La Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana constituye uno de los problemas de salud más importante de Latinoamérica. El presente trabajo tuvo corno objetivos: Tipificar la especie de Trvpanosoma en las localidades de Hebron y Morochal, Distrito d e Cajaruro, Provincia de Utcubamba, Departamento de Amazonas; determinar la especie de triatomino presente en la zona de estudio, su distribución en las diferentes áreas de las viviendas; y determinar el índice tripano triatomínico. Se realizó el estudio morfométrico de Trypanosoma presente en las heces de Panstrongylus herreri, en sangre de Mus musculus infectados experimentalmente y en medio de cultivo, en este último se observó el Comportamiento. Se hicieron coloraciones de los frotices de heces, sangre y medio de cultivo con Giemsa y de los cortes histológicos de cerebro y corazón de Mus musculus con H E. Para la identificación de la especie de triatomino se usó la clave de Elliot el aL (1989) y para los estadios evolutivos la de Guillen el aL (1991). Para determinar el índice tripano tríatomínico se aplicó las fórmulas de Silveira (1993). De acuerdo a la morfología externa (antenas, tibia, conexivo) se determinó que la especie de triatomino presente en ambas zonas es Panstrongylus herreri. En Hebron se muestrearon 9 viviendas de los cuales 8 (88,89%) estaban infestadas, se capturó 140 triatomínos de ellos 39 (27,86%) se encontraron infectados con Trypanosoma cruzi. En Morochal se muestrearon 12 resultando 8 (66,67%) infestadas, se capturó 35 triatominos de ellos 5 (14,29%) se encontraron infectados con T cruzi. En Hebron, P. herreri se encontró distribuido en todas las áreas (dormitorio, cocina cuyero, cocina, cuyero, sala y peridomicilio) siendo el dormitorio el mas infestado con 56 (40%) triatominos encontrándose mayor porcentaje de positivos en la cocina cuyero, mientras que, en Morochal sólo se encontró en el dormitorio y cuyero; el lugar mas infestado con 30 (85,71%). / --- Chagas' discase or Arnerican Tripanosomiosis is one of the most .important health problems in Latin America. The present work had the following objectives: Typify the specie of rypanosoma m the localities of Hebrán and Morochal, District of Cajaruro, Province Uctubamba, Department of Amazonas; determine the specie of triatornine present the field of study; its distribution in the different places of the houses, and ,termine the tripano﷓triatomínico index. it was carríed out the morphometric study of Trypanosoma found in faeces f PanstrongyIus herreri, in blood of Mus musculus infected experimentally and in Ature media, in this latter, we studied the behavior. We stained the facces, b1ood and Ature media with Giemsa and the histological cuts from brain and heart of fus musculus with H ﷓ E. To identify the specie of triatomine was used Elliot et al. (1989) key d for the evaluative stages Guillén et al. (199 1) key. To determine the index ípano﷓triatomínico was used Silvíera's fórmula (1993). Taking into consideration the external morphology (antenna, shinbone, conexive) we determined that the triatomine specie found in both zones is `anstrongy1us herreri. In Hebron was sarnpled 9 houses frown which 8 (88,890/0) were infested, it was aptured 140 triatomínes from which 39 (27,861%) were found infected with 'rypanosoma cruzi. In Morochal was sampled 12 bouses being infested 8 (66,67 O/o), lt was aptured 35 triatomines from which 5 (14,29%) were found infectedwith T cruzi. In Hebron, P. herreri was found distributed in all areas of the houses bedroom, kitchen ﷓ guinea píg house, kitchen, guinea pig house, living room and en﷓domestie) bem9 the bedroom the most infested with 56 (40%) triatornines, being und the major percentage of positive inseas in the kitchen ﷓ guinea pig house while n Morochal only was found in the bedroom and guinea pig house. The place most

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se estudió la presencia de Trypanosoma cruzi en roedores silvestres y cosmopolitas (reservorios del ciclo silvestre), en sectores de las comunas de Calera de Tango y Til-Til, ubicados a 16 y 59 Km. respectivamente de la ciudad de Santiago. Se capturó un total de 138 roedores incluyendo ejemplares de Octodon degus, Rattus rattus, Phyllotis darwini, Abrothrix olivaceus y Abrocoma bennetti. Se les extrajo 0,5 ml de sangre mediante punción cardiaca, con el objetivo de determinar la frecuencia de T. cruzi por medio de la reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Las muestras fueron sometidas a extracción del ADN contenidas en ellas, amplificación y detección de la región hipervariable de los minicírculos del ADNk de T. cruzi. Con el fin de visualizar el producto de la amplificación, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se observó en transiluminador de luz ultravioleta. Se detectó la presencia de T. cruzi en 19 (14,84%) de las 128 muestras, diez de R. rattus, (7,25%), siete de O. degus, (5,07%), y dos de P. darwini, (1,45%). Los ejemplares de A. olivaceus y A. bennetti resultaron negativos. Estos resultados demostraron la circulación del parásito en la comunidad de micromamíferos, de lo que se puede concluir que los triatominos usan la sangre de roedores (silvestres y sinantrópicos), como alimento lo que asegura el mantenimiento del ciclo silvestre y peridoméstico del parásito, en las zonas rurales estudiadas en el presente trabajo

