Diversos desordres neuropsiquiàtrics en humans estan relacionats amb una disfunció en el control de les emocions i del comportament social, i alguns d'ells estan associats a una alteració en el desenvolupament de l'amígdala. El control de les emocions i del comportament social estan, en particular, associats a la denominada amígdala estesa, un corredor de cèl·lules del telencèfal basal que s'estén des de l'amígdala centromedial al nucli del llit de l'estria terminal (BST), que constitueix l'estació d'eixida mes important cap a centres efectors de l'hipotàlem i tronc encefàlic. No obstant això, hi ha molts aspectes del desenvolupament de l'amígdala estesa que es desconeixen, incloent l'origen embrionari de les seves diferents subpoblacions de neurones. L'objectiu d'esta Tesi ha sigut investigar l'origen de les neurones de l'amígdala estesa en embrions de ratolí (E13.5-E16.5) per mitjà d'assajos de migració in vitro. Els resultats d'estos assajos es van combinar amb inmunofluorescencia per a analitzar el fenotip de les neurones que van migrar a l'amígdala des d'orígens distints, i es van comparar amb dades d'inmunohistoquímica (per a marcar distints neuropèptids, proteïnes o enzims) i hibridació in situ (per a detectar el RNAm de diferents factors de transcripció i altres proteïnes) per a ajudar en la delimitació de distints dominis embrionaris del prosencèfal i distintes subdivisions de l'amígdala estesa. En particular, esta Tesi està dedicada a l'estudi de l'origen embrionari de les neurones de les dos subdivisions (o subcorredors) principals de l'amígdala estesa, l'amígdala medial estesa (Capítol 2) i l'amígdala central estesa (Capítol 3). En relació a l'amígdala medial estesa (Capítol 2), la present Tesi proporciona evidència experimental de l'origen múltiple de les seves neurones principals, incloent les de l'amígdala medial i les del BST medial. En particular, aquest estudi aporta proves que indiquen que una gran part de les neurones de l'amígdala medial i el BST medial deriva de la part caudoventral de l'eminència ganglionar medial (MGEcv, prèviament coneguda com, o inclosa en, l'àrea peduncular anterior), formant un subcorredor de cèl·lules amb característiques moleculars semblants (expressió del factor de transcripció Lhx6 i la proteïna calbindina). La comparació amb altres dades indica que les neurones d'aquest subcorredor de cèl·lules que deriven de MGEcv estan interconnectades i projecten a les mateixes dianes de l'hipotàlem, involucrades en el control del comportament reproductor. Esta Tesi també aporta dades experimentals que demostren que el pal·li ventral produeix algunes neurones de l'amígdala medial, que pareixen expressar el factor de transcripció Lhx9. Els resultats també confirmen que algunes neurones de l'amígdala medial estesa s'originen en l'àrea preòptica (les nostres dades indiquen que s'originen específicament en l'àrea preòptica comissural o POC, i aquest origen es correlaciona amb expressió de la proteïna senyalitzadora Shh) i en el domini supraopto-paraventricular de l'hipotàlem (SPV, que dóna lloc a neurones amb expressió postmitòtica dels factors de transcripció Lhx5 i Otp). De forma semblant a les neurones que deriven de MGEcv, és possible que les neurones de l'amígdala medial estesa que deriven d'altres dominis embrionaris també formen distints subcorredors de cèl·lules amb funcions específiques. En relació a l'amígdala central estesa (Capítol 3), els resultats d'esta Tesi mostren que els seus principals components, incloent l'amígdala central i el BST lateral, són mosaics formats per distintes proporcions de neurones derivades de la part dorsal de l'eminència ganglionar lateral (LGEd), la part ventral de l'eminència ganglionar lateral (LGEv), o l'eminència ganglionar medial (MGE). La neurones derivades de LGEd expressen el factor de transcripció Pax6 i invadeixen preferentment les parts laterals de l'amígdala central, encara que unes poques també arriben al BST lateral. Basant-se en correlació amb el RNAm de pre-proencefalina i altres dades, moltes d'aquestes cèl·lules són probablement neurones de projecció encefalinèrgiques. Les neurones derivades de LGEv expressen el factor de transcripció Islet1 i invadeixen principalment la part central i medial de l'amígdala central, i part del BST lateral. La correlació amb altres estudis suggereix que aquestes cèl·lules són probablement les neurones de projecció que contenen el factor alliberador de la corticotropina. D'altra banda, MGE produeix la majoria de les neurones del BST lateral, però la part caudoventral del MGE (MGEcv) també produeix una important subpoblació de neurones de projecció que expressen somatostatina que invadeixen la part medial de l'amígdala central. Així, distints tipus de neurones de projecció s'originen en distints dominis embrionaris, però els mateixos dominis produeixen neurones per a quasi totes les parts de l'amígdala central estesa, la qual cosa podria explicar la similitud de les neurones en característiques neuroquímiques i connexions al llarg del corredor. Els resultats, junt amb altres dades publicades, també suggereixen l'existència de al menys tres subcorredors de cèl·lules en l'amígdala central estesa, cada un relacionat amb un origen embrionari distint i involucrat en el control d'un aspecte diferent de les respostes de por i ansietat. En resum, aquest estudi proporciona importants dades que aclareixen aspectes rellevants del desenvolupament i organització adulta de l'amígdala estesa, i ajuda a establir les bases per a una millor comprensió del control neural de les emocions i el comportament social en condicions normals i patològiques. / Varios desórdenes neuropsiquiátricos humanos están relacionados con una disfunción en el control de las emociones y del comportamiento social, y algunos de ellos están asociados a una alteración en el desarrollo de la amígdala. El control de las emociones y el comportamiento social están, en particular, asociados a la denominada amígdala