Cette thèse porte sur l’élaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation génétique (SNP) grâce à la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisées avec des oligonucléotides couplée à une détection de la fluorescence. Le modèle biologique choisi pour ce projet est le génotypage plaquettaire et plus particulièrement la recherche du gène biallélique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a été d’optimiser un outil de capture préalablement développé dans l’équipe (Trévisan, 2011) afin de réduire le nombre d’étapes et de simplifier la mise en oeuvre globale du test en modifiant les interactions moléculaires utilisée pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme élément de détection. En présence d’ADN cible, des sandwichs sont formés entre les particules fluorescentes et les particules magnétiques biofonctionnalisées. Ces sandwichs sont purifiés par séparation magnétique et la fluorescence est détectée par trois méthodes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (détection par ondes évanescentes). Dans un premier temps, les paramètres de fonctionnalisation chimique et biologique des différentes particules (magnétiques et fluorescentes) ont été déterminés et optimisés ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur détection ont été suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois méthodes différentes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur à ondes évanescentes). Les résultats obtenus avec les différentes méthodes de détection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN développé permet de capturer la cible synthétique (oligonucléotide) HPA-1 en réduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1 qui ne diffère que d’un nucléotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich spécifique et du sandwich non spécifique est d’environ 2,5 à 3. Ce rapport devra être amélioré par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine étape consistera à optimiser le système de capture d’ADN développé pour gagner en spécificité et déterminer la limite de détection du test. Ce test devra également être validé avec des échantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra être détectée par un photodétecteur miniaturisé actuellement développé à l’Université de Sherbrooke. Des études préliminaires présentées dans ce manuscrit montrent les potentialités de ce nouveau transducteur. / This thesis is about the development of a new assay to capture DNA. This assay is based on the formation of sandwiches between biofunctionnalized with oligonucleotides carboxylatex microparticles combined with fluorescence detection. It should be able to discriminate single nucleotide polymorphism (SNP). This assay is designed to be applied to platelet genotyping for the research of the gene HPA-1. The main goal of this work was to improve an assay previously developed (Trévisan, 2011) by INL and EFS Rhône-Alpes. The objectives are to reduce the number of steps and to simplify the test. To do so, the molecular interactions used in order to capture target DNA are modified and fluorescent microparticles are used for the detection. In the presence of target DNA, sandwiches are formed between both biofunctionnalized fluorescent and magnetic particles. Those sandwiches are purified through magnetic separation. Then, fluorescence is detected by three methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader (detection with an evanescent wave). First, chemical and biological parameters for the functionalization of the different particles (magnetic and fluorescent) are determined. The conditions for the capture of target DNA were optimized. Then, the formation and the detection of the sandwiches were estimated by measuring the fluorescence using three different methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader. The results obtained with the three methods are consistent. They show that the new system enables to capture synthetic target (oligonucleotide) HPA-1 with a reduction of total time analysis of 45 min. In our conditions, SNP can be discriminated for HPA-1 gene. For this discrimination, the fluorescence signal ratio about 2.5 to 3. This ratio should be improved by optimizing the conditions of sandwiches formation. Next step will consist in the optimization of the system developed to capture DNA in order to gain specificity and to determine the limit of detection. This test should also be validated with biological samples. In the long term, fluorescence could be detected by a miniaturized photodetector developed in the University of Sherbrook. Preliminary studies presented in this manuscript show the potentialities of this new transducer.