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En cirugía ortopédica, el uso de factores tróficos que favorezcan la formación de tejido de granulación y eviten o retrasen la formación de nuevo hueso es deseable en resoluciones quirúrgicas de ciertas patologías en pequeños animales. Calreticulina (CRT) es una proteína chaperona que asegura el correcto plegamiento de proteínas y actúa en la regulación del metabolismo del calcio dentro del retículo endoplásmico (RE). Esta proteína ha sido localizada además fuera de la célula donde cumple variadas funciones, entre ellas, favorece la formación de tejido de granulación en piel y además, inhibe la formación de hueso. Es así como, en este estudio se evaluó y se comparó el efecto de CRT recombinante humana (rHuCRT) y parasitaria proveniente de Trypanosoma cruzi (rTcCRT) sobre la regeneración ósea, mediante liberación controlada desde una esponja de quitosano al interior de una lesión circular en hueso cortical de conejo. rHuCRT y rTcCRT demostraron inhibir la regeneración ósea in vivo, sin embrago, rTcCRT demostró ser más eficaz en esta función que su contraparte humana / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 3100021

Memoria para optar al título de Bioquímico / El agente etiológico de la enfermedad de Chagas es el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Esta enfermedad posee un carácter endémico en América Latina y se estima un promedio de 8 millones de personas infectadas. El ciclo de vida de T. cruzi involucra insectos vectores y mamíferos hospederos, en los cuales se diferencia en tres formas celulares finales: epimastigote (extracelular y replicativa) presente en los vectores triatominos; tripomastigote (extracelular no replicativa e infectiva) que se encuentra tanto en insectos vectores como en hospederos mamíferos; y amastigote (intracelular y replicativa) presente en hospederos mamíferos. En ambos hospederos, T. cruzi se encuentra sometido a la acción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) que dañan su DNA. No obstante, el parásito sobrevive a la acción del estrés oxidativo. En la mayoría de los eucariontes, el daño oxidativo al DNA es reparado principalmente por la vía de reparación por escisión de bases (BER), proceso conservado en el que participan una serie de proteínas con actividad enzimática, siendo fundamentales las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (endonucleasas AP). En el genoma de T. cruzi se identificó la secuencia de la endonucleasa AP TcAP1, homóloga al endonucleasa AP de humano (APE1). Se demostró que la sobrexpresión de esta enzima incrementa la viabilidad de epimastigotes y tripomastigotes expuestos a ROS/RNS y que la inhibición de la actividad de TcAP1 genera el efecto opuesto; es decir, disminuye la viabilidad de los parásitos tratados con agentes oxidantes. Actualmente, se sabe que APE1 humana se relaciona directamente con otras enzimas de la vía BER y modula la expresión de proteínas que participan de otras vías de reparación del DNA. Hasta el momento no se ha determinado si TcAP1 se asocia a otras proteínas, como ocurre con su ortóloga APE1 en humanos. En esta memoria de título se propuso generar herramientas que permitan a futuro identificar las proteínas parasitarias asociadas a la endonucleasa TcAP1 de T. cruzi, las cuales podrían modular o ser moduladas por ella. Para tales efectos, se diseñaron dos construcciones plasmidiales (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 y pTREX-cmyc-tcap1) con el objetivo de generar proteínas de fusión de TcAP1 asociadas a diferentes epítopes ((HA)3-(FLAG)3 o c-Myc). Estos vectores de expresión se transfectaron en XIepimastigotes de la cepa Y de T. cruzi, los que se seleccionaron con el antibiótico G-418. Solo se obtuvieron epimastigotes transfectantes que expresaron la proteína de fusión N-cMyc-TcAP1, evidenciado mediante ensayos de Western blot. Utilizando un kit comercial (anti-cMyc), se realizaron ensayos de inmunoprecipitación sobre homogeneizados de proteínas totales obtenidas desde los epimastigotes transfectantes que expresan N-cMyc-TcAP1 y epimastigotes control no transfectados. Las proteínas obtenidas se separaron mediante electroforesis