Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La vía de señalización del gen Wnt cumple importantes roles en el desarrollo y oncogénesis, es transducido por al menos dos vías: la vía canónica β-catenina dependiente y la cascada no canónica, independiente de β-catenina. La caseína quinasa CK1 es una familia de proteínas a la que recientemente se le ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos 7 isoformas, de las cuales CK1α, CK1δ, CK1ε Y CK1γ han sido relacionadas con la vía canónica de Wnt. En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de CK1γ y wnt3a en el desarrollo embrionario del pez zebra (Danio rerio). Para ello, hemos analizado los patrones de expresión de estos genes mediante hibridación in situ y RT-PCR. Los resultados indican que estos genes se expresan de manera diferencial temporal y espacialmente durante el desarrollo embrionario. CK1γ presenta una expresión ubicua en los primeros estadios. La expresión de wnt3a es evidente desde las 12 horas post fecundación, de forma débil. En estadios más avanzados, ambos genes se expresan fuertemente en la región cefálica y en el primordio de las aletas pectorales. CK1γ además se expresa débilmente en el resto del embrión. Para analizar la función de ambos genes se realizaron estudios de sobreexpresión mediante la inyección del mRNA codificante para CK1γ y wnt3a y ensayos de bloqueo de función para wnt3a mediante la inyección del morfolino oligo antisentido, que silencia específicamente la actividad de este gen. Estos experimentos anteriormente mencionados se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadio de una célula. Posteriormente los embriones fueron incubados y observados en distintos estadios bajo lupa estereoscópica y clasificados según su fenotipo. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que CK1γ y wnt3a están involucrados en el desarrollo ocular. CK1γ además, en los procesos que regulan la formación del eje dorso-ventral y los movimientos de convergencia y extensión embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra. wnt3a también participa en la formación de estructuras cefálicas y del eje antero-posterior, específicamente en el desarrollo de la cola / FONDECYT No. 1040697 y Millenium Nucleus in Development Biology ICM-PO2-05-OT

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La proteína CK1 es una familia de proteínas quinasa a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas: CK1α, CK1β, CK1γ1, CK1γ2, CK1γ3, CK1δ y CK1ε. En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para esto, analizamos los patrones de expresión de estos genes mediante RT-PCR e hibridización in situ. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera similar en cuanto a su temporalidad, ya que ambas se detectan desde la primera hora post fecundación (h.p.f). CK1δ1 presenta un patrón ubicuo hasta las 8 h.p.f y limitándose después al sistema nervioso central. Por su parte, la expresión de CK1δ2 presenta ubicuidad hasta las 24 h.p.f, restringiéndose posteriormente a la zona cefálica y al primordio de las aletas pectorales. Para analizar la función de ambas isoformas se efectuaron estudios de sobre expresión, mediante la inyección en embriones de pez cebra de los mRNAs codificante para CK1δ1 y CK1δ2, y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección en embriones de los mRNA de las formas Dominantes Negativas de cada uno de los genes estudiados. Estos experimentos se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula y posteriormente incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores específicos de desarrollo embrionario, en embriones inyectados con una cantidad conocida de mRNA de CK1δ1 y CK1δ2, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podrían estar involucradas estas isoformas. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que la sobre expresión de ambas isoformas, CK1δ1 y CK1δ2, inducen distintos grados de malformación en cerebro anterior y ojos, siendo el fenotipo principal observado con la inyección de CK1δ1 los embriones sin ojos. El bloqueo de función mediante Dominantes Negativos indujo, en ambas isoformas, embriones dorsalizados y ciclópicos. Se puede concluir, que las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 están participando en la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente cerebro anterior y ojos. / FONDECYT N° 1020753 y por Millenium Nucleus in Developmental Biology

