La leptospirose est une zoonose de distribution mondiale provoquant plus d'un million de cas sévères chez l'Homme et causant des infections chez les animaux. Les agents responsables de cette maladie sont les espèces pathogènes du genre Leptospira, bactéries atypiques dont les mécanismes de virulence sont largement méconnus. Des vaccins humains et vétérinaires existent mais leur action est restreinte à certains sérovars qui ne reflètent que partiellement l'épidémiologie actuelle, complexe et fluctuante dans l'espace et le temps. Les objectifs de la thèse présentée dans ce manuscrit ont été d'une part de caractériser de nouveaux facteurs de virulence de Leptospira et d'autre part d'identifier des candidats vaccins capables d'induire une protection croisée dans le cadre du projet collaboratif COVALEPT mené par Merial, regroupant des partenaires académiques et industriels. Dans un premier temps, un outil de numération par cytométrie en flux, plus rapide et performant que la méthode standard, a été développé. Par la suite, l'étude de mutants générés par transposition aléatoire ou spontanés a permis d'identifier trois facteurs de virulence : LIC12144, requis pour la synthèse des lipopolysaccharides, FliM, essentiel à la motilité, et LIC11221, potentiellement impliqué dans le chimiotactisme. De plus, deux candidats vaccins, une protéine recombinante et une souche vivante atténuée, ont été conçus et ont démontré une efficacité partielle contre la maladie en modèle rongeur. En conclusion, ce travail apporte des connaissances inédites sur les facteurs de virulence de Leptospira et permet d'envisager le développement de vaccins à large spectre de protection contre la leptospirose / Leptospirosis is a worldwide zoonosis responsible for more than 1 million human cases and severe infections in animals. The causative agents are pathogenic species of Leptospira. The virulence mechanisms of these atypical bacteria remain largely unknown. Human and animal vaccines exist but the protection is restricted to a few serovars, representing only partially the complex and fluctuating epidemiology of the disease. The aims of the thesis presented in this manuscript were to characterize new virulence factors on Leptospira on the one hand and to identify new cross-protective vaccine candidates on the other hand, in the context of the COVALEPT collaborative project led by Merial, gathering industrial and academic partners. First, a flow cytometry based enumeration method for leptospires was developed, more rapid and efficient than the current standard technique. Then, the study of mutants generated by random transposition and spontaneously avirulent strains led to the identification of three virulence factors: LIC12144, required for lipopolysaccharides biosynthesis, FliM, essential for motility, and LIC11221 which may be involved in chemotaxis. Finally, two vaccine candidates conferring partial protection against the disease in a rodent model were conceived, a recombinant protein and a live attenuated strain. Altogether, this work brings new knowledge on Leptospira virulence and supports the development of broad spectrum vaccines against leptospirosis

Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne caractérisée par la prolifération d’un clone plasmocytaire tumoral dans la moelle osseuse et d’une accumulation d’une immunoglobuline monoclonale dans le sérum et/ou les urines. La diversité des anomalies cytogénétiques, rendant la maladie plus ou moins agressive, et la variabilité de la réponse au traitement font du MM une maladie hétérogène. Le MM reste incurable dans la majorité des cas avec une médiane de survie de 5 à 7 ans. La rechute après traitement est due à la persistance de cellules tumorales au sein de la moelle osseuse, appelée maladie résiduelle ou en anglais « Minimal Residual Disease » (MRD). La cytométrie en flux multiparamétrique (CFM) est une technique sensible, simple et rapide qui permet d’identifier et de caractériser des cellules d’intérêt dans un échantillon biologique. C’est dans le but de simplifier le suivi de la MRD du MM que nous avons développé une solution complète basée sur la CFM. Cette solution comprend (i) la conception d’un panel à 5 couleurs, composés des anticorps (Ac) anti-CD38, anti-kappa et anti-lambda pour identifier les plasmocytes totaux et de deux pools d’Ac couplés au même fluorochrome (anti-CD19/anti-CD27, pool négatif et anti-CD56/anti-CD117/anti-CD200, pool positif) pour détecter les plasmocytes tumoraux ; (ii) le développement d’un préparateur afin d’automatiser l’ensemble des étapes de préparation de l’échantillon ; et (iii) l’automatisation de l’analyse des résultats de CFM grâce à un logiciel que nous avons créé. Cette solution simple et entièrement automatisée permet d’augmenter la reproductibilité et la productivité, de diminuer le coût du test, sans altérer la sensibilité ou la spécificité. En parallèle de ces travaux, nous avons construit un score de risque simple basé sur l’expression de gènes codant pour des protéines de surface (CD24, CD27, CD36 et CD302) permettant de prédire la survie des patients atteints de MM au diagnostic ainsi qu’à la rechute. / Multiple myeloma (MM) is a hematological malignancy characterized by clonal plasma cell proliferation in bone