Os animais foram distribuídos em um delineamento experimental inteiramente casualizado, composto por cinco tratamentos e quatro repetições. Os tratamentos foram constituídos por rações isoprotéicas e isoenergéticas contendo 30 % de proteína digestível (PD) e 3.000 kcal de energia digestível (ED).kg-1 de ração e cinco níveis de inclusão de glicerina bruta nas proporções de 0, 4, 8, 12 e 16 %. Após 12 meses do início do experimento, foram avaliados os parâmetros reprodutivos dos machos e a integridade do DNA de espermatozoides pelo método ensaio cometa. Oito machos de cada unidade experimental foram submetidos à coleta de sangue para quantificação dos níveis plasmáticos de cálcio, triglicerídeos, glicose, proteínas totais, aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase, fosfatase alcalina e colesterol total. Também foi avaliada a integridade do DNA de eritrócitos. Em seguida, todos os machos foram submetidos à eutanásia para dissecação e mensuração individual dos pesos do fígado, gônadas e vísceras para avaliação dos parâmetros zootécnicos e avaliação da composição centesimal de órgão e tecidos. Houve aumento (p < 0,05) na concentração de espermatozoides nos animais alimentados com rações contendo o maior nível de glicerina bruta. Os demais parâmetros seminais e espermáticos não foram alterados (p > 0,05). Dentre os parâmetros sanguíneos, o colesterol total e a proteína total apresentaram maiores (p < 0,05) valores em animais alimenados com rações contendo 8 % de glicerina bruta, enquanto que o cálcio diminuiu (p < 0,05) nos animais alimentados com 16 %. O desempenho zootécnico não foi alterado (p > 0,05). A matéria seca e cinzas do músculo e a proteína bruta nos testículos aumentaram (p < 0,05) nos animais alimentados com rações contendo as maiores inclusões de glicerina, enquanto que os teores de proteína bruta do músculo diminuíram (p < 0,05). Conclui-se que reprodutores de jundiá alimentados com rações contendo maior nível de inclusão de glicerina bruta apresentaram alterações metabólicas que levaram ao aumento da deposição de proteína nos testículos e ao aumento da concentração espermática, e que as rações não apresentaram efeito negativo sobre a saúde dos animais.

Com os processos de preservação do sêmen, os espermatozoides sofrem danos devido à indução de alterações estruturais e funcionais na membrana e, aliada a estrutura anatômica do cérvix da ovelha, repercute na redução de fertilidade após a inseminação artificial. Muitos protocolos de congelação e de refrigeração aliados a inúmeros diluentes, vêm sendo estudados, a fim de diminuir os danos causados a essas células e aumentar sua capacidade fertilizante. Para otimizar os processos de congelação e de refrigeração, os objetivos deste estudo foram determinar (1) a influência do método de congelação na motilidade, viabilidade, potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos acrossomais do semen ovino criopreservado e (2) a influência de três diluentes comerciais na motilidade, viabilidade, potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos acrossomais do sêmen ovino refrigerado. Doze ejaculados foram coletados, diluídos e congelados utilizando (A) uma curva manual de congelação (em vapor de nitrogênio liquido) e (B) um congelador programável (CL-8800, Cryologic Freeze Control®). Na curva A, as amostras foram refrigeradas e congeladas à 30°C/min. Na curva B, houve uma redução de temperatura de 20°C até -50°C durante 37min. Imediatamente após as curvas de criopreservação, as amostras foram submersas em nitrogênio líquido (-196ºC). Para o descongelamento, as palhetas foram submetidas à 37°C por 20seg e analisadas. Para os protocolos de refrigeração, o sêmen diluído em Botubov®, Bovimix® e TYB® foi armazenado à 5°C e à 15°C, e avaliado em 0, 24, 48 e 72h pós coleta. As análises de viabilidade e potencial de membrana mitocondrial (MMP) foram realizadas por citometria de fluxo, e a motilidade e os defeitos acrossomais foram avaliados microscopicamente. Motilidade (29%), viabilidade (18%) e MMP (26%) dos espermatozoides criopreservados com o diluente Bovimix® e a curva B foram significativamente (P<0,05) superiores do que todos os outros tratamentos. As amostras refrigeradas e diluídas com o diluente Bovimix® apresentaram resultados superiores, tanto à 5°C quanto à 15°C, para MMP (44% e 51%, respectivamente) e viabilidade (60% e 53%, respectivamente) 72h pós coleta, quando comparado com as amostras diluídas com Botubov® e TYB®. Em conclusão, os protocolos de congelação/descongelação e de refrigeração utilizados nestes