Apesar do aconselhamento no campo das DST/aids ser considerado, em diferentes regiões do mundo, como uma das principais estratégias para prevenção primária, secundária e terciária, implantada nos serviços da rede de atendimento às DST/aids e em serviços da rede básica de saúde, tanto estudos nacionais como internacionais mostram que esta prática ainda concentra uma dose significativa de fragilidades e problemas.Estes estão relacionados principalmente à falta de uma reflexão e clareza sobre a definição, conceituação, estrutura e forma de atuação do aconselhamento, bem como sobre seus limites e possibilidades. Este estudo se propôs a resgatar as origens históricas e conceituais do aconselhamento em DST/aids, e identificar e analisar criticamente a principal concepção teórica indicada como fundamento dos materiais de referência sobre o aconselhamento em DST/aids, apontando suas contribuições, limites e possibilidades de aplicação. Trata-se, portanto, de um estudo de natureza qualitativa, baseado na análise de documentos sobre o aconselhamento em geral, o aconselhamento em DST/aids, e sobre a principal corrente teórica identificada nesses materiais: a Abordagem Centrada na Pessoa, de Carl Rogers. Além de identificar a origem histórica da imprecisão do conceito de aconselhamento enquanto prática social, este estudo colocou em evidência tanto as potencialidades e fragilidades da Abordagem Centrada na Pessoa para lidar com a complexidade de facetas presentes nessa epidemia, como a existência de alguns desacordos e contrastes entre a prática de ajuda proposta por esse referencial teórico e a estrutura de aconselhamento proposta pelos manuais, bem como, algumas contradições e ambigüidades existentes na própria proposta desenhada para o aconselhamento no campo da aids. Sustenta-se que, para fazer um uso consistente da Abordagem Centrada na Pessoa no aconselhamento em DST/aids, algumas mudanças de concepção, expectativa, enfoque e posicionamento se fazem necessárias. Primeiramente é imperioso que se veja o aconselhamento como um espaço onde a ação está voltada às necessidades e características do cliente, e não voltado para resolver a múltiplas demandas da política de prevenção e assistência, pois ele nunca deve ser visto como uma ação isolada, mas deve sempre estar inserido em uma estratégia mais ampla aonde se somam outros tipos de intervenção.É importante que se reveja a idéia de objetivos, conteúdos e resultados fechados e pré-determinados, possibilitando que sejam centrados na pessoa do cliente e, portanto mais abertos, flexíveis ou construídos conjuntamente. Finalmente, é importante para uma maior qualificação e efetividade dessa prática, utilizar-se de outros quadros teóricos e conceituais, que discutem outras dimensões e aspectos do universo individual, não abordados por essa linha teórica. / In spite of the fact that in different regions of the world counseling in the field of STD/aids is considered as one of the main strategies for the primary, secondary and tertiary prevention techniques applied in the services available to STD/aids and in basic health services, studies done nationally and internationally show that this practice still concentrates a significant amount of weaknesses and problems. These relate mainly to the lack of a clear expression and thought on the definition, conceptualization, structure and format for the role of counseling, as well as its limitations and possibilities. This study proposes to rescue the historical and conceptual origins of counseling in STD/aids, and to identify and critically analyze the main theoretical concept used as the basis for the reference material on counseling in STD/aids, pointing out its contributions, limitations and possibilities of application. It is, therefore, a qualitative study by nature, based on the analysis of documents on counseling in general, counseling in STD/aids, and on the main theoretical current identified in the material: the Client Centered Therapy, by Carl Rogers. In addition to identifying the historical origin of the imprecision in the concept of counseling as a social practice, this study makes clear the potentialities and weaknesses of the Client Centered Therapy to deal with the complexity of facets present in this epidemic, such as the existence of some differences and contrasts between the help practice proposed by this theoretical reference and the structure of counseling proposed by manuals, as well as some contradictions and ambiguities present in the proposal itself, designed for the counseling in the field of aids. One supports the idea that in order to make a consistent use of the Client Centered Therapy in the counseling for STD/aids, some changes in the concept, expectation, focus and positioning are necessary. First of all it is imperative to see counseling as a space where action is oriented towards the needs and characteristics of the client, and not to solve the multiple demands of the policy for the prevention and assistance, as it should never be seen as an isolated action, but it must always be inserted in a wider strategy where other kinds of interventions are added. It is important to revisit the idea of objectives, content, closed and predetermined results, enabling them to be centered on the person, the client, and therefore, to be more open, flexible or constructed jointly. Finally, it is important for a wider qualification and effectiveness of this practice, to use other theoretical and conceptual frameworks, which discuss other dimensions and aspects of the individual universe, not dealt with in this theoretical line.