marrow and abnormal monoclonal immunoglobulin accumulation in the serum and/or urine. The heterogeneity of the disease is partly due to the cytogenetic abnormalities diversity making the disease more or less aggressive. MM is incurable in the majority of cases with a median survival between 5 and 7 years. The persistence of abnormal plasma cells in bone marrow after treatment is called minimal residual disease (MRD) and leads to the patient relapse. Multiparametric flow cytometry (MFC) is a sensitive, simple and fast technique to identify and characterize cells of interest in biological samples. In order to simplify MRD follow-up we have developed a complete solution based on MFC. This solution includes (i) the 5-color panel design, composed of anti-CD38, anti-kappa and anti-lambda antibodies (Ab) to identify total plasma cell population and two pools of Ab paired to the same fluorophore (anti-CD19/anti-CD27, negative pool and anti-CD56/anti-CD117/anti-CD200, positive pool) to detect abnormal plasma cells; (ii) the development of a device used to automatically prepare biological samples before MFC; and (iii) the analysis automation of MFC results using a homemade software. This fully automated solution increases reproducibility and productivity, decreases processing and analyzing time as well as test cost, without affecting sensibility and specificity. In parallel, we have built a simple risk score based on gene expression encoding surface proteins (CD24, CD27, CD36 and CD302) providing MM patient outcome at diagnostic and MRD follow-up.

Le compartiment phytoplanctonique joue un rôle prépondérant dans les écosystèmes marins de par sa position comme principal producteur primaire et fixateur de carbone, mais aussi en raison de sa capacité de multiplication élevée, qui lui permet de réagir rapidement aux changements environnementaux et d'en faire un potentiel bio indicateur. La plupart des études antérieures ne se sont basées que sur des observations réalisées à basse fréquence, ou bien ne ciblant qu'une partie des groupes/espèces phytoplanctoniques entraînant une perte importante d'information sur la variabilité d'abondance et composition du phytoplancton. Cette thèse a été réalisée dans le cadre du projet européen transfrontalier DYMAPHY dont l'objectif principal visait à améliorer les connaissances et l'évaluation de la qualité des eaux marines de la Manche et de la Mer du Nord, à travers l'étude de l'ensemble du compartiment phytoplanctonique et ses paramètres complémentaires. Dans ce contexte, une approche à haute fréquence et/ou haute résolution spatiale, via l'utilisation de la cytométrie en flux semi-automatisée, a permis de mieux caractériser la variabilité spatiale et temporelle du phytoplancton en Manche Orientale. Pour cela on a utilisé 3 approches complémentaires dont les résultats principaux obtenus lors de ce travail de thèse sont les suivants : (i) une étude à haute fréquence, avec une analyse cytométrique toutes les 10 minutes, qui a permis de révéler une forte variabilité spatiale du phytoplancton, à une échelle régionale (Manche Orientale), dont l'assemblage communautaire n'était pas déterminé par l'hydrologie ; (ii) un suivi saisonnier de l'ensemble du spectre de taille des cellules phytoplanctoniques le long d'un gradient côte-large proche du détroit du Pas de Calais, qui a révélé, au-delà d'une certaine hétérogénéité spatiale, une forte variabilité temporelle permettant de définir les successions saisonnières et les principaux facteurs les régissant, à savoir la luminosité et la concentration en sels nutritifs ; (iii) un suivi de 3 ans sur un point fixe en eaux côtières, qui a permis de mettre en relation les traits de vie des groupes phytoplanctoniques avec l'environnement, afin de comprendre comment les communautés phytoplanctoniques s'assemblent en réponse à la variabilité environnementale. Les résultats ont montré une différenciation fonctionnelle liée à l'utilisation des ressources et des stratégies de croissance, associées à un gradient de ressources. Cette étude confirme notamment l'importance de "l'hypothèse du ratio de masse", qui prédit que les traits de vie de l'espèce la plus abondante au sein d'une communauté, seraient le moteur des processus les plus importants au sein d'un écosystème. / Phytoplankton micro-organisms play a key role in marine ecosystems as main primary producers, being responsible for most of carbon uptake, but also due to their fast division rates which allow them to effectively react to environmental changes and which make them potentially good bio-indicators. Most previous studies have based their observations on low frequency sampling, only considering one fraction of phytoplankton communities, resulting in a significant loss of information on the dynamics of phytoplankton abundance and diversity. This thesis was carried out in the frame of the European cross-border DYMAPHY project, which main objective was to improve the understanding and the evaluation of the quality of marine waters in the English Channel and the North Sea, through the study of the whole phytoplankton compartment and related environmental parameters. A high frequency and/or high resolution approach, through the use of semi-automated flow cytometry, allowed us to reduce this