Hospital Federal Cardoso Fontes / Anencephaly is the most severe neural tube defect (NTD) in human fetuses. There is an increasing need for tissue replacement in chronic diseases and reconstructive surgeries. Fetal tissues have been used as a substitute for native organs. Compare the structure and morphology of the corpora cavernosa and spongiosum of penises from anencephalic and normal human fetuses to propose a new model for biological studies and tissue transplantation. We studied 11 penises from normal human fetuses, aged 14 to 23 weeks post-conception (WPC), and 5 penises from anencephalic fetuses, aged 18 to 22 WPC. The organs were removed and processed by routine histological and immunolabeling techniques. Analysis of connective tissue (Cot), smooth muscle (SMC) and elastic fibers (EF) were performed in sections. Data were expressed as area density (Ad) using digital processing and software. Means were statistically compared using the unpaired t test and linear regression was performed. Statistical significance was considered if p < 0.05. The Intracavernosal septum was present in all samples. We did not observe differences in the Ad of Cot and SMC in the penises of anencephalic fetuses when compared to normal ones. The simple linear regression suggested that during human development there is a gradual increase in Cot (R2= +0.45) and a decrease of SMC (R2=- 0.62) in the corpora cavernosa in both groups studied. Elastin was observed only in fetuses from 20th WPC. There was no difference in the structure of the corpora cavernosa and corpus spongiosum of anencephalic fetuses compared to normal ones. Elastin was documented from 20th WPC, which suggests the maintenance of erectile function. Histochemistry and immunolabeling suggested that penile shaft development is maintained and unaltered in anencephalic fetuses. Further studies should be performed to analyze anencephalic fetuses as a potential tissue donating group and a model for biological studies. / A anecencefalia é o Defeito do Tubo Neural (DTN) mais severo em fetos humanos. Há uma demanda crescente para reposição tissular em doenças crônicas e cirurgias reconstrutoras. Tecidos fetais têm sido utilizados como substitutos para órgãos sólidos. Comparar a estrutura e morfologia do corpo cavernoso e corpo esponjoso de pênis de fetos humanos anencéfalos e de controle a fim de propor um novo modelo para estudos biológicos e transplantes teciduais. Foram estudados 11 pênis de fetos de controle de 14 a 23 Semanas Pós Concepção (SPC), e cinco pênis de fetos anencéfalos de 18 a 22 SPC. Os órgãos foram removidos e processados pelas técnicas histo e imunohistoquímicas rotineiras. A análise do tecido conjuntivo, células musculares lisas e fibras elásticas foram realizadas em lâminas dos espécimes. Os dados foram expressos em Densidade de àrea (Da) utilizando-se um software de processamento digital. As médias foram comparadas utilizando-se o Teste - T não pareado e quando aplicável, a regressão linear simples foi utilizada. Foi considerada significância estatística se p<0,05. O septo intercavernoso encontrava-se presente em todas as amostras. Não foram observadas diferenças da Da do tecido colágeno e musculatura lisa dos pênis de fetos anencéfalos quando comparados aos normais. A regressão linear simples sugere que durante o desenvolvimento humano há um aumen2to gradual do tecido colágeno (R2=0,45) e uma diminuição da musculatura lisa (R =0,62) no corpo cavernoso de ambos os grupos. A elastina encontrava-se presente apenas em fetos a partir da 20 SPC. Não houve diferença na estrutura da genitália entre fetos normais e enencéfalos. Apresença da elastina em fetos a partir da 20 SPC é um dado objetivo da manutenção da capacidade de ereção nestes grupos. A histo e imunohistoquímica sugerem que o desenvolvimento do pênis destes fetos encontra-se inalterado. Futuros estudos deverão ser realizados com o objetivo de avaliar fetos anencéfalos como um potencial grupo de doadores teciduais e um adequado modelo para estudos biológicos.

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:01:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Correa_DanielHenriquedoAmaral_D.pdf: 14618006 bytes, checksum: 0865223d71dcf2f775b71ebcedecc875 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Proteínas enoveladas incorretamente, com freqüência levam à formação de agregados fibrilares contendo extensas estruturas em folha-?, comumente denominadas de fibrilas amilóides. A hipótese acerca da capacidade de formar fibrilas amilóides com estruturas idênticas e ricas em estruturas beta, ser uma propriedade genérica de toda proteína, apoia-se no fato de até mesmo proteínas sem conexão com doenças, como a mioglobina, serem capazes de gerar estruturas fibrilares. Embora várias proteínas sejam intrinsecamente desordenadas, muitas são apropriadamente empacotadas, podendo se desenovelar totalmente ou parcialmente de maneira a expor regiões propensas à agregação, que podem converter o polipeptídeo em fibrilas amilóides. De fato, vários estudos sugerem que intermediários parcialmente enovelados estão envolvidos na fibrilogênese. A apomioglobina (apoMb) de baleia do espermacete é uma proteína bem caracterizada, que forma um intermediário durante o desenovelamento do estado nativo ou após a diluição do estado desenovelado em tampão de enovelamento. A mioglobina é uma proteína altamente solúvel, cujas propriedades do estado nativo não sugerem uma predisposição dessa em formar fibrilas amilóides, corroborado pela organização de sua seqüência de resíduos de aminoácidos em hélices-? bem definidas sem elementos de estrutura em folha-?. Contudo, até a mioglobina forma fibrilas amilóides em certas condições, sugerindo que a capacidade de formar fibrilas seja uma característica comum de toda proteína e, portanto, não estando relacionada a uma estrutura primária específica. Neste projeto, visamos mapear as potenciais interações envolvidas na agregação e formação de fibrilas amilóides em apomioglobinas. Para tanto, apresentamos aqui os estudos dos efeitos de 19 mutantes de apoMb na cinética amiloidogênica da mesma. A indução de fibrilas amilóides foi realizada através da incubação das apoMbs em tampão borato de sódio 50 mM, pH 9 e aquecidas a 65°C. O processo de agregação foi acompanhado por medidas da emissão de fluorescência de Tioflavina T (ThT) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Outras propriedades morfo-fisicoquímicas das amilóides de apoMb foram também estudadas: energia de ativação da formação de fibrilas, organização estrutural, citotoxicidade, efeito de semeadura, desmontagem por uréia. Nossos resultados mostram que alguns mutantes (7 no total) afetaram a cinética de formação das amilóides, e surpreendentemente, esses efeitos correlacionam-se bem com o efeito que a mutação tem sobre a estabilidade do estado nativo, mas não com o efeito sobre a estabilidade do estado intermediário do enovelamento. As estruturas globais (investigadas por difração de raios-X) das fibrilas formadas pelas ampomioglobinas selvagem e mutantes mostram-se indistinguíveis. Experimentos de citotoxicidade, utilizando um modelo de células neuronais N2A (neuroblastoma de camundongo), e semeadura, confirmam que as diferentes formas de agregados das proteínas são capazes de diminuir a viabilidade celular e de acelerar a formação das fibrilas. Generalizando, nossos resultados suportam a hipótese de que, embora o desenovelamento parcial preceda a formação de fibrilas em apomioglobina, a formação do intermediário de enovelamento não parece ser um passo obrigatório no processo e assim, o enovelamento e a formação de agregados/fibrilas são aparentemente distintos para essa proteína. / Abstract: Protein misfolding usually leads to the formation of fibrillar aggregates with extensive ?