The diffraction limit restricts conventional light microscopes to approximately 250 nm laterally and 500 nm axially, these limits being first proposed by Abbe in 1873. Despite this, optical microscopes have found many applications in biological research and single cells that are 10 - 100 um in size. Furthermore by coupling the non-invasive nature of a light microscope with highly sensitive fluorescent probes, fluorescence microscopy has also become a standard imaging technique. Recent advances in fluorescence microscopy now provide a number of methods to circumvent the Abbe diffraction limit, with many techniques becoming prevalent over the last 10 years including direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM). A dSTORM system has been constructed and calibrated using a commercially available inverted florescence microscope and total internal reflection florescence (TIRF) imaging. dSTORM relies on the ability to switch sparse subsets of fluorophores and temporally separate them. Provided the spatial separation is sufficient between any member of a subset, the average error with which the emission can be localized is much less than size of the emission profile itself. The underlying mechanism for this switching is detailed based on the principle of photoinduced electron transfer (PET). The switching characteristics of the common florescent dye Alexa Fluor 568 are investigated and shown to be controlled by a number of factors including the excitation intensity and concentration of the primary thiol cysteamine beta-MEA. A number of parameters are defined, including the dye switching rate, for a given set of physical parameters. U2OS cells are labelled for the microtubule protein Tubulin using immunofluorescent labelling strategies. A direct comparison is made between diffraction limited TIRF images and dSTORM reconstructed images, with an average width for microtubules determined to (58.2 ± 8.1) nm. Further measurements are made by labelling the Rab5 effector Early Endosome Antigen 1 (EEA1). From this the aspect ratio for early endosomes is determined to be 1.68 ± 0.7 with an average radius of (45.8 ± 18.8) nm. The point spatial distribution of EEA1 is investigated by using the linearised form of Ripley's K-function H(r) and the null hypothesis of complete spatial randomness tested. EEA1 is shown to cluster at radius of 58.7 nm on individual endosomes, thought to be due to the well defined binding domains present on early endosomes for EEA1. Further evidence suggests that clustering is also exhibited at another maximum of approximately 500 nm when looking at an ensemble of EEA1 and early endosomes.

Résumé: Les récepteurs du glutamate de type NMDA (NMDAR) sont des canaux ioniques impliqués dans les phénomènes de plasticité de la transmission synaptique dans le système nerveux central, des mécanismes supposés être à la base du développement neuronal, de l’apprentissage et de la formation de la mémoire. Les NMDAR forment des tétramères à la membrane plasmique, constitués de deux sous-unités obligatoires GluN1 et deux sous-unités variables GluN2 (GluN2A-D) ou GluN3. Dans le prosencéphale, les récepteurs comportant les sous-unités GluN2A (GluN2A-NMDAR) et GluN2B (GluN2B-NMDAR) sont les plus abondants et présentent des profils d’expression différents au cours du développement, les GluN2B-NMDAR étant fortement exprimés aux stades précoces tandis que l’expression des GluN2A-NMDAR augmente progressivement au cours du développement postnatal. Des contributions relatives de ces deux sous-types majoritaires de NMDAR aux propriétés de signalisation distinctes dépendent directement les phénomènes de plasticité neuronale, tels que l’adaptation des synapses glutamatergiques et des circuits neuronaux excitateurs. Bien que la régulation moléculaire des NMDAR ait fait l’objet d’intenses recherches ces dernières décennies, la localisation précise de ces deux sous-types de récepteurs dans la membrane postsynaptique demeurait méconnue. Pour répondre à cette question, nous avons étudié la distribution des NMDAR à la surface de neurones d’hippocampe de rats en combinant deux techniques de microscopie de super-résolution - la microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) et la déplétion d’émission stimulée (STED) - permettant de dépasser la limite de résolution inhérente à la diffraction de la lumière. Ces techniques nous ont permis de mettre en évidence que les sous-types de récepteurs GluN2A- et GluN2B-NMDAR présentent une nano-organisation différente à la surface neuronale. En effet, ils sont organisés en structures nanoscopiques (nanodomaines) qui diffèrent en nombre, en surface et en morphologie, notamment au niveau des synapses. Au cours du développement, l’organisation membranaire des deux sous-types de NMDAR évolue, avec en particulier de profonds changements de distribution des GluN2A-NMDAR. De plus, cette organisation nanoscopique est impactée différemment par des modulations de l’interaction avec les protéines d’échafaudage à domaine PDZ ou de l’activité de la kinase CaMKII suivant le sous-type de NMDAR considéré. En effet, la réorganisation des GluN2A-NMDAR implique principalement des changements de nombre de récepteurs dans les nanodomaines sans modification de leur localisation, tandis que la réorganisation des GluN2B-NMDAR passe essentiellement par des modifications de localisation des nanodomaines sans changements du nombre de récepteurs qu’ils contiennent. Ainsi, les GluN2A- et GluN2B-NMDAR présentent des nano-organisations différentes dans la membrane postsynaptique, reposant vraisemblablement sur des voies de régulation et des complexes de signalisation distincts. / NMDA-type glutamate receptors (NMDARs) are a type of ion permeable channels playing critical roles in excitatory neurotransmission in the central nervous system by mediating different forms of synaptic plasticity, a mechanism thought to be the molecular basis of neuronal development, learning and memory formation. NMDARs form tetramers in the postsynaptic membrane, most generally associating two obligatory GluN1 subunits and two modulatory GluN2 (GluN2A-D) or GluN3 (GluN3A-B) subunits. In the hippocampus, the dominant GluN2 subunits are GluN2A and GluN2B, displaying different expression patterns, with GluN2B being highly expressed in early development while GluN2A levels increase gradually during postnatal development. In the forebrain, the plastic processes mediated by NMDARs, such as the adaptation of glutamate synapses and excitatory neuronal networks, mostly rely on the relative implication of GluN2A- and GluN2B-containing NMDARs that have different signaling properties. Although the molecular regulation of synaptic NMDARs has been under intense investigation over the last decades, the exact topology of these two subtypes within the postsynaptic membrane has remained elusive. Here we used a combination of super-resolution microscopy techniques such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) and stimulated emission depletion (STED) microscopy to characterize the surface distribution of GluN2A- or GluN2B-containing NMDARs. Both dSTORM and STED microscopy, based on different principles, enable to overcome the resolution barrier due to the diffraction limit of light. Using these techniques, we here unveil a differential nanoscale organization of native GluN2A- and GluN2B-NMDARs in rat hippocampal neurons. Both NMDAR subtypes are organized in nanoscale structures (termed nanodomains) that differ in their number, area, and shape. These observed differences are also maintained in synaptic structures. During development of hippocampal cultures, the membrane organization of both NMDAR subtypes evolves, with marked changes for the topology of GluN2A-NMDARs. Furthermore, GluN2A- and GluN2B-NMDAR nanoscale organizations are differentially affected by alterations of either interactions with PDZ scaffold proteins or CaMKII activity. The regulation of GluN2A-NMDARs mostly implicates changes in the number of receptors in fixed nanodomains, whereas the regulation of GluN2B-NMDARs mostly implicates changes in the nanodomain topography with fixed numbers of receptors. Thus, GluN2A- and GluN2B-NMDARs have distinct organizations in the postsynaptic membrane, likely implicating different regulatory pathways and signaling complexes.