extendida, un corredor de células del telencéfalo basal que se extiende desde la amígdala centromedial al núcleo del lecho de la estria terminal (BST), que constituye la estación de salida mas importante hacia centros efectores del hipotálamo y tronco encefálico. Sin embargo, existen muchos aspectos del desarrollo de la amígdala extendida que se desconocen, incluyendo el origen embrionario de sus diferentes subpoblaciones de neuronas. El objetivo de esta Tesis ha sido investigar el origen de las neuronas de la amígdala extendida en embriones de ratón (E13.5-E16.5) mediante ensayos de migración in vitro. Los resultados de estos ensayos se combinaron con inmunofluorescencia para analizar el fenotipo de las neuronas que migraron a la amígdala desde orígenes distintos, y se compararon con datos de inmunohistoquímica (para marcar distintos neuropéptidos, proteinas o enzimas) e hibridación in situ (para detectar el RNAm de diferentes factores de transcripción y otras proteinas) para ayudar en la delimitación de distintos dominios embrionarios del prosencéfalo y distintas subdivisiones de la amígdala extendida. En particular, esta Tesis está dedicada al estudio del origen embrionario de las neuronas de las dos subdivisiones (o subcorredores) principales de la amígdala extendida, la amígdala medial extendida (Capítulo 2) y la amígdala central extendida (Capítulo 3). En relación a la amígdala medial extendida (Capítulo 2), la presente Tesis proporciona evidencia experimental del origen múltiple de sus neuronas principales, incluyendo las de la amígdala medial y las del BST medial. En particular, este estudio aporta pruebas que indican que una gran parte de las neuronas de la amígdala medial y el BST medial deriva de la parte caudoventral de la eminencia ganglionar medial (MGEcv, previamente conocida como, o incluida en el área peduncular anterior), formando un subcorredor de células con características moleculares similares (expresión del factor de transcripción Lhx6 y la proteina calbindina). La comparación con otros datos indica que las neuronas de este subcorredor de células que derivan de MGEcv están interconectadas y proyectan a las mismas dianas del hipotálamo, involucradas en control del comportamiento reproductor. Esta Tesis también aporta datos experimentales que demuestran que el palio ventral produce algunas neuronas de la amígdala medial, que parecen expresar el factor de transcripción Lhx9. Los resultados también confirman que algunas neuronas de la amígdala medial extendida se originan en el área preóptica (nuestros datos indican que se originan específicamente en el área preóptica comisural o POC, y este origen se correlaciona con expresión de la proteina señalizadora Shh) y en el dominio supraopto-paraventricular del hipotálamo (SPV, que da lugar a neuronas con expresión postmitótica de los factores de transcripción Lhx5 y Otp). De forma similar a las neuronas que derivan de MGEcv, es posible que las neuronas de la amígdala medial extendida que derivan de otros dominios embrionarios también formen distintos subcorredores de células con funciones específicas. En relación a la amígdala central extendida (Capítulo 3), los resultados de esta Tesis muestran que sus principales componentes, incluyendo la amígdala central y el BST lateral, son mosaicos formados por distintas proporciones de neuronas derivadas de la parte dorsal de la eminencia ganglionar lateral (LGEd), la parte ventral de la eminencia ganglionar lateral (LGEv), o la eminencia ganglionar medial (MGE). La neuronas derivadas de LGEd expresan el factor de transcripción Pax6 e invaden preferentemente las partes laterales de la amígdala central, aunque unas pocas también alcanzan el BST lateral. En base a correlación con el RNAm de pre-proencefalina y otros datos, muchas de estas células son probablemente neuronas de proyección encefalinérgicas. Las neuronas derivadas de LGEv expresan el factor de transcripción Islet1 e invaden principalmente la parte central y medial de la amígdala central, y parte del BST lateral. La correlación con otros estudios sugiere que estas células son probablemente las neuronas de proyección que contienen el factor liberador de la corticotropina. Por otro lado, MGE produce la mayoría de las neuronas del BST lateral, pero la parte caudoventral del MGE (MGEcv) también produce una importante subpoblación de neuronas de proyección que expresan somatostatina que invaden la parte medial de la amígdala central. Así, distintos tipos de neuronas de proyección se originan en distintos dominios embrionarios, pero los mismos dominios producen neuronas para casi todas las partes de la amígdala central extendida, lo que podría explicar la similitud de las neuronas en características neuroquímicas y conexiones a lo largo del corredor. Los resultados, junto con otros datos publicados, también sugieren la existencia de al menos tres subcorredores de células en la amígdala central extendida, cada uno relacionado a un origen embrionario distinto e involucrado en el control de un aspecto diferente de las respuestas de miedo y ansiedad. En resumen, este estudio proporciona importantes datos que clarifican aspectos relevantes del desarrollo y organización adulta de la amígdala extendida, y ayuda a establecer las bases para una mejor comprensión del control neural de las emociones y el comportamiento social en condiciones normales y patológicas. / Dysfunctions in emotional control and social behavior are behind several human neuropsychiatric disorders, some of which are associated to an alteration of amygdalar development. The control of emotions and social behavior is particularly associated to the so-called extended amygdala, which is a cell corridor of the basal telencephalon extending from the centromedial amygdala to the bed nucleus of the stria terminalis (BST), that constitutes the major output station to effector centers of the hypothalamus and brainstem. However, many aspects of the development of the