Les Glioblastomes (GBM) sont des tumeurs cérébrales de trés sombre pronostic malgré leur traitement associant résection chirurgicale et chimio/radiothérapie. Ils contiennent notamment une sous-population de cellules souches/initiatrices de GBM (GIC) impliquée dans la radio/chimiorésistance et la récidive de ces tumeurs en étant capable de générer la majorité des cellules tumorales plus différenciées. Des études ont montré que les cellules tumorales pourraient avoir la capacité de se dédifférencier et d'acquérir un phénotype plus proche des GIC en réponse à des stress. Notre hypothèse est qu'une telle plasticité pourrait avoir lieu en réponse aux radiations ionisantes (RI) et participer à la récidive rapide de ces tumeurs après thérapie. En effet, j'ai montré que l'exposition de cultures primaires de cellules de GBM établies à partir de résection de patients à une dose infra-toxique et cliniquement relevante de RI potentialise à long terme la réacquisition de caractéristiques associées au phénotype des GIC (auto-renouvellement, expression de marqueurs souches et tumorigénicité). J'ai identifié au cours de ce processus (1) une surexpression de la protéine anti-apoptotique Survivine; dont l'inhibition pharmacologique bloque la plasticité radio-induite, (2) une reprogrammation métabolique précoce et (3) une enzyme impliquée dans l'acidification du pH extracellulaire, qui semble favoriser le processus de dédifférenciation radio-induite. A terme, le ciblage des mécanismes impliqués dans de ce processus adaptif aux RI pourrait contribuer à développer des stratégies thérapeutiques innovantes pour radiosensibiliser ces tumeurs. / Glioblastomas (GBM) are some highly lethal brain tumors despite a treatment associating surgical resection and radio-chemotherapy. Amongst these tumors, a subpopulation of radio/chemoresistant GBM stem-like/initiating cells (GIC) appears to be involved in the systematic GBM recurrence through the generation of more differenciated tumoral cells. Recent studies showed that tumor cells may have the ability to dedifferentiate and acquire a GIC phenotype in response to microenvironment stresses. We hypothesized that GBM cells could be subjected to a similar dedifferentiation process after ionizing radiations (IR), then supporting the GBM rapid recurrence after radiotherapy. Indeed, I showed that the exposure of several primo-cultures of differentiated GBM cells isolated from patient resections to a subtoxic and clinically relevant IR dose potentiated the long-term reacquisition of GIC properties (self-renewal ability, expression of stemness markers and tumorigenicity). I also identified during this process (1) an up-regulation of the anti-apoptotic protein Survivin whose pharmacological down-regulation led to a blockade of the IR-induced plasticity, (2) the presence of a metabolic shift occurring quickly after IR and (3) an enzymatic target, which appears to be involved in extracellular acidification under IR and could also potentiate the long term dedifferentiation induced by IR. At term, targeting the mechanisms associated with IR-induced plasticity in order to inhibit the IR-induced adaptive processes will likely contribute to develop some innovating pharmacological strategies for an improved radio-sensitization of these brain tumors.

A l'origine de notre travail se trouve le constat selon lequel, lorsqu'on s'intéresse au vieillissement, les recherches sont partitionnées en une multitude de domaines, de paradigmes expérimentaux et de théories résultant en un large puzzle de connaissance. Pourtant, au niveau comportemental, malgré les apparentes différences entre tous les champs d'étude, il existe des résultats empiriques montrant des évolutions communes dans les comportements des différents systèmes fonctionnels au cours de l'âge. C'est le cas notamment pour les tâches cognitives et sensorimotrices. Par exemple, pour les tâches où la rapidité est le critère de performance, les personnes âgées sont plus lentes que les jeunes ; elles sont aussi plus variables et moins adaptables face à l'augmentation de la difficulté. On observe cela à la fois au niveau cognitif et au niveau sensori-moteur. Plus généralement, avec l'âge les corrélations entre les performances de différents domaines fonctionnels augmentent, notamment entre la cognition et la sensori-motricité (Schäfer et al., 2006 ; Lindenberger & Ghisletta, 2009). Nous avons donc voulu comprendre comment et pourquoi des phénomènes comportementaux communs étaient observés aussi bien dans la cognition que la sensori-motricité. Une hypothèse envisagée est qu'ils seraient dus à des modifications structurelles et fonctionnelles du système nerveux central qui deviendrait de moins en moins différencié au fur et à mesure de l'avancement dans la vie (Reuter-Lorenz & Park, 2010 ; Heuninckx et al., 2005). C'est cette hypothèse que nous avons voulu explorer. / The starting point of this work was to realize that, when looking at aging research, studies are split in a multitude of domains, paradigms and theories resulting in a vast puzzle of knowledge. However, at the behavioral level, despite obvious differences between field of studies, there are empirical results showing common evolution between functional systems during the aging process. It is notably the case for cognitive and sensorimotor tasks. For example, when speed is the performance criterion, elderly are slower than their younger counterparts; there are also more variable and less adaptable as difficulty increases. These phenomenons can be observed in both cognitive and sensorimotor domain. More generally, correlation between performance in different functional domain increases through aging, and most notably between the cognitive and sensorimotor domain (Schäfer et al., 2006 ; Lindenberger & Ghisletta, 2009). We thus wanted to understand how and why those common behavioral phenomenon were observed. A considered hypothesis is that there would come from structural and functional modifications of the central nervous system which would become less and less differentiated through the course of aging (Reuter-Lorenz & Park, 2010 ; Heuninckx et al., 2005). We wanted to explore this hypothesis. At the start of our work, to our knowledge there was no theoretical framework explaining the compression of the cognitive and sensorimotor system in one less differentiated.