Ziel dieser Arbeit war es, strukturelle Veränderungen präsynaptischer Aktiver Zonen als mögliches Korrelat synaptischer Plastizität zu detektieren. Damit soll die Hypothese getestet werden, dass strukturelle Plastizität Aktiver Zonen eine zentrale Rolle bei der Informationsverarbeitung im Gehirn und bei Lern- und Gedächtnisprozessen spielt. Dazu war es notwendig Methoden zu etablieren, die die strukturelle Analyse Aktiver Zonen und deren Veränderung in vitalem Gewebe ermöglichen. Um die Untersuchungen in einem Gewebe mit plastischen Eigenschaften durchzuführen, wurden Methoden zur Herstellung organotypischer hippocampaler Hirnschnittkulturen etabliert, da hippokampale Moosfasersynapsen ausgeprägte präsynaptische Plastizität aufweisen (Bliss und Collingridge, 1993). Durch Einzelzellelektroporation wurde es möglich, individuelle Neurone mit Transgenen zur Markierung der gesamten Zelle (DsRed) und synaptischer Substrukturen wie Aktive Zonen (z.B.: GFP-CAST, einem Fluorophor-markierten AZ-Protein) zu transfizieren. Mit konfokaler Bildgebung transfizierter Zellen konnten strukturierte Anreicherungen von GFP-CAST in Moosfaserboutons dargestellt werden. Konfokale Bildgebung von Doppelimmunfluoreszenzfärbungen zur detaillierten Analyse der Proteinlokalisation zeigte ein diffraktionsbedingtes Auflösungsdefizit, das auch durch die Anwendung von STED-Mikroskopie nicht zufriedenstellend gelöst werden konnte. Um eine präzise Karte synaptischer Proteine zu erstellen, wurde hochauflösende Mikroskopie (dSTORM) mit einer lateralen räumlichen Auflösung von 20 nm etabliert. Dabei erwiesen sich die ausgeprägte Plastizität, die hohe Dichte an Aktiven Zonen und die variable Gestalt der Boutons im hippokampalen Präparat als problematisch. Aus diesem Grund wurde die elektronenmikroskopisch gut charakterisierte neuromuskuläre Endplatte mit ihrer symmetrischen molekularen Struktur als Präparat für dSTORM verwendet. An der Endplatte konnte die molekulare Organisation der Aktiven-Zonen-Proteine Piccolo und Bassoon dargestellt werden. Zudem konnten erstmals die Mündungen postsynaptischer Falten lichtmikroskopisch aufgelöst werden. So gelang es Werkzeuge zu etablieren, die mit lichtmikroskopischen Methoden die Darstellung der Architektur Aktiver Zonen mit molekularer Auflösung ermöglichen. Die Herausforderung wird es sein, diese neue Dimension in funktionellem Kontext zu nutzen. Die experimentellen Grundlagen dazu wurden durch eine spezielle Badkammer und die Etablierung von Rollertubekulturen bereits gelegt. Dabei ermöglicht dSTORM die Adressierung quantitativer Fragestellungen bis hin zur Bestimmung der Molekülanzahl. / The aim of this work was to visualize structural changes of presynaptic active zones (AZ) as a putative correlate of synaptic plasticity in the brain, thereby testing the hypothesis, that structural plasticity is a key player in information processing, learning and memory. Therefore it was necessary to establish methods that allowed the structural analysis of active zones and their changes in living tissue. To do these investigations in a tissue with plastic characteristics, organotypic hippocampal slice cultures have been established, due to distinct presynaptic plasticity of hippocampal mossy fibre boutons (Bliss and Collingridge, 1993). With single cell electroporation it became possible to mark transgenetically individual neurons (DsRed) and synaptic substructures like active zones (GFP-CAST, a fluorophor labelled AZ- Protein). By imaging transfected neuron using confocal light microscopy, discrete accumulations of GFP-CAST were found in mossy fibre boutons. Aiming to analyse protein localisation in detail, confocal imaging of double-immunofluorescence staining revealed a diffraction based lack of lateral resolution, that couldn’t be solved satisfactory by the application of STED microscopy. To generate a precise map of synaptic protein distribution, superresolution light microscopy (dSTORM) was established with a lateral resolution of 20 nm. Pronounced structural plasticity, high active zone density and complex structure of hippocampal mossy fibre boutons turned out to be a drawback of this preparation. Therefore mammalian neuromuscular endplates that are well characterised by electron microscopy and display a highly symmetrical shape were introduced as a preparation for dSTORM. At the endplate dSTORM revealed a differential distribution of active zone proteins Piccolo and Bassoon. Moreover, for the first time it was possible to resolve the aparture of postsynaptic folds by light microscopy. These results show that it was possible to establish tools based on superresolution light microscopy, that are capable of exploring active zone ultrastructure on a molecular level. It will be future tasks to use these novel techniques in a functional context. Based on experimental advances shown in this work like specialised recording chambers for slicecultures or the use of rollertube cultures, dSTORM will allow to address questions concerning synaptic function and plasticity, down to counting single molecules.