extended amygdala remain elusive, including the embryonic origin of its different neuron subpopulations. The aim of this Thesis has been to investigate the origin of the neurons of the extended amygdala in mouse embryos (E13.5-E16.5) by using in vitro migration assays. The fate mapping results were combined with immunofluorescence for analyzing the phenotype of the neurons that migrated to the amygdala from distinct origins, and were compared with data from immunohistochemistry (to label distinct neuropeptides, proteins or enzymes) and in situ hibridization (to detect the mRNA expression of different transcription factors and other proteins) which helped in the delineation of forebrain embryonic domains and extended amygdala subdivisions. In particular, this Thesis deals with studing the embryonic origin of the neurons of the two major subdivisions (or subcorridors) of the extended amygdala, the medial extended amygdala (Chapter 2) and the central extended amygdala (Chapter 3). Regarding the medial extended amygdala (Chapter 2), this Thesis provides experimental evidence for a multiple embryonic origin of its principal neurons, including those of the medial amygdala and medial BST. In particular, this study provides novel evidence indicating that a major part of the neurons of the medial amygdala and medial BST derives from the caudoventral part of the medial ganglionic eminence (MGEcv, previously called or included as part of the anterior peduncular area), forming a cell subcorridor with similar molecular features (expression of the transcription factor Lhx6 and the protein calbindin). Comparison to other data indicates that neurons along this MGEcv-related cell subcorridor are interconnected and project to the same hypothalamic targets, which are involved in reproductive behavior. This Thesis also provides novel experimental evidence indicating that the ventral pallium produces some neurons for the medial amygdala, which appear to express the transcription factor Lhx9. The results also confirm that some neurons of the medial extended amygdala originate in the preoptic area (our results indicate that these cells specifically originate in its commissural subdivision or POC and correlate to expression of the signaling protein Sonic hedgehog) and the supraopto-paraventricular domain of the hypothalamus (or SPV, which derived neurons express the transcription factors Lhx5 and Otp). Similarly to the neurons derived from MGEcv, it is possible that neurons of the medial extended amygdala derived from other embryonic domains also form distinct cell subcorridors related to specific functions. Regarding the central extended amygdala (Chapter 3), the results of this Thesis show that its major components, including central amygdala and lateral bed nucleus of the stria terminalis (BST), are mosaics formed by different proportions of dorsal lateral ganglionic eminence (LGE)-, ventral LGE- and medial ganglionic eminence (MGE)- derived neurons. Dorsal LGE-derived neurons express the transcription factor Pax6, and primarily populate lateral parts of the central amygdala, but a few also reach the lateral BST. Based on correlation with pre-proenkephalin mRNA and other data, many of these cells are likely enkephalinergic projection neurons. The ventral LGE-derived neurons express the transcription factor Islet1, and primariy populate the central and medial parts of the central amygdala, and part of the lateral BST. Correlation with other studies suggests that these cells represent projection neurons expressing corticotropin-releasing factor. The MGE produces the majority of neurons of lateral BST, but its caudoventral subdivision (MGEcv) also produces an important subpopulation of projection neurons containing somatostatin for medial aspects of the central amygdala. Thus, distinct principal neurons originate in different embryonic domains, but the same domains contribute neurons to most subdivisions of the central extended amygdala, which may explain the similarity in neurochemistry and connections along the corridor. The results, together with other published data, also suggest the existence of at least three subcorridors within the central extended amygdala, each related to a different embryonic origin and involved in the control of a different aspect of fear responses and anxiety. In conclusion, this study provides important data that clarify relevant aspects on the development and adult organization of the extended amygdala, and helps to set up the foundations for a better understanding of neural control of emotions and social behavior in normal and abnormal conditions.

La hipòtesi de treball d'aquesta tesi es que les malalties neurodegenerativespoden considerarse formes accelerades de l'envelliment, selectives per adeterminades localitzacions anatòmiques del teixit nerviós. D'acord a això, aquellsprocessos subjacents a les bases biològiques de l'envelliment (estrès oxidatiu,accumulació de proteïnes agregades, disfunció mitocondrial) i les sevesconseqüències son més intenses i prematures en aquestes poblacions cel.lulars.L'objectiu d'aquest treball es investigar la possible relació entre estrès oxidatiu ide retícle (ER) i les vies de senyalització iniciades per ambdós processos, com amecanisme patogènic en el desenvolupament de les malalties neurodegeneratives, dediferents localitzacions i caracteritzades per la presència d'agregats proteics. Així,hem caracteritzat la modificació oxidativa proteica, els seus causants més importants iles seves conseqüències fisiopatològiques en la forma esporàdica de l'esclerosi lateralamiotròfica (ELA) amb inici lumbar, en la taupatia frontotemporal malaltia de Pick(MdP) i en la malaltia de granuls argirofílics (MGA). Els resultats dels analisis demostres de pacients amb ELA s'han comparat amb els obtinguts en models in vitro dela malaltia.Desprès de la caracterització anatomopatològica exhaustiva, les mostres demèdul.la espinal (ME) i d'escorça frontal (EF) de malalts