experimentos, reduziram a motilidade, viabilidade, MMP e aumentaram os defeitos acrossomais quando comparados com o sêmen fresco. Os protocolos de congelação/descongelação prejudicaram mais a função espermática quando comparado com os protocolos de refrigeração. Por fim, os resultados sugerem que as amostras espermáticas diluídas com o diluente Bovimix® causou menos danos às células espermáticas do que as amostras diluídas com os diluentes Botubov® e TYB®, tanto nos protocolos de congelação, quanto nos protocolos de refrigeração. / The process of sperm preservation damages spermatozoa due to induction of structural and functional changes in the membrane, and allied to the ewe cervix anatomy, reflects the reduction in fertility after artificial insemination. Many semen preservation protocols including freezing and cooling rates coupled with different extenders have been studied in order to reduce sperm cryo-damage, increase the fertilizing capacity and increase the time of storage. To improve freezing and cooling processes, the objectives of this study were to determine (1) the influence of freezing method on sperm motility, viability, mitochondrial membrane potential and defected acrosome of cryopreserved sperm and (2) the influence of three commercial extenders on the motility, viability, mitochondrial membrane potential and defected acrosome of liquid storaged and frozen-thawed sperm. Twelve semen samples were collected from two mature rams, pooled, and diluted in Botubov®, Bovimix® and TYB®, and frozen using (A) a manual freezing method (liquid nitrogen vapor) and (B) an automated programmable freezer (CL-8800, Cryologic Freeze Control®). For curve A, semen samples were maintained at 37°C and then cooled/frozen at 30°C/min. For curve B, the temperature reduced from 20°C to -50°C during 37min. Immediately, after cryopreservation curves, samples were plunged and stored into liquid nitrogen (-196ºC). Then, the straws were thawed at 37°C for 20sec, and analyzed. For cooling studies, pooled ram semen was diluted in Botubov®, Bovimix® and TYB®, stored at 5°C and at 15°C, and evaluated at 0, 24, 48 and 72 h post collection. For viability and mitochondrial membrane potential (MMP) assessments, semen samples were stained and analyzed by flow cytometry. Motility and defected acrosome assessments were analyzed microscopically. Motility (29%), viability (18%) and MMP (26%) of spermatozoa cryopreserved in Bovimix® coupled to curve B were significantly (P<0.05) higher than all other treated groups. Semen samples diluted with Bovimix® and stored at 5°C and at 15°C yielded better MMP (44% and 51%, respectively) than the samples diluted in Botubov® and in TYB®, and also showed higher viability characteristics at 5°C and at 15°C (60% and 53%, respectively) 72h post collection. In conclusion, freezing/thawing and cooling protocols used in these experiments reduced sperm motility, viability, MMP and increased the defects of acrosomes when compared to fresh semen. Freezing/thawing protocols harmed more spermatozoa function than cooling protocols. Furthermore, our results suggest that the semen samples diluted in the extender Bovimix® caused the least cellular injury than the samples diluted in Botubov® and in TYB® on freezing and on cooling protocols.

A coleta de sêmen da cauda do epidídimo é a última oportunidade de obter espermatozoides de garanhões valiosos, sendo que durante a criopreservação, a etapa de centrifugação é considerada um ponto crítico. A principal hipótese é que a centrifugação com coloides pode melhorar a qualidade dos espermatozoides coletados da cauda do epidídimo de garanhões. Para avaliação da hipótese foram realizados dois experimentos. O experimento um teve por objetivo avaliar o efeito da centrifugação com cushion e com coloide em camada única (SLC) na motilidade de sêmen do epidídimo de garanhões após a etapa de centrifugação. O experimento dois teve o objetivo de determinar o efeito da SLC prévio ao congelamento e após o descongelamento. Experimento 1) Oito garanhões foram submetidos à orquiectomia bilateral e o sêmen foi coletado da cauda dos epidídimos (n=16). Após a coleta, as amostras foram submetidas a três protocolos de centrifugação: Convencional (20 minutos a 600xg), cushioned (20 minutos a 900xg) e SLC (20 minutos a 300xg). Os pellets foram ressuspendidos e as amostras foram submetidas à avaliação laboratorial de motilidade e morfologia espermática. Experimento 2) Dez garanhões foram submetidos a orquiectomia bilateral e o sêmen foi coletado da cauda dos epidídimos (n=20). Para criopreservação, as