Les myosites sont des maladies auto-immunes, caractérisées par des atteintes musculaires et extra musculaires. Le diagnostic des myosites peut être difficile et nécessite de l’expertise, afin d’éviter l’administration de thérapie inapproprié. Les mécanismes impliqués au cours des myosites sont peu connus. Notre but était de décrire le profil immunitaire des patients, afin d’identifier des biomarqueurs. Nous avons utilisé un panel de 36 marqueurs pour caractériser les PBMC issus de patients actifs (MIs, SAS anti-Jo1, myopathies anti-SRP et anti-HMGCR) et de sujets sains par cytométrie de masse combiné au « barcoding ». Tout d’abord, nous avons mis au point une procédure technique pour la détection simultanée de cibles extracellulaires et intracellulaires. En utilisant différents outils bio-informatiques, nous avons isolé une fréquence de lymphocytes CD8+T-bet+ > 51.5% comme étant un biomarqueur spécifique de la MIs en comparaison aux autres myosites, avec une sensibilité de 94,74% et une spécificité de 88,46%. De plus, nous avons identifié un profil immunitaire CD8+T-bet+ CD57- activé, potentiellement capable de prolifération et de maintien de mécanismes auto-immuns chez les patients atteints de MIs. Chez les patients anti-Jo1, nous avons observé une dérégulation de l’homéostasie des lymphocytes B, caractérisée par une diminution des lymphocytes B mémoires circulants. La présence de ces derniers dans le muscle des patients suggère qu’ils se nichent dans le muscle afin d’éviter l’action des immunosuppresseurs. Ces travaux ont permis l’identification de biomarqueurs et de phénotypes cellulaires potentiellement impliqués au cours de la MIs et du SAS anti-Jo1. / Myositis is an autoimmune disease characterized by muscular and extra-muscular disorders. In the early stages of the disease, the diagnosis of myositis can be misleading and requires expertise, in order to avoid the administration of inappropriate treatment. The mechanisms involved in these diseases are poorly understood. Our aim was to describe the immune profile specific to each patient group, in order to identify biomarkers that may be useful for diagnosis and management of patients. We used a panel of 36 markers by mass cytometry to characterize PBMCs derived from active patients (sIBM, anti-Jo1 ASyS, anti-SRP and anti-HMGCR myopathies) and healthy subjects. First, we developed and optimized a technical procedure for the simultaneous detection of extracellular and intracellular targets by mass cytometry. Using different bioinformatics tools, we isolated a frequency of CD8 +T-bet + cells > 51.5% as a specific biomarker for sIBM compared to other myositis, with a sensitivity of 94.74% and a specificity of 88. , 46%. In addition, we identified an activated CD8 + T-bet + CD57- immune profile, potentially capable of proliferation and the maintenance of autoimmune mechanisms in patients with sIBM. In anti-Jo1 patients, we observed a dysregulation of B cell homeostasis, characterized by a decrease in circulating memory B cells. The presence of the latter in the muscle of patients suggests that they nest in the muscle to avoid immunosuppressants. This work allowed the identification of a biomarker that could enhance the diagnosis of MIs compared to other myositis and the identification of cells potentially involved during sIBM and anti-Jo1 ASyS.

La production de nouveaux neurones, un processus appelé neurogenèse, persiste à l’âge adulte et est assurée par les cellules souches neurales (CSN) au sein de niches spécialisées telle que la zone sous-ventriculaire (ZSV). Cependant, la neurogenèse adulte diminue à la suite de diverses atteintes cérébrales et au cours du vieillissement, provoquant des déclins cognitifs pour l’heure irréversibles. A l’aide d’une méthode de cytométrie en flux développée au laboratoire, nous avons montré que le déclin progressif de la neurogenèse de la ZSV au cours du vieillissement est lié, non pas à une diminution du nombre des CSN, mais à une forte réduction de leur prolifération due, notamment, à l’allongement spécifique de la phase G1 médiée par l’augmentation du TGFβ1. Par ailleurs, nous avons isolé les CSN quiescentes et les CSN en prolifération afin de caractériser leurs propriétés cellulaires et établir leur profil d'expression génique. L’analyse comparative de ces deux populations de CSN a révélé plusieurs niveaux de régulation de la balance entre quiescence et prolifération, telles que l’intégration de signaux en provenance du microenvironnement et l’existence de programmes de transcription distincts. L’ensemble de ces résultats ouvrent des perspectives pour l’utilisation des CSN quiescentes endogènes comme cibles thérapeutiques au cours du vieillissement ou pour régénérer les tissus cérébraux lésés. / The production of new neurons, a process called neurogenesis, persists during adulthood and is ensured by neural stem cells (NSCs) that are located in specialized niches in the mammalian brain such as the subventricular zone (SVZ). However, adult neurogenesis declines dramatically following brain damage and during aging leading to irreversible cognitive deficits. Using a flow cytometry-based cell sorting strategy, we show that the progressive age-related decline in SVZ neurogenesis is not caused by a loss of NSCs but rather by a proliferation deficit of NSCs with the lengthening of their G1 phase due to increased levels of TGFβ1. We then sorted quiescent and proliferative NSCs to characterize their functional properties and define their gene expression profiles. Comparative analysis of the two populations of NSCs reveals that the balance between quiescence and proliferation is regulated at multiple levels with the integration of external signals from the microenvironment and distinct transcriptional programs. Taken together, our results open new vistas into the potential use of endogenous quiescent NSCs as therapeutic targets to increase neurogenesis in the aged brain and to participate to the regeneration of damaged brain tissue.