amb ELA, d'escorça occipital(EO) i EF de malalts amb MdP, i d'hipocamp (HC) de malalts amb MGA, es varenanaltizar en comparació amb mostres d'individus sans amb edats comparables. Laconcentració de marcadors de vies específiques de modificació oxidativa proteica(oxidació directa, glicoxidació i lipoxidació), així com la composició en àcids grasos esva analitzar mitjançant espectrometria de masses combinada amb separaciócromotogràfica. Com a factors reguladors d'oxidació proteica es varen emprar laquantitat de complexes respiratoris mitocondrials, sistemes de defensa antioxidant isistemes proteolíticis, estimats mitjançant western-blot. A més s'establí, emprant lamateixa metodologia, les conseqüències en forma d'ER i de resposta a proteïnesdesplegades (RPD). Així mateix, s'estimà la biogènesi mitcondrial mitjançant anàliside la quantitat de factors reguladors de la mateixa, mitjançant western-blot.Les mostres dels pacients amb ELA mostraren increments en els marcadorsd'oxidació directa, glicoxidació i lipoxidació en ME, i, de forma menys important, enmostres d'EF. Això s'associava a un increment en peroxidizabilitat lipídica, i a unadisminució de respostes neuroprotectores, degut a la disminució en el contingut d'àciddocosahexaenoic, i a alteracions proteasomals i en el contingut de complexesrespiratoris mitocondrials. Es va evidenciar estrés de reticle en ME, però no a l'EF.Així, es va concloure que l'ELA esporàdica duu a increments en lesió oxidativaproteica i a estrés de reticle en ME, mentres que a EF, hi ha menys afectació, bo i noestar indemne.D'altra banda, en mostres de EF, però no en EO de MdP, es varen detectarevidències compatibles amb estrés de reticle, com la RPD, associada a deplecció dexaperones de reticle. Aquestes troballes es relacionen amb un increment en laubiquitinització, compatible amb alteracions en l'activitat proteasomal. En EF, es varentrobar increments en lesió oxidativa directa i lipoxidació, afectant a enzimsantioxidants, amb disminució en la concentració de marcadors de glicoxidació.Sorprenentment, es varen evidenciar increments a la majoria de marcadors de lesióoxidativa en EO, localització morfològicament preservada a la MdP. Els canvispresents en aquesta malaltia s'associaven a canvis en la dotació de complexesrespiratoris mitocondrials, compatibles amb pèrdues de biogenesi mitocondrial i dedefensa antioxidant, combinats amb deplecció de l'àcid docosahexaenoic, consideratun neuroprotector, en EF. En aquest context, el contingut dels factors de transcripciórelacionat amb respostes antioxidants i amb biogènesi mitocondrial, mostrarendisminucions significatives en EF i de forma menys marcada, a EO. En contrast,mentres que a EO es va veure increment d'estrés oxidatiu, les cadenes respiratoriesmitocondrials i la biogenesi no semblaven afectades, de forma conjunta amb unincrement d'àcid docosahexaenoic, suggerint una resposta apropiada a l'estrésoxidatiu.L'anàlisi dels marcadors d'estrés oxidatiu en HC de MGA revelarendisminucions significatives en marcadors de glicoxidació, de manera similar a MdP,troballes compatibles amb un dèficit glicolitic. Aquests defectes glicolítics, s'han descritpreviament en altres malalties neurodegeneratives i podrien associarse amodificacions oxidatives d'enzims glicolítics, també evidenciats aquí. Això suggerreixun paper preferencial d'altres modalitats de lesió oxidativa, com la lipoxidació, comevidencien els increments en concentració de malondialdehid-lisina en aquestamalaltia. La medició dels carbonils proteics va reforçar l'existència d'estrés oxidatiu aHC, atribuible a la disfunció mitocondrial, evidenciada per canvis en complexes i en elnombre de mitocondris. Així mateix, diverses molecules clau en la RPD varen mostrarincrements a les mostres procedents de malalts de MGA, causant increments a lesxaperones de reticul endoplasmàtic. De forma remarcable, a pesar de les troballescompatibles amb la reducció mitocondrial, els factors transcripcionals implicats en laseva biogènesi no s'elevaren, suggerint que un defecte en biogènesi mitocondrialpodria estar implicat a la patogenesi de la MGA.Els resultats descrits a la present memòria de tesi, indiquen la relació entreestrés oxidatiu i de retícul endoplasmàtic, en ELA, MdP i MGA, suggerint la sevarelació recíproca, a travès de disfunció proteolítica, i un paper clau de la funciómitocondrial, o la seva pèrdua, conduint al procès neurodegeneratiu. / La hipótesis a contrastar en esta tesis es que las enfermedadesneurodegenerativas (ENDs) pueden ser una forma acelerada del envejecimiento,selectiva para determinadas localizaciones anatómicas del tejido nervioso.Consiguientemente, aquellos procesos subyacentes en las bases biológicas delenvejecimiento (estrés oxidativo, acumulación de proteínas con alto grado deagregación, disfunción mitocondrial) y sus consecuencias son más intensas yprematuras en estas poblaciones celulares.El objetivo de este trabajo es investigar la posible interrelación entre estrésoxidativo y de retículo (ER) y vías de señalización iniciadas por ambos procesos,como mecanismo patogénico en el desarrollo de ENDs de diferentes localizaciones ycaracterizadas por la presencia de agregados proteicos. Así, hemos caracterizado lamodificación oxidativa proteica, sus causantes más importantes y sus consecuenciasfisiopatológicas en la forma esporádica de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) coninicio lumbar, en la taupatía frontotemporal enfermedad de Pick (EdP) y en laenfermedad de granos argirofílicos (EGA). Los resultados de los análisis de muestras de pacientes con ELA se ha comparado con los obtenidos en modelos in vitro de laenfermedad.Tras caracterización anatomopatógica exhaustiva, las muestras de médulaespinal (ME) y de córtex frontal (CF) de pacientes de ELA; de córtex occipital (CO) yCF de enfermos de EdP, y de hipocampo (HC) de pacientes con EGA, se analizaronen comparación con muestras de individuos sanos con edades comparables. Laconcentración