A crisantaspase é uma enzima do tipo asparaginase (ASNase) produzida pela bactéria Erwinia chrysanthemi e utilizada como biofármaco no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em casos de hipersensibilidade à ASNase de E. coli. As principais desvantagens deste biofármaco são a curta meia-vida (10 horas) e imunogenicidade. Nesse sentido, sua forma peguilada (PEG-crisantaspase) não só reduziria o efeito imunogênico, como também melhoraria a meia-vida plasmática. Atualmente, somente a ASNase de E. coli está disponível comercialmente na forma peguilada e essa, por ter sido uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, é resultado de um processo de peguilação aleatória em resíduos de lisina. Portanto, apresenta alto grau de polidispersão em relação à quantidade de cadeias de PEG ligadas à enzima. Nesse trabalho desenvolvemos um processo de obtenção de crisantaspase peguilada de maneira sítio-específica, no grupamento N-terminal (PEG-crisantaspase). A crisantaspase foi obtida de forma recombinante na cepa E. coli BL21, cultivada em agitador metabólico e biorreator, em meio Luria Bertani. A produtividade volumétrica no biorreator aumentou 37% em comparação com o agitador metabólico (460 e 335 U·L-1·h-1 respectivamente). A crisantaspase foi recuperada por choque osmótico e purificada por cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP FF, 5 mL, eluição em pH 7,5), apresentando atividade específica de 694 U·mg-1, fator de purificação de 31 e rendimento de 69%. A crisantaspase purificada foi peguilada com mPEG-NHS 10 kDa, em tampão fosfato 100 mM, 22 °C, razão molar enzima:PEG 1:50 durante 30 min e sob diferentes valores de pH (6,5-9,0). O melhor rendimento de peguilação N-terminal (50%) foi em pH 7,5 com menor formação de estruturas poli-peguiladas (7%). A PEG-crisantaspase foi isolada por cromatografia de exclusão molecular, retendo 50% da atividade específica (357 U·mg-1) com valor de kM três vezes maior do que o da crisantaspase (150 e 48,5 µM respectivamente). Entretanto, apresentou maior estabilidade em altas temperaturas. Em duas semanas, a crisantaspase perdeu 93% de sua atividade específica enquanto que a PEG-crisantaspase foi estável por 20 dias. Portanto, a enzima PEG-crisantaspase desenvolvida representa uma alternativa promissora para o tratamento da LLA. / Crisantaspase is an asparaginase enzyme (ASNase) produced by Erwinia chrysanthemi bacterium and used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in case of hypersensivity to E. coli ASNase. The main disadvantages of this biopharmaceutical are the short half-life (10 hours) and immunogenicity. In this sense, its PEGylated form (PEG-crisantaspase) could not only reduce the immunogenic effect but also improve plasma half-life. Currently, only E. coli ASNase is commercially available in its pegylated form. Since ASNase was one of the first proteins to be pegylated, it corresponds to a random PEGylation process on lysine residues and consequently preparations are highly polydisperse. In this work we developed a process to obtain a site-specific N-terminal PEGylated crisantaspase (PEG-crisantaspase). Crisantaspase was recombinantly expressed in E. coli BL21 strain, grown in shaker and bioreactor, in Luria Bertani medium. Volumetric productivity in bioreactor increased 37% compared to shaker conditions (460 and 335 U·L-1·h-1 respectively). Crisantaspase was extracted by osmotic shock and purified by cation exchange chromatography (HiTrap SP FF column, 5 mL, elution at pH 7.5), presenting specific activity of 694 U·mg-1,31 purification fold and an yield of 69%. Purified crisantaspase was PEGylated with 10 kDa mPEG-NHS in 100mM phosphate buffer, 22°C, enzyme:PEG molar ratio of 1:50 for 30 min, and at different pH values (6.5-9.0). The highest N-terminal pegylation yield (50%) was at pH 7.5 with less poly-PEGylated forms (7%). PEG-crisantaspase was purified by size-exclusion chromatography, retaining 50% of specific activity (357 U·mg-1) with a kM value 3 times higher than crisantaspase (150 and 48,5 µM respectively). Nonetheless, PEG-crisantaspase was found to be more stable at high temperatures and over the time. In two weeks, crisantaspase lost 93% of its specific activity, while PEG-crisantaspase was stable for 20 days. Therefore, the novel PEG-crisantaspase enzyme developed represents a promising alternative for the treatment of ALL.