La dédifférentiation du chondrocyte peut être provoquée par le stress mécanique ou cytokinique ainsi que la diffusion des facteurs de croissance dans le cartilage. C’est un élément-clé de la dégradation irréversible qui accompagne l’arthrose (ostéoarthritis, OA). Notre but est de rechercher des mécanismes moléculaires susceptibles d’être des cibles thérapeutiques originales contre cette affection. Or, il a été montré récemment que la voie des récepteurs Notch est fortement exprimée dans l’OA humaine. Objectifs: Etudier le rôle de la voie de signalisation Notch /Hes1/Hey1 dans les effets de l’Interleukine-1 β (IL-1β) et du FGF2 sur la dédifférenciation in-vitro des chondrocytes. Méthodes: Des chondrocytes de cartilage articulaire humain ou murin sont mis en culture primaire, puis traités par IL-1β ou FGF2. L’expression de Notch1-R/Hes1/Hey1 est étudiée par immunocytochimie, immunoblot et q-RT-PCR. L’implication de Hes1 dans les effets de l'IL-1β et du FGF2 a été étudiée au moyen d’un siRNA spécifique anti Hes1. Résultats: En normoxie, le marquage de Notch-R1 est localisé à la membrane et dans le cytoplasme des chondrocytes, sans effet des effecteurs. Notch1-R est en revanche nucléaire en hypoxie. L’hypothèse d’un contrôle de la localisation de Notch1-R par la pO2 est confortée par l’inhibition de l’expression de la Préséniline (γ-secrétase) en hypoxie. L’étude des effets des effecteurs sur Hes1 et Hey1 a été réalisée dans les conditions classiques de culture en normoxie. Hes1 est cytoplasmique mais passe dans le noyau sous l’effet de l’IL1β ou de FGF2, suggérant la possibilité d’effets transcriptionnels. Les ARNm de Hes1 sont augmentés d’un facteur de 2,5 avec l’IL-1β et de 7-8 avec le FGF2. Hey1 est insensible à l’IL-1β mais augmente de 4-5 fois sous FGF2. Ces effets sont transcriptionnels directement pour Hes1 (DRB-) et indirectement pour Hey1 (DRB+). Ils passent par la voie NF-κB pour les deux facteurs mais en plus par p38 MAP pour le FGF2. L’induction de Hes1 est insensible au DAPT, inhibiteur de la γ-sécrétase, donc indépendant d’une activation de novo du Notch-R1. L’utilisation d’un siRNA spécifique contre Hes1 montre que l’induction de Hey1 par FGF2 dépend de Hes1 et permet de vérifier l’influence de Hes1 dans la modulation des marqueurs phénotypiques. Hes1 est impliqué dans l’induction par IL-1β de l’expression de MMP13 et ADMTS-5. Hes1 est aussi le médiateur de l’induction par le FGF2 des messagers de la MMP13 (en partie) et de l’isomère Col2A. La protéine Col2A immature est normalement absente du cartilage de souris post-natale, où Col2B est l’isoforme essentielle du collagène de type 2. A l’inverse, le cartilage de souris vieillissante réexprime Col2A, comme cela a été montré dans le cartilage arthrosique chez l’homme. Conclusion: Hes1 est le médiateur des effets d’IL-1β et du FGF2 sur la dédifférentiation in-vitro des chondrocytes (Col2A, MMP13). La voie de Hes1 apparaît donc comme une cible valide pour de nouvelles thérapeutiques contre la dégradation chondrocytaire et donc les maladies dégénératives du cartilage. / Chondrocyte