La cytométrie de masse CMM) a révolutionné l'étude de la diversité cellulaire et phénotypique, en augmentant de manière significative le nombre de marqueurs pouvant être analysés simultanément (41 à ce jour). En permettant de définir précisément l'état des populations de lymphocytes, notamment en ce qui concerne leur différenciation, activation et leur entrée dans le cycle cellulaire, la CMM a mis au jour de petits sous-ensembles jusqu'ici inconnus. Dans cette étude, la CMM a été utilisée pour tenter de mieux caractériser les réservoirs du VIH. Avec l'introduction de la thérapie antirétrovirale combinée (ART) en 1996, l'infection par le VIH est passée d'un destin fatal à une maladie chronique gérable avec une durée de vie normale grâce à une réduction de la réplication virale active (la quantité de virus est en deçà des limites de détection optimales). Cependant, si le traitement est interrompu, la charge virale chez le patient augmente à nouveau du fait des réservoirs de provirus viables localisés dans des populations de cellules à longue durée de vie et qui ne peuvent pas être éliminées par les traitements actuels. Ces cellules infectées réservoirs constituent un obstacle majeur à l'éradication du VIH. Le réservoir le mieux caractérisé est celui des lymphocytes T CD4+ et est principalement hébergé dans les TCM, les TTM, les TSCM et les Tfh. Une première étude nous a permis d’évaluer les stades du cycle cellulaire en association à des marqueurs de différenciation, d'activation et d'épuisement, pour aboutir à une évaluation poussée de l'état de quiescence des lymphocytes T CD4 susceptibles d’abriter les réservoirs latents de VIH. Cette large analyse multiplexe démontre que certains sous-ensembles des LTCD4+CD25-HLA-DR- classiquement considérés "au repos"- contiennent en fait des quantités notables de cellules en cycle ou exprimant des récepteurs inhibiteurs, ouvrant de nouvelles voies pour une redéfinition des cellules T CD4 quiescentes du sang périphérique. Une deuxième étude avait pour but de définir les populations de LT CD4 produisant du VIH in vivo. Nous avons développé une analyse multiparamétrique sur des cellules de patients VIH+ sous ART et en phase d’interruption thérapeutique (ATI). Cette étude met en évidence que les cellules CD3+CD4+CD32high expriment un fort taux de marqueurs d’activation et reçoivent d’importants signaux d’activation via des cytokines, à l'inverse des cellules CD32a-. D'autre part, l'analyse des LTCD4+ producteurs de VIH (exprimant la protéine de capside p24), nous a permis de détecter un très faible nombre de cellules positives p24+ (inférieur à 0,004% en phase d’ATI mais aucun avant). Le phénotype des cellules productrices a ensuite été mis en évidence. Il s’agit de lymphocytes T n’exprimant pas de CD8, enrichis d’un facteur 4 en cellules TSCM, et d'un facteur 2 en TFH. Ces populations sont très enrichies en cellules activées co-exprimant 3 marqueurs d’activation (augmentés d’un facteur 20) et sont en cycle (Ki67+) et/ou sur-expriment des molécules de contrôle immunitaire (ICP) avec un enrichissement d’un facteur 500. Ceci nous permet de détecter des cellules productrices avec des fréquences beaucoup plus élevées dans ces populations TCD3+CD8- en cycle à hauteur de 0,08%, et en phase G2 (2,46%), mais également dans les cellules présentant une poly-expression des 4 immune-checkpoints (2,27%). L’avènement de la cytométrie de masse a augmenté de façon exponentielle les informations que nous pouvions obtenir sur une cellule. Grâce à cet outil, l’identification du cycle cellulaire, en corrélation avec différents marqueurs phénotypiques, permet d’explorer des informations jusque-là inaccessibles, entre autre l’analyse des réservoirs latents et productif du VIH. Ce travail permet ainsi de caractériser le plus précisément possible ces cellules productrices de VIH, mais aussi les cellules latentes, et potentiellement réservoirs du virus. / Mass cytometry (CMM) has revolutionized the study of cell and phenotypic diversity, significantly increasing the number of markers that can be analyzed simultaneously (41 to date). By making it possible to precisely define the state of the lymphocyte populations, particularly regarding their differentiation, activation and entry into the cell cycle, the CMM has revealed small subsets so far unknown. In this study, the CMM was used to try to better characterize the HIV’s reservoirs. With the introduction in 1996 of Combined Antiretroviral Therapy (ART), HIV infection has shifted from a fatal destiny to a manageable chronic disease with a normal life span through a reduction in active viral replication (the amount of virus is below optimal detection limits). However, if treatment is interrupted, the viral load increases again in the patient due to viable provirus reservoirs located in long-lived cell populations that cannot be eliminated by current treatments. These reservoirs constitute a major obstacle to the eradication of HIV. The best characterized reservoir is that of CD4+ T cells and is mainly hosted in TCM, TTM, TSCM and Tfh. A first study allowed us to evaluate the stages of the cell cycle in association with markers of differentiation, activation and exhaustion, leading to a thorough assessment of the quiescent state of CD4 T cells likely to harbour latent reservoirs of HIV. This broad multiplex analysis demonstrates that some subsets of LTCD4+CD25-HLA-DR- classically considered "at rest" – do actually contain significant amounts of cells in