loss of information and to better characterize the phytoplankton spatial and temporal variability in coastal water of the eastern English Channel.Three approaches were applied, leading to the ollowing results : (i) A high frequency study, performing one analysis every 10 minutes, which revealed a strong phytoplankton variability at the regional scale, with community assemblages that were not governed by hydrology ; (ii) A seasonal monitoring of the whole phytoplankton size-spectrum, which revealed the seasonal successions and the main factors governing them : nutrient concentrations and the daily light level which structured the transition of most phytoplankton groups ; (iii) A three-year follow-up at a coastal station, which made it possible to relate the traits-based characterization of each functional phytoplankton group to the environmental conditions, in order to better understand phytoplankton community assembly in response to environmental variability. The results have revealed a functional differentiation mainly due to the use of resources and the growth strategies, both of them driven by a resource gradient. This study confirms the importance of the "mass ration hypothesis", which predicts that the dominant life traits of the most abundant species, would be the main driver of the key ecosystem processes.

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La biomasse lignocellulosique (BLC) est, à l’heure actuelle, la meilleure alternative au pétrole en ce qui concerne la production d’énergie et de molécules à haute valeur ajoutée. Seulement, son exploitation nécessite l’emploi de prétraitements dont les plus courants génèrent des composés inhibant la croissance des microorganismes (dérivés furaniques, acides aliphatiques, phenols).Le but de ces travaux de thèse est donc de répondre à la question suivante : “Est il possible d’utiliser la nanofiltration pour éliminer les composés inhibiteurs présents dans un hydrolysat hémicellulosique, afin de le rendre fermentescible par Bacillus subtilis 168 ?”La détermination des concentrations minimales inhibitrices de ces composés inhibiteurs sur Bacillus subtilis 168 ont permis de fixer la quantité d’inhibiteurs à éliminer de l’hydrolysat.La dia-nanofiltration à l’aide de la membrane DK (GE, USA) a permis d’éliminer de manière efficace (+ de 90%) les dérivés furaniques et les acides alphatiques. Toutefois l’émination des composés phénoliques s’est révélée plus complexe, ainsi seul 25% du syringaldéhyde a été éliminé.La cytométrie en flux a permis de montrer une action de l’acide férulique et de la vanilline sur la fluidité et la polarisation de la membrane plasmique. / Lignocellulosic biomass is a promising alternative to oil for the production of energy and high added value molecules. However, its exploitation requires the use of pretreatment processes. The most commonly used processes generate by-products which present inhibitory action on microorganisms (furan derivatives, aliphatic acids, phenolic compounds).The main goal of this thesis project is to answer the following question : “Is it possible to use nanofiltration to remove inhibitory compounds from hemicellulosic hydrolysate, in order to ferment the latter with Bacillus subtilis 168 ?”Determination of minimal inhibitory concentrations of these inhibitory compounds allowed to determine, for each one, the quantity to remove from the hydrolysate.Dia-nanofiltration with DK membrane (GE, USA) allowed to efficiently remove (more than 90%) furane derivatives of aliphatic acids. However, removal of phenolic compounds was more complexe, hence, only 25% of syringaldehyde could be removed. Though most indentified inhibitory compounds were removed, Bacillus subtilis 168 was still not able to ferment the hydrolysate.Flow cytometry showed that férulic acid and vanillin presented an impact on Bacillus subtilis 168 plasma membrane fluidity of polarisation.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Actinobacillus pleuropneumoniae est un pathogène strict des voies respiratoires du porc et l'agent causal d'une pleuropneumonie. Plusieurs facteurs de virulence déjà connus sont impliqués dans ce processus infectieux. Récemment, nous avons démontré la liaison de l'hémoglobine porcine au lipopolysaccharide (LPS) d'A. pleuropneumoniae. Nous avons également mis en évidence qu'A. pleuropneumoniae pouvait utiliser l'hémoglobine comme seule source de fer pour sa croissance. Par contre, aucune information n'est présentement disponible concernant le système d'acquisition en fer provenant de l'hémoglobine porcine. Certains chercheurs ont identifié la liaison entre le LPS de certaines bactéries et l'hémoglobine humaine. De plus, des protéines liant l'hémoglobine ont été mises en évidence chez certaines bactéries. L'intérêt premier des études décrites dans cette thèse était de caractériser les molécules impliquées dans la liaison de l'hémoglobine porcine chez A. pleuropneumoniae. Le premier objectif de ce travail consistait à étudier l'effet de la liaison de l'hémoglobine porcine sur les propriétés biologiques et physiques du LPS d'A . pleuropneumoniae. Tout d'abord, la liaison de l'hémoglobine porcine à la surface de la cellule entière d'A. pleuropneumoniae a été mise en évidence par microscopie électronique