Les picocyanobactéries marines Synechococcus sont les seconds organismes photosynthétiques les plus abondants sur Terre. Elles présentent une grande diversité pigmentaire du fait de différences dans la composition de leur antenne collectrice de lumière (phycobilisome), ce qui leur permet d'utiliser efficacement une grande partie du spectre lumineux. Cependant, l'évolution, l'écologie et les bases moléculaires de cette diversité restent mal comprises. La comparaison d'une région génomique impliquée dans la synthèse des phycobilisomes de 54 souches et de populations naturelles m'a permis de proposer un scénario pour l'évolution des différents types pigmentaires et de montrer que cette diversité pigmentaire précède la diversification des Synechococcus marins. J'ai ensuite développé une procédure bioinformatique pour quantifier l'abondance relative de tous les types pigmentaires connus à partir de métagénomes. Appliquée aux données de Tara Oceans, cela m'a permis de décrire leur répartition à l'échelle mondiale, révélant que l'acclimatation chromatique de type IV, qui permet aux cellules de modifier leur spectre d'absorption en fonction de la couleur de la lumière, domine les populations naturelles de Synechococcus, et que des mutants naturels de l'acclimatation chromatique prévalent dans les étendues oligotrophes de l'océan Pacifique sud. Enfin, la caractérisation génétique de deux membres d'une famille d'enzymes liant les pigments à la phycoérythrine II, constituant majeur des phycobilisomes, a apporté de nouvelles perspectives sur les bases moléculaires de l'acclimatation chromatique et révélé l'importance des variations alléliques dans la diversité des types pigmentaires. / Marine Synechococcus are the second most abundant photosynthetic organisms on the planet. These picocyanobacteria present very diverse pigmentations due to differences in the composition of their light-harvesting antenna (phycobilisome), allowing them to efficiently exploit a wide range of spectral niches. Yet, the evolution, ecology and molecular bases of the different Synechococcus pigment types are not well understood. By comparing the genomic regions involved in the synthesis of phycobilisome rods from 54 sequenced isolates spanning all cultured pigment types and from natural Synechococcus populations, I proposed a scenario for the evolution of the different pigment types and showed that the pigment diversity of marine Synechococcus predates the diversification of this genus. Then, I developed a bioinformatic pipeline for reliably quantifying all known Synechococcus pigment types from metagenomes. Applying it to the Tara Oceans dataset allowed me to describe for the first time their distribution in the global ocean and revealed that type IV chromatic acclimation, a process by which cells can match their absorption properties to the ambient light colour, is widespread and constitutes the dominant pigmentation in Synechococcus populations. It also showed that natural chromatic acclimation mutants prevail in wide oligotrophic areas of the southern Pacific Ocean. Finally, I genetically characterized two members of an enzyme family binding chromophores to phycoerythrin-II, a major component of phycobilisomes. This provided new insights into the molecular bases of chromatic acclimation and revealed the importance of allelic variation for the diversity of pigment types.

En raison des forçages anthropiques exercés sur les écosystèmes aquatiques et des effets des changements globaux présents et à venir, on s’attend à une augmentation de la fréquence et de l’intensité des proliférations cyanobactériennes lacustres. Une meilleure connaissance des facteurs biotiques, et notamment du parasitisme, impliqués dans le control des dynamiques cyanobactériennes semble essentielle. Il est désormais établi que les Chytridiomycota (chytrides) constituent les principaux pathogènes fongiques du phytoplancton. Ainsi, les travaux de recherche menés au cours de cette thèse ont eu pour objectif d’étudier le parasitisme fongique associé aux efflorescences cyanobactériennes, et plus précisément l’écologie des chytrides parasites de la cyanobactérie Anabaena macrospora, espèce filamenteuse présentant des proliférations massives et récurrentes dans le lac d’Aydat (France). Par la mise en place d’un schéma d’échantillonnage temporel et spatial à haute fréquence et prenant en compte deux années consécutives (2010 et 2011), nous avons pu (i) étudier les cycles de vie des deux espèces de parasites fongiques associées à A. macrospora, (ii) évaluer l’impact de ces parasites sur la dynamique de la population cyanobactérienne, et (iii) caractériser des facteurs contrôlant la dynamique des systèmes hôtes-parasites d’intérêt. De plus, (iv) afin de mettre en exergue les relations étroites existantes entre l’hôte et la production fongique associée, nous avons mis au point des protocoles méthodologiques permettant une analyse microscopique fine de l’hôte, des sporanges et de leur contenu en zoospores (fécondité des chytrides). Les résultats acquis mettent en évidence la coexistence de deux espèces de chytrides, Rhizosiphon crassum