-sheet structure, commonly termed amyloid fibrils. The hypothesis that the ability to form ordered ?-rich amyloid fibers with identical structures is a generic property of proteins is supported by the fact that even proteins with no connection to disease, such as myoglobin, are able to generate fibrillar structures. Although several proteins are intrinsically disordered, many are properly packed and should unfold totally or partially exposing aggregation-prone regions that can convert the polypeptide into amyloid fibrils. Actually, several studies suggest that partially folded intermediates are involved in fibrillogenesis. Sperm whale apomyoglobin (apoMb) is a well-characterized protein that forms an intermediate after either unfolding from the native state or dilution of the unfolded protein in a folding buffer. Mb is a highly soluble protein whose native state properties do not suggest a predisposition to form amyloid fibrils, corroborated by its amino acid residues sequence organization in well-defined ?-helices with no ?-sheet elements. However, even Mb forms amyloid fibrils under certain conditions, suggesting that the ability to form fibrils is a common feature of all proteins and is not related to a specific primary structure. In this work, we aim to map potential interactions involved in apomioglobin aggregation and fibrils formation. To such aim, we present here the studies of effects on amiloidogenic kinetics of 19 apoMb mutants. The induction of amyloid fibrils was performed by incubating apoMb proteins on 50 mM sodium borate buffer at pH 9 and heat to 65°C. The aggregation process was monitored both by thioflavin T (ThT) emitted fluorescence and circular dichroism (CD) spectroscopy measurements. Other morph-physicochemical properties of apoMb amyloids were also studied: activation energy of fibril formation, structure organization, cytotoxicity, seeding effect, disassembly by urea. Our results show that some mutants (7 in total) affect the amyloid formation kinetics, and surprisingly, these effects are well correlated with the effect that the mutation has on the stability of the native state but not with the effect on the stability of the folding intermediate. The overall structures, probed by X-ray diffraction, of fibers formed by mutants and wild-type apomyoglobin are indistinguishable. Cytotoxicity experiments, using a neuronal cell line model N2A (murine neuroblastoma), and seeding experiments, confirm that different aggregated forms of proteins are capable of decreasing the cell viability and to speed up the formation of fibrils. Generally, our results support the hypothesis that although partially unfolding precedes fibril formation in apomyoglobin, formation of the folding intermediate is not an obligatory step in the process and thus folding and aggregation/fibril formation are apparently distinct in this protein. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:18:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Juliana Gomes de Freitas - parte 1.pdf: 1986084 bytes, checksum: 775092561e5ebbcb68aef7acbe0f2a91 (MD5) Previous issue date: 2012-08-29 / The climatic elements are related to the deterioration of the facades of buildings. Understanding the joint action of rain, wind and sunshine is important for prevention of pathological manifestations, thus ensuring the durability of coatings. Then, it becomes essential to know about the mechanisms of heat and moisture in porous materials. The problems related to this phenomenon are many, including the dimensional variation, which can cause cracks. The solar orientation and the presence of architectural details on the facades can cause the existence of the wettest spots, which favors the deposition of pollutants and microorganisms, causing stains. Thus, this paper aims at analyzing and understanding of issues that address the durability of facade coatings based on the understanding of the influence of climatic factors in buildings of the School of Engineering of the Federal University of Goiás (UFG), in Goiânia. Methodologically, the study aimed to: conducting a survey in order to quantify and map the pathological manifestations present, measurements of surface temperature and humidity in the dry and rainy seasons, trying to relate them to the cardinal orientations, creation of maps of wind-driven rain using data from the meteorological station of UFG, and conducting thermographic images, also in the rainy and dry seasons. The main results, it was found that the facades are exposed to different levels of humidity and temperature, which may favor the further deterioration of these. It was found that the north façade is the one that receives more sunlight in both the rainy and dry season, contributing to a high rate of fissuration. The same orientation is also one of the most humid and with higher levels of staining, consolidated information through wind-driven rain, that in the months of January and February 2012 reached one of the highest values. It was also observed that among the sites chosen for the measurements of surface moisture and temperature, the more prone to deterioration are the architectural details, as reached the highest values. In relation to infrared thermography, it was found that the best time of year for inspections was in the dry season and in the afternoon. In these periods, it was possible to identify pathological manifestations in the facades, such as stains, cracks and fantômes. An example is the case of the cracks which had a temperature 1°C lower than the part of the masonry without defects. It was also possible to visualize moist spots, as well as the lining of the points that were on the masonry and structure. / A deterioração das fachadas dos edifícios está relacionada com os elementos climáticos. A compreensão da ação conjunta da chuva, vento e insolação é importante para prevenção de manifestações patológicas, garantindo, assim, a durabilidade dos revestimentos. Para tanto, torna-se essencial o conhecimento a respeito dos mecanismos de transporte de calor e umidade em materiais porosos. Os problemas relacionados a estes fenômenos são diversos, dentre eles a variação dimensional, que pode ocasionar fissuras. A orientação solar e a presença de detalhes arquitetônicos nas fachadas podem provocar a existência de pontos mais úmidos, o que favorece a deposição de poluentes e a proliferação de microorganismos, causando manchamentos. Deste modo, o presente trabalho objetiva a análise e entendimento de aspectos que visem à durabilidade dos revestimentos de fachadas a partir da compreensão da influência dos fatores climáticos em edifícios da Escola de Engenharia da Universidade Federal de Goiás (UFG), na cidade de Goiânia - GO. Metodologicamente, o