bidimensional en condiciones desnaturantes con el objetivo de evidenciar patrones electroforéticos diferenciales entre parásitos transfectantes y controles. Las proteínas detectadas de manera exclusiva para los parásitos transfectantes se enviaron a identificar mediante espectrometría de masa, sin embargo, no se obtuvieron resultados concluyentes. A pesar de los problemas presentados, esta memoria de título presenta una gran relevancia para nuestro laboratorio, ya que permitió generar herramientas para la futura identificación de proteínas reguladoras de la actividad de TcAP1 o que son reguladas por ella / The etiologic agent of Chagas disease is the hemoflagellate parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi). This disease is endemic in Latin America and an estimated 8 million people are infected. The life cycle of T. cruzi involves triatomine insect vectors and mammalian hosts, in which it differs in three final cellular forms: epimastigote (extracellular and replicative) present in triatomine vectors; trypomastigote (non-replicative and infective extracellular form) found in both, insect vectors and mammalian hosts; and amastigote (intracellular and replicative) present in mammalian hosts only. Inside both hosts, T. cruzi is exposed to reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) that damage the parasite DNA, however the parasite survives. In most eukaryotes, oxidative DNA damage is repaired mainly by the base excision repair pathway (BER), a conserved mechanism, in which a series of proteins with enzymatic activity participate, being apurinic/apyrimidinic endonucleases (AP endonuclease) essential to this process. In the T. cruzi genome the nucleotide coding sequence for an AP endonuclease (TcAP1), homologous to human AP endonuclease (APE1), was identified. In previous reports it has been demonstrated that the overexpression of this enzyme in T. cruzi, increases the viability of epimastigotes and trypomastigotes exposed to ROS/RNS and that the inhibition of TcAP1 activity generates the opposite effect, decreasing the parasite viability. Currently, human APE1 is known to directly interact with other enzymes of the BER pathway and modulates the expression of proteins involved in other DNA repair pathways. To date, it has not been determined whether T. cruzi TcAP1 is associated with other proteins, similar to those reported for APE1 ortholog human protein. In this work, it was proposed to generate tools that allow the future identification of parasitic proteins that interacts with the TcAP1 endonuclease, which could modulate their activity or or proteins that modulate their activity product of its interaction with TcAP1. For this purpose, two plasmid constructs (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 and XIIIpTREX-cmyc-tcap1) were designed with the aim of generating TcAP1 fusion proteins associated with different tags ((HA)3-(FLAG)3 or c-Myc). These expression vectors were transfected into epimastigotes of the T. cruzi Y strain, which were selected with the G-418 antibiotic. Only transfectant epimastigotes expressing the N-cMyc-TcAP1 fusion protein, evidenced by Western blot assays, were obtained. Using a commercial kit (anti-cMyc), immunoprecipitation assays were performed on total protein homogenates obtained from transfectant epimastigotes expressing N-cMyc-TcAP1 and untransfected control epimastigotes. The proteins obtained were separated by two-dimensional electrophoresis under denaturing conditions with the aim of evidencing differential electrophoretic patterns between transfectant and control parasites. The proteins exclusively detected for the transfectant parasites were sent to be identified by mass spectrometry. However, these could not be identified. Despite the presented problems, this title memory presents a great relevance for our laboratory, since it allowed to generate tools for the future identification of proteins that interacts with the TcAP1 enzyme

La Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana constituye uno de los problemas de salud más importante de Latinoamérica. El presente trabajo tuvo corno objetivos: Tipificar la especie de Trvpanosoma en las localidades de Hebron y Morochal, Distrito d e Cajaruro, Provincia de Utcubamba, Departamento de Amazonas; determinar la especie de triatomino presente en la zona de estudio, su distribución en las diferentes áreas de las viviendas; y determinar el índice tripano triatomínico. Se realizó el estudio morfométrico de Trypanosoma presente en las heces de Panstrongylus herreri, en sangre de Mus musculus infectados experimentalmente y en medio de cultivo, en este último se observó el Comportamiento. Se hicieron coloraciones de los frotices de heces, sangre y medio de cultivo con Giemsa y de los