et R. akinetum, associées à A. macrospora. La reconstruction des cycles de vie par analyse d’images prises à partir d’échantillons naturels nous a permis de montrer que les deux chytrides présentaient une durée de leur cycle de vie similaire, et estimée à environ 3j. pour R. crassum. Cependant, ces deux espèces se différencient d’un point de vue fonctionnel en parasitant des types cellulaires distincts : R. crassum influence directement la biomasse active en parasitant les cellules végétatives, alors que R. akinetum parasite les cellules de résistances (akinètes) de A. macrospora. Cette dernière espèce peut donc avoir un impact sur le recrutement, la structure génétique et la variabilité interannuelle de la population hôte. Par ailleurs, outre leur impact direct, nous montrons que l’action des chytrides parasites peut aboutir à une fragmentation mécanique des filaments de A. macrospora, augmentant potentiellement la perte de biomasse cyanobactérienne par broutage. De plus, nous avons pu mettre en évidence que la production zoosporique des chytrides dépendait des ressources nutritives disponibles tant d’un point vue quantitatif (taille de l’hôte) que qualitatif (groupe phytoplanctonique parasité, métabolisme de l’hôte...). La réduction de la biomasse active de cyanobactéries, la fragmentation mécanique, ainsi que la production de zoospores dont la qualité nutritive pour le zooplancton a été démontrée, établissent les chytrides comme lien trophique entre les proliférations cyanobactériennes filamenteuses « inedible », considérée comme impasses trophiques, et les niveaux trophiques supérieurs. Enfin, l’ensemble des résultats acquis montre l’intérêt de prendre en compte, désormais, le rôle fonctionnel des champignons microscopiques parasites, notamment comme agents régulateurs direct et indirect du développement phytoplanctonique. Cette prise en compte permettrait, sans aucun doute, d’améliorer les modèles de transferts de matière et d’énergie qui transitent dans les écosystèmes aquatiques, dans le contexte général d’optimiser la gestion des plans d’eau. / Face to both the important anthropogenic input in nutrients and the global change, numerous authors predict that the cyanobacterial blooms will increase in relative abundance in aquatic ecosystems. An exhaustive knowledge of the driving biotic factors of the cyanobacterial dynamic is essential. In lakes, the most common fungal parasites of phytoplankton belong to the phylum Chytridyomycota (i.e. chytrids). The aim of the thesis was to investigate the fungal parasitism associated to the cyanobacterial blooms, particularly the ecology of chytrids parasitizing the filamentous cyanobacterial species Anabaena macrospora, in Lake Aydat (France). During two successive years (2010-2011), investigations on (i) the chytrid cycle of life of two chytrid species parasitizing A. macrospora, (ii) the impact of the fungal parasitism on the cyanobacterial bloom dynamic and (iii) driving factors of the host-parasite pairings dynamics have been led during two spatio-temporal surveys using high resolution sampling strategies. Moreover (iv) a double staining method based on a combination of CFW and SYTOX green for counting, identifying, and investigating the fecundity of phytoplankton fungal parasites and the putative relationships established between hosts and their fungal parasites has been developed. Results underlined the coexistence of two chytrids, Rhizosiphon crassum and R. akinetum, which have similar life cycles but differed in their infective regimes depending on the cellular niches offered by their host. R. crassum infected both vegetative cells and akinetes while R. akinetum infected only akinetes. A reconstruction of the developmental stages suggested that the life cycle of R.crassum was completed in about 3 days. By infecting akinetes, R. akinetum could reduce or modify the genetic structure of the cyanobacterial bloom of the following year. Furthermore, chytrids may reduce the length of filaments of Anabaena macrospora significantly by ‘‘mechanistic fragmentation’’ following infection. All these results suggest that chytrid parasitism is one of the driving factors involved in the decline of cyanobacterial blooms, by direct mortality of parasitized cells and indirectly by the mechanistic fragmentation, which could weaken the resistance of A. macrospora to grazing. Moreover, we underlined that the production of zoospore depends on the nutritional host quantity (host size) and quality (host phytoplanktonic group, host metabolism...). The decrease of the cyanobacterial active biomass, mechanistic fragmentation, and production of zoospores which exhibit a high nutritional quality for the zooplankton, established the chytrids as a real link between the inedible filamentous cyanobacteria, considered as trophic dead ends, and the higher trophic levels. Overall, we consider that the acquisition of our data places the chytrid parasitism as an important driving factor of the phytoplankton dynamic, allowing the inclusion of fungi and their main function (parasitism) in the energy and matter fluxes in the pelagic ecosystems.