Recent development of super-resolution (SR) fluorescence microscopy techniques has provided a new tool for direct visualization of subcellular structures and their dynamics in cells. The homing of Hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) to bone marrow is a multistep process that is initiated by tethering of HSPCs to endothelium and mediated by spatiotemporally organised ligand-receptor interactions of selectins expressed on endothelial cells to their ligands expressed on HSPCs which occurs against the shear stress exerted by blood flow. Although molecules and biological processes involved in this multi-step cellular interaction have been studied extensively, molecular mechanisms of the homing, in particular the nanoscale spatiotemporal behaviour of ligand-receptor interactions and their role in the cellular interaction, remain elusive. Using our new method of microfluidics-based super-resolution fluorescence imaging platform we can now characterize the correlation between both nanoscale ligand-receptor interactions and tethering/rolling of cells under external shear stress. We found that cell rolling on E-selectin caused significant reorganization of the nanoscale clustering behavior of CD44 and CD43, from a patchy clusters of ~ 200 nm in size to an elongated network-like structures where for PSGL-1 the clustering size did not change significantly as it was 85 nm and after cell rolling the PSGL-1 aggregated to one side or even exhibited an increase in the footprint. Furthermore, I have established the use of 3D SR images that indicated that the patchy clusters of CD44 localize to protruding structures of the cell surface. On the other hand, a significant amount of the network-like elongated CD44 clusters observed after the rolling were located in the close proximity to the E-selectin surface. The effect of the nanoscale reorganization of the clusters on the HSPC rolling over selectins is still an open question at this stage. Nevertheless, my results further demonstrate that this mechanical force-induced reorganisation is accompanied by a large structural reorganisation of actin cytoskeleton. Our microfluidics-based SR imaging also demonstrate an essential role of the nanoscale clustering of CD44 on stable rolling behaviours of cells. Our new experimental platform enhances understanding of the relationship between nanoscopic ligand-receptor interactions and macroscopic cellular interactions, providing a foundation for characterizing complicated HSPC homing

La microscopie optique stochastique de reconstruction (STORM) contourne la limite de diffraction en enregistrant des signaux monomoléculaires spatialement et temporellement séparés, atteignant une résolution de ~10-40 nm. Dans mon étude, j'ai développé une stratégie d'imagerie et d'analyse de données dSTORM bicolore afin d'étudier l'ultrastructure des synapses inhibitrices mixtes. Mes résultats ont montré que les GlyRs, les GABAARs, la géphyrine et RIM1/2 présentent une organisation intra-synaptique hétérogène et forment des domaines sous-synaptiques (SSDs). Les GlyR et les GABAAR ne sont pas complètement mélangés, mais peuvent occuper des espaces différents à la densité post-synaptique (PSD). De plus, les SSD de géphyrine postsynaptique sont alignées avec les SSD de RIM1/2 pré-synaptiques, formant des nanocolonnes trans-synaptiques. Au cours d'une activité neuronale élevée par traitement 4-AP, la corrélation spatiale entre les GlyRs, les GABAARs et la géphyrine a augmentée au PSD. De plus, la corrélation spatiale des GlyRs et RIM1/2 a également augmenté, tandis que celle des GABAARs et RIM1/2 n'a pas changé. Le nombre de SSD par synapse pour ces protéines synaptiques n'est pas modifié par 4-AP. Cette étude fourni un nouvel angle de compréhension des mécanismes sous-jacents à la co-transmission GABAergique/glycinergique. / Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) bypasses the diffraction limit by recording spatially and temporally separated single molecule signals, achieving a resolution of ~10-40 nm. In my study, I have developed a two-color dSTORM imaging and data analysis strategy, in order to investigate the ultrastructure of mixed inhibitory synapses. My results show that GlyRs, GABAARs, gephyrin and RIM1/2 exhibit a heterogeneous intra-synaptic organization and form sub-synaptic domains (SSDs). GlyRs and GABAARs were not fully intermingled, but sometimes occupied different spaces at the post-synaptic density (PSD). In addition, post-synaptic gephyrin SSDs were aligned with pre-synaptic RIM1/2 SSDs, forming trans-synaptic nanocolumns. During elevated neuronal activity by 4-AP treatment, the spatial correlation between GlyRs, GABAARs and gephyrin was increased at the PSD. Moreover, the spatial correlation of GlyRs and RIM1/2 was also increased, while that of GABAARs and RIM1/2 did not change. The number of SSDs per synapse for these synaptic proteins was not changed by 4-AP. My study thus provides a new angle for understanding the mechanisms underlying GABAergic/glycinergic co-transmission.