de marcadores de vías específica de modificación oxidativa proteica(oxidación directa, glicoxidación y lipoxidación), así como la composición en ácidosgrasos se analizaron mediante espectrometría de masas combinada concromatografía. Como factores reguladores de oxidación proteica se tomaron lacantidad de complejos respiratorios mitocondriales, sistemas de defensa antioxidantey sistemas proteolíticos, estimados mediante análisis de wester-blot. Además, seestableció mediante la misma metodología, las consecuencias en forma de ER y derespuesta a proteínas desplegadas (RPD). Asimismo, se estimó la biogenésismitocondrial mediante análisis de la cantidad de factores reguladores de la misma,mediante western-blot.Las muestras con ELA mostraron incrementos en los marcadores de oxidacióndirecta, glicoxidación y lipoxidación en ME, y, de forma menor cuantitativamente, enmuestras de CF. Ello se asoció a un incremento en la peroxidizabilidad lipídica, y auna disminución de respuestas neuroprotectoras debido a la disminución en el contenido de ácido docosahexaenoico y a alteraciones del proteasoma y en elcontenido de complejos respiratorios mitocondriales. Se evidenció estrés de retículoen ME, pero no en CF. Consiguientemente, se concluyó que la ELA esporádicaconlleva incremento en lesión oxidativa proteica y a estrés de retículo en médulaespinal, mientras que el CF, muestra menor afectación, pero no esta indemne.Por otro lado, en muestras de CF, pero no en CO de EdP, se detectaronevidencias de estrés de retículo, como RPD, asociadas a pérdida de chaperonas deretículo. Estos hallazgos se relacionan con un incremento en la ubiquitinizacióncompatible con alteraciones en la actividad proteasomal. En esta localización (CF), sehallaron incrementos en lesión oxidativa directa y lipoxidación, dirigidas a enzimasantioxidantes, con disminución en la concentración de marcadores de glicoxidación.Sorprendentemente, se demostraron incrementos en la mayoría de marcadores delesión oxidativa en CO, localización morfológicamente preservada en EdP. Loscambios presentes en esta enfermedad se asociaron a cambios en la dotación decomplejos respiratorios mitocondriales, compatibles con pérdida de biogénesismitocondrial y de defensa antioxiante, combinados con depleción del ácidodocosahexaenoico, considerado como neuroprotector, en CF. En este contexto, elcontenido de los factores de transcripción relacionados con respuestas antioxidantesy con biogénesis mitocondrial, mostraron cambios significativos en CF y menosmarcados en CO. En contraste, mientras que en CO se observó incremento en lesiónoxidativo en EdP, las cadenas respiratorias mitocondriales y la biogénesis podríanestar preservadas, de forma conjunta con un incremento de ácido docosahexaenoico,sugiriendo una respuesta apropiada al estrés oxidativo.El análisis de los marcadores de estrés oxidativo en HC de EGA revelarondisminuciones significativas en marcadores de glicoxidación, de modo similar a EdP,hallazgos compatibles con un déficit de glicolisis en esta situación. Estos defectos sehan descrito previamente en otras ENDs y pueden asociarse a modificacionesoxidativas de enzimas glicolíticos, tambien evidenciados aquí. Ello sugiere un papelpreferencial de otros modos de lesión oxidativa, como la lipoxidación, como evidencian los incrementos en concentración de malondialdehido-lisina en estaenfermedad. La medición, mediante western-blot, de los carbonilos proteicos reactivosreforzó la existencia de estrés oxidativo en HC, atribuible a la disfunción mitocondrialevidenciable por cambios en la función respiratoria y en su número. Asimismo,diversas moléculas clave en la RPD mostraron incrementos en las muestrasprocedentes de enfermos, causando incrementos en chaperonas de retículoendoplasmatico. De forma remarcable, a pesar del número reducido de mitocondrias,los factores transcripcionales implicados en su biogénesis no se elevaron, sugiriendo que un defecto en biogénesis mitocondrial puede estar implicado en la patogénesis deEGA.Los resultados descritos en esta memoria de tesis indican la interrelación entreestrés oxidativo y de retículo endoplasmatico, en ELA, EdP y EGA sugiriendo surelación recíproca a través de disfunción proteolítica, y un papel clave de la funciónmitocondrial, conduciendo al proceso neurodegenerativo. / It is hypothesized that the neurodegenerative diseases (NDDs) could be anaccelerated form of aging selective for nervous tissue in specific anatomic locations.Accordingly, the processes observed in the biological basis of aging (oxidative stress,accumulation of highly modified protein aggregates, mitochondrial dysfunction) and theensuing processes that it triggers are more intense and premature in these cellpopulations.The aim of this work was to investigate the potential interplay betweenoxidative and endoplasmic reticulum (ER) stress and the underling signallingpathways, as a potential mechanism involved in the pathogenesis of theneurodegenerative disorders affecting different locations, and characterized by proteinaggregates. We characterized protein oxidative damage, its major contributors and itspathophysiological consequences in the sporadic form of amyotrophic lateral sclerosis(ALS) patients with lumbar onset disease, in the frontotemporal tauopathy Pick'sdisease (PiD) and in the argyrophilic grain disease (AGD) patients. The results of ALSsamples were compared with in vitro models of the disease.After extensive pathological characterization, samples from spinal cords (SC)and frontal cortex (FC) from ALS patients, FC and occipital cortex (OC) from PiDpatients, and hippocampus (HC) from AGD patients were analyzed in comparison withage-matched control samples. The concentration of markers for specific pathways ofprotein oxidative damage (direct oxidation, glycoxidation and lipoxidation) and fattyacid composition were assessed by mass spectrometry. Contributors to proteinoxidation (mitochondrial respiratory complexes, antioxidant