Les microorganismes photosynthétiques suscitent un intérêt biotechnologique important pour la production de dihydrogène. La cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 6803 est capable d'initier une photoproduction d'hydrogène catalysée par une hydrogénase [NiFe] bidirectionnelle qui se présente sous la forme d'un complexe pentamérique (HoxEFUYH). Toutefois l'inhibition de cette enzyme par l'oxygène émis par le photosystème II rend cette photoproduction transitoire et constitue un verrou majeur au développement de tels procédés. L'exploitation de ces organismes impose une meilleure compréhension des bases moléculaires associées à la sensibilité de l'hydrogénase envers l'oxygène ainsi que des composantes limitant son activité de production d'H2, ce qui implique la connaissance détaillée des jeux d'interactions avec ses partenaires physiologiques NAD(P)+/NAD(P)H.Diverses substitutions d'acides aminés potentiellement impliqués dans la sensibilité de l'enzyme à l'O2 et situés au cœur du site actif (Ileu64, Leu107, Leu112) de la sous-unité catalytique HoxH ont été réalisées. Les résultats in vitro et in vivo indiquent une sensibilité envers l'O2 moindre chez le mutant I64M, qui présente une diffusion limitée et un biais vers l'activité de production d'H2.L'étude des interactions de mutants de délétion des gènes diaphorase hoxE et hoxF avec les cofacteurs NAD(P) a montré que NAD+/NADH semblent être les partenaires privilégiés de l'hydrogénase pour le transfert d'électrons, tandis que le NADPH a un effet activateur sur l'enzyme.Ces études apportent des éléments importants pour envisager une optimisation ciblée et maîtrisée pour la bioproduction d'H2. / Oxygenic photosynthetic organisms are a matter of great biotechnological interest for the production of dihydrogen using what seem to be infinite resources, water and solar energy. The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 encodes a bidirectional [NiFe] hydrogenase consisting of a pentameric complex (HoxEFUYH) that allows it to carry H2 photoproduction. However, it is a transient process, mainly due to the oxygen sensitivity of hydrogenases, O2 being produced at PSII during photosynthesis. Future exploitation of these organisms in bioprocesses requires a better understanding of the molecular bases of O2 sensitivity of the hydrogenase and of the elements limiting H2 evolution which involves detailed knowledge of the interactions of the enzyme with its physiological partners NAD(P)+/NAD(P)H.Various mutants of the Synechocystis hydrogenase were created by genetic engineering, targeting specific amino acid residues (Ileu64, Leu107, Leu112) in the catalytic subunit HoxH identified as putative critical elements for O2 sensitivity. Results obtained in vitro and in vivo indicate that the substitution I64M slightly improves O2 tolerance and alters gas diffusion kinetics with a bias towards H2 production. Studying the interaction of diaphorase gene-deletion mutants hoxF and hoxE with partners NAD(P) showed that NAD+/NADH are the preferential electron acceptor/donor of the hydrogenase, while NADPH is more efficient for enzyme activation.These studies provide first insights on the determinants of the oxygen sensitivity of the hydrogenase of Synechocystis and its activation, which are critical elements to consider in targeted optimization for bioproduction of H2.

L'oxydation de l'eau et la production du dioxygène atmosphérique sont réalisées par le Photosystème II. Le centre catalytique du PSII est constitué d'un cluster de 4 ions manganèse et de 1 ion calcium. Sous l'action de la lumière, le complexe Mn4Ca passe par 5 états d'oxydation successifs (S0 à S4) avant l'émission d'oxygène au cours de la transition S4 à S0. Bien que l'ion Ca2+ soit détecté dans les structures cristallographiques actuelles, son rôle reste à préciser. Un deuxième cofacteur est mis en jeu : le chlorure, dont la position et le rôle dans le dégagement d'oxygène ne sont pas clairement définis. Pour étudier ces deux cofacteurs, nous avons réalisé le remplacement biosynthétique du Ca2+ et du Cl- par du Sr2+ et/ou du Br- dans la cyanobactérie thermophile Thermosynechococcus elongatus. Le dégagement d'oxygène sous éclairement continu diminue après substitution des cofacteurs. Il varie dans l'ordre suivant : Ca/Cl>Ca/Br>Sr/Cl>Sr/Br. Dans le chapitre III, nous mettons en évidence que cette baisse d'activité est due à un ralentissement de certaines étapes du transfert d'électron, et plus particulièrement de la transition S3 à S0 durant laquelle une phase de délai a été mise en évidence. Nous montrons que cette phase de délai correspond à une modification de l'environnement électrostatique de la chlorophylle P680, impliquant très probablement des mouvements de protons. Nous arrivons ainsi à détecter un intermédiaire réactionnel au cours de la transition, grâce au ralentissement dû à l'échange des cofacteurs Ca2+ et Cl-. Ces cinétiques ralenties accompagnent une baisse du niveau d'énergie libre de l'état S3 et donc du potentiel d'oxydo-réduction du couple S3/S2. Dans le chapitre IV, le chlorure est remplacé biochimiquement par de l'iodure après une étude des conditions d'échangeabilité de l'halogénure. A nouveau, une baisse d'activité sous éclairement continu est expliquée par un ralentissement des cinétiques d'oxydation du cluster de Mn4Ca. Les propriétés thermodynamiques du PSII sont modifiées en présence d'Imais il reste à savoir si cela est dû à la réduction du cluster de Mn4Ca par l'iodure, ou à une augmentation du potentiel redox du couple S3/S2. Dans le chapitre V, nous nous intéressons à différents aspects structuraux des échantillons substitués biosynthétiquement. D'une part, nous mettons en évidence l'implication directe du Ca2+ dans la fixation des molécules d'eau substrat, ainsi que des phénomènes de protonation/déprotonation ayant lieu au cours du cycle des états Si. D'autre part, nous montrons que nos résultats sont en faveur de l'existence de deux sites de fixation aux halogénures.