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El pez dorado S. lalandi, es una especie marina pelágica, que posee características favorables para su producción intensiva, tales como altas tasas de crecimiento y de conversión alimenticia, resistencia a las altas densidades de los cultivos, docilidad y demanda internacional creciente (Poortenaar et al., 2001). Sin embargo, en su acuicultura se ha observado una baja sobrevivencia en las etapas de hatchery, la que se atribuiría principalmente a la producción de huevos y embriones de baja calidad (Carnevali et al., 2001). Una de las principales causas de esta deficiencia, sería una deficiente acumulación y procesamiento del vitelo durante la ovogénesis y el desarrollo embrionario temprano. Se ha visto, que las catepsinas B, D y L son las principales enzimas lisosomales involucradas en la proteólisis del vitelo en los vertebrados ovíparos (Carnevali et al., 2006). La expresión de estas enzimas, así como su actividad durante la ovogénesis y la embriogénesis, parecen ser especie-específicas, desconociéndose estos antecedentes en miembros del género Seriola. En este trabajo, se evaluó la expresión de las catepsinas B, D y L durante diferentes etapas del desarrollo embrionario temprano de S. lalandi (E1: huevos recién fecundados, E2: 4 células, E3: 16 células, E4: bástula, E5: 24 HPF y E6: 48 HPF). Se utilizó la técnica RT-qPCR y como estrategia de cuantificación, la normalización de la expresión con los genes constitutivos Tubulina (TUB) y -actina (ACTB), los cuales se validaron como referencia entre seis genes constitutivos candidatos. Las tres catepsinas se expresaron durante los distintos estadíos, presentando un nivel de expresión alto en los primeros estadíos, representando probablemente los niveles de transcritos maternos. Luego, durante la blastulación donde ocurre la MBT, hubo una disminución brusca de la expresión. Posteriormente, la expresión presentó una disminución en catepsina B, no así para catepsina D y L, que aumentaron sus niveles de expresión indicando la expresión cigótica de estas enzimas. Estos resultados concuerdan con la función de estas proteasas en generar las condiciones osmóticas necesarias para la hidratación final del ovocito y además, proveer al embrión de energía durante su periodo de alimentación endógena, a través de los aminoácidos libres generados de la proteólisis del vitelo / Financiamiento: Proyecto Fondecyt Postdoctorado 3120211 y PDACH Área Genética

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La proteína quinasa CK1 es una familia de proteínas a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas (α, β, δ, ε, γ-1, γ-2 y γ-3). En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1α y CK1ε en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para ello, hemos analizado los patrones de expresión de estos genes mediante hibridización in situ y RT-PCR. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera diferencial temporal y espacialmente durante el desarrollo embrionario. CK1α se detecta desde la primera hora post fertilización y presenta un patrón de expresión ubicuo en los primeros estadíos para luego restringirse a la región cefálica y a las aletas pectorales, mientras que CK1ε no presenta un componente materno y el mRNA cigótico es detectado después de las 12 horas post fertilización con un patrón de expresión restringido exclusivamente al cerebro. Para analizar la función de ambas isoformas se realizaron estudios de sobrexpresión mediante la inyección del mRNA codificante para CK1α y CK1ε y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección de las dominantes negativas de cada isoforma. Para CK1α también se utilizó la inyección del morfolino oligo antientido que silencia específicamente la actividad de éste gen. Estos experimentos anteriormente mencionados se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula. Posteriormente los embriones fueron incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores en embriones inyectados con el Morfolino Anti CK1α, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podría estar involucrada esta ultima isoforma. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que CK1α, a diferencia de CK1ε, está involucrada en los procesos que regulan la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente en las que se encuentran ubicadas en el límite entre cerebro medio y posterior (cerebelo y cuarto ventrículo). En cambio, CK1ε solo tendría participación en la formación de estructuras cerebrales sin afectar la formación de los ejes en el embrión en desarrollo / La realización de esta tesis fue financiada en parte por el proyecto FONDECYT N° 1020753