amostras foram submetidas a: centrifugação convencional (20 minutos a 600xg), SLC prévio a criopreservação (SLC-Pre) (20 minutos a 300xg) e SLC após a criopreservação (SLC+) (20 minutos a 600xg seguidos de uma segunda centrifugação descrita após descongelamento). Os pellets foram ressuspendidos em diluente de congelamento, submetidos ao processo de congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento. Os grupos de 6 centrifugação convencional e SLC-Pre foram avaliados imediatamente após descongelamento. O grupo SLC+ foi descongelado e submetido à SLC (20 minutos a 300xg) e ressupendido em diluente de congelamento (SLC+F) ou resfriamento (SLC+C). A motilidade total e a motilidade progressiva das amostras foram avaliadas com análise computadorizada do movimento espermático. A morfologia foi avaliada com auxílio de microscópio com contraste de fase. Funcionalidade de mitocôndria, integridade de membrana e DNA foram avaliados com auxílio de microscópio de fluorescência. Os dados foram analisados por estatística descritiva, simple one-way ANOVA e Teste de Tukey. Experimento 1) a motilidade de espermatozoide submetidos à SLC (p<0,05) e cushion (p>0,05) foi superior do que os submetidos a centrifugação convencional. Experimento 2) SLC-Pre e SLC+F apresentaram maior motilidade total, enquanto SLC+F apresentou maior motilidade progressiva. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi maior em SLC-Pre e SLC+F. A funcionalidade de mitocôndria foi maior em todos grupos com SLC, enquanto a integridade de membrana foi maior em SLC-Pre. A centrifugação com coloides melhorou a qualidade de espermatozoides coletados da cauda do epidídimo de garanhões, tanto no momento prévio ao congelamento como após o descongelamento. / Epididymis cauda sperm recovery and cryopreservation are last opportunity to obtain spermatozoa from a valuable animal, even though during cryopreservation centrifugation step is considered as a critical point. It is hypothesized that colloidal centrifugation could enhance epididymal stallion sperm parameters. To evaluate this hypothesis two experiments were performed. In experiment one, the objective was to evaluate the effect of cushioned and Single Layer Centrifugation (SLC) on epididymal stallion sperm motility postcentrifugation. In experiment two, the objective was to determine the effect of SLC on epididymal stallion sperm quality pre-freezing and post-thawing. Experiment 1) Eight stallions were submitted to bilateral orchiectomy and the resulting epididymal cauda (n = 16) were flushed with semen extender. After harvesting, samples were submitted to three centrifugation protocols: conventional (20 minutes at 600xg), cushioned (20 minutes at 900xg), and SLC (20 minutes at 300xg). Pellets were resuspended, motility and morphology were evaluated. Experiment 2) Ten stallions were submitted to bilateral orchiectomy and epididymal cauda (n=20) were harvested. For cryopreservation, epididymal sperm were submitted to: conventional centrifugation (20 minutes at 600xg), Single Layer Centrifugation prior cryopreservation (SLC-Pre) (20 minutes at 300xg) and Single Layer Centrifugation after cryopreservation (SLC+) (20 minutes at 600xg followed by a second centrifugation described after thawing). Pellets were resuspended in freezing extender, submitted to cryopreservation process in liquid nitrogen and thawed. Conventional and SLC-Pre were evaluated immediately after thawing. SLC+ samples were thawed, submitted to SLC (20 minutes at 300xg) and the pellets were resuspended with freezing (SLC+F) and cooling extender (SLC+C). Total motility (TM) and progressive 8 motility (PM) were evaluated with computer-assisted semen analyses. Sperm morphology was evaluated under a phase-contrast microscope. Mitochondrial functionality, membrane e DNA integrity were evaluated with an epifluorescence microscope. Data was evaluated by descriptive statistics, simple one-way ANOVA and comparison between means by Tukey test. Significance was assigned to all values p<0.05. Experiment 1) Motility of spermatozoa recovered by SLC (p<0.05) and cushioned centrifugation (p>0.05) were higher than those recovered by conventional centrifugation. Experiment 2) SLC-Pre and SLC+F yielded the highest TM, while SLC+F yielded the highest PM. Higher morphological normal sperm was observed in SLC-Pre and SLC+F. Mitochondrial functionality was significantly higher in all treatments with SLC, while membrane integrity was higher in SLC-Pre. Colloidal centrifugation improved epididymal sperm quality before freezing and after thawing.