Le Bassin de Franceville situé au SE du Gabon présente une série de black shales (Formation FB) d'âge Paléoprotérozoïque (2.1 Ga) surmontant les grès de la Formation FA. Ce bassin peu déformé et non métamorphique représente une archive exceptionnelle des processus de dépôt de cette période de l’histoire de la Terre où la vie commence à se développer. En particulier, la Formation FB contient le protore d'un gisement mondial d'oxydes de manganèse exploité par la société Eramet-Comilog. L’objectif de ce travail est de préciser les conditions de formation de ce protore et de le replacer dans l’histoire du remplissage du bassin. Ce protore d'une épaisseur moyenne de 75 m est constitué de carbonates de manganèse ; il a fait l'objet d'une récente campagne de 24 forages carottés d'une profondeur moyenne de 125 m sur le plateau de Bangombé (Pl. Bangombé).A travers une approche pluridisciplinaire comprenant l'étude de ces forages et des affleurements clefs du bassin, ce travail porte sur la caractérisation i) de l'environnement de dépôt du protore et des séries qui l'encadrent (du toit du FA au toit du FB) ; ii) du mode de formation des carbonates de Mn à 2.1 Ga et iii) de l'architecture et de la répartition des hautes teneurs en Mn du protore représentant un gisement potentiel du futur.L’étude pétro-sédimentaire détaillée a permis de distinguer neuf unités (U1 à U9) au sein de la Formation FB organisées suivant un cycle rétrogradant jusqu’à U5 puis progradant jusqu’à U9. Ce découpage montre une évolution du milieu de dépôt depuis un domaine de shoreface contrôlé par des courants deltaïques (U1) évoluant vers des dépôts d’offshore restreint (U2). Ce bassin enregistre ensuite un système de chenaux-levées turbiditiques (U3) qui alimentent un réseau d'injectites reconnu sur l’ensemble du Pl. de Bangombé et qui traverse 150 m de série (U4 à U7) en affectant le protore et ainsi les teneurs en Mn. L'environnement de dépôt du protore (U5 et U6) marque l’isolement du bassin qui devient affamé et contrôlé par une sédimentation biochimique à l’origine du dépôt des carbonates de Mn. L'Unité 7 correspond à la réouverture des apports détritiques en domaine d'offshore supérieur puis en domaine de shoreface dominé par des dépôts de tempêtes et de chenaux sous-aquatiques deltaïques (U8), et enfin lagunaire (U9) dans lequel apparaissent les premiers métazoaires de l’histoire de la planète, suivant une séquence régressive.Une étude géochimique a permis de préciser les conditions de dépôt du protore qui se forme en milieu alcalin anoxique à sub-oxique. Dans ce milieu, nous montrons pour la première fois une précipitation directe des carbonates de Mn sous forme bactériomorphe induite par l'activité photosynthétique des cyanobactéries qui consomment le CO2/HCO3 et conduisant à une augmentation du pH favorable à la formation des carbonates de Mn. L'activité cyanobactérienne est conditionnée par l’absence de courants de fond qui augmentent la turbidité du milieu et stoppent cette dernière.Les corrélations diagraphiques et séquentielles permettent de préciser la répartition spatiale et temporelle du FB permettant ainsi de replacer le protore dans l’histoire tectono-sédimentaire du bassin. Une première phase syn-tectonique (U1 à U3) contrôle l’épaisseur et la mise en place de dépôts turbiditiques dans les parties subsidentes, de dépôts argileux sur les pentes et de dépôt de carbonates sur les hauts-fonds. La seconde phase post tectonique (U4 à U7) permet la mise en place de dépôts relativement isopaques, bien que le protore enregistre une subsidence plus importante au nord du Pl. de Bangombé. On observe ainsi, sur le Pl. de Bangombé, des teneurs en Mn qui augmentent vers le sud alors que l’épaisseur du protore augmente vers le NNE. Postérieurement au dépôt du FB, le protore est structuré par des failles qui le compartimentent en touches de piano limitant ainsi sa continuité sur le Pl. de Bangombé. / The Franceville Basin (2.1 Ga) in southeastern Gabon, hosts a black shale series well preserved (FB Formation) which represents an exceptional example of unmetamorphised Paleoproterozoic sediment strata. This basin includes the protore of one of the largest Mn-oxide laterite ore worldwide, mined by Eramet-Comilog. The aim of this this work is to determine formation conditions of this protore and to characterize the global sedimentary evolution of the FB Formation which include the protore. This 75 m thick protore is constituted of Mn carbonate-rich black shales which represent a potential ore deposit for the future. It was drilled, on the Bangombé plateau, during a recent campaign of 24 boreholes with an average depth of 125 m.Through multidisciplinary study on these cores and key outcrops of the basin, this work focuses on : i) the depositional environment of the Mn-protore and FB Formation ; ii) the processes of formation of the Mn-carbonates at 2.1 Ga and iii) the architecture and distribution of Mn-rich levels of the protore on the Bangombé Plateau.A detailed sedimentological and petrological study allowed us to redefine the division of the FB into nine units, named U1 to U9 from the base to the top. These units show a fine upward cycle up to U5 and a reverse coarse loop until U9. This division leads to a new interpretation to propose an evolution from a shoreface depositional environment controlled by deltaic currents (U1) to an offshore depositional environment with anoxic conditions (U2). In this basin, a system of submarine fan is developed, feeding a network of sand injections (injectites) covering the Bangombé plateau (70 km²) and with a thickness of 150 m affecting U4 to U7, including the Mn-protore. The protore depositional environment formed below the wave base limit (U4, U5 and U6) in a starved basin, controlled by biochemical sedimentation allowed the formation of Mn-carbonates. The end of starved basin, would