à transmission (MET) et par spectroscopie. Puis il a été observé par cytométrie en flux que cette liaison ne modifiait pas l'accessibilité des anticorps aux antigènes de surface 0 et K. Ensuite, la liaison de l'hémoglobine porcine au lipide A de la molécule de LPS a été confirmée par le déplacement de la sonde fluorescente dansylcadavérine. Des analyses en MET ont mis en évidence que l'hémoglobine porcine fragmentait le LPS et diminuait ainsi sa vélocité de sédimentation sur un gradient de sucrose. Des tests sur lysats d'amébocytes du Limulus (ou LAL) ont révélé que l'hémoglobine diminuait l'activité biologique du LPS et réduisait également son habileté à stimuler la production d'oxide nitrique par les macrophages murins. Le deuxième objectif de notre étude consistait à élaborer une méthodologie nous permettant de quantifier la liaison de l'hémoglobine porcine à la surface d'A. pleuropneumoniae dans le but de comparer différentes souches et différentes conditions de croissance. L'activité liant l'hémoglobine a été évaluée chez A. pleuropneumoniae par cytométrie en flux à l'aide d'hémoglobine porcine marquée à la fluorescéine. L'activité liant l'hémoglobine a été démontrée chez des souches représentatives d'A . pleuropneumoniae appartenant aux sérotypes 1 et 2. En comparant l'activité liant l'hémoglobine chez A. pleuropneumoniae sérotype 1 souche 4074 dans différentes conditions de croissance, il a été démontré que la restriction en fer augmentait l'expression des récepteurs d'hémoglobine. Ceci implique que l'activité liant l'hémoglobine semble, en partie, répressible par le fer. Ces résultats nous indiquaient que, en plus des LPS, des protéines de la membrane externe (OMPs) régulées par le fer pourraient possiblement être impliquées dans l'activité liant l'hémoglobine. De plus, des mutants isogéniques LPS et un mutant acapsulé d A. pleuropneumoniae serotype 1 ont été testés par cytométrie en flux afin de comprendre le rôle des polysaccharides de surface dans l'activité liant l'hémoglobine. Les expériences menées avec le mutant acapsulé ont indiqué que les molécules de surface possédant une activité liant l'hémoglobine étaient plus exposées à la surface cellulaire en absence du polysaccharide capsulaire. Cependant, l'activité liant l'hémoglobine des mutants LPS analysés dans cette étude était semblable à celle de la souche mère. Le profil des protéines de la membrane externe d'A. pleuropneumoniae sérotype 1 obtenu dans des conditions suffisantes ou restreintes en fer a été également évalué sur gel de polyacrylamide. Des OMPs régulées par le fer ont été observées suggérant qu'une ou plusieurs de ces OMPs pourraient jouer un rôle dans l'activité liant l'hémoglobine détectée par cytométrie en flux. Le troisième objectif de notre étude était d'identifier et de caractériser un ou des récepteurs protéiques impliqués dans la liaison de l'hémoglobine porcine. Les souches de référence représentant les 12 sérotypes d'A. pleuropneumoniae ont été examinées pour tester leur habileté à utiliser différentes sources de fer pour leur croissance. Dans un test de promotion, toutes les souches ont utilisé soit l'hémoglobine porcine ou l'hémine porcine. Cette acquisition ne semblait pas spécifique d'espèce étant donné que les souches d'A. pleuropneumoniae ont également utilisé l'hémoglobine bovine ou l'hémine bovine comme seule source de fer pour croître. En utilisant une procédure de purification par affinité à l'aide d'hémine- ou d'hémoglobine-agarose, une OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine a été isolée chez A. pleuropneumoniae sérotype 1 souche 4074 après croissance dans des conditions de restriction en fer. Des OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hémine ou l'hémoglobine ont également été identifiées. Une étude portant sur les souches de référence des 12 sérotypes d'A. pleuropneumoniae après croissance dans des conditions de restriction en fer a révélé que toutes les souches, excepté celles des sérotypes 3, 6, 7, et 10 synthétisaient l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine. Cette étude a également démontré que l'OMP mineure de 47 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine était conservée chez toutes les souches testées représentant les 12 sérotypes; l'OMP mineure de 36 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine a été isolée chez toutes les souches testées sauf chez la souche 8329/85 représentant le sérotype 12. Le marquage de la cellule entière d'A. pleuropneumoniae au palmitate radioactif a indiqué que l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine n'était pas de nature lipoprotéique. Cependant, les OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine pourraient être des lipoprotéines étant donné que des bandes d'approximativement 47 et 36 kDa ont été observées suite au marquage. Malgré plusieurs essais, il n'a pas été possible de déterminer la séquence N-terminale en acides aminés de l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine. Afin de prouver que l'OMP majeure de 75 kDa purifiée par hémine-agarose ou hémoglobine-agarose étaient identiques et dans le but d'obtenir une séquence nous permettant de synthétiser un oligonucléotide, ces protéines ont été analysées par un spectromètre de masse couplé à un HPLC et à un séquenceur Edman. Ces analyses ont révélé des peptides communs entre l'OMP purifiée par hémineagarose et l'OMP purifiée par hémoglobine-agarose. Ces résultats suggèrent fortement que ces peptides proviendraient de la même protéine. L'ensemble de nos résultats suggèrent donc que l'OMP majeure de 75 kDa et les OMPs mineures de 36 et 47 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine chez A. pleuropneumoniae pourraient être impliquées dans le système d'acquisition en fer provenant de l'hémine ou de l'hémoglobine porcine.