estudo propôs-se à: realização de uma vistoria, com o intuito de quantificar e mapear as manifestações patológicas presentes; medições de temperatura e umidade superficiais nas estações seca e chuvosa, buscando relacioná-las com as orientações cardeais; cálculo do índice de chuva dirigida direcional mensal utilizando os dados da estação meteorológica da UFG; e realização de imagens termográficas, também nos períodos seco e chuvoso. Como principais resultados, verificou-se que as fachadas estão expostas a diferentes níveis de umidade e temperatura, o que pode favorecer a maior deterioração destas. Constatou-se que a fachada Norte é a que recebe mais insolação tanto no período seco quanto no chuvoso, contribuindo para um alto índice de fissuração. A mesma orientação também é uma das mais úmidas e com maiores níveis de manchamento, informação consolidada por meio do índice de chuva dirigida direcional que, nos meses de janeiro e fevereiro de 2012, atingiu um dos valores mais altos. Observou-se também que, dentre os locais escolhidos para as medições de umidade e temperatura superficiais, o mais propício à deterioração são os detalhes arquitetônicos, pois atingiram os mais altos valores. Em relação à termografia infravermelha, constatou-se que o melhor período do ano para as inspeções era na época seca e no horário da tarde. Nestes períodos, foi possível a identificação de manifestações patológicas nas fachadas, como manchas, fissuras e fantômes. Um exemplo é o caso das fissuras que possuíam temperatura 1°C menor que a parte da alvenaria sem defeitos. Foi possível a também a visualização de pontos úmidos, bem como dos pontos do revestimento que estavam sobre a alvenaria e a estrutura.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:18:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos Mariano Melo Junior part 1.pdf: 577155 bytes, checksum: 817dbd867863c2bd3b18c86fdc2bc20b (MD5) Previous issue date: 2010-05-21 / The durability of the facades is related to performance against the deleterious effects of climatic elements, among them the wind driven rain, and the effects provided by the elements presents in building facades. Understanding these aspects is important for the prevention of pathological manifestations, increasing the capacity of the building to perform his functions for a long period. The presence of architectural and construction details can act as protective barriers or conductive elements of moisture from rain, well as a platform for deposition of pollutants and microorganisms, causing staining of the facades. Thus, this paper aims to point out the influences of wind driven rain and elements of facades of the durability of the facades of buildings located in Goiania-GO, related them to the cardinal points North, South, East and West. Methodologically, the paper seeks to: creation of the first maps of wind-driven rain to the city of Goiania, with data obtained from the National Institute of Meteorology in the period of 2002 to 2008; carrying out measurements of surfaces moisture on the four facades of the local building with mixed mortar rendering; data collection of cases of infiltration along the technical assistance for builders, relating them to their respective guidelines; identification of microorganisms collected on the façade elements and visual inspection with photographic record of the facades staining due to the inefficiency of the architectural and construction details. As main results, it was found that the infiltration and staining occur differently for each façade, due mainly, the specific climate of the city of Goiania. From the analysis of the results of the indices of wind driven rain, it was found that the facades oriented toward the North are more susceptible to moisture penetration by cracks and openings, fact also confirmed by the survey of cases of infiltration. For the identification of microorganisms, it was observed that facades face South tend to favor the growth of fungi, while the others showed the growth of phototrophs, justified by the increased incidence of the sunlight on these facades and the staining described generically as dirt due the pollutions are also the presence of microorganisms. From the standpoint of staining, observed an increased formation of spots near the region of window sill and dripping on the facades facing the South direction and greater presence of staining on the parapets of the facades facing the North directions. The fantômes occurred more frequently in walls of the South facades. / A durabilidade das fachadas está relacionada ao desempenho frente à ação deletéria dos elementos climáticos, dentre eles a chuva dirigida, bem como dos efeitos proporcionados pelos elementos presentes nas fachadas dos edifícios. A compreensão destes aspectos é importante para a prevenção de manifestações patológicas, aumentando a capacidade da edificação em desempenhar suas funções por um maior período. A presença de detalhes arquitetônicos e construtivos pode funcionar como barreiras de proteção ou elemento condutor de umidade da chuva, assim como plataforma para deposição de poluentes e microorganismos, causando manchamento das fachadas. Deste modo, o presente trabalho tem como objetivo apontar as influências da chuva dirigida e dos elementos das fachadas sobre a durabilidade das fachadas de edifícios localizados na cidade de Goiânia, relacionando-as com os pontos cardeais Norte, Sul, Leste e Oeste. Metodologicamente, o trabalho propôs-se à: criação dos primeiros mapas de chuva dirigida para a cidade de Goiânia, com dados obtidos junto ao Instituto Nacional de Meteorologia, no período de 2002 a 2008; realização de medições de umidade superficial nas quatro fachadas de edifício local com revestimento em argamassa mista; levantamento de dados de casos de infiltração junto às assistências técnicas de construtoras, relacionando-os com suas respectivas orientações; identificação de microorganismos coletados sobre elementos de fachadas e inspeção visual com registro fotográfico do manchamento de fachadas de edifícios em decorrência da ineficiência dos detalhes arquitetônicos e construtivos. Como principais resultados, constatou-se que as infiltrações e manchamentos ocorrem de maneira diferenciada para cada fachada em função, principalmente, das especificidades do clima da cidade de Goiânia. A partir da análise dos resultados dos índices de chuva dirigida, verificou-se que as fachadas voltadas à direção Norte estão mais suscetíveis à penetração de umidade por fissuras e aberturas, fato também confirmado pelo levantamento de casos de infiltração. Pela identificação de microorganismos, observou-se que fachadas voltadas a Sul tendem a favorecer o crescimento de fungos, enquanto que as demais apresentaram o crescimento de fototróficos, justificado pela maior incidência solar nessas fachadas e as manchas descritas genericamente como sujidades devida à poluição possuem a presença também de microorganismos. Do ponto de vista do manchamento, observou-se uma maior formação de manchas próximas às regiões de peitoris e sobre pingadeiras nas fachadas voltadas à direção Sul e maior presença de manchas nas platibandas das fachadas voltadas à direção Norte. Os fantômes ocorreram com maior freqüência nas vedações das fachadas Sul.