Les tétraspanines sont des protéines transmembranaires de la membrane plasmique qui forment un réseau d'interactions protéiques, appelé "Tetraspanin Web", entre tétraspanines ou avec d'autres protéines partenaires. Elles ont également la capacité de s'organiser en microdomaines membranaires appelés TEM (Tetraspanin-Enriched Microdomains). Ces protéines sont impliquées dans plusieurs mécanismes cellulaires et associées à de nombreuses pathologies. La diversité de leurs interacteurs reflète la pléiotropie de leurs fonctions.. Entre autres, elles jouent un rôle déterminant au cours des processus infectieux et notamment lors du bourgeonnement du VIH-1. Des études récentes menées au laboratoire ont plus particulièrement démontré, à l’échelle de la molécule unique, que les tétraspanines CD9 et CD81 étaient spécifiquement recrutées au niveau des sites d'assemblage de la protéine virale Gag. Ces travaux ont été faits dans un système modèle de cellules HeLa transfectées par Gag-GFP, dans lesquelles se forment des sites de bourgeonnement de pseudo-particules virales de type VIH-1. Ces observations soulèvent plusieurs questions quant à l’implication des tétraspanines CD9 et CD81 dans le mécanisme d’assemblage du virus, notamment dans le remodelage de la membrane plasmique de la cellule hôte et sa courbure lors du bourgeonnement, deux phénomènes auxquels les tétraspanines sont associées. Dans ce contexte, le principal objectif de ma thèse a été de déterminer l'organisation structurale des sites d'assemblage du VIH-1 en utilisant une nouvelle méthodologie combinant la microscopie à force atomique (AFM) et la microscopie super résolue de type dSTORM. La microscopie dSTORM fait partie des techniques basées sur la localisation de molécules individuelles et permet de cartographier des protéines fluorescentes avec une résolution latérale inférieure à 50nm tandis que l'AFM permet de déterminer la topographie membranaire avec une résolution du même ordre. La première partie de ma thèse a consisté à construire ce nouveau montage expérimental, en collaboration avec l'équipe de Marcelo Nollmann. Nous avons confirmé en premier lieu que les sites regroupant Gag-GFP corrélaient bien avec des protrusions membranaires caractérisés par AFM Nous avons montré que les tétraspanines CD9 étaient spécifiquement recrutées au niveau de ces sites de bourgeonnement et que leur recrutement corrélait avec le degré de maturation des bourgeons Gag-GFP qui dépend du diamètre et de la hauteur des sites de bourgeonnement. En plus d’une redistribution des tétraspanines au cours du processus d’assemblage des nouveaux virions, nous avons pu observer une déplétion des tétraspanines CD9 et CD81 à la surface des cellules exprimant la protéine virale Gag-GFP. Ces résultats préliminaires révèlent la capacité des protéines virales Gag à modifier spécifiquement l’environnement de la cellule hôte en modulant la répartition et l’expression des tétraspanines au niveau de la membrane plasmique, suggérant un rôle déterminant des tétraspanines au cours de la réplication du virus VIH-1. / Tetraspanins are transmembrane proteins forming a network of protein-protein interactions at the cell surface, called "Tetraspanin Web". They can also be organized into membrane microdomains named « TEMs » for « Tetraspanin Enriched Microdomains ». These domains are involved in many cellular functions and pathologies. The role of tetraspanins during infection has been described early on, notably TEMs are implicated in various aspects of the HIV-1 life cycle, including entry and budding. It has been demonstrated recently, at the single molecule level, that the CD9 and CD81 tetraspanins are specifically recruited by HIV-1 Gag to viral assembly and release sites. These observations raise crucial questions about the role of these two tetraspanins in this process and their implication in membrane remodelling and/or bending during assembly and budding of the viral particles. In this context, the main objective of my PhD thesis was to investigate the structural organization of HIV-1 assembly/budding sites by a combination of two advanced microscopy techniques: atomic force microscopy (AFM) and direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM). AFM provides information on the membrane topography with lateral resolution lower than a 50 nm. A similar resolution can be reached with dSTORM that is suitable to map fluorescently labeled proteins at the single molecule level. Combination of these two techniques allowed us to characterize the distribution of CD9 clusters within HIV-1 budding sites in the membrane topography context. The first task of my PhD was to build this new combo in collaboration with Marcelo Nollmann's group. We then performed AFM imaging of HeLa cells transfected with the viral protein Gag fused to GFP and demonstrated that Gag-GFP assembly sites correlate with membrane protrusions. In addition, by dSTORM imaging of the same region, we have shown that CD9 tetraspanins were enriched and recruited at Gag assembly sites and that their distribution depends on the assembly stage of the virus-like particles imaged with AFM (the dimensions of the budding sites relates to the assembly stage of the viral particles). Finally, we documented that Gag mediated depletion of both CD9 and CD81 tetraspanins from the surface of HeLa transfected cells. These results reveal the impact of the viral protein Gag on the host cell environment by modulating the partition and expression of tetraspanins within the plasma membrane, reinforcing an important role of tetraspanins during HIV-1 life cycle.