allow the re-opening of the detrital input into the offshore basin (U7). This basin is then filled by storm bar deposits intersected by deltaic sub-aquatic channels (U8). The U9 unit corresponds to a quiet lagoon environment, allowing the multicellular organism development for the first time on the planet.A geochemical study allowed the characterization of the depositional environment of Mn-carbonates as an anoxic to sub-oxic and alkaline environment. For the first time, we showed that the manganese carbonates, present as bacteriomorph forms, are precipitated from the seawater by the mediated photosynthetic cyanobacterial activity, which allows CO2 / HCO3 depression of the environment and a local increase of pH. The cyanobacterial activity is controlled by the absence of bottom currents, which increase the detrital input. This would stop the activity of the cyanobacteria and thus would lead to the decrease of the Mn-concentration along the protore.Finally, well-log and a sequential correlation analyses allowed us to detail spatial and timing repartition of FB Formation deposit, controlled by a tectono-sedimentary model. We propose two- tectono-sedimentary phases. A first syn-tectonic phase (U1 to U3) controls the depocentres and sedimentation gaps. Turbidite coarse deposits are located in the most subsident part, clay deposits rather on the slope and carbonates on shoals. A second post-tectonic phase (U4 to U7) allows isopach deposits. The Mn-protore formed during the post-tectonic phase. However, it shows a variable thickness due to subsidence to the north of the Bangombé plateau. So, on the Bangombé plateau, Mn-contents increase towards the south, whereas the protore thickness increases towards the NNE. Moreover sand injectites decrease Mn-content in the eastern part of the Bangombé plateau and impact on the economic evaluation of the Mn-carbonates. Currently, the protore is structured by post-sedimentary faults, which lead to a non-continuity of the high Mn levels on the Bangombé plateau.

Avec la hausse mondiale de la fréquence des floraisons de cyanobactéries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le développement d’une méthode de détection/quantification rapide d’un maximum de CT s’impose. Cette méthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicité de plans d’eau contaminés par des CB et ainsi d’émettre rapidement des avis d’alerte appropriés afin de protéger la santé publique. Une nouvelle technologie utilisant la désorption thermique induite par diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique sous pression atmosphérique (APCI) et reliée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a déjà fait ses preuves avec des temps d'analyse de l’ordre de quelques secondes. Les analytes sont désorbés par la LDTD, ionisés en phase gazeuse par APCI et détectés par la MS/MS. Il n’y a donc pas de séparation chromatographique, et la préparation de l’échantillon avant l’analyse est minimale selon la complexité de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testées (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule l’ANA-a a généré une désorption significative nécessaire au développement d’une méthode analytique avec l’interface LDTD-APCI. La forte polarité ou le poids moléculaire élevé des autres CT empêche probablement leur désorption. L’optimisation des paramètres instrumentaux, tout en tenant compte de l’interférence isobarique de l’acide aminé phénylalanine (PHE) lors de la détection de l’ANA-a par MS/MS, a généré une limite de détection d’ANA-a de l’ordre de 1 ug/L. Celle-ci a été évaluée à partir d’une matrice apparentée à une matrice réelle, démontrant qu’il serait possible d’utiliser la LDTD pour effectuer le suivi de l’ANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 à 12 ug/L). Il a été possible d’éviter l’interférence isobarique de la PHE en raison de sa très faible désorption avec l’interface LDTD-APCI. En effet, il a été démontré qu’une concentration aussi élevée que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interférence sur le signal de l’ANA-a. / Within the context of the worldwide increasing frequency of cyanobacterial (CB) blooms, some containing cyanotoxins (CT), the development of a detection/quantification method for the fast analysis a maximum of CT is necessary. This method would allow daily tracking of the toxicity of CB-contaminated water such that, as warranted, appropriate measures can be taken quickly to protect public health. A new technology using laser diode thermal desorption (LDTD) coupled to atmospheric pressure chemical ionization (APCI)-tandem mass spectrometry (MS/MS) has shown great potential to reduce analysis time to seconds. Analytes are desorbed by the LDTD, ionized in gas-phase by APCI and detected by MS/MS. Therefore, there is no chromatographic separation and sample treatment prior to analysis is minimal, depending on the complexity of the sample matrix. Among the four CT tested (microcystin-LR, cylindrospermopsin, saxitoxin and anatoxin-a (ANA-a)), only ANA-a exhibited sufficient desorption which is necessary to develop an analytical method with the LDTD-APCI interface. The strong polarity or high molecular weight of the other CT probably inhibited their efficient desorption. Optimization of instrumental parameters, while accounting for the isobaric interference caused by the acid amino phenylalanine (PHE) in the detection of ANA-a by MS/MS, generated a detection limit of the order of 1 ug/L ANA-a. This value was obtained in a simulated natural matrix, demonstrating that it would be possible to use LDTD to monitor ANA-a in natural waters within the range of current applicable environmental guidelines (1 to 12 ug/L). Because PHE desorption is limited with the LDTD-APCI interface, this method avoids its interference on ANA-a analysis, even at PHE concentrations as high as 500 ug/L.