No se posee.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (MSC, del inglés, Mesenchymal Stem Cells) son células progenitoras adultas capaces de diferenciarse hacia células de tejidos mesodérmicos y que además poseen potencial de auto-renovación y morfología fibroblastoide. Como parte de su capacidad de diferenciación multilinaje, estudios recientes han demostrado que las MSC cuentan con la capacidad de diferenciarse in vitro hacia linaje celular germinal. El objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial de diferenciación germinal de MSC derivadas de médula ósea fetales bovinas (MSC-MO) mediante exposición in vitro a los biofactores proteína morfogénica ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento transformante β1 (TGFβ1) y ácido retinoico (AR). Las MSC-MO fueron aisladas mediante adherencia a placas de cultivo de plástico desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=14). El efecto dosis-respuesta fue analizado luego de 21 días de cultivo utilizando tres concentraciones de BMP4 (10, 50, 100 ng/mL), TGFβ1 (1, 10, 100 ng/mL) y AR (0,01; 0,1 y 1 μM). El efecto temporal fue analizado en los días 0, 7, 14 y 21 de cultivo utilizando 100 ng/mL de BMP4, 100 ng/mL de TGFβ1 o 0,1 μM de AR. Se analizaron los genes de pluripotencia OCT4, NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de macho DAZL, PIWIL2, STRA8 y el marcador de meiosis SCP3 mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). La expresión de Dazl, Nanog y Oct4 fue analizada mediante citometría de flujo. El tratamiento con AR y BMP4 aumentó la expresión génica de DAZL (P<0,05) a partir del día 7. Sin embargo, el aumento bajo el efecto de BMP4 fue transitorio. TGFβ1 no modificó la expresión de mRNA de DAZL. La suplementación con AR activó la expresión de mRNA de NANOG a partir del día 7 hasta el día 21 de exposición, pero no se observaron cambios de expresión bajo el efecto de BMP4 durante el período de cultivo. Los niveles de mRNA de OCT4 y de SCP3 no fueron modificados bajo el efecto de ninguno de los factores utilizados. En conclusión, AR fue el biofactor más efectivo en la diferenciación germinal de MSC-MO logrando el aumento de la expresión del gen germinal DAZL / Mesenchymal Stem Cells (MSC) are adult progenitor cells that possess self-renewal capacity and fibroblastoid morphology and are also capable of differentiating into cells of mesodermal tissues. In addition to the multilineage differentiation potential, recent studies have shown that MSCs can differentiate in vitro into germ cell lineage. The objective of the present study was to evaluate the potential for germ cell differentiation of MSCs derived from fetal bovine bone marrow (BM-MSC) by in vitro exposure to bioactive factors bone morhogenetic 4 (BMP4), transforming growth factor β1 (TGFβ1) and retinoic acid (RA). BM-MSC were isolated by adherence to plastic culture plates from bone marrow of bovine fetuses (7-9 months gestation, n = 14). The dose-response effect of each factor was analyzed using three concentrations of BMP4 (10, 50, 100 ng / mL), TGFβ1 (1, 10, 100 ng / mL) and RA (0.01, 0.1 and 1 μM), after 21 days of culture. The temporal effect was analyzed on days 0, 7, 14 and 21 of culture using 100 ng/mL of BMP4, 100 ng/mL of TGFβ1 o 0,1 μM of RA. The pluripotency genes OCT4, NANOG, germ cell genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germ cell genes DAZL, PIWIL2, STRA8 and the meiosis marker SCP3 were analyzed by quantitative PCR (Q-PCR). The expression of Dazl, Nanog and Oct4 was analyzed by flow cytometry. Treatment with AR and BMP4 increased DAZL gene expression (P <0.05) from day 7, however the increase under the effect of BMP4 was transient. TGFβ1 did not modify the expression of DAZL mRNA. Supplementation with RA activated NANOG mRNA expression from day 7 to day 21 of exposure, but no expression changes were observed under the effect of BMP4 during the culture period. OCT4 mRNA levels are not modified under the effect of any of the factors as well as the SCP3 meiosis marker. In conclusion, AR was the most effective biofactor in the germ differentiation of BM-MSC achieving increased expression of the DAZL germline gene / Financiamiento: Proyecto Fondecyt N° 1161251 y Programa de becas “Convocatoria Abierta 2013” – SENESCYT, Ecuador