Au cours de ce travail de thèse expérimental, nous nous sommes intéressés à l’étude de la localisation nucléaire et nucléolaire de la protéine de la nucléocapside (NC) du VIH-1. Des études antérieures menées au laboratoire avaient mis en évidence une très forte accumulation de la NC dans les nucléoles. Ce compartiment nucléaire est connu pour être ciblé par de nombreux virus afin de promouvoir leur réplication. Des expériences de microscopie électronique avaient révélé la structure complexe du nucléole et montré qu’il est composé de trois sous-compartiments : les centres fibrillaires, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire dans lesquels se déroule la synthèse des ribosomes. Afin de caractériser la localisation de la NC dans ces trois sous-compartiments, nous avons développé une approche de microscopie optique à haute résolution permettant d’obtenir des images à deux couleurs avec une résolution spatiale améliorée. Pour cela, nous avons mis au point un protocole qui permet d’utiliser simultanément une protéine fluorescente photocommutable et un fluorophore organique introduit par immunomarquage. Après avoir minimisé les aberrations optiques et corrigé les dérives mécaniques inhérentes au montage, nous avons visualisé simultanément la localisation de la NC surexprimée dans des cellules HeLa avec des marqueurs spécifiques des trois sous-compartiments nucléolaires (immunomarquage). La microscopie de fluorescence à haute résolution a permis de résoudre pour la première fois les différents compartiments et de montrer que la NC se localise préférentiellement dans le compartiment granulaire. Finalement, des expériences préliminaires avec des cellules vivantes ont permis de mettre en évidence que la NC est transportée de manière active dans le noyau et qu’elle pourrait interagir directement avec des protéines nucléolaires / During this experimental thesis work, we investigated the nuclear and nucleolar localization of the nucleocapsid protein (NC) of HIV-1. Previous studies performed in our laboratory evidenced a strong accumulation of NC in a subnuclear structure called nucleolus. Playing role in multiple cellular processes, nucleolus is often targeted by viruses to promote their replication. Electron microscopy revealed three nucleolar components (fibrillar centers, dense fibrillar component and granular component) associated to specific steps of the ribosome biogenesis. To characterize the distribution of the NC in these three sub-compartments and therefore shed light on the nucleolar localization of NC during the replication cycle, we developed a high-resolution optical microscopy approach. After having minimized the optical aberrations and corrected the mechanical drifts inherent to the imaging setup, the NC-mEos2 fusion protein overexpressed in HeLa cells was visualized simultaneously with immunolabeled nucleolar markers. The use of high-resolution fluorescence microscopy enabled us to resolve for the first time the three nucleolar compartments and to demonstrate the preferential localization of NC in the granular compartment of nucleolus. Finally, preliminary experiments performed with living cells showed that NC is actively transported in the nucleus and therefore may interact directly with nucleolar proteins.