cortes histológicos de cerebro y corazón de Mus musculus con H E. Para la identificación de la especie de triatomino se usó la clave de Elliot el aL (1989) y para los estadios evolutivos la de Guillen el aL (1991). Para determinar el índice tripano tríatomínico se aplicó las fórmulas de Silveira (1993). De acuerdo a la morfología externa (antenas, tibia, conexivo) se determinó que la especie de triatomino presente en ambas zonas es Panstrongylus herreri. En Hebron se muestrearon 9 viviendas de los cuales 8 (88,89%) estaban infestadas, se capturó 140 triatomínos de ellos 39 (27,86%) se encontraron infectados con Trypanosoma cruzi. En Morochal se muestrearon 12 resultando 8 (66,67%) infestadas, se capturó 35 triatominos de ellos 5 (14,29%) se encontraron infectados con T cruzi. En Hebron, P. herreri se encontró distribuido en todas las áreas (dormitorio, cocina cuyero, cocina, cuyero, sala y peridomicilio) siendo el dormitorio el mas infestado con 56 (40%) triatominos encontrándose mayor porcentaje de positivos en la cocina cuyero, mientras que, en Morochal sólo se encontró en el dormitorio y cuyero; el lugar mas infestado con 30 (85,71%). / Chagas' discase or Arnerican Tripanosomiosis is one of the most .important health problems in Latin America. The present work had the following objectives: Typify the specie of rypanosoma m the localities of Hebrán and Morochal, District of Cajaruro, Province Uctubamba, Department of Amazonas; determine the specie of triatornine present the field of study; its distribution in the different places of the houses, and ,termine the tripano﷓triatomínico index. it was carríed out the morphometric study of Trypanosoma found in faeces f PanstrongyIus herreri, in blood of Mus musculus infected experimentally and in Ature media, in this latter, we studied the behavior. We stained the facces, b1ood and Ature media with Giemsa and the histological cuts from brain and heart of fus musculus with H ﷓ E. To identify the specie of triatomine was used Elliot et al. (1989) key d for the evaluative stages Guillén et al. (199 1) key. To determine the index ípano﷓triatomínico was used Silvíera's fórmula (1993). Taking into consideration the external morphology (antenna, shinbone, conexive) we determined that the triatomine specie found in both zones is `anstrongy1us herreri. In Hebron was sarnpled 9 houses frown which 8 (88,890/0) were infested, it was aptured 140 triatomínes from which 39 (27,861%) were found infected with 'rypanosoma cruzi. In Morochal was sampled 12 bouses being infested 8 (66,67 O/o), lt was aptured 35 triatomines from which 5 (14,29%) were found infectedwith T cruzi. In Hebron, P. herreri was found distributed in all areas of the houses bedroom, kitchen ﷓ guinea píg house, kitchen, guinea pig house, living room and en﷓domestie) bem9 the bedroom the most infested with 56 (40%) triatornines, being und the major percentage of positive inseas in the kitchen ﷓ guinea pig house while n Morochal only was found in the bedroom and guinea pig house. The place most

Orientador: Jussara Marcondes-Machado / Resumo: Não disponível. / Abstract: Not available. / Doutor

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A imunização genética com um DNA plasmidial, contendo o gene que codifica a proteína 2 da superfície de amastigotas (ASP-2), é capaz de proteger parte dos camundongos altamente suscetíveis A/Sn contra uma infecção letal pelo Trypanosoma cruzi. Com base neste resultado, a hipótese central desta tese foi a de que se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações. Para tal, empregaram-se protocolos de imunização e reforço homólogo ou heterólogo, usando DNA plasmidial, proteínas recombinantes, e vírus recombinantes da ASP-2 de T. cruzi. Inicialmente, testou-se se o reforço heterólogo com a proteína ASP-2 recombinante aumentava a eficácia da vacinação com o DNA plasmidial (pIgSPCl.9). Este protocolo não se mostrou mais eficaz, mas abriu a possibilidade de que a imunização com a proteína ASP-2 recombinante pudesse ser utilizada como um protocolo vacinal alternativo. Com esta abordagem, descreveu-se que a administração de 3 doses de uma proteína recombinante (GST-P4P7), representando os aminoácidos 261-500 da ASP-2 em fusão com a glutationa S-transferase, na presença dos adjuvantes alum e CpG ODN 1826, era capaz de induzir altos níveis de proteção. Neste modelo experimental, observou-se que a imunidade protetora foi de longa duração e dependente dos linfócitos CD8 específicos para o epítopo imunodominante TEWETGQI. Determinou-se também que o adjuvante CpG ODN 1826 melhorou a eficácia da imunidade protetora, e que linfócitos T CD4 específicos são importantes para a indução dos linfócitos CD8 protetores. Como o protocolo de vacinação com a proteína recombinante GST-P4P7 exigia