defence and proteolysis)and its consequences (endoplasmic reticulum stress and/or unfolded protein response(UPR)) were evaluated by western-blot of specific markers. Furthermore, themitochondrial biogenesis system was assessed by measuring by western blot thelevels of key factors.ALS was associated to increased direct oxidative, glycoxidative and lipoxidativedamage in SC and, to a lower extent, in FC samples. This was associated to increasedlipid peroxidizability, and to impaired neuroprotective responses because of decreaseddocosahexaenoic content as well as alterations of the mitochondrial respiratorycomplexes and proteasomal impairment. Endoplasmic reticulum stress was evidencedin SC, but not in FC. Therefore, it could be concluded that sporadic ALS leads toincreased oxidative damage in proteins and to ER stress in SC, while FC is lessaffected, but not preserved.In samples from FC, but not in OC of PiD, there were evidences of ER stresssuch as activated UPR, associated to specific depletion in ER chaperones. Thosefindings are related to increased ubiquitination compatible with alteration in ubiquitinproteasomesystem. In the same location, evidences for increased direct oxidative andlipoxidative damages targeting antioxidant enzymes were found, with decreasedamount of glycoxidation markers. Strinkingly, increases in most of the examinedparameters of oxidative stress in morphologically preserved OC of PiD patients weredetected as well. The changes registered in PiD could be associated with disturbancesin mitochondrial respiratory complexes compatible with diminished mitochondrialbiogenesis and lack of antioxidant defence, combined with depletion in the contents ofthe neuroprotective docosahexaenoic acid observed in FC. In this line, the content ofthe transcription factors related to antioxidant responses and mitochondrial biogenesisshowed significant changes in FC but less marked in OC. In contrast, while OCshowed increased oxidative damage, mitochondrial respiratory chain and biogenesiswere preserved, a finding associated to increased docosahexaenoic content,suggesting an appropriate response to the generated increase in oxidative stress.Analysis of various oxidative stress biomarkers in HC of AGD revealedsignificantly decreased levels of the markers of glycoxidation, similarly to PiD, which iscompatible with defects in glycolytic potential in this location. Those defects have beenpreviously reported in other NDDs and may be associated to oxidative modifications ofglycolytic enzymes also evidenced here. There were no changes in the concentrationsof direct protein oxidation markers. This suggests a preferential role of other forms ofoxidative damage, such as lipoxidation, as evidenced by increased malondialdehydelysinelevels in this disease. Western blot measurements also revealed increasedprotein reactive carbonyl groups further supporting elevated oxidative damage in HCof AGD samples, which can be attributed to the mitochondrial dysfunction evidencedby disturbance in the respiratory chain function and reduced mitochondria number.Furthermore, the key molecules critically involved in UPR were found activated, whichcaused elevation in ER chaperones. Most importantly, despite the reduced number ofmitochondria, transcription factors for their biogenesis were not increased, suggestingthat impaired mitochondria biogenesis may be implicated in AGD pathogenesis.The described results indicate the implication of oxidative and endoplasmicreticulum stress in sporadic ALS, PiD and AGD suggesting a possible interplaybetween them through proteolysis dysfunction, with a predominant role ofmitochondrial impairment leading to the neurodegenerative process.

Introducció: La Malaltia d’Alzheimer (AD), és la malaltia neurodegenerativa amb més incidència actualment. La hipòtesi més acceptada sobre l’origen de la malaltia és la “hipòtesi amiloide”, en la que el cúmul de pèptid beta amiloide (Aβ) a l’espai extracel•lular a cervell du a la formació d’oligòmers solubles, fibril•les i plaques provocant una disfunció sinàptica i neuronal i, conseqüentment, dèficits cognitius. Tots aquests esdeveniments van acompanyats de neuroinflamació i de la formació de cabdells neurofibril•lars. Diversos són els models animals utilitzats per a l’estudi l’AD, dintre dels quals hi trobem els gossos de companyia envellits s’ha descrit la Síndrome de Disfunció Cognitiva (CDS). Els gossos amb la CDS es caracteritzen per presentar per alteracions a nivell cognitiu, anatòmic i histopatològic similars les descrites anteriorment i comparables a les observades en els estadis inicials de l’AD. Totes aquestes convergències, fan que el gos amb la CDS sigui considerat un bon model natural d’envelliment humà i dels estadis més inicials de l’AD i que pugui ser de gran utilitat en estudis de tractaments dirigits l’AD. Dintre dels tractaments dirigits a la prevenció de la formació i/o eliminació d’amiloide hi trobem les immunoteràpies anti-amiloide actives. Aquestes, mitjançant l’administració d’un fragment d’Aβ sintètic combinat amb diversos adjuvants i proteïnes transportadores, indueix l’eliminació d’amiloide de Sistema Nerviós Central cap a la perifèria mitjançant diversos mecanismes. Des de l’estudi fet l’any 2000 amb la immunoteràpia (AN1792), dissenyada a partir de l’Aβ42 i QS21 com a adjuvant, que va provocar un 6% de casos de meningoencefalitis en els pacients inclosos a l’estudi, diversos han estat els esforços per dissenyar vacunes eficaces i que evitin els efectes secundaris no desitjats. Objectiu general: En aquest treball es planteja si l’administració d’una immunoteràpia dissenyada a partir d’un adjuvant que indueix respostes de tipus Th2 o anti-inflamatòria juntament amb un fragment C-terminal del pèptid Aβ fibril•lar indueix una millora cognitiva en gossos amb CDS, evitant els efectes nocius observats en immunoteràpies ja testades en humans. / Development of an anti-amyloid therapy for Alzheimer Disease in dogs with Cognitive