Introdução: a alta prevalência do câncer e o aumento significativo da sobrevivência em longo prazo geraram interesse quanto à preservação da fertilidade em mulheres jovens expostas a quimioterapia e radioterapia. Neste sentido estudos de congelamento de tecido ovariano para posterior transplante, abriram uma nova perspectiva de aplicação no tratamento e prevenção da infertilidade feminina. Objetivos: comparar dois protocolos de congelamento de tecido ovariano, um lento não automatizado e um por vitrificação, com o intuito de avaliar a viabilidade dos tecidos para posterior transplante autólogo. Método: Foram utilizadas 30 camundongos fêmea CF1 com aproximadamente 8 semanas e pesando 29,29g±2,9. •Os ovários extraídos foram vitrificados ou congelados, mantidos em nitrogênio líquido por 30 dias e descongelados. Após o descongelamento, o ovário esquerdo foi destinado às análises histológicas e caracterização por imuno histoquímica para o marcador mouse vasa homologue (MVH) e o ovário direito foi utilizado para os testes de viabilidade celular com exclusão por azul de trypan. Resultados: Nas análises de Hematoxilina e Eosina (HE) foram contados folículos primordiais, primários, pré-antrais e antrais. Não houve diferença significativa na proporção de folículos primordiais, primários e pré-antrais após descongelamento entre os grupos testados. A contagem de folículos antrais foi significativamente maior no grupo de vitrificação (p = 0,004). No ensaio de imunohistoquímica para o marcador MVH, folículos MVH + e MVH- foram contados e comparados com o número total de folículos. O grupo congelamento lento apresentou maior número de células não marcadas (p = 0,012). Conclusão: Embora ambos os protocolos tenham apresentado resultados semelhantes na análise histológica das contagens foliculares, o protocolo de vitrificação foi significativamente melhor para preservar a população de células tronco ovarianas. / Introduction: The high prevalence of cancer and the significant increase in long-term survival have generated interest as the preservation of fertility in young women exposed to chemotherapy and radiotherapy. Experimental techniques have been tried in an attempt to reverse the ovarian failure induced by these treatments. In this regard studies of ovarian tissue freezing for subsequent transplantation disclose a new application perspective in the treatment and prevention of female infertility. Objective: two ovarian tissue freezing protocols were tested, a non-automated slow-freezing and by vitrification, in order to assess the viability of the tissues for subsequent autologous transplantation. Methods: as ovaries donors, were used 30 female CF1 mice approximately 8 weeks and weighing 29,29g±2,9. • The ovaries were vitrified or frozen, stored in liquid nitrogen for 30 days and thawed. After thawing, the left ovary was intended for histological and immunohistochemical characterization by histochemical marker for MVH and right ovary was used for the tests with cell viability by trypan blue exclusion. Results: In HE slides was counting primordial, primary, pre antral and antral follicles. No significant difference was found in the proportion of high-quality primordial, primary and pre antral follicles after thawing/warming in the slow-freezing and vitrification group, respectively. The antral follicle counting was significant higher in vitrification group (p=0,004). In immunohistochemistry assay for MVH Antibody , MVH+ and MVH- follicles were counted and compared with the total number of follicles and slow freeze group had a higher number of not marked cells (p=0,012). Conclusion: Although both protocols showed similar results in the histological analysis for follicular counts, the vitrification protocol was significantly better for preserve the ovarian stem cell population.