o uso de três doses, testou-se então a possibilidade de que um adenovírus recombinante, expressando a ASP-2 (AdASP-2), pudesse ser utilizado num protocolo de imunização e reforço homólogo ou heterólogo (somente duas doses). Na comparação dos protocolos de vacinação homólogos ou heterólogos com pIgSPCl.9 e AdASP-2, observou-se que, nos animais A/Sn, tanto a imunização homóloga quanto a heteróloga, usando o AdASP-2, proporcionaram um alto grau de imunidade protetora contra a infecção pelo T. cruzi. Os estudos utilizando o protocolo heterólogo (pIgSPCl.9 seguido por AdASP-2), que protege 80-100% dos camundongos, mostraram que a imunidade era de longa duração e dependente dos linfócitos T CD4 e CD8. Esta imunidade protetora se correlacionou com a atividade citotóxica específica in vivo, antes do desafio com o T. cruzi. Com base nestes resultados, analisou-se a imunidade protetora após a vacinação heteróloga em camundongos com deficiência de um importante mediador da citotoxicidade, a perforina. Os animais deficientes (KO) da expressão de perforina vacinados se mostraram suscetíveis à infecção experimental. Uma análise da resposta imune celular destes camundongos mostrou que eles apresentavam uma menor produção de IFN-γ por esplenócitos re-estimulados in vitro, na presença do antígeno recombinante. Na análise dos linfócitos T CD8 específicos observou-se que havia: i) uma expansão numérica normal; ii) uma redução numérica significativa dos linfócitos multifuncionais, capazes de expressar simultaneamente IFN-γ/CD107a e IFN-γ/TNF-α.; iii) baixa citotoxicidade in vivo; iv) baixa expressão de CD44 e de KLRG-1. Por fim, para definir a importância relativa do IFN-γ e da citotoxicidade na proteção contra a infecção pelo T. cruzi após a vacinação heteróloga, camundongos IFN-γ KO foram imunizados com pIgSPCl.9 seguido por AdASP- 2. Estes animais apresentaram um alto grau de citotoxicidade in vivo, mas nenhuma imunidade protetora detectável. Em resumo, ao longo deste trabalho obtiveram-se evidências que confirmam a hipótese inicial de que, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações, se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi. Pela utilização de depleções in vivo e de animais geneticamente deficientes, definiu-se a importância dos linfócitos T CD4 e CD8, da perforina e do IFN-γ na imunidade gerada pela vacinação com a ASP-2 de T. cruzi. Acredita-se que os dados obtidos no decorrer desta tese serviram para: i) uma melhor compreensão dos mecanismos imunológicos de resistência à infecção pelo T. cruzi e dos seus antígenos alvos; ii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra infecções por protozoários intracelulares em geral e, especificamente, contra a doença de Chagas; iii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes capazes de induzir uma potente resposta imune mediada por linfócitos T. / Genetic immunization with plasmidial DNA containing the gene encoding the amastigote surface protein 2 (ASP-2) protects part of the highly susceptible A/Sn mice against a lethal challenge with Trypanosoma cruzi. Based on these results, in this thesis, we tested the hypothesis that the efficacy of the vaccination against T. cruzi experimental infection could be rationally improved by the use of different vaccine formulations and/or vaccinations strategies. For that purpose, we employed homologous or heterologous priming and boosting strategies, with plasmidial DNA, recombinant proteins, and adenovirus expressing T. cruzi ASP-2. Initially, we tested whether boosting with a recombinant protein of ASP-2 could improve the efficacy of the priming vaccination with plasmidial DNA (pIgSPCl.9). This protocol was not more efficient, but opened the possibility that the immunization with the recombinant protein could be used as an alternative vaccine strategy. Using this approach, we described that the administration of 3 doses of a recombinant protein representing the amino acids 261-500 of ASP-2 in fusion o the gluthatione Stransferase (GST-P4P7), in the presence of the adjuvants alum and CpG ODN 1826, was capable of eliciting high levels of protective immunity. In this experimental model, protective immunity was: i) long-lasting; and ii) dependent on the effector CD8 T lymphocytes specific for the immunodominant epitope TEWETGQI. We also established that the adjuvant CpG ODN 1826 improved the efficacy of protective immunity, and that CD4 T lymphocytes were important for the induction of protective CD8 T cells. Because the vaccination strategy employing the recombinant protein GST-P4P7 required 3 doses, we tested the possibility that a recombinant adenovirus expressing ASP-2 (AdASP-2) could be used in a homologous or heterologous priming and boosting protocol with two doses only. By comparing homologous