Dysfunction Introduction: Alzheimer’s Disease (AD) is a neurodegenerative disease where the cognitive deficits are due to the accumulation of the different forms of amyloid beta peptide (Aβ) (oligomers, fibrils and plaques). They also induce neuroinflamation and the formation of the neurofibrillary tangles. Aged dogs with Cognitive Dysfunction Syndrome (CDS) also present cognitive deficits associated to the accumulation of the different forms of Aβ into the brain. Because of the similarities with AD, dogs with CDS are considered a good model for the study of aging human and the first stages of AD. Active anti-amyloid immunotherapy is one of the strategies proposed with the aim to ameliorate the cognitive deficits through the clearance of the amyloid burden from the central nervous system to the periphery. After the harmful side effects due to the administration of the immunotherapy AN1792 in the 21st century, studies with different anti-amyloid immunotherapies have been performed with the aim to prevent and/or ameliorate AD and avoiding the side affects. Objective: This work considers the development of an immunotherapy designed with a Th2 adjuvant and C-terminal fragments of the fibrillar Aβ to induce a cognitive improvement in CDS dogs avoiding the side effects of the immunotherapies tested in humans. Results: The immunization study was performed after the selection of the V5 vaccine designed using the mixture of the Aβ1-40 + KLH-Aβy-40 fragments and the Aluminium Hydroxide (Alum®) as the adjuvant. V5 vaccine was administrated during a fifty days period to CDS dogs (n=12) and housed adult beagle dogs (n=9). Changes in cognitive deficits, in biochemistry and haematologist biomarkers were observed during the follow-up period. With the aim to observe the changes in neuroinflamation responses, a comparative study between brain samples form unimmunized and immunized dogs was performed as well. Increases in the Aβplasma/ AβLCR ratio associated to the reduction of the neuroinflamation responses could diminish the neuronal damage leading to a cognitive improvement without side effects in CDS dogs.

La malaltia hepàtica per dipòsit de greix (MHDG) constitueix la manifestació hepàtica de la síndrome metabòlica. La seva incidència augmenta en les societats occidentals paral•lelament a la de l'obesitat. El dipòsit de greix intrahepàtic pot conduir al desenvolupament de dany hepatocitari, inflamació, fibrosi i cirrosi, però no es coneixen els mecanismes que promouen la progressió de la malaltia. No existeix un tractament farmacològic eficaç per a aquesta malaltia. La resistència a la insulina, el fet fisiopatològic subjacent a la síndrome metabòlica, condueix al desenvolupament de disfunció endotelial perifèrica. No obstant això, l'endoteli sinusoidal hepàtic és fenotípicament diferent al perifèric, i es desconeix si la resistència a la insulina genera disfunció endotelial en la circulació hepàtica. L'adequada funció de l'endoteli sinusoïdal és necessària per al manteniment d'un ambient antiinflamatori, antifibrogènic i antitrombòtic en el fetge. En aquest estudi hipotetitzem que a la MHDG, associada a resistència a la insulina, existeix disfunció endotelial sinusoïdal que contribueix a la progressió del dany hepàtic. Els objectius d'estudi van ser determinar en un model animal de EHDG si aquesta s'associa amb disfunció endotelial del sinusoïdal, els possibles mecanismes implicats, incloent la seva relació amb la resistència a la insulina, i si aquesta contribueix al desenvolupament de lesió hepàtica. Per respondre a aquestes preguntes es van caracteritzar les respostes vasculars de la circulació hepàtica mitjançant perfusió aïllada de fetge, i es van estudiar els mecanismes que determinen la biodisponibilitat de NO mitjançant tècniques moleculars en fetge complet. Es van estudiar, a més els efectes de la correcció de la insulino resistència sobre aquestes alteracions. En el primer estudi, després d'administrar a rates durant 3 dies una dieta rica en greix, aquestes van presentar esteatosi en absència d'inflamació. Això es va acompanyar d'un increment del contingut intrahepàtic de triglicèrids i àcids grassos lliures. Les rates amb fetges esteatòsics van presentar resistència vascular a la insulina i, més concretament, resistència a la insulina a nivell del endoteli sinusoidal hepàtic. Això es va acompanyar d'una menor capacitat de la insulina per fosforilar eNOS. Aquestes alteracions es van deure, si més no en part, per la regulació a l'alça de iNOS. El pre-tractament amb un fàrmac sensibilitzador de la insulina va atenuar la l'acumulació intrahepàtic de triglicèrids i àcids grassos lliures, va prevenir el desenvolupament de resistència a la insulina a nivell i va restaurar la capacitat de la insulina per fosforilar eNOS en rates alimentades durant 3 dies amb una dieta rica en greix. En el segon estudi, vam demostrar que l'administració durant un mes d'una dieta rica en greix provoca esteatosi en absència d'inflamació i fibrosi. Això es va acompanyar d'alteracions inclosa en la síndrome metabòlica, com l'obesitat, hipertrigliceridèmia, hiperglucèmia, hiperinsulinèmia i hipertensió arterial. Aquestes rates van presentar un augment de la pressió portal de perfusió, a causa de canvis funcionals, així com disfunció endotelial sinusoïdal. A nivell molecular això es va traduir en un una menor fosforilació de Akt i eNOS en els fetges de rates alimentades amb una dieta rica en greix. Aquests canvis funcionals es van produir en absència de canvis fenotípics en les cèl•lules endotelials sinusoïdals. Concloem d'aquest segon estudi que els resultats obtinguts en aquest estudi reforçarien la idea de considerar la disfunció endotelial hepàtica com un esdeveniment precoç que podria constituir una diana terapèutica per tractar aquesta malaltia. / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the hepatic manifestation of the metabolic syndrome. NAFLD incidence is increasing in western societies, paralleling