In the Model-Driven Software Engineering (MDSE) context, software production can be performed by defining models. Despite the advantages of this methodology, different domains require specific support tools and modeling languages, which, in turn, must be developed along with the final software. Because of this, developers face problems when applying the method. The objective of this work is twofold: 1) to identify the most critical problems when developing with this method; 2) discuss and provide possible solutions to those problems. The critical problems were identified by performing a systematic mapping, empirical studies, collaborations and interviews with specialists. It has been identified that MDSE, according to basic literature, has an excessively high abstraction level which leads to a lack of adequate processes and developer training, besides the need for modeling tools. A new method is necessary to allow developers to treat models and source-code differently. Therefore, in this thesis, the need for evolving MDSE processes is discussed. In this manner, this work introduces a new development method described as a possible concrete evolution of MDSE that defines a paradigm for software development. This method is defined along with domain specific languages, a tool-chain and sample software systems. After conducting analytic and experimental studies, it has been concluded that these applications also represent a valuable contribution for implementing service-oriented systems which can be employed in real world applications. / No contexto da Engenharia de Software Dirigida por Modelos (MDSE), a produção de software pode ser realizada por meio de definições de modelos. Apesar dos benefícios desse método de desenvolvimento, diferentes domínios exigem a especificação de linguagens de modelagem e ferramentas específicas, que, por sua vez, precisam ser desenvolvidos em conjunto com o software final. Desta forma, desenvolvedores encontram problemas ao utilizar este método. Este trabalho possui duplo objetivo: 1) identificar os problemas mais críticos deste método; 2) discutir e fornecer possíveis soluções aos problemas. A identificação de problemas foi realizada por meio de um mapeamento sistemático, estudos empíricos, colaborações e entrevistas com especialistas. Foi identificado que MDSE, de acordo com a literatura básica, possui um nível de abstração excessivamente alto, acarretando em carência de processos adequados e de treinamento de desenvolvedores que vão além de problemas de necessidade de ferramentas de modelagem. Portanto, nesta tese, discute-se a necessidade de evoluir processos de MDSE que permita aos desenvolvedores uma nova forma de tratar modelos e código-fonte. Para tanto, neste trabalho também é descrito um novo método de desenvolvimento, descrito como uma possível evolução concreta do MDSE, o qual define um paradigma para desenvolver software. Este método é exemplificado em várias aplicações dentro deste trabalho. Após conduzir estudos analíticos e experimentais, concluiu-se que estas aplicações também possibilitam uma contribuição significativa no domínio de software orientado a serviços que podem ser empregadas em software do mundo real.

A crisantaspase é uma enzima do tipo asparaginase (ASNase) produzida pela bactéria Erwinia chrysanthemi e utilizada como biofármaco no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em casos de hipersensibilidade à ASNase de E. coli. As principais desvantagens deste biofármaco são a curta meia-vida (10 horas) e imunogenicidade. Nesse sentido, sua forma peguilada (PEG-crisantaspase) não só reduziria o efeito imunogênico, como também melhoraria a meia-vida plasmática. Atualmente, somente a ASNase de E. coli está disponível comercialmente na forma peguilada e essa, por ter sido uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, é resultado de um processo de peguilação aleatória em resíduos de lisina. Portanto, apresenta alto grau de polidispersão em relação à quantidade de cadeias de PEG ligadas à enzima. Nesse trabalho desenvolvemos um processo de obtenção de crisantaspase peguilada de maneira sítio-específica, no grupamento N-terminal (PEG-crisantaspase). A crisantaspase foi obtida de forma recombinante na cepa E. coli BL21, cultivada em agitador metabólico e biorreator, em meio Luria Bertani. A produtividade volumétrica no biorreator aumentou 37% em comparação com o agitador metabólico (460 e 335 U·L-1·h-1 respectivamente). A crisantaspase foi recuperada por choque osmótico e purificada por cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP FF, 5 mL, eluição em pH 7,5), apresentando atividade específica de 694 U·mg-1, fator de purificação de 31 e rendimento de 69%. A crisantaspase purificada foi peguilada com mPEG-NHS 10 kDa, em tampão fosfato 100 mM, 22 °C, razão molar enzima:PEG 1:50 durante 30 min e sob diferentes valores de pH (6,5-9,0). O melhor rendimento de peguilação N-terminal (50%) foi em pH 7,5 com menor formação de estruturas poli-peguiladas (7%). A PEG-crisantaspase foi isolada por cromatografia de exclusão molecular, retendo 50% da atividade específica (357 U·mg-1) com valor de kM três vezes maior do que o da crisantaspase (150 e 48,5 µM respectivamente). Entretanto, apresentou maior estabilidade em altas temperaturas. Em duas semanas, a crisantaspase perdeu 93% de sua atividade específica enquanto que a PEG-crisantaspase foi estável por 20 dias. Portanto, a enzima PEG-crisantaspase desenvolvida representa uma alternativa promissora para o tratamento da LLA. / Crisantaspase is an asparaginase enzyme (ASNase) produced by Erwinia chrysanthemi bacterium and used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in case of hypersensivity to E. coli ASNase. The main disadvantages of this biopharmaceutical are the short half-life (10 hours) and immunogenicity. In this sense, its PEGylated form (PEG-crisantaspase) could not only reduce the immunogenic effect but also improve plasma half-life. Currently, only E. coli ASNase is commercially available in its pegylated form. Since ASNase was one of the first proteins to be pegylated, it corresponds to a random PEGylation process on lysine residues and consequently preparations are highly polydisperse. In this work we developed a process to obtain a site-specific N-terminal PEGylated crisantaspase (PEG-crisantaspase). Crisantaspase was recombinantly expressed in E. coli BL21 strain, grown in shaker and bioreactor, in Luria Bertani medium. Volumetric productivity in bioreactor increased 37% compared to shaker conditions (460 and 335 U·L-1·h-1 respectively). Crisantaspase was extracted by osmotic shock and purified by cation exchange chromatography (HiTrap SP FF column, 5 mL, elution at pH 7.5), presenting specific activity of 694 U·mg-1,31 purification fold and an yield of 69%. Purified crisantaspase was PEGylated with 10 kDa mPEG-NHS in 100mM phosphate buffer, 22°C, enzyme:PEG molar ratio of 1:50 for 30 min, and at different pH values (6.5-9.0). The highest N-terminal pegylation yield (50%) was at pH 7.5 with less poly-PEGylated forms (7%). PEG-crisantaspase was purified by size-exclusion chromatography, retaining 50% of specific activity (357 U·mg-1) with a kM value 3 times higher than crisantaspase (150 and 48,5 µM respectively). Nonetheless, PEG-crisantaspase was found to be more stable at high temperatures and over the time. In two weeks, crisantaspase lost 93% of its specific activity, while PEG-crisantaspase was stable for 20 days. Therefore, the novel PEG-crisantaspase enzyme developed represents a promising alternative for the treatment of ALL.