As fosfolipases A2 (PLA2s, ou fosfatidil-acil hidrolases EC 3.1.1.4) catalisam especificamente a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídio. São encontradas em plantas, mamíferos e em veneno de animais vertebrados e invertebrados e estão envolvidas em uma ampla variedade de processos fisiológicos. A fosfolipase A2 secretada humana do grupo IIA (hsPLA2 gIIA) é uma proteína de fase aguda da resposta imunológica, pois sua expressão é induzida por endotoxinas e citocinas via processos autócrinos e/ou parácrinos durante processos inflamatórios de relevância clínica. A hsPLA2 gIIA mostra efeito bactericida contra infecção por Staphylococcus aureus, e tem marcada preferência por fosfolipídios aniônicos tais como fosfatidilglicerol (PG) encontrados em membranas bacterianas. Uma grande variedade de inibidores de PLA2 do grupo IIA foi descrita na literatura, incluindo substâncias polianiônicas que atuam contra os efeitos inflamatórios destas enzimas. Suramina é um derivado de naftiluréia polissulfonado que recentemente mostrou ligação com os resíduos catiônicos no sítio de reconhecimento interfacial de Bothropstoxina-I (BthTX-I), uma PLA2-Lys49 isolada do veneno de Bothrops jararacussu, inibindo a atividade miotóxica da proteína. Devido ao tipo de interação diferenciada da suramina com BthTX-I em relação aos inibidores competitivos de PLA2, nós avaliamos a especificidade de ligação da suramina na hsPLA2 gIIA como um modelo para estudar este novo tipo de inibidor de PLA2s. O efeito da suramina nas atividades biológicas e de membranas artificiais da hsPLA2 gIIA foi avaliado. A suramina aboliu tanto a atividade hidrolítica da hsPLA2 gIIA quanto a atividade de danificação de membranas artificiais Ca2+ independente. Embora a suramina não tenha inibido a atividade bactericida da hsPLA2 gIIA contra a linhagem Micrococcus luteus, a ativação de macrófagos foi abolida pela mesma de maneira dependente de hidrólise. Além disso, técnicas de simulação de dinâmica molecular, calorimetria de titulação isotérmica e mutagênese sítio dirigida foram utilizadas para mapear os sítios de ligação da suramina na proteína. A interação da suramina com a hsPLA2 gIIA resultou de interações eletrostáticas entre grupos sulfonados com cadeias laterais de aminoácidos da região do sítio ativo e dos resíduos em torno das posições 15 e 116 localizados, respectivamente, na N- e Cterminal. Portanto, estes resultados permitem sugerir que a suramina pode atuar como inibidor de sPLA2s / Suramin is a polysulphonated napthylurea used as an antiprotozoal drug that presents inhibitory activity against a broad range of enzymes. We have evaluated the effect of suramin against the artificial and biological activities of the secreted human group IIA phospholipase A2 (hsPLA2 gIIA), a protein involved in inflammatory processes. To map the suramin binding sites on the hsPLA2 gIIA, proteins with mutations in the active site region and in the protein surface that makes contact with the phospholipids membrane were expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. The activation of macrophage cell line RAW 264.7 by hsPLA2 gIIA was monitored by nitric oxide release, and bactericidal activity of the protein against Micrococcus luteus was evaluated by colony counting and by flow cytometry. The hydrolytic activity of the hsPLA2 gIIA against lipossomes composed of a mixture of dioleoylphosphatidylcholine/dioleoylphosphatidylglycerol (DOPC/DOPG) was inhibited by a concentration of 100 nM suramin. The activation of macrophages by hsPLA2 gIIA was abolished at protein/suramin molar ratios where the hydrolytic activity of the enzyme was inhibited. In contrast, both the bactericidal activity of hsPLA2 gIIA against Micrococcus luteus and permeabilization of the bacterial inner membrane were unaffected by suramin concentrations up to 50 M. The affinity of interaction of the suramin with hsPLA2 gIIA was evaluated by suramine fluorescence and the mutants K15A, K38A, R54A and K123A presented a reduced affinity. The binding of the suramin/hsPLA2 gIIA complex was investigated by molecular dynamics simulations, which indicated two conformations of the bound inhibitor, which involve cationic amino-acid side chains in the active-site region and residues around positions 15 and 116 located in the N- and C-termini respectively in the substrate recognition surface. These results were correlated with isothermal titration calorimetry data, which demonstrated 2.7 suramin-binding sites on the hsPLA2 gIIA. These results suggested that suramin represents a novel class of phospholipase A2 inhibitor