cycling or expressing inhibitory receptors, opening new pathways for redefining CD4 T quiescent cells from peripheral blood. A second study aimed to define CD4+ T Cells populations producing HIV in vivo. We have developed a multiparametric analysis on cells of HIV+ patients under ART and in therapeutic interruption phase (ATI). This study shows that CD3+CD4+CD32high cells express a high level of activation markers and receive important activation signals via cytokines, unlike CD32a- cells. On the other hand, the analysis of HIV-producing LTCD4+ (expressing the p24 capsid protein), allowed us to detect a very small number of p24+ positive cells (less than 0.004% in ATI phase but none before). The phenotype of the producing cells was then highlighted. These are T lymphocytes that do not express CD8, enriched with a factor 4 in TSCM cells, and a factor 2 in TFH. These populations are highly enriched in activated cells co-expressing 3 activation markers (increased by a factor of 20) and are in cycle (Ki67+) and/or over-express immune control molecules (ICPs) with an enrichment of a factor of 500. This allows us to detect producing cells with much higher frequencies in these TCD3+CD8- populations in cycles up to 0.08%, and in G2 phase (2.46%), but also in cells with poly-expression of 4 immune-checkpoints (2.27%). The advent of mass cytometry has exponentially increased the information we could get on a cell. Thanks to this tool, cell cycle identification, in correlation with different phenotypic markers, makes possible the exploration of previously inaccessible information, including the analysis of latent and productive reservoirs of HIV. This work enables us to characterize as precisely as possible these HIV-producing cells, but also the latent cells, and potentially reservoirs of the virus.

Tous les patients de soins intensifs reçoivent des solutés cristalloïdes. Ils sont souvent dans un état inflammatoire sévère. Parmi ces solutés cristalloïdes, le Normal Salin (NS) a des concentrations élevées en chlorure et en sodium ce qui a été associé à divers effets immuno-activateurs. Nous visons à évaluer l’effet des différents solutés sur les cellules immunitaires de sujets sains et sur un modèle d’inflammation aiguë sur sang total. Dans cette étude de type chassé-croisé, 11 sujets sains ont été recrutés pour recevoir 1L de chaque soluté. Grâce aux prélèvements sanguins pris en pré et post-infusion, nous évaluons le phénotype des leucocytes par cytométrie en flux et les cytokines plasmatiques par multiplex. Les tests ex vivo sont faits en exposant du sang total aux solutés suite à une stimulation au LPS. Notre étude suggère une diminution de l’activation des neutrophiles par le LR et le PL par rapport au NS. On constate aussi une augmentation des monocytes totaux et classiques circulants suite au NS. Le NS augmente les concentrations de la cytokine pro-inflammatoire Interleukine (IL)-17A et diminue certains facteurs anti-inflammatoires comme IL-10 et basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) par rapport aux deux autres solutés. Ex vivo, l’ajout de NS augmente l'activation des monocytes par rapport au LPS seul par rapport au LR et au PL. Le PL diminue aussi l’activation précoce des lymphocytes T. Nos résultats suggèrent que le NS a un effet plus immunoactivateur que les 2 autres solutés. Une meilleure compréhension de ces effets pourrait mener à une utilisation personnalisée des cristalloïdes pour un retour plus efficace à l’homéostasie inflammatoire. / Intensive care unit patients' inflammatory status can switch from an early pro-inflammatory to a late anti-inflammatory phase, which favors infections. They can receive different crystalloids, either Normal Saline (NS), Ringer’s Lactate (RL) or Plasma-Lyte (PL). NS has high NaCl concentrations which has been associated with inflammatory effects on immune cells. Our aim is to evaluate the impact of these three different crystalloid fluids on immune cells in healthy subjects and on a whole blood model of acute inflammation. Using our comprehensive immunomonitoring platform, we assessed the immunological phenotype of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and neutrophils in humans. 11 healthy subjects received a liter of NS, RL and PL in a randomized cross-over fashion. Blood samples were taken before and 6h later. PBMC and neutrophil phenotypes were assessed by flow cytometry and cytokine concentrations were measured by a multiplex assay. Ex vivo assays were performed by exposing whole blood to the different crystalloids following a stimulation with LPS. Study of healthy subject’s PBMCs suggested that RL and PL reduced activation of neutrophils compared to NS. Total and classical monocytes were increased with NS compared to RL and PL. RL and PL also increase plasma levels of anti-inflammatory cytokine Interleukin (IL)-10 and pro-repair cytokine basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) compared to NS, while NS increased plasma levels of the pro-inflammatory cytokine IL-17A. In whole blood assays, following LPS stimulation, NS increased monocytic activation compared to LR and PL. In T cells, PL decreased early activation. Conclusions: Our results suggest that crystalloids have different immune consequences with NS being more immune activating than RL and PL. A better understanding of their immune modulation could lead to personalization of their use according to the inflammatory status of patients to restore their immune homeostasis.