Um ambiente inteligente é um sistema de computação ubíqua e sensível ao contexto onde os sistemas computacionais embutidos no ambiente, a comunicação entre dispositivos e o ambiente, e a acessibilidade aos serviços do ambiente são transparentes ao usuário. O presente trabalho tem como objetivo propor um modelo para ambientes inteligentes baseado em serviços web semânticos, em que os serviços disponíveis para os dispositivos do ambiente são proporcionados como serviços web e a interação dispositivo - ambiente é feita em um contexto de computação móvel, onde a disponibilidade dos serviços e a informação de contexto do dispositivo mudam freqüentemente. No modelo proposto todas as funcionalidades do ambiente são fornecidas como serviços. Estes serviços são descobertos e executados automaticamente com a finalidade de ajudar o usuário a desenvolver tarefas específicas, permitindo ao usuário se concentrar nas tarefas e não na interação com o ambiente. O modelo se fundamenta na oferta de serviços dirigida pela tarefa a ser desenvolvida, o que é conhecido como Task-driven Computing. Por outro lado, para a automação do processo de descoberta e execução dos serviços é necessário ter uma especificação não ambígua da semântica dos serviços. Empregamos para isso a ontologia WSMO (Web Services Modeling Ontology) que fornece os elementos necessários para a descrição dos serviços disponíveis no ambiente e o contexto do dispositivo. Finalmente, como prova de conceitos do modelo proposto, foi implementado um ambiente inteligente para uma biblioteca. A ativação de um ambiente inteligente baseado no modelo proposto se baseia na definição de ontologias, descrição semântica dos serviços no ambiente e a implementação de serviços web tradicionais. / A smart environment is a system computing ubiquitous computing and context awareness, in which the computational systems embedded in the environment, the communication between devices and the environment, and the accessibility to services are transparent to the users. The aim of this work is to propose a semantic web services based model for smart environments, in which services are offered to devices as web services and the device - environment interactions are based on a mobile computing environment, in which the contextual information and availability of services change frequently. In the proposed model all functionalities in the environment are offered as services. These services are automatically discovered and executed to support the user in a specific task, allowing to the user to focus on his task and not in the interactions with the environment. The model is based on a task-driven offer of services and on task-driven computing. To automate the discovery and execution of services, we need a nonambiguous specification of the semantic of services. We use the WSMO ontology (Web Services Modeling Ontology), which provides the required elements for description of the services in the environment and the context device. Finally, as a conceptual proof of the proposed model, we implemented a smart environment for a library. In the proposed model the activation of a smart environment is based in the ontologies definition, semantic description of the services.