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_simone_simionatto.pdf: 333806 bytes, checksum: 6d2a7ca25216004656318115c514c721 (MD5) Previous issue date: 2008-10-10 / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia (EP), a respiratory disease responsible for significant economic losses. Commercial vaccines are widely used in the control of this disease, however, they provide only partial protection. Besides, their preparation is expensive because of fastidiously growth of M. hyopneumoniae in vitro. Therefore, the development of alternatives for EP prophylaxis is important for improving health conditions of pigs. Recombinant DNA technology can be used to overcome problems with conventional vaccines. Nevertheless, because of the use of TGA and not TGG to code for tryptophan, translation of mycoplasmal genes terminates prematurely when cloned in other bacteria, such as Escherichia coli. Because of this, the number of antigenic proteins characterized to date in vaccine formulations or immunodiagnostic tests is still restricted. In this work, 63 genetic fragments were selected, which correspond to 48 sequences coding (CDS) of M. hyopneumoniae. First, an overlap extension-PCR method for site-directed mutagenesis of M. hyopneumoniae genes was standardized, aiming at substituting TGA codon by TGG. With this improved method, site-directed mutagenesis was successfully achieved in 14 M. hyopneumoniae genes. Other selected genes were amplified by PCR and cloned into Champion pET200D/TOPO®. A total of 59 genetic fragments were efficiently cloned. From these, 49 had their proteins expressed in E. coli and 35 were purified by affinity chromatography using Ni- Sepharose columns (HisTrap ). Immunogenic and antigenic properties of these proteins were analyzed. For this, the proteins were tested against sera from hyperimmune and from convalescent pigs through ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) and Western blot. Nineteen recombinant proteins were specifically recognized by convalescent pig sera indicates they are expressed during infection. Immune humoral response against recombinant proteins was evaluated in BALB/c mice by ELISA. The results showed that antigens induce variable levels of antibodies, which allows inferring the immunogenicity of each antigen. Sera from inoculated mice with twenty recombinant proteins were able to recognize the native protein by ELISA. This study allowed identifying and characterizing new immunogenic proteins according to their potential for use in diagnostic tests and/or vaccine. These data represent an important contribution for the development of more efficient serological tests and a subunit vaccine for controlling M. hyopneumoniae infections in pigs. / Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES), uma doença respiratória responsável por significativas perdas econômicas. Vacinas comerciais são mundialmente utilizadas no controle desta doença, porém proporcionam apenas proteção parcial. Além disso, são caras devido ao crescimento fastidioso do M. hyopneumoniae in vitro. Desta forma, o desenvolvimento de alternativas para a profilaxia da PES é fundamental para a melhoria da sanidade dos suínos. A tecnologia do DNA recombinante pode ser usada para superar problemas com as vacinas convencionais. No entanto, pela utilização de códons TGA e não TGG para codificar o amino ácido triptofano, a tradução de genes de micoplasmas termina prematuramente quando clonados e expressos em outras bactérias, como Escherichia coli. Devido a isso, o número de proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae caracterizadas e testadas como vacinas ou em testes de imunodiagnóstico ainda é restrito. Neste trabalho, 63 fragmentos gênicos foram selecionados, os quais correspondem a 48 seqüências codificadoras (CDS) de M. hyopneumoniae. Num primeiro momento, foi padronizado um método de PCR de sobreposição para mutagênese sítio-dirigida de genes de M. hyopneumoniae, objetivando a substituição do códon TGA por TGG, na seqüência do DNA. Com esse método, a mutagênese sítio-dirigida foi realizada com sucesso em 14 genes de M. hyopneumoniae. Os demais genes selecionados foram amplificados por PCR e clonados no vetor Champion pET200D/TOPO®. No total, 59 fragmentos gênicos foram clonados eficientemente. Destes, 49 tiveram suas proteínas expressas em E. coli e 35 foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de Ni- Sepharose (HisTrap ). As propriedades antigênicas e imunogênicas destas proteínas foram analisadas. Para isso, as proteínas foram testadas contra soro de suínos convalescentes e soro hiperimune através de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) e Western blot. Dezenove proteínas recombinantes foram reconhecidas especificamente por soro de suínos convalescentes, indicando que elas são expressas durante a infecção. Resposta imune humoral contra as proteínas recombinantes foi avaliada em camundongos BALB/c através de ELISA. Os resultados demonstraram que os antígenos induzem um nível variável de anticorpos, o que nos permite inferir quanto à capacidade imunogênica de cada antígeno. O soro dos camundongos inoculados com 20 proteínas foi capaz de reconhecer as proteínas nativas através de ELISA. Este estudo permitiu identificar e caracterizar novas proteínas imunogênicas de acordo com o seu potencial para uso em testes de diagnóstico e/ou vacina. Estes dados representam uma importante contribuição para o desenvolvimento de testes sorológicos mais efecientes e vacinas de subunidade para o controle da infecção causada por M. hyopneumoniae em suínos.