Le sepsis est un problème mondial de santé publique du fait de son incidence croissante et de sa mortalité importante. Après une première phase très inflammatoire, les patients septiques présentent une profonde immunodépression, objectivée par un risque accru d’infections secondaires et de décès. Dans ce contexte, des thérapeutiques immunostimulantes sont actuellement testées. Afin d’identifier des cibles thérapeutiques pertinentes et des biomarqueurs permettant l’individualisation des traitements, la description exhaustive des mécanismes immunosuppresseurs mis en jeu est primordiale. Les lymphocytes B ont été peu étudiés au cours du sepsis. Des données récentes ont révélé l’existence de cellules B régulatrices dans différents contextes cliniques. Ainsi, nous avons fait l’hypothèse que des lymphocytes B / plasmocytes régulateurs pouvaient être impliqués dans l’établissement de l’immunodépression induite par le sepsis.Chez les patients en choc septique, nous avons montré que les lymphocytes B présentent une perte de leur fonction de prolifération et un phénotype d’épuisement cellulaire. Ils produisent de l’IL-10, cytokine suppressive (Journal of Immunology 2018). Enfin, une plasmocytose circulante apparait, confirmée par cytométrie de masse (Scientific Reports 2018). Dans un modèle murin de sepsis, ces plasmocytes inhibent la prolifération des lymphocytes T ex vivo et expriment des marqueurs phénotypiques suggérant pour la première fois la présence de plasmocytes régulateurs dans le sepsis.L’importance clinique des plasmocytes régulateurs reste à définir (mécanismes régulateurs, liens avec les paramètres cliniques, association avec les réactivations virales…). Elle pourrait conduire à l’établissement de nouveaux biomarqueurs pour le suivi immunitaire des patients et à de nouvelles approches thérapeutiques / Sepsis in a major health problem associated with rising incidence and high mortality rate. In septic patients, an initial proinflammatory response causing life-threatening organ failures is followed by the development of a deep immunosuppression, associated with increased risk of secondary infections and death. In this context, immunostimulating therapies are currently tested. However, success of this strategy requires identification of relevant therapeutical targets and biomarkers allowing individualisation of treatments. B lymphocytes have been poorly studied in sepsis. Moreover, existence of regulatory B cells was recently revealed in several clinical contexts. Thus, we made the assumption that regulatory B lymphocytes or plasma cells could be implied in sepsis-induced immunosuppression establishment.In septic shock patients, we showed that B cells present with decreased proliferation capacity and exhausted-like profile, and are able to produce immunosuppressive IL-10 (Journal of Immunology 2018). We also observed blood plasmacytosis in patients, confirmed by mass cytometry analysis (Scientific Reports 2018). In a murine model of sepsis, the ability of plasma cells to inhibit T cell proliferation ex vivo, and their phenotypic profile suggest for the first time the existence of regulatory plasma cells in sepsis.The role of regulatory plasma cells within sepsis-induced immunosuppression has to be further explored in patients (underlying regulatory mechanisms, associations with clinical outcomes and viral reactivations…). It could highlight novel biomarkers for patients’ monitoring and innovative therapeutical approaches