O trabalho ora apresentado foi concebido como tendo dois objetivos. O primeiro, mais geral, foi implementar uma nova metodologia para o estudo de mudanças conformacionais em proteínas, ou seja, de sua dinâmica estrutural. A técnica de marcação de spin sítio dirigida aliada à ressonância paramagnética eletrônica (SDSL-RPE) são os pilares desse novo método que faz, agora, parte do conjunto de técnicas disponíveis no Grupo de Biofísica Molecular Sérgio Mascarenhas do Instituto de Física de São Carlos (USP). O segundo objetivo, mais específico, representou o caminho efetivamente tomado para que se alcançasse o objetivo geral. Para isso, foi proposto o estudo da correlação estrutura e função de dois sistemas biológicos muito interessantes. O primeiro deles envolveu o estudo do movimento das hélices que compõem a estrutura da proteína ligante de cálcio S100A12 humana (HS100A12) induzido pelos íons cálcio e zinco. Sabendo que a proteína S100A12 humana além de ligar íons Ca+2, apresenta afinidade por outros metais divalentes, como os íons Zn+2 e Cu+2, e que a formação de diferentes oligômeros da proteína é governada pela concentração dos íons Ca+2 e Zn+2, realizamos estudos espectroscópicos utilizando a técnica de dicroísmo circular a fim de investigarmos a estabilidade térmica da proteína HS100A12 na presença e ausência dos íons cálcio e zinco. Mudanças conformacionais na estrutura da HS100A12 foram monitoradas através da construção de uma série de mutantes (simples e duplos) em que resíduos nas hélices B, C e D foram trocados por cisteínas, subsequentemente marcadas com a sonda magnética MTSSL e submetidas às análises de SDSL-RPE. Estas consistiram na medida do espectro de RPE dos vários mutantes em temperatura ambiente para estudarmos os efeitos da presença dos íons sobre a dinâmica experimentada pela sonda nas diversas posições. Além disso, efetuamos medidas de distância entre duas sondas seletivamente inseridas na estrutura protéica, procurando assim complementar o entendimento acerca do efeito da presença dos íons sobre a proteína. Por fim, devido ao fato da proteína HS100A12 estar envolvida em alguns eventos de sinalização celular e interação com o receptor para produtos de glicosilação (RAGE), decidimos também, estudar a interação da proteína com modelos de biomembranas, utilizando monocamadas de Langmuir. O outro problema de interesse utilizou a lizosima do fago T4, uma proteína padrão, da qual uma variedade de mutantes é produzida rotineiramente a fim de obtermos mais detalhes a respeito da sua correlação estrutura e função e tornar mais sólido o entendimento da técnica SDSL. Inicialmente, realizamos um estudo com a suposta criação de uma cavidade no \"core\" hidrofóbico da porção C-terminal da enzima, quando mutamos a Leu 133 por Ala e/ou Gly, ou seja, quando trocamos um resíduo grande por um de menor volume, pois se acredita que a proteína sofra um reajuste estrutural com o intuito de preencher o espaço vazio criado por essa substituição. Para isso, propusemos estudar por SDSL o movimento da α-hélice H inserindo o marcador de spin na posição vizinha ao resíduo mutado. Adicionalmente, realizamos um experimento de \"transmutação\" com a enzima T4L, a fim de investigar a natureza das contribuições para os diferentes modos dinâmicos experimentados pelo marcador de spin quando introduzido em sítios topologicamente semelhantes. / The work presented here was conceived with two main objectives. The first one, more general, involved the implementation of a new methodology for the study of conformational changes in proteins, i.e., its structural dynamics. The technique of Site-directed Spin Labeling combined with Electronic Paramagnetic Resonance (SDSL-EPR) are the pillars of this new method, which is now part of the set of techniques available at the Grupo de Biofísica Molecular Sérgio Mascarenhas, Instituto de Física de São Carlos (USP). The second objective, more specific, represented the path actually taken to achieve the overall goal. Therefore, it was proposed to study the structure-function correlation in two interesting biological systems. The first involved the study of the movement of the helices that form the structure of the human calcium binding protein S100A12 (HS100A12) induced by calcium and zinc ions. Knowing that, besides Ca+2, human S100A12 has also affinity for other divalent metals, such as Zn+2 and Cu+2 ions, and that the formation of different protein oligomers is governed by the concentration of Ca+2 and Zn+2, we performed spectroscopic studies using circular dichroism (CD) to investigate the thermal stability of protein HS100A12 in the presence and absence of calcium and zinc. Conformational changes in the structure of HS100A12 were monitored by producing a series of mutants (singles and doubles) in which residues in helices B, C and D were replaced by cysteine and subsequently labeled with a magnetic probe MTSSL and then analyzed via SDSL-EPR. The latter consisted of the EPR spectra measurement of many mutants at room temperature to study the effects of the presence of ions on the dynamics experienced by the probe in different positions. In addition, we performed measurements of the distance between two probes inserted in the protein structure, thereby, seeking to improve the understanding of the effect of the ions presence on the protein. Finally, due to the fact that HS100A12 is involved in some events of cell signaling and interaction with the Receptor for Advanced Glycation End Products (RAGE), we also decided to study the interaction of protein with models of biomembranes using Langmuir monolayers. In the other problem of interest, we used a variety of mutants of the enzyme T4 lysozyme, a protein standard, in order to obtain more details about its structure-function correlation and make more solid the understanding of SDSL technique. Initially, we conducted a study about the alleged creation of a cavity in the hydrophobic C-terminal portion of the enzyme, when we replaced the Leu 133 by Ala and/or Gly, or when we changed a large residue for a smaller one, because it is believed that the protein undergoes a structural adjustment in order to fill the gap created by this substitution. For this, we studied by SDSL the α-helix H motion, inserting the spin label in a neighbor position of the mutated residue. Additionally, we performed an experiment of \"transmutation\" with the enzyme T4L in order to investigate the nature of contributions for different dynamic modes experienced by the spin label when it is introduced in topologically similar sites.