El objetivo principal de esta tesis consistió en optimizar y validar un protocolo de maduración in vitro (MIV) de ovocitos profase I (PI), con el fin de obtener mayor proporción de ovocitos maduros en las técnicas de reproducción asistida (TRA). Las condiciones de cultivo son claves en el proceso de MIV ovocitaria y los medios empleados deben proporcionar los requisitos energéticos y metabólicos necesarios. En este estudio se analizó la eficacia de distintos medios comerciales de cultivo embrionario, así como la influencia de componentes suplementados en la maduración de ovocitos PI denudados procedentes de ciclos estimulados. El trabajo de tesis se desarrolló en dos fases experimentales: 1) En la primera parte del estudio se valoró la tasa de maduración, potencial de activación y capacidad de desarrollo embrionario hasta blastocisto de los ovocitos metafase II (MII) obtenidos de cada grupo. Nuestros resultados confirman que los ovocitos PI son capaces de progresar en la meiosis hasta MII de manera similar en los diferentes sistemas de cultivo estudiados. Además, los ovocitos maduros obtenidos adquirieron similar capacidad de estímulo de activación partenogenota, independientemente del medio de incubación. No obstante, la competencia de desarrollo embrionario de los ovocitos madurados in vitro en medio SAGE 1-STEP es significativamente superior que aquellos cultivados el CCM y Sydney IVF Blastocyst médium. También se determinó la influencia de la posición de la vesícula germinal (VG) en la maduración ovocitaria, siendo favorable la localización periférica. En cambio, no se observó ningún efecto en función de la presencia/ausencia de células de la granulosa del cúmulo en la maduración ovocitaria. 2) En la segunda fase de estudio, se estudió la calidad de los ovocitos tras la MIV en base a la estructura del huso meiótico mediante marcaje inmunocitoquímico. No se encontró variación en la conformación del huso y la distribución de cromosomas en la placa metafásica según el medio comercial utilizado.

Programa de Doctorado: Biotecnología en ciencias de la salud (Biotecnología y Bíomedicina)

El objetivo de esta Tesis ha sido profundizar en el estudio del desarrollo del complejo claustroamigdalino en ratón. Para ello hemos estudiado: 1) cuales de sus componentes derivan del palio lateral o ventral, en base a expresión diferencial de genes reguladores Dbx1, Lhx9, Lhx2, Lmo3, Lmo4, Cadherina 8 y Emx1 durante el desarrollo embrionario; 2) el desarrollo de las interneuronas del complejo claustroamigdalino que contienen proteínas ligadoras de calcio (incluyendo el desarrollo de sus circuitos locales); 3) el origen histogenético de dichas interneuronas, mediante cultivos organotípicos y el análisis del ratón transgénico Nkx2.1-Cre/Rosa26-GFP (Kessaris y col. 2006). Nuestros datos permiten distinguir los componentes paliales laterales o ventrales del complejo, que contienen múltiples subtipos de interneuronas con orígenes en distintas subdivisiones del subpalio. Esto abre las puertas a futuras investigaciones sobre la conectividad y función de cada subtipo de interneurona, y sobre su grado de implicación en los desórdenes neuropsiquiátricos. / The objective of this Doctoral Thesis was to deepen in the study of the development of the claustroamygdaloid complex in mouse. For that, we pursued to study: 1) which components derive from either the lateral or ventral pallium based on differential expression of regulatory genes (Dbx1, Lhx9, Lhx2, Lmo3, Lmo4, Cadherina 8 y Emx1) during embryonic development; 2) the development of interneurons of the claustroamygdaloid complex that contain calcium binding proteins (including the development of its local circuits); 3) the histogenetic origin of these interneurons, by means of organotypic cultures and analysis of the transgenic mouse Nkx2.1-Cre/Rosa26-GFP (Kessaris and col. 2006). Our data allowed the distinction between lateral and ventral pallial components of the complex, which contain multiple subtypes of interneurons with origins in different subpallial subdivisions. This opens new venues for future investigations on the connectivity and function of each interneuron subtype, and on their involvement in neuropsychiatric disorders.