La recherche a été initiée par l'observation d'efflorescences de Planktothrix agardhii, une cyanobactérie dulçaquicole potentiellement toxique, dans deux étangs saumâtres, les étangs de l'Olivier et de Bolmon, avec dans ce dernier le déclin de l'espèce concomitamment à une augmentation de salinité. L'objectif de l'étude consistait à évaluer l'influence de la salinité du milieu sur la performance, l'hégémonie et la production de toxine de Planktothrix agardhii au sein de la communauté phytoplanctonique.La réalisation de suivis pluriannuels in situ couplés à des expérimentations en milieu contrôlé a permis de démontrer (i) la capacité d'acclimatation et d'adaptation à la salinité de Planktothrix agardhii, laquelle garantit sa suprématie et sa production toxinique en milieu saumâtre ; et (ii) la modification structurale et fonctionnelle de la communauté phytoplanctonique suite à une augmentation de salinité supérieure au seuil d'halotolérance de Planktothrix agardhii. La recherche témoigne ainsi de la versatilité des cyanobactéries qui renforce leur aptitude à être de bons compétiteurs, laissant présager leur persistance, la continuité de leurs nuisances, et leur expansion dans le futur. / The research was launched by the observation of Planktothrix agardhii blooms, a potentially toxic freshwater cyanobacterium, in two brackish ponds, the Olivier and Bolmon ponds, with in the latter, the concomitantly collapse of P. agardhii with an increase in salinity. The goal of the study was to assess the salinity influence on the performance, the dominance and the toxin production of P. agardhii within the phytoplankton community.The achievement of a long-term monitoring in situ combined with batch cultures experiments has demonstrated (i) the ability of P. agardhii to acclimate and adapt to salinity, which ensure its supremacy and its toxin production in brackish areas, and (ii) the structural and functional changes of the phytoplankton community with the exceeding of the salt-tolerance threshold of P. agardhii .The research reflects the cyanobacteria versatility that enhances their suitability for being good performers, suggesting their persistence along with their nuisances, and their expansion in the future.

La photosynthèse oxygénique peut être le lieu de formation des Formes Réactives de l’Oxygéne (FROs). Les FROs altèrent toutes les macromolécules de la cellule, générant ainsi un stress oxydant. Toute perturbation du métabolisme cellulaire peut conduire à ce type de stress. Les cyanobactérie sétant les premiers organismes à avoir émis de l’oxygène sur terre, elles ont du développer très tôt au cours de l’évolution des mécanismes de perception et de défense pour lutter contre ce stress. Nous nous sommes intéressés à l’étude des mécanismes qui permettent à la cyanobactérie filamentuse et diazotrophe Anabaena PCC 7120 de s’adapter à diverses conditions de stress et de carence : stress oxydant, carence en fer et en azote combiné. En réponse à une carence en azote combiné, elle différencie en 24 h des hétérocystes : cellules spécialisées dans la fixation de l’azote atmosphérique. Nous avons étudié la réponse transcriptomique globale de cette bactérie à la fois au stress oxydant et à la carence en fer et nous avons établit la connection existant entre ces deux stress. Nous avons pu identifier le régulateur transcriptionnel pleiotrope impliqué dans la perception et la signalisation du stress peroxyde et nous en avons élucidé le mécanisme d’action. Nous avons également étudié une Ser/Thr kinase qui joue un rôle important à la fois dans la réponse au stress oxydant et à la carence en azote combiné. Notre étude a montré que cette kinase pourrait être le lien moléculaire entre ces deux conditions, puisque une cible potentielle de cette kinase semble être la protéine HetR qui est le régulateur clé du processus de différenciation cellulaire. / Oxygenic photosynthesis may generate Reactive forms of Oxygéne (ROS). These reactive oxygen species can damage all the macromolecules of the cell, inducing oxidative stress. Any disruption of cellular metabolism can lead to oxidant damage. Cyanobacteria were the first organisms producing oxygen on Earth, they therefore had to develop very early during evolution the mechanisms of perception and defence to cope with this tstress. We are interested in studying the mechanisms that allow the diazotrophic filamentous cyanobacterium Anabaena PCC 7120 to adapt to various conditions of stress and stravations: oxidative stress, iron and combined nitrogen starvations. Anabaena PCC 7120 is a simple model for the study of cell differentiation. In response to combined nitrogen stravation it can differentiate heterocysts, cell specialized in molecular nitrogen fixation. We studied the global transcriptomic response of this bacterium to both oxidative stress and iron deficiency and we establish the crosstalk between these two stresses. We were able to identify the global transcriptional regulator involved in the perception and in the signaling of a peroxide stress. Its mechanism of action was elucidated. We also studied a Ser / Thr kinase that plays an important role both in the response to oxidative stress and combined nitrogen stravation. Our study showed that this kinase may be the molecular link between these two conditions, as a potential target of this kinase appears to be the HetR protein which is the key regulator of cellular differentiation process.