A troponina (Tn) regula a contração do músculo estriado esquelético de vertebrados. Ela é composta de três subunidades: troponina I (TnI), troponina C (TnC) e troponina T (TnT). A TnI tem a função inibitória que é neutralizada pela ligação de Ca2+ nos sítios regulatórios do N-domínio da TnC, e a TnT posiciona o complexo no filamento fino. Para monitorar o sinal do Ca2+ sendo transmitido da TnC para a TnI as propriedades espectrais únicas do 5-hidroxitriptofano (5HW) foram utilizadas. O 5HW foi incorporado em mutantes pontuais de TnI com um único códon para triptofano. Foram identificadas duas sondas espectrais intrínsecas na TnI capazes de detectar a ligação de Ca2+ na Tn: as TnIs com 5HW nas posições 100 e 121. Complexos troponina reconstituídos com estes mutantes fluorescentes de TnI, Tn-TnIF100HW e Tn-TnIM121HW, apresentaram respectivamente 12 e 70 % de aumento na intensidade do espectro de emissão devido à ligação de Ca2+ na TnC. Nos complexos binários (TnC-TnI) as TnIs com 5HW nas posições 106 e 121 também captam a ligação do Ca2+ na TnC. A análise da fluorescência destas sondas demonstrou que: 1) as regiões da TnI que respondem ao N-domínio regulatório da TnC ocupado com Ca2+ são a região inibitória da TnI, resíduos 96 até 116, e a região vizinha que inclui a posição 121 da TnI; 2) mutações pontuais e a incorporação de 5HW na TnI podem afetar tanto a afinidade como a cooperatividade da ligação de Ca2+ na TnC, confirmando o papel da TnI em modular a afinidade da TnC por Ca2+; 3) as constantes de dissociação de Ca2+ surpreendentemente altas, Kd ~ 10-8 M, calculadas a partir dos sinais das sondas na região inibitória da TnI, sugerem a possibilidade de que os sítios do domínio N-terminal da TnC sejam os sítios de ligação de Ca2+ de maior afinidade no complexo troponina. / Vertebrate striated muscle contraction is regulated by troponin (Tn). Tn is composed of three subunits: troponin I (TnI), troponin C (TnC) and troponin T (TnT). TnI has an inhibitory role that is neutralized by calcium binding to the regulatory sites in the N-domain of TnC, and TnT positions the troponin complex on the thin filament. In order to follow the Ca2+ induced conformational change that is transmitted from TnC to TnI, the unique spectral properties of 5-hydroxytryptophan (5HW) incorporated as point-mutants of TnI were used. It was possible to identify two new TnI intrinsic spectral probes sensitive to Ca2+ binding to Tn: TnI with single 5HW at positions 100 and 121. Trimeric troponin complexes reconstituted with two fluorescent mutants of TnI, Tn-TnIF100HW and Tn-TnIM121HW, showed respectively 12 and 70 % increase in the emission spectra when Ca2+ bound to TnC. In the binary complexes (TnC-TnI) two TnIs with 5HW at positions 106 and 121 were also sensitive to Ca2+ binding to TnC. Fluorescence analysis of these probes showed: 1) the regions in TnI that respond to Ca2+ binding to the regulatory N-domain of TnC are the inhibitory region of TnI (residues 96 to 116), and a neighbor region that includes position 121; 2) point mutations and incorporation of 5HW in TnI can affect both the affinity and the cooperativity of Ca2+ binding to TnC, confirming the role of TnI as a modulator of the Ca2+ affinity of TnC; 3) the high dissociation constant for sites in the N-terminal domain of TnC (Kd ~ 10-8 M), derived from data using probes in the inhibitory region of TnI suggested the possibility that these sites are the high affinity Ca2+ binding sites in the troponin complex.