or heterologous priming and boosting with pIgSPCl.9 and AdASP- 2, we found that homologous or heterologous immunizations with AdASP-2 led to a high degree of protective immunity against T. cruzi infection, in highly susceptible A/Sn mice. Follow up studies using the heterologous priming and boosting strategy (pIgSPCl.9 followed by AdASP-2), which protects 80-100% of the mice, showed that protective immunity was long-lived and dependent on the activation of CD4 or CD8 T cells. Protective immunity correlated with antigenspecific in vivo cytotoxic activity prior to the challenge with T. cruzi. Based on this observation, we evaluated the protective immunity following the heterologous vaccination in mice genetically deficient for an important mediator of cytotoxicity, perforin. Vaccinated perforin knock-out (KO) mice were extremely susceptible to the experimental infection. The analyses of the immune response of these mice showed that their splenocytes produced less IFN-γ when re-stimulated in vitro with recombinant antigen. Analysis of specific CD8 T lymphocytes showed: i) a normal numeric expansion; ii) a significantly lower frequency of polyfunctional cells expressing simultaneously IFN-γ/CD107a or IFN-γ/TNF-α.; iii) lower in vivo cytotoxicity; iv) lower expression of CD44 and KLRG-1. Finally, to define the relative importance of IFN-γ and cytotoxic T lymphocytes in the protection against T. cruzi infection following heterologous vaccination, IFN-γ KO mice were immunized with pIgSPCl.9 followed by AdASP-2. These mice developed a high level of in vivo cytotoxicity, but no detectable protective immunity. In summary, during this work we gathered evidences that confirmed our initial hypothesis that we could rationally improve the efficacy of vaccination against T. cruzi experimental infection using different vaccine formulations and/or vaccination strategies. Using in vivo depletions and KO mice, we defined the importance of CD4 cells, CD8 cells, perforin and IFN-γ during immunity generated by vaccination with ASP-2 of T. cruzi. We believe that our findings will provide: i) a better understanding of the immunologic mechanisms and the target antigens during the resistance to T. cruzi infection; ii) to aid the development of recombinant vaccines against intra-cellular parasitic protozoan infections in general and Chagas’ disease, specifically; iii) to aid the development of recombinant vaccines capable of eliciting potent immune response mediated by T lymphocytes. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Este estudio fue desarrollado para investigar los mecanismos de reducción y reactividad de una nueva familia 5-Nitroindazoles. Estos compuestos poseen actividad radicalaria a partir de su grupo nitro, razón por la cual son candidatos a presentar una posible actividad tripanocida. Para evaluar esta capacidad tripanocida se recurrió a técnicas voltamperometricas y espectroscópicas además de un estudio biológico de toxicidad sobre parásitos. La formación del anión radical nitro fue estudiada por medio de voltametría cíclica, donde se determinó un mecanismo electrónico simple caracterizado por un par redox único dando como resultado una reacción cuasireversible. Además a través de la misma técnica se evaluó el efecto de un antioxidante natural, como es glutatión, sobre la generación radicalaria. También se utilizó la espectroscopía de espín electrónica para caracterizar los radicales generados, donde se determinó un patrón hiperfino común para toda la serie de compuestos. Por último se recurrió a un estudio biológico de toxicidad realizado en células murinas y parásitos epimastigotes, mostrando variados resultados en la serie, por lo que se recurrió a una fase exploratoria para determinar aquellos que poseían mayores facultades como agentes tripanocidas.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthlea@bce.unb.br) on 2008-10-29T14:38:15Z No. of bitstreams: 1 2008_AnaCarolinaBMaranhao.pdf: 1723120 bytes, checksum: b2328a02886ae7db1a1e77f4da928e01 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-02-26T12:22:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AnaCarolinaBMaranhao.pdf: 1723120 bytes, checksum: b2328a02886ae7db1a1e77f4da928e01 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-26T12:22:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AnaCarolinaBMaranhao.pdf: 1723120 bytes, checksum: b2328a02886ae7db1a1e77f4da928e01 (MD5) / A doença de Chagas causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi é transmitida pelo triatomíneo hematófago e provoca mais de 17 milhões de infecções em toda America Latina. Mais de 140 espécies de triatomíneos foram descritas. O gênero Rhodnius compreende mais da metade dos triatomíneos encontrados na Amazônia, como o Rhodnius brethesi e Rhodnius