dedifferentiation is a key element of irreversible cartilage degradation induced by mechanical or cytokinic stress, or growth factors, as in degenerative osteoarthritis (OA). Our goal is to search for new therapeutical targets within this process, and Notch signaling has been reported to be strongly expressed during human OA. Objectives: To investigate the involvement of the Notch1/Hes1/Hey1 pathway as mediators of interleukin 1 β (IL-1β) and FGF2 in chondrocytes in vitro. Methods: Mouse or human articular chondrocytes were established in primary culture then challenged with IL-1β or FGF2. Notch-R1, Hes1/Hey1 and chondrogenic target genes expression was monitored by immunocytochemistry, q-rt-PCR, and immunoblotting. Hes1 involvement in IL-1β/FGF2 induced gene expression was investigated with a specific siRNA against Hes1. Results: In normoxia, Notch1-R labeling remained nuclear and stable in intensity in chondrocytes, irrespective of treatment. This suggested steady-state activation of this pathway. In contrast, Notch1-R labeling was located almost exclusively at the membrane or cytoplasm of chondrocytes in hypoxia, irrespective of treatment. Notch-R1 activation may thus be, at least in part, regulated by pO2 as supported by the inhibition of γ-secretase (Presenilin1) expression in hypoxia versus normoxia. In normoxia, addition of IL1β or FGF2 to the cells induced Hes1 translocation to the nucleus, suggesting the possibility of transcriptional effects. This was associated with a transient increase of Hes1 mRNA cyclic expression with mechanistic differences between the two effectors. Hes1 mRNA was increased 2.5-fold by IL-1β and 7-8-fold by FGF2. IL-1β elicited a loss of cyclicity in Hes1 expression while FGF2 conserved the cycles, akin to the effect of serum. These effects were transcriptional and occurred through NF-κB for both effectors but only through the p38 pathway for FGF2. Hey1 expression was not modified by IL-1β, while a 4-5 fold transient increase was observed with FGF2, always posterior to the Hes1 peak. Hey induction by FGF2 was transcriptional and depended on Hes1 expression (DRB). Hes1/ Hey inductions by IL-1β or FGF2 were insensitive to DAPT, a γ-secretase inhibitor, confirming the independence from novel activation of Notch-R. Hes1 expression was silenced by a specific siRNA, showing that the FGF2-induced Hey1 expression is under Hes1 control and ascertaining the role of Hes1 in chondrocyte phenotype modulations. Hes1 mediated IL-1β induction of MMP-13 and ADAMTS-5. Hes1 also mediated FGF2 up-regulation of MMP13 (partly) and Col2A isomer expression. Col2A is normally absent in post-natal mice cartilage, Col2B being the essential isoform of Type 2 collagen. Conversely, aging mice cartilage re-expresses Col2A abundantly as shown for human OA cartilage. Conclusion: Hes1 mediates IL-1β and FGF2 modulations of dedifferentiating chondrocyte phenotype (MMP13, Col2A). Thus the Hes1 pathway appears a valid target for therapeutical research on chondrocytes dedifferentiation, hence degradative cartilage diseases.

Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif spécialisé recouvrant les surfaces osseuses et assurant, avec d’autres tissus comme la membrane synoviale, le bon fonctionnement des articulations. Le cartilage est composé d'un type cellulaire, le chondrocyte, qui assure la synthèse et la dégradation d’une matrice extracellulaire essentielle à ses propriétés mécaniques. Les articulations, en conditions physiologique et pathologique, sont soumises à deux stress principaux agissant sur l’homéostasie du cartilage : le stress mécanique et le stress inflammatoire. Le premier objectif de ma thèse était d’étudier l’effet d’un stress mécanique de type étirement sur le profil d’expression des gènes dans des chondrocytes articulaires de lapin en culture primaire en utilisant une approche à grande échelle (micro‐arrays). Nous avons identifié 36 et 57 transcrits répertoriés dans le génome de lapin et dont les taux d’expression sont respectivement augmentés et diminués par un étirement équibiaxial cyclique (5%, 1Hz, 20h). Certains gènes sont connus pour leur implication dans l’inflammation, la mort cellulaire et la dégradation matricielle. Parmi eux, celui de la relaxine (RLN) était le gène le plus induit par l’étirement. La relaxine, hormone peptidique de la superfamille de l’insuline/relaxine, est connue pour son implication dans la reproduction et la grossesse. En revanche son rôle dans le cartilage articulaire restait à étudier. Le deuxième objectif de ma thèse était, par conséquent, de caractériser la fonction de la RLN dans le cartilage. Mes résultats de RT‐PCR quantitative montrent pour la première fois que la quantité des transcrits de la RLN est augmentée par le stress mécanique et le stress inflammatoire (traitement par l’interleukine‐1) dans des chondrocytes articulaires de lapin. De plus, la quantité des transcrits de la RLN est diminuée au cours de la dédifférenciation des chondrocytes. Dans un modèle de gonarthrose induite chez la souris par déstabilisation du ménisque médial, j’ai montré par immunofluorescence que la RLN est principalement présente au niveau des couches superficielles du cartilage de genou et que son expression diminue dans le cartilage arthrosique par rapport au cartilage normal. De plus, le traitement par de la RLN de chondrocytes de lapin augmente l’activité de la métalloprotéinase MMP‐9 impliquées dans la dégradation du cartilage. En conclusion, cette étude montre que la RLN est sensible aux stress mécanique et inflammatoire et la dédifférenciation des chondrocytes. Elle suggère que cette hormone pourrait moduler l’homéostasie du cartilage. La RLN est donc une cible potentielle d’intérêt dans les pathologies ostéoarticulaires. / The articular cartilage is a specialized conjunctive tissue covering bone surfaces. It ensures, together with other tissues like the synovial membrane, the right functioning of the articulations. The cartilage is formed of one cellular type, the chondrocyte, which is responsible for the synthesis and degradation of the extracellular matrix required for its mechanical properties. The joints, under physiological and pathological conditions, are subjected to two main types of stress that affect cartilage homeostasis: mechanical stress and inflammatory stress. The first objective of my PhD thesisis is to study the effect of stretching, one type of mechanical stress, on the gene expression profile in rabbit articular chondrocytes in culture using a large scale approach (micro‐arrays). 36 and 57 transcripts of the rabbit genome which are up‐regulated and down‐regulated by equibiaxial cyclic tensile stretching (5%, 1Hz, 20h) respectively were identified. Some of these genes are known for their implication in inflammation, cell death and matrix degradation. Among them, the relaxin (RLN) gene is the most induced by stretching. RLN is a peptide hormone that belongs to the insulin/relaxin superfamily. It is known for its implication in reproduction and pregnancy. However, the role of RLN in cartilage is still to be studied. The second objective of my PhD thesis is, consequently, to characterize the function of RLN in cartilage. My qRT‐PCR results show, for the first time, that the RLN transcript levels increase upon mechanical and inflammatory (interleukin ‐1treatment) stress in rabbit articular chondrocytes. Moreover, RLN transcript levels decrease during cell dedifferentiation. In a model of gonarthrosis induced in mice by destabilization of the medial meniscus, I showed by immunofluorescence that RLN is mainly present in the superficial layers of the knee cartilage and that its expression decreases in osteoarthritic cartilage as compared to normal cartilage. Furthermore, treatment of rabbit chondrocytes with RLN increases the activity of the metalloproteinase MMP‐9 involved in cartilage degradation. In conclusion, this study shows that RLN is sensitive to mechanical and inflammatory stress and to chondrocyte dedifferentiation. It also suggests that this hormone could modulate cartilage homeostasis. Therefore, RLN is a potential target in osteoarticular pathologies.