the increase of obesity. The deposit of fat in the hepatocytes leads in some patients to the development of hepatocyte injury, inflammation, fibrosis and cirrhosis, but the mechanisms that govern the progression of liver injury are not well understood. There is not an effective pharmacological treatment for NAFLD. Insulin-resistance, the underlying pathophysiological feature of the metabolic syndrome, is associated with peripheral endothelial dysfunction. However, the sinusoidal endothelium is phenotypically different from the peripheral endothelium, and it is not known whether insulin resistance induces sinusoidal endothelial dysfunction. An adequate sinusoidal endothelial function is required to maintain an anti-inflammatory, antifibrogenic and antithrombotic environment in the liver. We hypothesize in this project that in NAFLD, which is associated with insulin-resistance, there is sinusoidal endothelial dysfunction, and that this is relevant to the development of liver injury. In the first study, we have demonstrated that after 3-days high fat feeding, rats developed steatosis without the presence of inflammation. Insulin resistance was present at the liver vasculature, and specifically, at the liver sinusoidal endothelium. This was accompanied by a reduction of the ability of insulin to phosphorylate eNOS. The conclusions of this first study were that vascular insulin resistance precedes inflammation, and can contribute to the progression of the disease. In the second study we demonstrate that rats fed for one month with a high fat diet presented steatosis without fibrosis or inflammation. This was accompanied by alterations resembling metabolic syndrome, endothelial dysfunction and a decreased liver eNOS and Akt phosphorylation. This was due to functional alterations (and no structural) at the sinusoidal endothelial cells, without phenotypical changes occurring at this level. We concluded that endothelial dysfunction is a primary event that precedes inflammation in a model of NAFLD, and might constitute a useful target for devising new therapies for this disease.

L'objectiu principal de la investigació va ser estudiar els efectes ocasionats per un hàbit de respiració oral en les diferents estructures orofacials i analitzar la relació entre respiració oral i deglució atípica. Per a això, es van definir les estructures que poden sofrir alteració per la inspiració oral i que són objecte d'estudi. La selecció de la mostra es va realitzar a partir de la revisió de 762 històries clíniques dels pacients que van iniciar tractament en el Servei de Logopèdia de l'Hospital de Nens de Barcelona. Es van descartar 389 nens que no s'ajustaven als nostres criteris de selecció, quedant 373 per a la realització de la investigació (309 amb respiració oral i 64 amb respiració nasal). Es va utilitzar per a la recollida de dades un protocol d'evolució i un protocol de trastorns miofuncionals. L'anàlisi dels resultats es va realitzar a través d'una metodologia correlacional que ens va permetre comptabilitzar les diferències estructurals i funcionals entre els nens amb respiració oral i nasal. Es van obtenir estadístics Chi-quadrat i V de Cramer a partir de taules de contingències. Els resultats obtinguts mostren diferències significatives en la majoria de les estructures orofacials entre els respiradores orals i nasals. I reflecteixen relació entre respiració oral i deglució atípica. / El objetivo principal de la investigación fue estudiar los efectos ocasionados por un hábito de respiración oral en las diferentes estructuras orofaciales y analizar la relación entre respiración oral y deglución atípica.Para ello, se definieron las estructuras que pueden sufrir alteración por la inspiración oral y que son objeto de estudio.La selección de la muestra se realizó a partir de la revisión de 762 historias clínicas de los pacientes que iniciaron tratamiento en el Servicio de Logopedia del Hospital de Nens de Barcelona.Se descartaron 389 niños que no se ajustaban a nuestros criterios de selección, quedando 373 para la realización de la investigación (309 con respiración oral y 64 con respiración nasal).Se utilizó para la recogida de datos un protocolo de evolución y un protocolo de trastornos miofuncionales.El análisis de los resultados se realizó a través de una metodología correlacional que nos permitió contabilizar las diferencias estructurales y funcionales entre los niños con respiración oral y nasal. Se obtuvieron estadísticos Chi-cuadrado y V de Cramer a partir de tablas de contingencias.Los resultados obtenidos muestran diferencias significativas en la mayoría de las estructuras orofaciales entre los respiradores orales y nasales. Y reflejan relación entre respiración oral y deglución atípica. / The main objective of the research was to study the effects caused by a habit of oral respiration on different orofacial structures and analyze the relationship between oral respiration and atypical swallowing. Thereby, there were defined structures that may suffer alteration by the oral inspiration and which are under consideration. The sample selection was made after reviewing medical history of 762 patients who started treatment within the Logopedia Service at "Hospital de Nens" in Barcelona. It ruled that 389 children did not meet our criteria for selection, leaving 373 for conducting the research (309 to 64 with oral respiration and nasal respiration). A development protocol and a miofunctional disorder protocol were both used for data collection.The analysis of the results was conducted through a correlational methodology that allowed us to account for structural and functional differences between children with oral and nasal respiration. We obtained Chi-square statistical and V of Cramer from contingency tables. The results show significant differences in most orofacial structures between oral and nasal respirators. And they reflect a relationship between oral respiration and atypical swallowing.