Apparues il y a environ trois milliards d'années, les cyanobactéries ont façonné notre planète, en produisant l’atmosphère oxygénique. De nos jours, les cyanobactéries sont les organismes photosynthétiques les plus abondants dans notre environnement, elles assurent environ 30 à 40% de la production d'O2, et de la consommation du CO2 par les océans et constituent le premier maillon de la chaîne alimentaire. A part la photosynthèse, leur métabolisme est encore très mal connu. Ainsi, pour mieux comprendre le métabolisme cyanobactérien et proposer des stratégies de reprogrammation, il est primordial de développer des méthodes analytiques permettant l’étude globale de leur métabolisme en réponse à des variations de conditions environnementales et de stress. La cyanobactérie modèle Synechocystis PCC6803 convient parfaitement à ce type d’analyse. En effet, Synechocystis est un unicellulaire, hétérotrophe facultative capable de se développer en eau douce ou saumâtre et à un pH alcalin. Synechocystis possède un petit génome d’environ 4.0 Mb entièrement séquencé et facilement manipulable grâce aux outils développés au laboratoire. Son génome prédit l'existence d'un métabolisme carboné complexe mais encore peu étudié. Mon travail de thèse est centré sur cette analyse par la combinaison de deux approches, la génomique fonctionnelle et la métabolomique. Durant ma thèse en collaboration avec le LEMM dirigé par Christophe Junot iBiTec-S/SPI, j’ai développé un protocole d’extraction des métabolites de Synechocystis, ainsi qu’une méthode d’analyse métabolomique par couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse LTQ-Orbitrap à haute résolution. L’application de cette nouvelle méthode analytique m’a permis d’étudier l’influence de la lumière et du glucose sur le métabolisme de Synechocystis. Ainsi, j’ai montré que Synechocystis cultivée en présence du glucose reprogramme fortement son métabolisme. Parmi les résultats très intéressants, j’ai montré que le glucose engendre un stress oxydant. Chez tous les organismes, une forte activité du métabolisme carboné entraîne la production de métabolites toxiques tels que le méthyglyoxal (MG). Le MG modifie irréversiblement de nombreuses bio-molécules. Dans le cadre de ma thèse, j’ai commencé à m’intéresser à l'effet du MG sur la physiologie et le métabolisme de Synechocystis. J'ai construit 25 mutants KO pour les gènes de la glycolyse et du métabolisme du glycérol permettant de moduler la concentration intracellulaire de MG et également les gènes impliqués dans les voies de détoxication du MG dont celle dépendante de la synthèse du GSH (la voie des glyoxalases). J’ai pu montrer que les gènes responsables de la synthèse du GSH sont essentiels à la viabilité cellulaire. Je suis parvenu toutefois à obtenir un mutant déplété de gshB et ne produisant plus de GSH à un niveau détectable. En faisant une analyse métabolomique approfondie, j’ai mis en évidence pour la première fois que Synechocystis était capable produire deux tripeptides non-thiolés analogues structuraux du GSH; l’acide ophthalmique et l’acide norophthalmique identifiés jusqu’à présent uniquement chez les mammifères. La comparaison des métabolomes de culture de souches sauvage, ou dépletées en gshA, gshB ou ggt, a permis de montré que ces analogues sont synthétisés par les mêmes enzymes que le GSH à savoir GshA et GshB. Par ailleurs, une autre molécule anti-oxydante dont la synthèse est connue chez quelques champignons et qui s’accumule chez l’Homme par l’apport alimentaire a également été observée. / Cyanobacteria are fascinating microorganisms. They are among the oldest life forms, regarded as the progenitors of the oxygenic photosynthesis and plant chloroplast. Furthermore, cyanobacteria have evolved as the largest and most diverse groups of bacteria in colonizing most marine and fresh waters, as well as soils. An important reason for the hardness of cyanobacteria is their successful combination of effective metabolic pathways driven by their efficient photosynthesis that uses nature's most abundant resources, solar energy, water and CO2, to produce a large part of the Planet's oxygenic atmosphere and organic assimilates for the food chain. Hence, cyanobacteria are receiving a growing attention because of their potential for the carbon-neutral production of biofuels and bioplastics. To better understand cyanobacteria and turn their biotechnological potentials into an industrial reality, we need to develop robust protocols for global analysis of their metabolism and its responses to environmental stresses. The model cyanobacterium Synechocystis PCC6803 is well suited for this purpose. Synechocystis is a basic organism, i.e. unicellular, which grows well (i) in fresh- and marine-waters; (ii) in the presence of glucose that can compensate for the absence of light; and (iii) at high pH that prevents microbial contaminations. Furthermore, Synechocystis harbors a small sequenced genome (about 4.0 Mb), which can be easily manipulated. In the present work, we developed a robust protocol for metabolome analyses of Synechocystis, using liquid chromatography (LC) for metabolite separation, coupled to a LTQ-Orbitrap mass spectrometer that provides high sensitivity and resolution, accurate mass measurements, and structural informations with MS/MS or sequential MSn experiments that facilitate metabolite identification. Consequently, we applied the PFPP-LC/MS method to analyze the metabolome of Synechocystis growing under various conditions of light and glucose, which strongly influence cell growth. We found that glucose increases glucose storage and catabolism, while it decreases the Calvin-Benson cycle that consumes photosynthetic electrons for CO2 assimilation. Depending on light and glucose availabilities, this global metabolic reprogramming can generate an oxidative stress, likely through the recombination of the glucose-spared electrons with the photosynthetic oxygen thereby producing toxic reactive oxygen species. Furthermore, we studied the metabolism of an endogenous toxic the méthylglyoxal and its main catabolic pathway going through the glyoxalases system glutathione dependent.