Les Tumeurs NeuroEndocrines Pancréatiques (TNEPs), qui se développent à partir des cellules endocrines des îlots de Langerhans, sont des tumeurs de caractéristiques diverses, sur le point hormonal, fonctionnel ou encore moléculaire. Leur diversité complexifie les diagnostics et les traitements pour les patients atteints. Depuis quelques années, la plasticité cellulaire du pancréas endocrine commence à être bien documentée dans des pathologies comme le diabète et les TNEPs. Les facteurs de croissance de la famille TGF-beta, connus pour leur rôle en cancérologie, sont impliqués dans le contrôle de l'expression des marqueurs d'identité des cellules beta. Mes travaux de thèse ont consisté à étudier la place de la plasticité cellulaire dans le développement d'insulinomes et d'identifier un facteur TGF-beta, impliqué dans ce processus. J'ai ainsi démontré un mécanisme de dédifférenciation des cellules beta tumorales, invalidées pour le gène Men1 chez la souris. De plus, j'ai identifié un ligand de la famille TGF-beta, l'ActivinB, surexprimé dans les insulinomes et responsable de la plasticité cellulaire. Des études complémentaires sur le modèle murin RipTag2, développant également des insulinomes, combinées à des analyses in cellulo, m'ont enfin permis de montrer le rôle de Menin dans l'expression de ce ligand, grâce à la régulation épigénétique, notamment les modifications d'histones. Mes travaux ont ainsi permis de mettre en évidence l'ActivinB comme un nouvel acteur dans la plasticité des cellules beta endocrines, tumorales ou non. La détection d'ActivinB pourra être utilisée à des fins diagnostiques/pronostiques chez des patients atteints de TNEPs. Enfin, mes travaux démontrent que la diversité des TNEPs ne se restreint pas seulement à leurs caractéristiques hormonales, leur fonctionnalité ou leur capacité de prolifération, mais qu'elle est également due à leur origine cellulaire et les mécanismes de tumorigenèse, qui se mettent en place. Ainsi, une caractérisation moléculaire approfondie de ces tumeurs chez l'homme semble désormais essentielle pour affiner la classification, le diagnostic et enfin les thérapies pour les patients atteints des TNEPs / Pancreatic NeuroEndocrine Tumors (PNETs), which develop from endocrine cells in Langerhans islets, present a wide array of hormonal, functional or molecular characteristics. Their diversity complicates the diagnosis and the treatment of affected patients. In recent years, the cellular plasticity of the endocrine pancreas begins to be well documented in pathologies like diabetes or PNETs. Growth factors of TGF-beta family, known for their role in cancer, are involved in the control of beta cell identity marker expression. My PhD work was aiming at studying the role of cell plasticity in insulinoma development and identifying the potent contribution of a subset of members of the TGF-beta superfamily in this mechanism. Using mice model, I proved a mechanism of dedifferentiation in tumor endocrine beta cells, invalidated for Men1 gene. Moreover, I identified a TGF beta member, ActivinB, to be overexpressed in insulinomas and responsible of cellular plasticity. Using a combination of studies based on the RipTag2 mice, that also develop insulinomas, and in cellulo analyses, I further highlighted the role of Menin in the controlled-expression of ActivinB through an epigenetic mechanism, involving histone mark modifications. Therefore, my thesis works permitted to demonstrate that ActivinB represents a novel actor of endocrine beta cell plasticity. More importantly it highlights the possible use of ActivinB for diagnostic/prognostic purposes for PNETs patients. Finally, my work demonstrates that PNETs diversity is not only restricted to hormonal, functional or proliferative features, but shows that both the cell origin and mechanisms of tumorigenesis may actively contribute to the observed tumor heterogeneity. Thus, further molecular and cellular characterization of PNETs appears essential to refine the classification, diagnosis and therapeutics for patients