Cloud computing has brought many benefits to its users that are derived from its specific characteristics. However, it also creates new challenges as regards the provisioning of software and hardware services. One of the most significant challenges is the appropriate provisioning of high quality services that cloud providers should offer to their customers. Given the large number of cloud service providers, it is essential to supply customers with services that satisfy their needs and the expected level of quality. The characteristics of the Quality of Services (QoS) agreed upon between customers and providers are contained in Service Level Agreements (SLAs), which also describes the penalties to be applied when the SLA is violated. It is, therefore, necessary to monitor the status of services to the fulfillment of SLAs. Monitoring methods and tools plays a crucial role in this context, as they provide information about the status of the running services and their quality level. Although there are many general purpose monitoring solutions, it is not possible to use them properly for the monitoring of specific resources in cloud environments. Moreover, there are specific solutions for cloud services with which to determine compliance with the SLA and the overall behavior and quality of cloud services. However, these solutions have significant limitations when monitoring specific individual needs because they are focused on monitoring low-level quality attributes (e.g., CPU or disk usage), and because of their rigidity as regards dealing with the modifications of monitoring requirements at runtime. In addition, other solutions are limited to certain cloud platforms or do not exploit data monitoring provided by third parties. There is thus a need for a method with which to monitor cloud services that can help to mitigate these problems, and also exploit data obtained by third-party solutions (e.g., specialized tools with which to monitor certain quality attributes, agents, data provided by platform libraries). The hypothesis of this thesis is that the use of models at runtime, which is a Model Driven Engineering (MDE) technique, can provide an appropriate solution to this problem owing to its reflection mechanisms that decouple the model specification which contain the monitoring requirements from the monitoring infrastructure. The principal objective of this thesis is, therefore, the definition and empirical validation of Cloud MoS@RT, a method for monitoring services deployed in the cloud. We have also designed and implemented a monitoring infrastructure that supports the proposed method. Finally, the method and the monitoring infrastructure have been empirically evaluated through a quasi-experiment and three replications with participants from Spain, Paraguay, and Ecuador. Consequently, it is important to emphasize that this thesis contributes to an innovative monitoring solution, owing to its high flexibility as regards specifying monitoring requirements provided by the model at runtime. The solution is also highly interoperable as it allows the extraction and integration of monitoring data from various scenarios and data sources. / La computación en la nube ha traído consigo muchas ventajas derivadas de sus características particulares, proporcionando a sus usuarios varios beneficios pero también nuevos retos en el aprovisionamiento de servicios de hardware y software. Entre los desafíos más significativos está el aprovisionamiento adecuado y de alta calidad de los servicios que el proveedor ofrece a sus clientes. Dado el amplio número de proveedores de plataformas en la nube, se hace indispensable que éstos ofrezcan servicios de calidad, a fin de satisfacer las expectativas de sus clientes. Las características de calidad de los servicios (Quality of Services, QoS) que son pactadas entre clientes y proveedores se ven reflejadas en los acuerdos de nivel de servicios (Service Level Agreement, SLA), que también describen las penalizaciones que se deben aplicar en caso de incumplimientos del SLA. De ahí, la necesidad de conocer el estado actual de los servicios para comprobar si los términos del SLA se cumplen. Los métodos y herramientas de monitorización juegan un papel crucial en este contexto ya que proporcionan información sobre la utilización de los servicios y su nivel de calidad. A pesar de que existen muchas soluciones de monitorización de propósito general, éstas no se adaptan adecuadamente debido a que es habitual necesitar monitorizar aspectos específicos de los servicios con respecto a los recursos concretos de la plataforma. Por otra parte, existen soluciones de monitorización específicas para la nube, pero estas presentan limitaciones importantes a la hora de especificar necesidades de monitorización particulares ya que están centradas en monitorizar atributos de calidad de bajo nivel (uso de CPU, memoria en disco, etc) o son muy rígidas para poder modificar los requisitos en tiempo de ejecución. Además, algunas soluciones existentes están limitadas a ciertas plataformas cloud y otras no permiten explotar datos de monitorización provistos por otras herramientas ya que funcionan de manera aislada. De esta forma, surge la necesidad de un método de monitorización de servicios cloud que permita mitigar los problemas descritos y que además, explote datos obtenidos por soluciones de terceros, ya sean herramientas especializadas en monitorizar ciertos atributos de calidad, agentes, datos proporcionados por las plataformas cloud, entre otros. La hipótesis de esta tesis es que la utilización de modelos en tiempo de ejecución, una técnica que se enmarca en la Ingeniería Dirigida por Modelos, puede constituir una solución apropiada ya que estos modelos permitirán cambiar dinámicamente los requisitos de monitorización sin la necesidad de cambiar la infraestructura de monitorización. Por tanto, el principal objetivo de esta tesis doctoral es la definición y validación empírica de un método de monitorización de servicios cloud (Cloud MoS@RT) que explote los modelos en tiempo de ejecución para hacer frente a los desafíos de monitorización de servicios cloud previamente mencionados. Además, se ha diseñado e implementado una infraestructura de monitorización que soporta el método propuesto. Finalmente, el método y la infraestructura de monitorización han sido validados empíricamente mediante un cuasi-experimento y tres replicaciones en España, Paraguay y Ecuador. Por tanto, esta tesis doctoral presenta una solución de monitorización innovadora, ya que al emplear modelos en tiempo de ejecución, proporciona un alto grado de flexibilidad en la especificación de requisitos de monitorización de servicios