Parmi les méthodes de super-résolution, la microscopie par localisation de molécules uniques se distingue principalement par sa meilleure résolution réalisable en pratique mais aussi pour l’accès direct aux propriétés des molécules individuelles. Les données principales de la microscopie par localisation sont les coordonnées des fluorochromes, un type de données peu répandu en microscopie conventionnelle. Le développement de méthodes spéciales pour le traitement de ces données est donc nécessaire. J’ai développé les logiciels SharpViSu et ClusterViSu qui permettent d’effectuer les étapes de traitements les plus importantes, notamment une correction des dérives et des aberrations chromatiques, une sélection des événements de localisations, une reconstruction des données dans des images 2D ou dans des volumes 3D par le moyen de différentes techniques de visualisation, une estimation de la résolution à l’aide de la corrélation des anneaux de Fourier, et une segmentation à l’aide de fonctions K et L de Ripley. En plus, j’ai développé une méthode de segmentation de données de localisation en 2D et en 3D basée sur les diagrammes de Voronoï qui permet un clustering de manière automatique grâce à modélisation de bruit par les simulations Monte-Carlo. En utilisant les méthodes avancées de traitement de données, j’ai mis en évidence un clustering de la protéine CENP-A dans les régions centromériques des noyaux cellulaires et des transitions structurales de ces clusters au moment de la déposition de la CENP-A au début de la phase G1 du cycle cellulaire. / Among the super-resolution methods single-molecule localization microscopy (SMLM) is remarkable not only for best practically achievable resolution but also for the direct access to properties of individual molecules. The primary data of SMLM are the coordinates of individual fluorophores, which is a relatively rare data type in fluorescence microscopy. Therefore, specially adapted methods for processing of these data have to be developed. I developed the software SharpViSu and ClusterViSu that allow for most important data processing steps, namely for correction of drift and chromatic aberrations, selection of localization events, reconstruction of data in 2D images or 3D volumes using different visualization techniques, estimation of resolution with Fourier ring correlation, and segmentation using K- and L-Ripley functions. Additionally, I developed a method for segmentation of 2D and 3D localization data based on Voronoi diagrams, which allows for automatic and unambiguous cluster analysis thanks to noise modeling with Monte-Carlo simulations. Using advanced data processing methods, I demonstrated clustering of CENP-A in the centromeric regions of the cell nucleus and structural transitions of these clusters upon the CENP-A deposition in early G1 phase of the cell cycle.

Cell wall mannans of Candida albicans mask β-(1,3)-glucan from recognition by Dectin-1, contributing to innate immune evasion. Glucan exposures are predominantly single receptor-ligand interaction sites of nanoscale dimensions. Candida species vary in basal glucan exposure and molecular complexity of mannans. We used super-resolution fluorescence imaging and a series of protein mannosylation mutants in C. albicans and C. glabrata to investigate the role of specific N-mannan features in regulating the nanoscale geometry of glucan exposure. Decreasing acid labile mannan abundance and α-(1,6)-mannan backbone length correlated most strongly with increased density and nanoscopic size of glucan exposures in C. albicans and C. glabrata, respectively. Additionally, a C. albicans clinical isolate with high glucan exposure produced similarly perturbed N-mannan structures and elevated glucan exposure geometry. Thus, acid labile mannan structure influences the nanoscale features of glucan exposure, impacting the nature of the pathogenic surface that triggers immunoreceptor engagement, aggregation, and signaling. Graus et al. find that N-mannan structural features regulated by Candida mannosyltransfersases control glucan exposure. Loss of mannan increased the frequency and size of glucan exposures and changed multivalent receptor engagement. Changes to mannan structure in a bloodstream isolate are associated with elevated glucan exposure at the nanoscale.

Synapse is the fundamental unit of synaptic transmission. Learning, memory and neurodegenerative diseases of the brain are attributed to the maintenance and alteration in synaptic connections. The efficiency for synaptic transmission depends on how well the post synapse receives the signals from the presynapse; this in turn depends on the receptors present in the post synaptic density (PSD). PSD is present in the post synapse right opposite to the neurotransmitter release site in presynapse (active zone) is an indispensable part of the synapse. The PSD is comprised of receptors and scaffold proteins, which is ultimately supported by the actin cytoskeleton of the dendritic spines. Cytoskeletal dynamics is shown to influence the structural plasticity of spine and also PSD, but how it regulates the dynamicity of the synaptic transmission is not completely understood. Here we studied the influence of actin depolymerisation on sub synaptic organization of an excitatory synapse. In order to study the organization of the synapse at molecular resolution, the conventional microscopy cannot be employed due to the limit of diffraction. Super resolution microscopy circumvents this diffraction limitation. In this study we have used custom built fluorescence microscope with Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) modality to observe the nanometre sized structures inside spines of mouse hippocampal primary neurons. The setup was integrated with Metamorph imaging software for both operating the microscope and imaging acquisition purpose with a separate appropriate laser system. This setup was successful in achieving the lateral resolution of ~30nm and axial resolution of ~51nm. Over all we were able to observe the loss of spines and significant reduction in area of nanometer sized protein clusters in postsynaptic density with in the spines of latrunculin A treated mouse hippocampal primary neurons compared to the native neurons. Along with the morphological alterations in neurons we also observed the changes in nanoscale organization of few key molecules in the postsynaptic density.