Rôle de la NADPH oxydase NOX4 dans la régulation de l'expression du symporteur sodium/iode (NIS) dans le cas du cancer papillaire de la thyroïde (PTC). L’activation autocrine de la voie TGF-β induite par BRAFV600E régule négativement l’expression du symporteur sodium/iode (NIS) via une production de ROS dépendante de la NOX4 dans le cancer papillaire de la thyroïde. Résumé : Le cancer papillaire de la thyroïde (PTC) est la pathologie thyroïdienne la plus répandue. Les mutations ponctuelles de BRAF sont retrouvées dans 40 à 60 % des cas de PTC. La transversion BRAFT1799A est la mutation de BRAF la plus fréquente. Les tumeurs porteuses de la mutation BRAFV600E sont souvent associées avec une diminution significative de l’expression du transporteur sodium/iode (NIS). Les résultats cliniques sur les patients atteints d’un cancer de la thyroïde porteur de la mutation BRAFV600E ont montré que l’inhibition de la voie MAPK ne permet pas de rétablir de manière assez importante l’expression du NIS induite par BRAFV600E. L’expression de BRAFV600E induit la sécrétion de TGF-β fonctionnel, qui inhibe l’expression des protéines thyroïdiennes impliquées dans le métabolisme de l’iode, et particulièrement le NIS. La NOX4 est surexprimée dans un nombre croissant de tumeurs, et particulièrement dans les cas de PTC. Dans le cas du cancer du sein, les mécanismes critiques pour le développement du cancer impliquent la régulation par le TGF-β de la NOX4 au niveau transcriptionnel via le facteur de transcription Smad3. Ces données nous mènent à considérer la NOX4 comme un candidat sérieux pour le rôle de système générateur de ROS contrôlé par la boucle autocrine TGF-β induite par BRAFV600E. Dans cette étude, nous avons tout d’abord observé une corrélation entre la présence de l’oncogène BRAFV600E, la surexpression de la NOX4 et l’inhibition de l’expression du NIS dans les cancers papillaires de la thyroïde. Puis, en utilisant la lignée BCPAP comme modèle in vitro de PTC, nous avons démontré BRAFV600E contrôle l’expression de la NOX4 et de la p22phox par l’intermédiaire de la signalisation TGF-β/Smads. La boucle TGF-β induite par BRAFV600E induit l’expression de la NOX4 et de la p22phox au niveau transcriptionnel via phosphorylated SMAD3. L’expression constitutive de la NOX4 et de la p22phox, qui forment ensemble un complexe NADPH oxydase fonctionnel, contribue au stress oxydatif observé dans les cellules BCPAP. Le traitement des cellules BCPAP par des scavengers de ROS comme le N-acetyl cysteine (NAC) et le Tiron permettent d’augmenter l’expression du NIS au niveau transcriptionnel et de rétablir l’expression d’une protéine fonctionnelle permettant la captation d’iode, ce qui indique que les ROS sont impliqués dans l’inhibition de l’expression du NIS. L’inhibition spécifique de la NOX4 par siRNA permet de réinduire l’expression de l’ARN messager et de la protéine NIS. Ces résultats montrent pour la première fois que les ROS produits par la NOX4 jouent un rôle critique dans l’inhibition de l’expression du NIS induite par BRAFV600E via la signalisation TGF-β/SMAD3. / BRAFV600E induced-TGF-β secretion down-regulates sodium iodide symporter (NIS) expression via NOX4-dependent ROS generation in papillary thyroid carcinoma. Abstract : Papillary thyroid cancer (PTC) is the most common thyroid pathology and BRAF point mutations account for 40-60% of tumors. BRAFT1799A is the most frequent BRAF mutation and BRAFV600E positive tumors are often associated with a significant loss of sodium/iodide symporter (NIS) expression. Clinical results on patients harboring thyroid cancer with BRAF mutation have recently shown that MAPK pathway inhibition does not fully reverts the BRAF-induced NIS repression. BRAFV600E expression induces secretion of functional TGF-β which is a repressor of thyroid specific genes such as NIS. Importantly, NOX4 has been shown to be prominently expressed in an increasing number of tumors, in particular in PTCs. In breast cancer cells, a critical mechanism for cancer development involves the transcriptional regulation of NOX4 by TGF-β. This result prompted us to test NOX4 as a ROS-producing candidate induced by BRAF-induced TGF-β. In this report, we first show in PTCs a correlation between BRAFV600E status, NOX4 overexpression, and low NIS expression level. Then, using BCPAP cells as an in vitro PTC model, we demonstrate that BRAFV600E controls NOX4 and p22phox expression via TGF-β signalling. The TGF-β autocrine loop activated by BRAFV600E induces NOX4 and p22phox expression at the transcriptional level via phosphorylated SMAD3. Both constitutively expressed proteins form a functional NADPH oxidase which produces high intracellular ROS levels. ROS scavengers increase the NIS expression at both mRNA and protein levels, and rescue a functional NIS, indicating that ROS are involved in the repression of NIS. Knocking down NOX4 with specific siRNAs reinduces NIS expression at both mRNA and protein levels. Altogether, these results show for the first time that NOX4-dependent ROS generation has a critical role in BRAF-induced NIS repression via the TGF-β/SMAD3 oncogenic signalling.