Le développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d’H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l’analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l’hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l’opéron hox. Lorsque j’ai débuté ce travail, 2 activateurs de l’opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l’opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l’opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d’AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j’ai montré que cette cystéine n’est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l’affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s’agit de la première fois, qu’un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J’ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d’abrB2. J’ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L’effet est également visible sur l’activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d’AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s’accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l’Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L’ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l’expression de l’hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d’un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l’hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j’ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d’éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d’H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d’élaborer des stratégies de production d’H2 efficace. / Developing photosynthetic organism (trapping CO2 while preserving fresh water and arable soils without adding fertilizers) able to use Sun light to produce dihydrogen (H2) is depending on a better understanding of the role of hydrogenase in the cyanobacterial metabolism. The Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobactéries (LBBC) where I worked during my thesis uses « Integrative Biology » approach to analyze the metabolism leading to H2 photoproduction by the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. My work focused on analyzing the regulation network leading to H2 production by the bidirectionnal hydrogenase with Ni-Fe cluster (composed of 5 subunits) encoded by hox operon. When I started this work, two transcriptionnal activators were identified : AbrB1 and LexA. An article, of which I’m sharing first author position, is published (Dutheil et al. 2012 J Bact.), it describes the identification by different approachs of a new transcriptionnal factor of hox operon : AbrB2 (homologous to AbrB1). I showed that hox expression is negatively regulated by AbrB2 by using transcriptionnal fusion to cat reporter gene (introduced in the wild type background or the AbrB2-deleted one) and qRT-PCR experiments. By the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method, we confirmed a direct interaction between AbrB2 and the promoter region of hox operon. Collaborating with two CEA laboratories, we showed that a mutant lacking AbrB2 harbours an increased hydrogenase activity, validating that AbrB2 is a negative regulator of H2 production.In a second time of my thesis and colaborating with two post-doc of the laboratory, we evidenced the role of the unique cysteine of AbrB2 in redox-controlling the transcriptionnal regulator activity of the protein.Using the EMSA method, I showed that the cysteine is not crucial for AbrB2 fixing on hox promoter, but also that the redox modification occuring on this residue inhibits this same binding activity. Collaborating with other labs, we identified the post-translational modifications that may occur on AbrB2 cysteine and it is the first time that such a regulating mechanism is identified for this family of regulators and in cyanobacteria. I constructed a strand harbouring the abrB2C34S mutant allele on the chromosome and expressed by the abrB2 natural promoter. I showed with this construction and using diverse methods (hydrogenase activity, qRT-PCR, Western blot and transcriptome) that AbrB2 cysteine plays a role in its regulating activity : regulating activity is 60% less efficient towards the 529 target genes (either direct and indirect) of the mutated regulator. The effect is also seen on hydrogenase activity and hox genes. This result was completed by thermoinduced overexpression assays that show that C34S mutation of AbrB2 alters protein stability : the mutated protein accumulates less than wild type allele in the same conditions, which is lethal. A manuscript, of which I’m sharing first author position, and describing those results is being finalised and will be submitted soon to the IJHE (International Journal of Hydrogen Energy).Altogether, my results allow a better understanding of the biological mechanisms linked to bidirectionnal hydrogenase expression and agree with a possible role for hydrogenase in detoxifying redox stresses. The determination of the relationships between the different regulators of hydrogenase, and their possible post-translational modifications that I revealed, highlight an enzyme with complex regulation. This new knowledge brings an original outlook on hydrogen photoproduction by cyanobacteria and shall allow elaboration of efficient H2 production strategies.