O campo dos interesses profissionais é amplo e complexo, circunscrito por diferentes perspectivas teóricas e técnicas, com impacto na construção da carreira dos indivíduos. Nesse contexto, esta pesquisa objetivou caracterizar inclinações e interesses profissionais de estudantes de diferentes níveis de ensino por meio de instrumentos de avaliação psicológica (Teste de Fotos de Profissões, BBT-Br e o Questionário de Busca Autodirigida SDS), bem como avaliar características psicométricas das referidas técnicas de exame na região norte do Brasil. Foram avaliados 729 estudantes provenientes de escolas públicas e particulares da cidade de Manaus (AM), pertencentes ao final do ensino fundamental (9º ano), ensino médio (1ª, 2ª e 3ª séries) e a 3ª série do ensino técnico integrado ao ensino médio, igualmente distribuídos em função do sexo. Os instrumentos (BBT-Br e SDS) foram aplicados no próprio contexto escolar, após as devidas autorizações formais para a pesquisa, incluindo-se também Questionário de Classificação Econômica Brasil para caracterização da amostra. Os resultados, após sistematização padronizada em cada instrumento de avaliação psicológica, foram tratados de modo inicialmente descritivo, para o grupo geral, bem como em função das variáveis: sexo, idade, nível de ensino e origem escolar (pública ou particular). Seguiram-se análises inferenciais dos possíveis efeitos dessas características sócio demográficas sobre as inclinações e os interesses profissionais, bem como a análise de características psicométricas do BBT-Br e SDS. Os resultados do BBT-Br apontaram tendência geral dos interesses dos estudantes (de diferentes níveis de ensino e de ambos os sexos) por atividades que envolvam pensamento abstrato/criativo e senso social/ajuda ao outro (respectivamente representadas pelos radicais G e S). No SDS a tipologia que se destacou, em todos os níveis de ensino, foi o tipo Social (interesses em atividades profissionais de ajuda e ensino) no grupo feminino, e o tipo Empreendedor (liderança, relacionamentos interpessoais e atividades persuasivas) no grupo masculino. Foram detectados padrões específicos na expressão dos interesses de estudantes da região norte em relação aos dados disponíveis do BBT-Br e do SDS para a região sudeste, embora com pontos de convergência motivacional. Sobre as características psicométricas dos instrumentos utilizados, foram identificados bons indicadores de fidedignidade (Alfa de Cronbach para o BBT-Br no sexo feminino foi de 0,84 e, para o sexo masculino, foi de 0,85; no SDS para o sexo feminino foi 0,78 e para o sexo masculino foi 0,79), e também de validade (análise de componentes principais e correlação entre resultados do BBT-Br e do SDS). O estudo contribuiu para a compreensão de características vocacionais e de interesses profissionais de estudantes da cidade de Manaus (AM), comparando-as aos dados disponíveis com estudantes do sudeste do Brasil, demonstrando indicadores positivos de validade das duas versões do BBT-Br e do SDS para uso na região norte. Reflexões foram realizadas, a partir dos achados, no sentido de sugerir processos de orientação vocacional e profissional para os estudantes do 9º ano do ensino fundamental, ensino médio e ensino técnico, para estimular escolhas profissionais que favoreçam a saúde mental e a realização pessoal, em termos científicos e educacionais, de indivíduos dessa região do Brasil. / The field of professional interests is wide and complex, circumscribed by different theoretical and technical perspectives, having impact in the construction of individuals\' career. In this context, this research aimed to describe professional interests and inclinations in students of different levels of education through instruments of psychological assessment (Berufsbilder Test BBT-Br, and Self-Directed Search SDS), as well as assess psychometric characteristics of these measures in the North region of Brazil. The sample was comprised of 729 students from public and private schools in the city of Manaus (AM), that were attending the last year of fundamental school (9th grade), middle school (1st, 2nd and 3rd years) and 3rd year of technical education, equally distributed for gender. Instruments were administered within the school context, after formal authorizations were obtained, along with the Brazil Economic Classification Questionnaire to sample description. The results, after patterned systematization in each instrument, were first analyzed for the description of all sample, on the variables gender, age, school level and school origin (public vs. private school). Following, inferential analysis of possible effects of the sociodemographic profile on professional interests and inclinations were tested, as well as the psychometric properties of BBT-Br and SDS. The results for BBT-Br pointed to a general tendency of students interests (of different educational levels and both sexes) to activities involving abstract/creative reasoning and social sense/help to others (respectively represented by radical G and S). On SDS, the featured typology was the Social type (interest in professional activities of help and teaching), for all school levels, for females group, and Entrepreneur type (leadership, interpersonal relationships, and persuasive activities) for males group. Specific patterns of the expression of interests in the North region emerged in comparison to normative data available of Southeast region, for both tests, with some points of motivational convergence. About psychometric qualities of the measures, good indicators of reliability (Cronbachs alpha of .84 for females and .85 for males on the BBT-Br; and .78 for females and .79 for males on SDS), as well as validity (principal component analysis and correlation between results on BBT-Br and SDS). This study contributes to the comprehension of vocational and professional interests of students in the city of Manaus (AM) when comparing to data available from the Southeast region of Brazil, demonstrating positive indicators of validity for both tests, to its use in the North region context. Some reflections about the data intended to contribute with suggestions about the process of vocational and professional orientation to students of 9th grade of fundamental school, middle school, and technical education, in order to stimulate professional choices that promote mental health and self-fulfillment, scientifically and educationally, for individuals of this region of Brazil.