Il est généralement admis que le cancer du sein représente un ensemble de plusieurs maladies, définies comme des sous-types ayant des caractéristiques moléculaires et cliniques qui leurs sont propres. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent l'hétérogénéité du cancer du sein est essentielle au développement de thérapies mieux ajustées. Le concept de cellules souches cancéreuses (CSC) pourrait être un des clés de cette compréhension. A ce jour, un certain nombre de marqueurs ont été proposés pour isoler et caractériser les cellules souches dans le cancer du sein, mais aucun ne semble totalement satisfaisant.Le but de mon travail était de déterminer un marqueur ou une combinaison de marqueurs avec lesquels les fractions enrichies en CSC pourraient être isolées de manière reproductible dans le cancer du sein de sous-types basal (BLBC). En effet, les tumeurs basales représentent 15% de toutes les tumeurs mammaires, mais constituent le sous-type le plus agressif. À cet effet, j'ai analysé un certain nombre de marqueurs par analyse FACS et tri cellulaire et utilisé la capacité de formation de mammosphères (MS) comme critère de validation pour la présence de CSC. Les lignées cellulaires utilisées comme modèles étaient les SUM 159, MDA-MB-231, MDA-MB-436, HCC1143, MDA-MB-468, Hs578T et BT-549 correspondant aux modèles basal-A et B. J'ai également testé trois lignées luminales les MCF7, T47D et BT474.De tous les marqueurs testés, seules, la combinaison des protéines de surface cellulaire CD44/CD24/EpCAM et l’activité enzymatique ALDH élevée ont permis d’obtenir un enrichissement significatif en CSC. Toutefois, le niveau de l'activité ALDH est apparu inconstant d’une lignée cellulaire à une autre et selon le type de tumeurs. D'autres marqueurs membranaires ont donné des résultats mitigés dans le cancer du sein ER-. En effet, la plupart des lignées basales ont montré des profils FACS assez homogènes avec des proportions élevées de cellules CD44+. Cependant, l'association de la positivité de CD44 avec l'EMT et la souchitude, ainsi que la bonne corrélation observée dans les modèles luminaux de la population de cellules CD44+/CD24- avec l’enrichissement en CSC, nous a incité à déterminer si le niveau d'expression en CD44 faisait une différence dans les tumeurs basales. Sur cette base, j’ai montré que les cellules CD44 high présentent une forte capacité à former des MS dans toutes les lignées cellulaires testées. Cette constatation nous a incités à utiliser CD44high vs. CD44low comme critère de tri cellulaire et à utiliser ces fractions pour effectuer une analyse du transcriptome afin d'identifier d'autres marqueurs non encore déterminés, pouvant isoler des fractions cellulaires plus faibles avec un enrichissement plus élevé en CSC. / It is now accepted that breast cancer is a compendium of several diseases defined as subtypesthat are associated with different clinical outcomes and molecular characteristics. A betterunderstanding of the mechanisms underlying breast cancer heterogeneity is critical to the development of better adjusted therapies. One of the keys to breast cancer heterogeneity may be explained by cancer stem cells (CSC). A number of markers have been proposed to isolate and characterize breast cancer stem cells, but none appears totally satisfactory.The purpose of my work was determine a marker or combination of markers with which CSC enriched fractions could be reproducibly isolated in basal like breast cancer (BLBC). BLBC represent 15% of all breast tumors, but are the most aggressive subtype. To this aim, I have analyzed a number of markers by FACS analysis and cell sorting and used the capacity to form mammospheres (MS) as a validation criterion for the presence of CSCs. The cell lines used as models were SUM 159, MDA-MB-231, MDA-MB-436, HCC1143, MDA-MB-468, Hs578T and BT-549 comprising both Basal A and Basal B models. I also tested three luminal models MCF7, T47D and BT474.Of all the markers tested those that most consistently allowed enrichment of CSCs were the combination of cell surface proteins CD44/CD24/EpCAM and elevated ALDH enzyme activity. However, ALDH activity appeared irregular, ranging from good to inconsistent according to the cell line. Other cell surface markers gave mixed results in ER- breast cancer because the elevated fraction of CD44+ cells found in most of basal breast cancer cell lines and their propensity to show rather homogenous FACS labeling patterns. However, the association of CD44 positivity with EMT and stemness, as well as the good correlation, we observed in luminal models, of CD44+/CD24- cell population with CSC enrichment incited us to determine whether the level of expression of CD44 could make a difference in basal like models. I show that CD44high cells present higher capacity to form MS in all cell line models tested. This prompted us to use CD44high vs. CD44low as a cell sorting criterion and use these fractions to perform transcriptome analysis in order to identify other markers yet not determined, that may point to smaller cell fractions with a higher CSC enrichment.