cloud, evitando la re-implementación de la infraestructura, todo esto debido a que cualquier modificación en los requisitos de monitorización se incluyen en el modelo en tiempo de ejecución. Por otro lado, la solución es interoperable debido a que permite la captura e integración de datos de monitorización desde distintos escenarios y fuentes de datos. / La computació en el núvol (cloud computing) ha comportat molts avantatges derivades de les seues característiques particulars (autoservei baix demanda, accés ampli a la xarxa, elasticitat, model de multitenencia, pagament per l'ús, entre d'altres) proporcionant als seus usuaris diversos beneficis però també nous reptes en l'aprovisionament de serveis de maquinari i programari. Entre els desafiaments més significatius està l'aprovisionament adequat i d'alta qualitat dels serveis que el proveïdor oferix als seus clients. Donat l'ampli nombre de proveïdors de plataformes en el núvol, es fa indispensable que estos oferisquen serveis de qualitat, a fi de satisfer les expectatives dels seus clients. Les característiques de qualitat dels serveis (Quality of Services, QoS) que són pactats entre clients i proveïdors es veuen reflecticts en els acords de nivell de servei (Service Level Agreenment, SLA) , que també descriuen les penaliaciones que s'han d'aplicar en cas d'incompliments del SLA. D'ací, la necessitat de conéixer l'estat actual dels serveris amb la fí comprovar si els termes del SLA es complixen. Els mètodes i ferramentes de monitorització juguen un paper crucial en este context ja que proporcionen informació sobre la utilització dels serveis i el seu nivell de qualitat. A pesar que hi ha moltes solucions de monitorització de propòsit general, estes no s'adapten adequadament pel fet que és habitual necessitar monitoritzar aspectes específics dels serveis respecte als recursos concrets de la plataforma. D'altra banda, hi ha solucions de monitorització específiques per al núvol, però estes presenten limitacions importants a l'hora d'especificar necessitats de monitorització particulars ja que estan centrades a monitoritzar atributs de qualitat de baix nivell (ús de CPU i memòria en disc) o a la seua rigidesa per a modificar els requisits en temps d'execució. A més, algunes solucions existents estan limitades a certes plataformes cloud i altres no permeten explotar dades de monitorització proveïts per altres ferramentes ja que funcionen de manera aïllada. D'esta manera, sorgix la necessitat d'un mètode de monitorització de servicis cloud que permeta mitigar els problemes descrits i que a més, explote les dades obtinguts per solucions de tercers, ja siguen ferramentes especialitzades a monitoritzar certs atributs de qualitat, agents, o les dades proporcionats per les plataformes cloud, entre d'altres. La hipòtesi d'esta tesi és que la utilització de models en temps d'execució (models@run.time), una tècnica que s'emmarca en l'Enginyeria Dirigida per Models, pot constituir una solució apropiada ja que estos models permetran canviar dinàmicament els requisits de monitorització sense la necessitat de canviar la infraestructura de monitorització. Per tant, el principal objectiu d'esta tesi doctoral és la definició i validació empírica d'un mètode de monitorització de servicis cloud (Cloud MoS@RT) que explota els models en temps d'execució per a fer front als desafiaments de monitorització de serves cloud prèviament mencionats. A més, s'ha dissenyat i implementat una infraestructura de monitorització que suporta el mètode proposat. Finalment, el mètode i la infraestructura de monitorització han sigut validats empíricament per mitjà d'un quasi-experiment i tres replicacions del mateix a Espanya, Paraguai i L'Equador. Per tant, cal destacar que aquesta tesi doctoral presenta una solució de monitorització innovadora, ja que a l'emprar models en temps d'execució, proporciona un alt grau de flexibilitat en l'especificació de requisits de monitorització de serveis cloud, evitant la reimplementació de la infraestructura, tot açò pel fet que qualsevol modificació en els requisits de monitorització s'inclouen en el model en temps d'execució. D'altra banda, la solució és interoperable pel fet que permet la captura i integració de dades de monitorització des / Cedillo Orellana, IP. (2017). Monitorización de calidad de servicios cloud mediante modelos en tiempo de ejecución [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/78032 / TESIS

En una era donde el análisis del Big Data está a la orden del día, la analítica visual se convierte en un componente clave. Sin embargo, establecer unos objetivos analíticos y encontrar las visualizaciones que mejor se adapten a un contexto determinado es una tarea desafiante, especialmente cuando se trata con usuarios no expertos en visualización de datos. El uso de un tipo de visualización inadecuado puede llevar a malinterpretar los datos y a tomar decisiones equivocadas, provocando pérdidas significativas. Por ello, el objetivo principal de la presente tesis doctoral es definir una metodología que agrupe una serie de técnicas y aproximaciones para mejorar la comprensión visual de Big Data. En concreto, se han analizado las necesidades actuales en la toma de requisitos para la generación de visualizaciones y se ha propuesto una metodología completa, desde la definición de requisitos hasta la implementación de visualizaciones, que guía al usuario en la definición de sus objetivos analíticos y genera automáticamente la mejor visualización para cada uno, agrupando dichas visualizaciones en cuadros de mandos. La metodología está compuesta por (i) un modelo de requisitos de usuario, (ii) un modelo de perfilado de datos que extrae de forma semiautomática información sobre las características de las fuentes de datos y (iii) un modelo de visualización de datos. Nuestra propuesta ha sido evaluada y aplicada en distintos ámbitos, tales como ciudades inteligentes, procesos de producción industrial y entornos sanitarios. Además, con los resultados obtenidos y que se presentan en el trabajo, podemos concluir que se logra el objetivo principal del estudio, ya que, en línea con los experimentos realizados en el núcleo de la presente tesis doctoral, nuestra propuesta: (i) permite a los usuarios cubrir más cuestiones analíticas; (ii) mejora el conjunto de visualizaciones generadas; (iii) produce una mayor satisfacción general en los usuarios. La investigación realizada en la presente tesis doctoral ha dado como resultado diferentes artículos científicos que han sido presentados en congresos internacionales y revistas científicas de alto impacto, es por ello por lo que se elige presentar la tesis doctoral por compendio de publicaciones.