Résumé : Cette thèse porte sur l’élaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation génétique (SNP) grâce à la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisées avec des oligonucléotides couplée à une détection de la fluorescence. Le modèle biologique choisi pour ce projet est le génotypage plaquettaire et plus particulièrement la recherche du gène biallélique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a été d’optimiser un outil de capture préalablement développé dans l’équipe (Trévisan, 2011) afin de réduire le nombre d’étapes et de simplifier la mise en œuvre globale du test en modifiant les interactions moléculaires utilisée pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme élément de détection. En présence d’ADN cible, des sandwichs sont formés entre les particules fluorescentes et les particules magnétiques biofonctionnalisées. Ces sandwichs sont purifiés par séparation magnétique et la fluorescence est détectée par trois méthodes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (détection par ondes évanescentes). Dans un premier temps, les paramètres de fonctionnalisation chimique et biologique des différentes particules (magnétiques et fluorescentes) ont été déterminés et optimisés ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur détection ont été suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois méthodes différentes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur à ondes évanescentes). Les résultats obtenus avec les différentes méthodes de détection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN développé permet de capturer la cible synthétique (oligonucléotide) HPA-1 en réduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1 qui ne diffère que d’un nucléotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich spécifique et du sandwich non spécifique est d’environ 2,5 à 3. Ce rapport devra être amélioré par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine étape consistera à optimiser le système de capture d’ADN développé pour gagner en spécificité et déterminer la limite de détection du test. Ce test devra également être validé avec des échantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra être détectée par un photodétecteur miniaturisé actuellement développé à l’Université de Sherbrooke. Des études préliminaires présentées dans ce manuscrit montrent les potentialités de ce nouveau transducteur. // Abstract : This thesis is about the development of a new assay to capture DNA. This assay is based on the formation of sandwiches between biofunctionnalized with oligonucleotides carboxylatex microparticles combined with fluorescence detection. It should be able to discriminate single nucleotide polymorphism (SNP). This assay is designed to be applied to platelet genotyping for the research of the gene HPA-1. The main goal of this work was to improve an assay previously developed (Trévisan, 2011) by INL and EFS Rhône-Alpes. The objectives are to reduce the number of steps and to simplify the test. To do so, the molecular interactions used in order to capture target DNA are modified and fluorescent microparticles are used for the detection. In the presence of target DNA, sandwiches are formed between both biofunctionnalized fluorescent and magnetic particles. Those sandwiches are purified through magnetic separation. Then, fluorescence is detected by three methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader (detection with an evanescent wave). First, chemical and biological parameters for the functionalization of the different particles (magnetic and fluorescent) are determined. The conditions for the capture of target DNA were optimized. Then, the formation and the detection of the sandwiches were estimated by measuring the fluorescence using three different methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader. The results obtained with the three methods are consistent. They show that the new system enables to capture synthetic target (oligonucleotide) HPA-1 with a reduction of total time analysis of 45 min. In our conditions, SNP can be discriminated for HPA-1 gene. For this discrimination, the fluorescence signal ratio about 2.5 to 3. This ratio should be improved by optimizing the conditions of sandwiches formation. Next step will consist in the optimization of the system developed to capture DNA in order to gain specificity and to determine the limit of detection. This test should also be validated with biological samples. In the long term, fluorescence could be detected by a miniaturized photodetector developed in the University of Sherbrook. Preliminary studies presented in this manuscript show the potentialities of this new transducer.