Resumo: Efeitos deletérios dos radicais livres causam a lipoperoxidação da membrana plasmática dos gametas feminino e masculino e dos embriões cultivados in vitro, sendo responsável por perda da produção in vitro de embriões e redução da fertilidade in vivo. O estudo foi realizado com objetivo de investigar o efeito protetor do diluidor de sêmen contendo antioxidante submetido à criopreservação e avaliado por testes complementares (teste de termo resistência, hiposmótico e fluorescência), pela inseminação artificial e fertilização in vitro. Ejaculados de cinco touros foram agrupados nos seguintes tratamentos: 1 - Diluidor Tris - gema (controle - Dil C); 2 - Diluidor Tris -gema + Trolox 200mM (antioxidante-Dil T). Amostras com os diluidores com concentração final de 25 x 106 espermatozóides/ palheta foram envasadas em palhetas de 0,25 mL. Em uma fazenda localizada no Mato Grosso do Sul - MS, foram inseminadas 300 novilhas Nelore, e para cada touro realizou-se 60 inseminações artificiais (palhetas descongeladas em 35°C por 20 seg). Oócitos com citoplasma homogêneo e cumulus compacto de ovário de vacas de abatedouro foram selecionados e maturados em grupos de 25 por gota em 100μl de meio TCM 199 com SFB, FSH, hCG e estradiol, piruvato de sódio e amicacina, por 24 horas, sob óleo mineral, e foram cultivados com 5% CO2 e 95% umidade em ar, a 38,5ºC. Depois da maturação, os oócitos foram colocados em gotas com TALP contendo BSA, PHE e 10μg/ml de heparina com 1x 106 espermatozóides móveis por ml. Quatro palhetas (duas - DC e duas - DT) do mesmo touro e ejaculado foram descongeladas e cada palheta foi processada por um método de separação espermática para recuperação do sobrenadante: método de lavagem (duas centrifugações de 36xg por 5 min em 2ml de TL-sêmen) e gradiente de Percoll (45 e 90%, submetido a centrifugação a 500xg por 30 min)...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Deleterious effects of free radicals cause lipoperoxidation of the plasmatic membrane of female and male gametes and in vitro cultured embryos, being responsible for losses in in vitro production of embryos and reduction in in vivo fertility. The objective of this study was to investigate the protective effects of semen extender containing antioxidant submitted to cryopreservation and evaluated by artificial insemination, in vitro fertilization and complementary tests (hyposmotic, fluorescence, and thermal resistance tests). Ejaculates from 5 bulls were treated with Tris egg yolk extender (control-CE) alone or supplemented with 200ml Trolox in the extender (antioxidant-AE). The samples with the extenders with a final concentration of 25 x 106 spermatozoa/ml were placed into 0.25 ml straws. Three hundred Nelore heifers from a cattle farm in Mato Grosso do Sul - MS, were separated into 5 groups of 60 animals. For artificial insemination, the straws were thawed at 35°C for 20 sec and the females in each group were inseminated with semen of the same bull, using 30 female for each semen extender treatment. For in vitro fertilization, oocytes with homogeneous cytoplasm and compact cumulus, collected from ovaries of slaughtered cows were selected and maturated in groups of 25 in droplets of 100μl TCM 199 medium with FCS, FSH, hCG and estradiol, sodium pyruvate and amicacin, for 24 hours, under mineral oil, in atmosphere of 5% CO2 and 95% humidity in air, at 38.5ºC. After maturation, the oocytes were placed in droplets with TALP containing BSA, PHE and 10μg/ml of heparin with 1x 106 motile spermatozoa/ml...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Paulo Henrique Franceschini / Coorientador: Antônio Cláudio Tedesco / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: César Roberto Esper / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: José Domingos Guimarães / Doutor

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: César Roberto Esper / Banca: Karina Beloti Avelino / Resumo: Dentre as biotecnologias aplicadas à reprodução animal, atualmente um dos maiores desafios é a criopreservação de embriões PIV. Esses embriões apresentam alta criosensibilidade, devido principalmente a excessiva deposição lipídica no citoplasma, e que por sua vez está relacionada com a utilização de SFB nos meios. Neste trabalho foram avaliados os efeitos da suplementação protéica com BSA, SFB e FE e suas associações na PIV de embriões bovinos durante as etapas de MIV e CIV, visando melhorar sua criotolerância. Na MIV foram utilizadas sete diferentes combinações (SFB, BSA, FE, BSA+SFB, BSA+FE, SFB+FE e BSA+SFB+FE), e no CIV quatro tratamentos (BSA, BSA+SFB, BSA+FE e BSA+SFB+FE). Os embriões em estádios de Bl e Bx foram vitrificados e após seu reaquecimento foram avaliadas as taxas de eclosão embrionária em 24 e 48 horas. Dos oócitos colocados em maturação, obteve-se um total de 85,4% de clivagem e 35,52% de produção embrionária. Ao analisar os efeitos da fonte protéica na MIV notou-se que o grupo tratado com BSA apresentou as piores taxas de clivagem (80,96%) (p<0,05) em relação aos demais grupos, o melhor resultado de produção embrionária foi obtido com BSA+SFB (46,69%) e os melhores índices de eclosão embrionária pós reaquecimento foram nos tratamentos BSA+FE (44,35%), SFB+FE (44,90%) e BSA+SFB+FE (42,48%). Quando se avaliou os efeitos de fonte protéica na CIV, não houve diferença significativa entre os tratamentos quanto a clivagem, o BSA apresentou o pior desempenho na produção de embriões (31,88%) (p<0,05) em relação aos demais grupos que não diferiram