Made available in DSpace on 2016-08-17T14:53:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Helaine_Cristina_Silva_Sousa.pdf: 2630560 bytes, checksum: fb46a7db2abe38334d4a7e684f39c287 (MD5) Previous issue date: 2009-05-14 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The emergence of model driven approaches provides a new alternative for managing the complexity involved in the creation of test cases, for enhancing the automation of software testing and for promoting the broad reuse of models developed during the analysis of requirements and design of software. In addition, it reduces the injection of errors and software development time. However, in the use of model driven approaches, possible errors can be injected during the manual creation of transformation rules applyied to develop a software system. In this dissertation, we propose metamodels for test, a methodology and a framework called Automatic Test Case based on Models (ATCM) in order to generate test cases to test the source code generated by an model driven approach. A prototype of the framework ATCM was developed, providing tools that minimize the injection of errors during the generation of test cases, making this task less dependent on people and less error-prone reducing the development time and providing high quality and efficiency of test cases. / O surgimento das Abordagens Dirigidas por Modelos fornece uma nova alternativa para o gerenciamento da complexidade do desenvolvimento de software, para criação de testes de software, para automação dos processos de testes e para fornecimento da ampla reutilização de modelos desenvolvidos durante a fase de análise dos requisitos e projeto de software, reduzindo a possível injeção de erros e o tempo de desenvolvimento do software. No entanto, com a utilização das Abordagens Dirigidas por Modelos, possíveis erros podem ser injetados na criação das regras de transformação para implementar um determinado sistema de software. Propõe-se neste trabalho metamodelos de testes, uma metodologia e um framework ATCM (Automatic Test Case based on Models) com a finalidade de gerar casos de teste a fim de testar o código-fonte gerado por uma Abordagem Dirigida por Modelos. Um protótipo do framework ATCM foi desenvolvido, fornecendo ferramentas que minimizam a injeção de erros durante a geração dos casos de teste, tornando esta tarefa menos dependente de pessoas e menos propensa a erros reduzindo o tempo de desenvolvimento e provendo maior qualidade e eficiência nos casos de teste gerados.

Apesar do aconselhamento no campo das DST/aids ser considerado, em diferentes regiões do mundo, como uma das principais estratégias para prevenção primária, secundária e terciária, implantada nos serviços da rede de atendimento às DST/aids e em serviços da rede básica de saúde, tanto estudos nacionais como internacionais mostram que esta prática ainda concentra uma dose significativa de fragilidades e problemas.Estes estão relacionados principalmente à falta de uma reflexão e clareza sobre a definição, conceituação, estrutura e forma de atuação do aconselhamento, bem como sobre seus limites e possibilidades. Este estudo se propôs a resgatar as origens históricas e conceituais do aconselhamento em DST/aids, e identificar e analisar criticamente a principal concepção teórica indicada como fundamento dos materiais de referência sobre o aconselhamento em DST/aids, apontando suas contribuições, limites e possibilidades de aplicação. Trata-se, portanto, de um estudo de natureza qualitativa, baseado na análise de documentos sobre o aconselhamento em geral, o aconselhamento em DST/aids, e sobre a principal corrente teórica identificada nesses materiais: a Abordagem Centrada na Pessoa, de Carl Rogers. Além de identificar a origem histórica da imprecisão do conceito de aconselhamento enquanto prática social, este estudo colocou em evidência tanto as potencialidades e fragilidades da Abordagem Centrada na Pessoa para lidar com a complexidade de facetas presentes nessa epidemia, como a existência de alguns desacordos e contrastes entre a prática de ajuda proposta por esse referencial teórico e a estrutura de aconselhamento proposta pelos manuais, bem como, algumas contradições e ambigüidades existentes na própria proposta desenhada para o aconselhamento no campo da aids. Sustenta-se que, para fazer um uso consistente da Abordagem Centrada na Pessoa no aconselhamento em DST/aids, algumas mudanças de concepção, expectativa, enfoque e posicionamento se fazem necessárias. Primeiramente é imperioso que se veja o aconselhamento como um espaço onde a ação está voltada às necessidades e características do cliente, e não voltado para resolver a múltiplas demandas da política de prevenção e assistência, pois ele nunca deve ser visto como uma ação isolada, mas deve sempre estar inserido em uma estratégia mais ampla aonde se somam outros tipos de intervenção.É importante que se reveja a idéia de objetivos, conteúdos e resultados fechados e pré-determinados, possibilitando que sejam centrados na pessoa do cliente e, portanto mais abertos, flexíveis ou construídos conjuntamente. Finalmente, é importante para uma maior qualificação e efetividade dessa prática, utilizar-se de outros quadros teóricos e conceituais, que discutem outras dimensões e aspectos do universo individual, não abordados por essa linha teórica. / In spite of the fact that in different regions of the world counseling in the field of STD/aids is considered as one of the main strategies for the primary, secondary and tertiary prevention techniques applied in the services available to STD/aids and in basic health services, studies done nationally and internationally show that this practice still concentrates a significant amount of weaknesses and problems. These relate mainly to the lack of a clear expression and thought on the definition, conceptualization, structure and format for the role of counseling, as well as its limitations and possibilities. This study proposes to rescue the historical and conceptual origins of counseling in STD/aids, and to identify and critically analyze the main theoretical concept used as the basis for the reference material on counseling in STD/aids, pointing out its contributions, limitations and possibilities of application. It is, therefore, a qualitative study by nature, based on the analysis of documents on counseling in general, counseling in STD/aids, and on the main theoretical current identified in the material: the Client Centered Therapy, by Carl Rogers. In addition to identifying the historical origin of the imprecision in the concept of counseling as a social practice, this study makes clear the potentialities and weaknesses of the Client Centered Therapy to deal with the complexity of facets present in this epidemic, such as the existence of some differences and contrasts between the help practice proposed by this theoretical reference and the structure of counseling proposed by manuals, as well as some contradictions and ambiguities present in the proposal itself, designed for the counseling in the field of aids. One supports the idea that in order to make a consistent use of the Client Centered Therapy in the counseling for STD/aids, some changes in the concept, expectation, focus and positioning are necessary. First of all it is imperative to see counseling as a space where action is oriented towards the needs and characteristics of the client, and not to solve the multiple demands of the policy for the prevention and assistance, as it should never be seen as an isolated action, but it must always be inserted in a wider strategy where other kinds of interventions are added. It is important to revisit the idea of objectives, content, closed and predetermined results, enabling them to be centered on the person, the client, and therefore, to be more open, flexible or constructed jointly. Finally, it is important for a wider qualification and effectiveness of this practice, to use other theoretical and conceptual frameworks, which discuss other dimensions and aspects of the individual universe, not dealt with in this theoretical line.