robustus. Normalmente esses insetos não estão em contato com os humanos, porém o desflorestamento e as migrações aproximam o contato entre o inseto infectado e o humano. Diferentemente, o Panstrongylus megistus é amplamente distribuído do México até a Argentina e coloniza diferentes ambientes silvestres como ninhos, tocas, arvores e até domicílios humanos. Nesse estudo nos descrevemos o transcriptoma das glândulas salivares de R. brethesi e R. robustus com 56 e 122 clusters respectivamente. Mais de 30% desses clusters nunca tinham sido descritos antes. Nos seqüenciamos também pela primeira vez 45 transcritos de glândulas salivares de P. megistus. Além disso, foi realizada uma análise proteômica por espectrometria de massa do conteúdo das glândulas salivares desses insetos. Encontramos 123, 111 e 159 proteinas nos proteomas de R. brethesi, R. robustus e P. megistus respectivamente. Além da grande prevalência de proteínas de manutenção, nos encontramos lipoclinas, inositol polifosfate 5-fosfatase e proteínas com domínio kazal, essenciais para um repasto sanguíneo com sucesso. Foram encontradas também outras proteínas relacionadas com resistência a inseticidas e defesa como a glutationa S transferase e proteína antigeno-5 respectivamente. Rhodnius findings showed their genetic distance with Triatoma, in the opposite, data confirmed the closeness between Triatoma and P. megistus. / Chagas disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi is mostly transmitted by the triatomine bug and causes over 17 million infections in Latin America. More than 140 species of triatomines were described. The Rhodnius gender comprises almost half of the triatomines found in the Amazon Basin, as Rhodnius brethesi and Rhodnius robustus, normally these insects aren’t in contact with humans, but deforestation and migration are approaching the infected bugs to human habitats and working areas. Differently, Panstrongylus megistus is widely distributed from Mexico to Argentina and are known to colonize different wild life dwellings, such as ground burrows, birds nest, crevices on tree barks and human domiciles. In this study we described the transcriptome of the salivary glands of R. brethesi and R. robustus, respectively comprising 56 and 122 clusters. Over 30% of these clusters had never been described before. We also sequenced for the first time 45 transcripts from the P. megistus salivary gland. Furthermore, we performed a proteomic analysis using LC-MS/MS technology and found 123, 111, 159 proteins in R. brethesi, R. robustus and P. megistus proteome, respectively. Besides the highly redundant housekeeping proteins we also could found lipocalins (biogenic amino binding proteins and salivary platelet aggregation inhibitor), inositol polyphosphate 5-phosphatase, and kazal domain proteins, essential proteins used for the successful blood-feeding habits, and glutathione S transferase, and antigen-5 protein, respectively, involved with resistance to insecticide and defense. Rhodnius findings showed their genetic distance with Triatoma, in the opposite, data confirmed the closeness between Triatoma and P. megistus.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-02T15:19:11Z No. of bitstreams: 1 Michelle Casal Fernandes.pdf: 12707205 bytes, checksum: 040075e6235acdaf47b50c64d61e086a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-02T15:19:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Michelle Casal Fernandes.pdf: 12707205 bytes, checksum: 040075e6235acdaf47b50c64d61e086a (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, representa um sério problema de Saúde Pública na América Latina, cujo tratamento clínico é insatisfatório. Nesse contexto, muitos esforços têm sido dirigidos para o desenvolvimento de novas drogas visando o tratamento desta doença negligenciada. Na medicina popular, produtos naturais ricos em naftoquinonas têm sido utilizados no combate de diferentes doenças parasitárias. Nosso grupo vem investigando a atividade de naftoquinonas e derivados sobre formas tripomastigotas de T. cruzi. No presente estudo, dentre 32 hidroxinaftoquinonas que tiveram sua atividade tripanocida avaliada, o composto 1C foi o mais ativo (IC50/24h=77,3 ±6,8 μM). Estudos prévios do nosso grupo com outra classe de derivados de naftoquinonas apontaram para a naftoquinona triazólica (NT) como um composto promissor, sendo esta mais ativa que a droga padrão benznidazol. Nesta dissertação, o mecanismo de ação de NT foi estudado, sendo observados danos ultraestruturais em epimastigotas como a ruptura dos reservosomos, blebbing da membrana flagelar, desorganização do Golgi, aparecimento de estruturas membranares concêntricas no citosol e parasitos anormais com múltiplos flagelos. Diferentemente do tratamento com outras naftoquinonas, NT