La vaccination est l'un des plus grands progrès réalisés en santé publique. Toutefois, malgré de nombreuses connaissances sur le système immunitaire, de nombreux pans d’ombre empêchent la conception de vaccins contre des pathogènes complexes. Pour pallier ce problème, une meilleure compréhension des modes d'action des vaccins est requise. En particulier, la plupart des vaccins nécessitent plusieurs immunisations pour induire une mémoire immunitaire adaptative au long terme, mais l'impact du délai entre primo-vaccination, induisant une mémoire primaire, et rappel(s) la restimulant pour générer une mémoire secondaire, est peu défini. De plus, la réponse immunitaire innée, induite à chaque immunisation et façonnant l'immunité adaptative, reste peu caractérisée dans ce contexte vaccinal. En vaccinant des macaques cynomolgus avec le virus de la vaccine modifiée Ankara, selon un schéma de primo-vaccination suivie d’un rappel homologue à deux mois, et en utilisant la cytométrie de masse couplée à des analyses bio-informatiques, nous avons caractérisé la réponse innée induite par chaque immunisation. Les réponses innées diffèrent entre primo-vaccination et rappel, avec induction par la primo-vaccination d’une modification phénotypique tardive des cellules innées, suggérant une meilleure capacité à répondre au rappel. De surcroît, la réduction à deux semaines du délai entre primo-vaccination et rappel abroge la mobilisation de ces cellules innées phénotypiquement modifiées et altère la qualité de la réponse humorale. En définitive, en plus de la réponse innée précoce, ce projet a mis en évidence l'induction par la primo-vaccination d'un vraisemblable entraînement inné tardif, un concept émergent traduisant la capacité de mémorisation des cellules innées via des modifications épigénétiques. Ce vraisemblable entraînement, non seulement des monocytes et cellules tueuses naturelles, mais aussi des cellules dendritiques et surprenamment des neutrophiles, est corrélé à la qualité de la mémoire immunitaire adaptative, de manière hautement dépendante du délai entre primo-vaccination et rappel. Ces résultats contribuent à ouvrir la voie vers l’optimisation rationnelle des futurs vaccins, via l'optimisation des calendriers vaccinaux et la valorisation de l'entraînement inné. / Vaccination is one of the best achievements made in public health. However, designing vaccines against complex pathogens is currently challenging. The immune system is indeed uncompletely characterized, despite large amount of accumulated knowledges. A better understanding of vaccine-induced immunity is then required to optimize vaccine design. In particular, while most vaccines require several immunizations to induce a long-lasting adaptive immune memory, little is known on the impact of the delay beween the prime inducing a primary memory and the boost restimulating it to induce a secondary memory. Also, the innate immunity induced by each immunization and shaping the adaptative immunity is poorly characterized in this vaccine context.We studied the innate immune responses in cynomolgus macaques immunized with the modified vaccinia virus Ankara, following an homologous prime-boost vaccination at two months apart. We applied mass cytometry and bioinformatic analyses to characterize the innate response induced by each immunization. We showed that prime and boost vaccination triggered distinct innate responses. Actually, prime induced late phenotypic modifications of innate cells. These phenotypic changes suggest a stronger ability to react to the boost. Moreover, reducing the delay between prime and boost to two weeks impeded the mobilization of these phenotypically modified innate cells, and qualitatively altered humoral response.In conclusion, beyond the early innate responses, these results highlight the late induction by the prime of "likely trained" innate cells. This emerging concept corresponds to the ability of innate cells to display memory features based on epigenetic modifications. This "likely training" occured not only on monocytes and NK cells, but also on dendritic cells and strikingly on neutrophils. It was deeply connected with adaptive immune memory establishment, in a prime-boost delay dependant fashion. These findings contribute to pave the way towards to the rationale design of future vaccines, via vaccine schedule optimization and harnessment of innate training.