As enzimas diidroorotato desidrogenases (DHODHs) são flavo-enzimas que catalisam a oxidação do diidroorotato em orotato na quarta etapa da biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. Durante a rápida proliferação celular em mamíferos, a via de salvação de pirimidinas é insuficiente para suprir deficiências na síntese de nucleotídeos. Além disso, certos parasitas não possuem a via de salvação e contam somente com a biossíntese de novo para a produção de nucleotídeos. Por esta razão, DHODH se tornou um excelente alvo na busca por inibidores que interrompam a síntese de nucleotídeos. As enzimas DHODHs de E. coli (EcDHODH) e de X. fastidiosa (XfDHODH) são membros da classe 2 das DHODHs e encontram-se associadas à membrana citoplasmática através de uma extensão em seu N-terminal, enquanto que DHODH de T. cruzi (TcDHODH), membro da classe 1 de DHODHs, é uma proteína citosólica. Neste trabalho, usamos uma combinação de metodologias de biologia molecular e bioquímica com técnicas espectroscópicas para obter informações estruturais e funcionais acerca da enzima DHODH. Assim, Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) associada à marcação de spin sítio dirigida (SDSL) e simulação espectral foram empregadas para estudar a interação da EcDHODH com modelos de membrana. Mudanças na dinâmica estrutural das vesículas induzidas pela enzima foram monitoradas via marcadores de spin localizados em diferentes posições ao longo da cadeia acil de fosfolipídios. Além disso, técnicas de DNA recombinante e mutações sítio dirigidas foram utilizadas para produzir mutantes de EcDHODH no qual um sondas paramagnéticas foram seletivamente ligadas em resíduos localizados na extensão N-terminal da proteína para experimentos subseqüentes de RPE-SDSL. Esses são os primeiros experimentos de marcação de spin sítio dirigida realizados no Brasil e com os quais monitoramos a dinâmica experimentada na região do N-terminal. Além disso, várias tentativas foram feitas para se expressar e purificar a enzima XfDHODH e a estabilidade estrutural da enzima TcDHODH na presença de um de seus inibidores naturais, o orotato, foi monitorada através de experimentos de Dicroísmo Circular (CD). / Dihydroorotate dehydrogenases (DHODHs) are flavin-containing enzymes which catalyse the conversion of (S)-dihydroorotate to orotate, in the fourth step of the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. In rapidly proliferating mammalian cells, pyrimidine salvage pathway is insufficient to overcome deficiencies for nucleotide synthesis. Moreover certain parasites lack salvage enzymes, relying solely on the de novo pathway to produce nucleotides. Thus, DHODH has turned out an excellent target to the development of inhibitors that block nucleotide biosynthesis. E. coli DHODH (EcDHODH) and X. fastidiosa DHODH (XfDHODH) are class 2 DHODHs found associated to cytosolic membranes through an N-terminal extension, whereas T. cruzi DHODH (TcDHODH) is a class 1 DHODH localizated in the cytoplasm. In the present work, we used a combination of molecular biology and biochemical methodologies with spectroscopic techniques to obtain structural and functional information on DHODH. On one hand, Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) associated with Site-directed Spin Labeling (SDSL) and spectral simulation were employed to study the interaction of EcDHODH with vesicles. Changes in vesicle dynamic structure induced by the enzyme were monitored via spin labels located at different positions along the phospholipid acyl chain and via spin labels located at enzyme specific positions. On the other hand, DNA techniques and site-directed mutagenesis were used to produce mutants of EcDHODH where a nitroxide spin probe was selectively attached to some residues located at the protein N-terminal extension for subsequent EPR-SDSL experiments. These are the first site-directed spin labeling experiments performed in Brazil and the spectra allowed us to monitor dynamics experienced by those residues at the EcDHODH N-terminal domain. Furthermore, molecular biology and biochemical assays were employed with the objective of expressing and purifying XfDHODH and Circular Dichroism (CD) was utilized to probe the structural stability of TcDHODH in the presence of its natural inhibitor (orotate).

Uma das principais responsabilidades da área de Engenharia de Requisitos é refinar requisitos em especificações. Em sistemas empresariais esse refinamento deve considerar o contexto empresarial no qual o sistema fará parte. Apesar de existirem algumas abordagens para refinar requisitos algumas delas até mesmo considerando o contexto empresarial essa tarefa é realizada manualmente. Baseado em conceitos de Engenharia Dirigida por Modelos, este trabalho propõe uma transformação semiautomática usando um modelo da empresa como modelo dos requisitos e um modelo de casos de uso como modelo das especificações. Para isso, considera-se que ao usar um modelo de empresa como origem dessa transformação é possível representar tanto os requisitos quanto os conhecimentos de domínio necessários para obter especificações através de uma transformação. Com isso, este trabalho apresenta os metamodelos de origem e de destino, um conjunto de regras de transformação e uma ferramenta que permite executar a transformação. Por fim, este trabalho também discute um experimento que foi executado para analisar alguns aspectos desta proposta. / One of the key responsibilities of Requirements Engineering is to refine requirements into specifications. For enterprise systems, this refinement must consider the enterprise context where the system will be deployed. Although there are some approaches for requirements refinement, some of them even considering the enterprise context, this task is executed manually. Based on Model-Driven Engineering concepts, this study proposes a semi-automatic transformation using an enterprise model as a requirements model and a use case model as a specifications model. For that, this work considers that using an enterprise model as a source it is possible to represent both the requirements and the domain knowledge that are necessary to obtain specifications through a transformation. Therefore, this study presents the source and target meta-models, a set of transformation rules, and a tool to support the transformation. Finally, this study also discusses an experiment executed to analyze some aspects of this proposal.