La réponse cellulaire aux ultra-violets (UV), ou réponse UV, est une réponse complexe et spécialisée dans l’adaptation et la tolérance des dommages aux UV. Celle-ci est initiée par un grand nombre d’évènements moléculaires et de signalisation nucléaire mais aussi au niveau de la membrane plasmique ou du cytoplasme. L’importance et l’influence exactes de ces évènements sur la réparation par excision de nucléotides (NER) des dommages UV à l’ADN sont encore mal comprises et doivent encore être méthodiquement démontrées. Dans cette thèse, grâce à l’utilisation d’une méthode sensible d’analyse de la réparation NER basée sur la cytométrie en flux, il est montré, dans un premier temps, que l’activité des voies MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), qui sont des voies de signalisation de stress UV d’origine cytoplsamique, ne participent pas à l’efficacité de réparation NER des dommages UV dans les cellules humaines. En effet, l’abrogation de la signalisation MAPK, par inhibition pharmacologique, par utilisation de mutants dominant-négatifs ou par inhibition de leur expression endogène, ne révèlent aucun changement de la cinétique de réparation des dommages UV par excision de nucléotides. Cependant, l’utilisation de cette même méthode de réparation, mais cette fois, appliquée pour l’étude de réparation NER en fonction du cycle cellulaire, a permis de mettre en évidence la nécessité fonctionnelle de l’ADN polymérase translésionnelle eta (Pol η) dans la réparation NER des dommages UV, uniquement en phase S. Cette observation fut initialement caractérisée dans les cellules de patients affectés du syndrome variant de xérodermie pigmentaire (XP-V) puis, confirmée ensuite par l’inhibition de l’expression de Pol η endogène ou par la complémentation avec des mutants non-fonctionnels dans les cellules XP-V. Ces résultats indiquent que, contrairement à la réponse UV MAPK cytoplasmique, les évènements nucléaires comme la synthèse translésionnelle, peuvent influencer l’efficacité de réparation NER en phase S. Plus particulièrement, ces données établissent un lien possible entre la réparation NER en phase S et les niveaux de stress réplicatifs, révélé ici par la déficience fonctionnelle Pol η ou ATR. Les observations, présentées dans cette thèse, renforcent un rôle du point de contrôle S aux UV sur l’efficacité de la réparation NER et suggèrent que l’inhibition NER, observée en phase S dans les cellules XP-V, est modulée par le stress réplicatif. Un tel moyen de contrôle pourrait avoir une action plutôt protectrice pendant cette phase critique du cycle cellulaire. Mots clés: UV, translésionnelle, eta, MAPK, NER, CPD, cytométrie, phase-S, tolérance. / The UV-response is a complex cellular response to UV irradiation, which allows cellular adaptation and protection against deleterious effects of UV. This specialized response involves numerous molecular and signaling events from plasma membrane and from the nucleus represented, among others, by Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) pathway activation and translesion synthesis respectively. More particularly, the exact role of these events on the removal UV-induced DNA damage by nucleotide excision repair (NER) in human cells is poorly understood and documented. By using a sensitive flow cytometry based-NER assay, presented and validated in this thesis, to quantify the removal of UV-DNA damage, it was unexpectedly found that Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) signalling, originating from the the plasma membrane, does not regulate the efficiency of UV-induced DNA damage repair in human cells. Indeed, MAPK inhibition with pharmacological inhibitors, expression of short-hairpin RNA or dominant negative mutant, all together, substantiate fully the lack of effect of this signalling pathway on UV-damage removal by NER in human primaries and tumorous cells. Surprisingly, the same NER assay, applied to quantify the removal of UV-induced DNA damages as a function of the cell cycle, has shown a requirement of functional translesion synthesis polymerase eta (Pol η) for efficient UV-DNA damage repair in human cells uniquely during S-phase, where its function is required for the bypass of UV DNA damage. This observation, originally made in fibroblasts from xeroderma pigmentosum variant syndrome (XP-V) afflicted patients, was further confirmed in normal human cells, by abrogation of endogenous Pol η expression or by complementation with Pol η in XP-V cells. All together, the data presented here, indicate that MAPK signaling play no role in NER-mediated UV-damage removal, but highlight a role for UV-DNA damage tolerance response, as translesion synthesis, in regulation of NER efficiency. More particularly, these observations establish a potential link between the S-Phase Repair (SPR) of UV-DNA damages and replicative stress, revealed by a deficiency of Pol η or ATR. This SPR defects seen under acute replicative stress conditions could impact tumorogenesis or chemotherapy outcomes. Moreover, SPR defects, seen in XP-V cells could be controlled by replicative stress, and also reflect a protective coordination to reduce high risks of genetic or chromosomal aberrations that may occur during DNA replication upon UV exposure. Key Words: Translesion, UV, TLS, eta, MAPK, NER, S-phase, flow-cytometry, CPD.