Le système immunitaire est divisé en deux réponses : innée et adaptative. Dans la réponse adaptative, les principaux acteurs sont les cellules T CD8 et CD4, dont l'activation est médiée par le complexe antigène-récepteur (TCR) et la génération de signaux intracellulaires. L'intensité du signal est contrôlée par l'affinité du ligand impliquant la kinase p56lck et la protéine adaptatrice SLP-76. Les souris dépourvues de SLP-76 sont bloquées dans leur développement thymique, ce qui rend difficile l'évaluation de l'importance de l'adaptateur, dans la fonction des cellules T périphériques. Récemment, le laboratoire Rudd a généré une souris knock-in (KI) avec une forme de SLP-76 mutée au niveau d'un seul résidu, K56, ayant des cellules T périphériques normales. Cette mutation empêche SLP-76 de se lier au complexe de pore nucléaire (CPN). L'objectif de ce mémoire est de comprendre le rôle de SLP-76, plus particulièrement du mutant K56E dans le contrôle de certains aspects de la fonction des cellules T périphériques. K56E sur un fond transgénique OT1, a montré une déficience partielle de la fonction et du métabolisme des cellules T en réponse à des ligands peptidiques d'ovalbumine de poulet, de différentes affinités. Plus précisément, les voies de la glycolyse et de la phosphorylation oxydative en ont été altérées. Dans l'ensemble, l'altération des fonctions et du métabolisme des lymphocytes T chez le mutant K56E confirme l'existence d'un lien entre le SLP-76 et le métabolisme des lymphocytes T, ce qui pourrait avoir des implications importantes dans le développement de thérapies ciblant la fonction des lymphocytes T. / The immune system is divided into two responses: innate and adaptive. In the adaptive response, the main players are CD8 and CD4 T-cells whose activation is mediated by ligation of the antigen-receptor complex (TCR) and its generation of intracellular signals. The strength of signal is controlled by the affinity of the ligand in a process that involves upstream kinases such as p56lck and downstream targets such as the adaptor protein SLP-76. Mice lacking SLP-76 are blocked in thymic development, making it difficult to assess the importance of the adaptor in peripheral T-cell function. Recently, the Rudd lab generated a knock-in (KI) mouse with a form of SLP-76 mutated at a single residue K56 which shows a normal peripheral T-cell compartment. The mutant prevents SLP-76 binding to the nuclear pore complex (NPC). The object of this dissertation is to understand role of SLP-76 and specifically the K56E mutant in the control of aspects of peripheral Tcell function. The K56E mutant on an OT1 TCR transgenic background showed a partial impairment of T-cell function and metabolism in response to chicken ovalbumin peptide ligands of different affinities. Specifically, both glycolysis and oxidative phosphorylation pathways were impaired in response to peptide ligand activation. Overall, the impairment of T-cell function and metabolism in the K56E mutant supports a link between SLP-76 and T-cell metabolism which may have important implications in the development of therapies targeting T-cell function.

Le canal calcique de type-L CaV1.2 participe au couplage excitation-contraction des cardiomyocytes. Cav1.2 est composé d’une sous-unité principale CaVα1, associée aux sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. Lorsque présente à la membrane, c’est CaVα2δ1 qui est responsable de moduler la densité du courant calcique. Elle ne possède qu’un seul segment transmembranaire présent du côté C-terminal, au niveau de la protéine δ, ce qui en fait une protéine transmembranaire de type I. Certaines protéines qui appartiennent à cette famille doivent être clivées au niveau du site dit « omega », une modification post-traductionnelle nécessaire à leur fonction. Une fois clivées, ces protéines sont retenues à la membrane plasmique par une ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI). Nos études en microscopie confocale montrent que la protéine sauvage est sensible à l’action de la phospholipase C qui clive de manière spécifique les groupements phosphoinositol, ce qui est compatible avec la présence d’une ancre GPI fonctionnelle. De plus, la mutation des résidus formant le site « omega » en isoleucine au niveau des sites G1060 et G1061 prévient l’adressage membranaire de CaVα2δ1 estimé par cytométrie en flux et imagerie confocale, et réduit la modulation des courants calciques mesurés par la méthode du « patch-clamp ». Les mutants G1060I et G1061I sont aussi associés à un changement dans le patron de migration de la partie C-terminale, suggérant un processus protéolytique défecteueux. Les mutations simples des glycines en alanines préservent les propriétés de la protéine mais le double mutant G1060A/G1061A réduit significativement l’expression de CaVα2δ1 à la surface de la cellule et sa modulation sur le canal CaV1.2. Ces données suggèrent fortement que le clivage requiert spécifiquement un résidu Glycine en position 1060 ou 1061 pour produire le clivage protéolytique dominant chez CaVα2δ1, et que cet ancrage GPI est essentiel à la fonction du canal. / Voltage-gated calcium channels CaV1.2 play an essential role in the regulation of cardiac excitability. Functional channels are formed by the CaVα1 subunit and the intracellular CaVβ and the extracellular CaVα2δ1 subunits. CaVα2δ1 are type I transmembrane proteins that undergo a posttranslational modification producing their association at the plasma membrane through a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. The molecular determinants required for the proteolytic cleavage of the recombinant CaVα2δ1 protein were studied using biochemical, immunocytochemical, fluorescence, and electrophysiological methods. Enzymatic treatment with a phospholipase C specific for the cleavage of phosphatidyl inositol lipids abolished the colocalisation of CaVα2δ1 with a plasma membrane marker as shown using live-cell confocal imaging. Single point mutations G1060I or G1061I in the predicted transmembrane CaVδ domain was shown to significantly reduce the cell surface fluorescence of CaVα2δ1 as characterized by two-color flow cytometry assays and confocal imaging, and to prevent the CaVα2δ1-mediated increase in the peak current density and voltage-dependent gating of CaV1.2 currents. The isoleucine mutations were also associated with a change in the migration pattern of the C-terminal fragments suggesting that proteolytic processing was altered. Single glycine to alanine mutations preserved the protein properties but the double mutant G1060A/G1061A significantly impaired cell surface expression of CaVα2δ1 and its functional regulation of CaV1.2. Altogether our data support a model where one Glycine residue at position 1060 or 1061 is required to produce the dominant proteolytic cleavage of CaVα2δ1 and further suggest that the GPI-anchored form of CaVα2δ1 is essential for channel function.