não induziu alterações na mitocôndria, dado este confirmado pela análise do potencial de membrana mitocondrial (Δm) por citometria de fluxo. Pela mesma técnica, ainda foram demonstrados o efeito de NT no bloqueio da mitose e no aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). O principal fenótipo induzido pelo tratamento com essa naftoquinona foi o aparecimento de perfis de retículo endoplasmático envolvendo organelas, que juntamente com o aumento da marcação com monodansilcadaverina (MDC) observado, sugere a autofagia como parte do mecanismo de ação tripanocida da NT. O T. cruzi apresenta-se em três diferentes formas evolutivas e durante seu ciclo de vida é exposto a condições físico-químicas adversas como variações no pH e escassez de nutrientes. A avaliação do efeito de tais condições se constituiu em um dos objetivos deste estudo. Análises por citometria de fluxo demonstraram que epimastigotas submetidos a estresse de pH e escassez nutricional apresentaram um aumento na produção de EROs, sendo também observada uma queda do Δm apenas após estresse de pH. A microscopia eletrônica de transmissão revelou um inchaço mitocondrial com desorganização das cristas, presença de estruturas membranares concêntricas citosólicas e no interior de organelas, perfis de retículo endoplasmático envolvendo estruturas subcelulares, perda de eletrondensidade dos reservosomos com invaginação da sua membrana e intensa vacuolização citoplasmática. Estes fenômenos característicos de autofagia, reforçados pela ausência de ruptura de membrana plasmática, de fragmentação do DNA e pelo aumento na marcação de MDC, indicam que esta via participa da resposta do protozoário aos diferentes tipos de estresses induzidos. / Chagas’ disease, caused by the protozoa Trypanosoma cruzi, represents a severe Public Health problem in Latin America, being its clinical treatment unsatisfactory. In this framework, several efforts have been directed for the development of novel drugs for the treatment of this negllected disease. In the folk medicine, natural products containing naphthoquinones have been employed for the treatment of different parasitic illnesses. Our research group has been investigating the activity of naphthoquinones and derivatives against T. cruzi bloodstream trypomastigotes. In the present study, among 32 hydroxinaphthoquinones, evaluated for their trypanocidal activity, compound 1C was the most effective (IC50/24h=77,3 ± 6,8 μM). Previous studies by our group with another naphthoquinones class of derivatives, pointed to the triazolic naphthoquinone (NT) as a promising compound, being more active than the reference drug benznidazol (IC50/24h=103,6 ± 0,6 μM). In this work, the mechanism of action of NT was also studied, being many ultrastructural damage described in epimastigotes such as the rupture of the reservosomes membrane, blebbing in the flagellar membrane, Golgi disruption, the formation of concentric membranous structures in the cytosol and the appearance of abnormal parasites with multiple flagella. Differently from the treatment with other naphthoquinones, NT did not induce mitochondrial alterations, data confirmed by mitochondrial membrane potential (Δm) by flow cytometry. By the same technique, it was also demonstrated the effect of NT on mitosis blockage and in the increase in reactive oxygen species (ROS) production. The main phenotype induced by the treatment with this naphthoquinone was the appearance of endoplasmic reticulum profiles surrounding organelles associated with the increase in monodansylcadaverine (MDC) labeling observed, suggests that autophagy is involved in the trypanocidal effect of NT. T. cruzi presents three different evolutive forms, and during its life cycle is exposed to adverse physico-chemical conditions such as pH variation and the shortage of nutrients, being the evaluation of the effect of these conditions one of the goals of this study. Flow cytometric analysis demonstrated that epimastigotes submitted to pH stress and nutritional scarcity presented an increase in ROS generation, being also observed a decrease in Δm detected only after the pH stress. The transmission electron microscopy revealed the mitochondrial swelling with crists disorganization, the formation of membranous concentric structures in the cytosol or inside organelles, the appearance of endoplasmic reticulum profiles surrounding subcellular structures, loss of reservosome electrondensity with the invagination of its membrane, and the intense citoplasmic vacuolization. Such characteristic phenomena of autophagy, reinforced by the absence of the plasma membrane rupture, DNA fragmentation and increase in MDC labeling, indicate that this pathway participates in the protozoa response to different types of induced stresses.