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins. / Infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age. In nearly half the cases, male factors are responsible, although causes underlying male infertility often remain unknown. Mammalian sperm undergo a series of maturational steps before acquiring the capacity to fertilize an oocyte. The first changes take place inside the epididymis, where sperm gain motility and the ability to recognize and interact with the oocyte. After ejaculation, sperm go through a second maturation event named capacitation, taking place inside the female reproductive tract. We previously showed that in the bovine species, proteins of the BSP (Binder of SPerm) family are essential for capacitation. Homologs of these proteins have also been isolated from boar, ram, goat, bison and stallion seminal fluid. Although BSP-related antigens have been detected in mouse and human seminal fluid, BSP homologs have never been characterized in these species. We hypothesized that BSPs would indeed be expressed in mice and humans and could be involved in sperm maturation. Our studies demonstrated that BSP-homologous sequences are present in the mouse and human genomes. The mouse genome contains three BSP-like sequences, Bsph1, Bsph2a and Bsph2b, whereas only one sequence (BSPH1) was identified in the human genome. The complete cDNA sequences of Bsph1, Bsph2a and BSPH1 were cloned, whereas Bsph2b is probably a pseudogene. The two murine and sole human genes are expressed uniquely in the epididymis, and are part of a distinct sub-family within the BSP superfamily. The BSPs of ungulates are expressed in the seminal vesicles, are added to sperm upon ejaculation and represent a significant proportion of seminal plasma proteins. In contrast, BSP proteins expressed in the mouse and human epididymides are found in very small quantities in seminal fluid. The study of their role in sperm functions was therefore less straightforward than for ungulate species, where direct isolation of the native proteins from seminal plasma was feasible using various chromatography techniques. In order to investigate the role of the human BSP protein, BSPH1, we expressed the recombinant protein in E. coli. Probably due to the multiple disulfide bonds within the fibronectin type-II domains characteristic of these proteins, expression of BSPH1 with a hexahistidine or glutathione-S-tranferase tag gave rise to insoluble protein trapped inside bacterial inclusion bodies. Successful expression of soluble BSPH1 was achieved when the protein was fused to a thioredoxin tag and expressed in a bacterial strain that possesses an oxidizing cytoplasm. This protein was purified using affinity chromatography techniques and tested for binding to known ligands of BSP proteins: phosphatidylcholine, low-density lipoproteins and the human sperm membrane. Since recombinant BSPH1 displayed all three binding properties, we concluded that it had assumed its native conformation and could be used in subsequent functional assays to determine its role in sperm functions. The native form of BSPH1 was detected in human seminal plasma after fractionation on a gel filtration column. Native BSPH1 also bound to a heparin-affinity column, indicating that it shares this binding property with the BSP family and may also bind heparin-like GAGs of the female reproductive tract. An anti-BSPH1 immunoaffinity column was prepared using antibodies generated with bacterially expressed recombinant proteins and was used to isolate native BSPH1 from human sperm extracts. In addition, our results show that BSPH1 probably localizes to detergent-resistant microdomains of the human sperm membrane. Its apparent molecular weight was 32 kDa, which is superior to that predicted by its amino acid sequence. Therefore, BSPH1 probably undergoes post-translational modifications or migrates abnormally during electrophoresis. The effect of recombinant BSPH1 protein and anti-BSPH1 antibodies on human sperm motility, viability and capacitation were also investigated. The latter two sperm functions were assayed using a flow cytometry technique optimized in this study. No effect of recombinant BSPH1 or antibodies on sperm motility or viability was noted. Although a modest yet significant stimulation of capacitation was observed at lower BSPH1 protein concentrations, higher concentrations showed no effect. In the same fashion, anti-BSPH1 antibodies showed no significant effect on capacitation. These results suggest that recombinant BSPH1 produced in E. coli does not appreciably affect capacitation. However, since native BSPH1 may be subject to post-translational modifications, it is possible that BSPH1 expressed in a mammalian system would affect sperm capacitation. Alternatively, epididymally expressed BSPs may play a somewhat different role in sperm functions than those secreted by the seminal vesicles of ungulates. The results described in this thesis could aid in better diagnosing male infertility, improving assisted reproduction and eventually, developing male contraceptives.