entre si, e os melhores índices de eclosão embrionária 24 e 48h pós reaquecimento foram obtidos com o tratamento BSA+FE (37,64% e 51,34%, respectivamente) / Abstract: Among the biotechnology applied to animal reproduction, nowadays one of the biggest challenges is the cryopreservation of embryos produced in vitro. These embryos have a high cryosensitivity, mainly due to excessive fat deposition in the cytoplasm, which in turn is related with the FCS used in the mediums for embryo production in vitro. The aim of this study was to evaluate the effects of protein supplementation with BSA, FBS and FE, and their associations in IVP bovine embryos during the stages of IVM and IVC, to improve their cryotolerance. For IVM were used seven different combinations (FCS, BSA, FE, BSA + FCS, BSA + FE, FE and FBS + BSA + FCS + FS), and four treatments during IVC (BSA, BSA + FCS, BSA + FE, BSA+ FE+ FCS). Embryos in stage of Bl and Bx were vitrified and after their reheating the rates of hatched blastocysts at 24 and 48 hours were evaluated. Of the oocytes placed into maturation, we obtained 85.4% of cleavage and 35.52% of embryo produced. When were evaluated the effects of protein source in IVM was noted that the BSA-treated group showed the worst rates of cleavage (80.96%) (p <0.05) compared to other groups, the best result of embryo production was obtained with FCS + BSA (46.69%) and the highest rates of hatched blastocysts after rewarming were obtained with FE + BSA (44.90%), FE + FCS (44.35%) and FS + FCS + BSA ( 42.48%). When we assessed the effects of protein source in the IVC, there was no significant difference between treatments for the cleavage, the BSA group had the worst performance in the production of embryos (31.88%) (p <0.05) compared to other groups that not differ, and the highest hatched blastocysts in 24 and 48 hours after rewarming were obtained by treating BSA + FE (37.64% and 51.34%, respectively) / Mestre

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Coorientador: Bruna De Vita / Banca: Leandro Maia / Banca: Cláudia Barbosa Fernandes / Resumo: As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplicação, o que as tornam muito atrativas para a terapia celular, tanto na medicina humana como na medicina veterinária . Quando cultivadas in vitro são capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. Atualmente há uma grande tendência para a utilização de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cordão umbilical (CU) e sangue do cordão umbilical (SCU), podendo ser obtidas no momento do parto por uma técnica não invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA, CU e SCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e em abatedouro. As células foram recuperadas por meio de digestão enzimática tecidual, realizada com solução de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e CU no momento do parto (n=6) e de MA e CU no terço inicial de gestação (n=6), bem como de SCU no terço médio de gestação em abatedouro (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e diferenciações in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e criopreservação. Além disso, foram criopreservadas e analisadas por citometria de fluxo para observação da viabilidade celular. Todas as amostras dos diferentes períodos gestacionais demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marcação para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marcação para CD44, ausência de marcação para CD34 e baixa expressão de MHC II. Apresentaram também capacidade de diferenciação in vitro nas três linhagens mesodermais e quando analisadas ... / Abstract: Stem cells are undifferentiated cells with a high proliferation potential. These cells can be characterized by their in vivo ability to self-renew and to differentiate into specialized cell lines. The most used stem cell type, in both human and veterinary field, is the mesenchymal stem cells (MSC). Nowadays, there is a great tendency to use stem cells derived from fetal tissues, such as amniotic membrane (AM), extravascular matrix of umbilical cord (EMUC) and umbilical cord blood (UCB), which can be obtained non-invasively at delivery time. Thus, the aim of this study was to isolate, characterize and differentiate. MSC derived from bovine fetal annexes cow dairy neonates after assisted delivery and of fetus obtained in slaughterhouse. Cells were isolated by enzymatic digestion of the tissue fragments with 0,1% collagenase solution. Six samples of AM and EMUC at delivery time, six samples of AM and EMUC at first third of pregnancy and six samples of UCB at secondary third of pregnancy were subjected to morphology evaluation, immunocytochemistry, flow cytometry and in vitro osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation. Moreover, sample were cryopresrved and evaluated for viability by flow citometri. All samples showed adherence to plastic and fibroblast-like morphology. Immunocytochemistry revealed expression of CD 44, NANOG and OCT-4 and lack of expression of MHC II in MSC from all samples. Flow cytometry demonstrated that cells from all samples expressed CD 44, lacked CD 34 expression and showed low expression of MHC II. They were also capable of trilineage mesenchymal differentiation and showed 80-90% viability after cryopreservation. According to the results, AM, EMUC and UCB, either obtained at delivery time or from slaughterhouse, are a painless and non-invasive source of MSC and can be used for stem cell bank creation / Mestre