Les levures Candida sont des pathogènes opportunistes responsables d’infections graves chez les patients immunodéprimés. Au cours de ce travail, nous avons développé un modèle cellulaire in vitro pour la caractérisation multiparamétrique des phénotypes d’interaction entre les levures Candida et les macrophages et les neutrophiles, principaux effecteurs de la défense anti-Candida. Il repose sur l’utilisation de marqueurs fluorescents pour le suivi quantitatif de l’interaction en cytométrie en flux et en fluorimétrie. Ce modèle a été validé par la comparaison de l’interaction de trois espèces de levures, C. albicans, C. glabrata et C. lusitaniae, avec des macrophages murins et des neutrophiles humains. Deux stratégies principales de survie des levures à la phagocytose ont été mises en évidence : par la résistance à la phagolyse et la multiplication des levures à l’intérieur des phagocytes jusqu’à leur éclatement, ou par l’évitement de la phagocytose et la multiplication des levures à l’extérieur des phagocytes. L’interprétation des données quantitatives a été confirmée par microscopie à fluorescence et vidéo-microscopie. Afin de mieux comprendre les interactions Candida-phagocytes, nous avons mis au point des outils pour l’analyse fonctionnelle de gènes chez C. lusitaniae. Une stratégie de PCR chevauchante a été développée pour l’obtention de mutants nuls de C. lusitaniae, sans étape de clonage. C’est ainsi que le gène OLE2, codant une Δ9 désaturase d’acides gras potentiellement impliquée dans la biosynthèse de la prostaglandine PGE2, a été invalidé. Le mutant ole2Δ présentait de très nets défauts de filamentation et de reproduction sexuée. Par rapport à une souche sauvage, le mutant ole2∆ était massivement phagocyté par les macrophages, et la survie des phagocytes était plus importante, ce qui suggère un rôle important des lipides insaturés et des oxylipides dans la signalisation cellulaire au cours de l’interaction Candida-phagocytes. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons construit une banque de 10 000 mutants de C. lusitaniae par l’intégration aléatoire d’un marqueur dans le génome. Le criblage de cette banque à travers notre modèle cellulaire d’interaction permettra d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’interaction avec les phagocytes afin de mieux comprendre la physiopathologie des candidoses et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. / Candida species are opportunistic pathogens causing severe infectious diseases in immunocompromised patients. In this work, we developed a tool for a multi-parameter characterization of the cell interactions between the yeasts Candida and both macrophages and neutrophils, which constitute the main defense against candidiasis. It relies on the labelling of each population with specific fluorescent markers, and on the use of fluorimetry and flow cytometry to assess interactions. The tool has been validated by comparing the interactions of three yeast species C. albicans, C. glabrata and C. lusitaniae, with murine macrophages and human neutrophils. We found that yeasts use two main ways for escaping phagocytosis, which has been confirmed using video-microscopy: either (1) by surviving to phagolysis and dividing into the phagosome until phagocytes burst, or (2) by avoiding phagocytosis and dividing outside phagocytes. In order to better understand the cellular and molecular mechanisms involved in Candida-phagocytes interactions, we developed new molecular tools for the functional analysis of genes in C. lusitaniae, notably a two-step cloning-free PCR-based method for the deletion of genes. This method was successfully used for the deletion of OLE2, a gene encoding a Δ9-desaturase of fatty acids, possibly implicated in prostaglandin PGE2 biosynthesis. The ole2Δ mutant exhibited strong defects in both pseudofilamention and sexual mating. During macrophages infection, ole2Δ yeast cells were massively internalized and triggered less phagocytes cell death than the wild type strain, suggesting that unsaturated fatty acids and/or oxylipids could play a role during interaction with phagocytes. Lastly, a bank of 10,000 mutants was constructed in C. lusitaniae by the random integration of a genetic marker in the genome. The screening of this bank through our tool to analyse cellular interactions will be undertaken to gain insights into understanding of the early stages of the infectious process.