Les canaux Ca2+ activés par le voltage (CaV) sont des protéines membranaires qui génèrent des courants Ca2+ dans les cellules excitables suite à une dépolarisation membranaire. Ces complexes oligomériques sont classifiés selon les propriétés structurelles de la sous-unité principale qui forme le pore du canal, soit la sous-unité CaVα1. La sous-unité auxiliaire CaVβ module l’expression membranaire et la dépendance au voltage du « gating » de la sous-unité CaVα1 des canaux HVA (« high-voltage-activated ») CaV1 et CaV2. La sous-unité CaVβ est formée par un domaine SH3 (« Src homology-3 ») connecté à un domaine GK (« guanylate kinase-like ») par le biais d’un domaine variable HOOK. Dans le but d’identifier les résidus dans la CaVβ3 qui sont responsables de la densité membranaire du CaV2.3, nous avons produit des mutants de la sous-unité auxiliaire le long de ses domaines fonctionnels. Cela dit, la délétion complète du domaine SH3 ainsi que la délétion du domaine HOOK n’ont pas modifié la densité membranaire de CaV2.3 ni ses propriétés d’activation. Cependant, la délétion de cinq résidus dans le domaine GK interrompt l’expression membranaire et l’expression fonctionnelle de CaV2.3. La mutation de résidus identifiés précédemment comme soutenant une affinité de liaison de l’ordre du nanomolaire dans le domaine GK de CaVβ n’a pas modifié de manière significative l’adressage membranaire de CaV2.3. Toutefois, les mutations de quatre résidus leucine dans les régions α3, α6, β10 et α9 du domaine GK ont grandement réduit l’adressage membranaire du canal CaV2.3. Nos résultats confirment que le domaine GK contient les déterminants moléculaires responsables de la fonction chaperone de CaVβ. Cela dit, l’adressage membranaire induit par CaVβ semble être déterminé par des éléments structuraux qui ne sont pas strictement dépendants d’une liaison à haute affinité de CaVβ sur CaVα1. / Voltage-activated Ca2+ channels (CaV) are membrane proteins that play a key role in promoting Ca2+ influx in response to membrane depolarization in excitable cells. They form oligomeric complexes that are classified according to the structural properties of the pore-forming CaVα1 subunit. Auxiliary CaVβ subunits modulate cell-surface expression and voltage-dependent gating of high-voltage-activated (HVA) CaV1 and CaV2 α1 subunits. CaVβ subunits are formed by a Src homology-3 (SH3) domain and a guanylate kinase-like (GK) domain connected through a variable HOOK-domain. In order to identify the residues responsible for the CaVβ3-induced membrane density of CaV2.3, we produced mutants along CaVβ3’s fonctionnal domains. Complete deletion of the SH3 domain as well as deletion of the HOOK domain did not alter plasma membrane targeting of CaV2.3 nor its typical activation gating. In contrast, 5-residue deletions in the GK domain disrupted cell surface trafficking and functional expression of CaV2.3. Mutations of residues known to carry nanomolar affinity binding in the GK domain of CaVβ did not significantly alter cell surface density. Mutations of a quartet of leucine residues in the α3, α6, β10, and α9 regions of the GK domain, each expected to curtail protein-protein interaction, were found to significantly impair cell surface targeting of CaV2.3 channels. Altogether, our results confirm that the GK domain includes the molecular determinants carrying the chaperone function of CaVβ. However, CaVβ-induced cell surface targeting appears to be determined by structural elements that are not strictly dominated by high-affinity binding of CaVβ onto CaVα1.