MELO, Priscila Bezerra dos Santos. Indução à embriogênese somática e identificação de marcadores ISSR em antúrio. 2016. 98 f. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-09T18:32:24Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_pbsmelo.pdf: 1915586 bytes, checksum: ca8ba64498bc085612866056110e7aef (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-11T17:14:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_pbsmelo.pdf: 1915586 bytes, checksum: ca8ba64498bc085612866056110e7aef (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-11T17:14:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_pbsmelo.pdf: 1915586 bytes, checksum: ca8ba64498bc085612866056110e7aef (MD5) Previous issue date: 2016 / Anthurium is an important ornamental species for floriculture's agribusiness. Thus, it is very important to ensure the success of its cultivation. The use of biotechnology allows the development of effective techniques for in vitro propagation. One of these techniques is the somatic embryogenesis. However, beyond these efforts, another technique that can effectively contribute to the success of Anthurium cultivation, is the characterization of anthurium's cultivars, by means of molecular markers. Therefore, the study was divided into two experiments. Experiment 1: The objective was to establish an induction protocol for somatic embryogenesis for the anthurium's cultivars Jureia and Luau, using nodal segments as explants. It was studied the effect of the interaction among the factors cultivar, growth regulator type and concentration on oxidation (%) and formation of embryogenic calli (%). The scanning electron microscopy (SEM) was used to identify whether the structures formed from the explants showed embryogenic characteristics. The evaluations about oxidation showed that Jureia is the most sensitive cultivar, and that the medium added with NAA is more prone to oxidation. As for the formation of embryogenic calli, it was found that Luau has more embryogenic potential and it was established the following protocol for induction of somatic embryogenesis for the two studied cultivars: nodal segments must be maintained for 75 days, in the dark, in the medium ESA (Pierik 1976 modified) supplemented with 7.5 mM of NAA. Experiment 2: The objective was the selection of ISSR markers for molecular characterization of anthurium's cultivars Sublime, Luau, Jureia and Maré, using leaf samples of in vitro established plants, from indirect organogenesis, and samples of embryogenic calli. The DNA extraction was made, showing a genetic material of good quality. The PCR of the 18 ISSR markers was made and the reaction products were visualized by electrophoresis. The revealed fragments in the agarose gel were transformed into binary data [1- presence of band; 0 - absence of band], allowing the classification of the samples in terms of genetic distance in a dendrogram. It was found that all the ISSR used showed polymorphism, being effective to characterization of the anthurium's samples studied. Cultivar-specific markers were identified. It was found that Sublime is the cultivar genetically most stable and Maré the most unstable. These results provide new perspectives for the in vitro propagation, and are useful for breeding and protection of the studied anthurium's cultivars. / O antúrio é uma importante espécie ornamental para o agronegócio da floricultura. Assim, é importante garantir o sucesso de seu cultivo. O uso da biotecnologia permite o desenvolvimento de técnicas eficientes de propagação in vitro. Uma dessas técnicas é a embriogênese somática. Porém, além destes esforços, uma das técnicas que pode contribuir efetivamente para o sucesso do cultivo do antúrio é a caracterização das cultivares da espécie, por meio de marcadores moleculares. Assim, o estudo foi dividido em dois experimentos. Experimento 1: Objetivou-se estabelecer um protocolo de indução à embriogênese somática para as cultivares de antúrio Jureia e Luau, utilizando como explantes segmentos nodais. Estudou-se o efeito da interação entre os fatores cultivar, tipo e concentração do regulador de crescimento sobre a oxidação (%) e formação de calos embriogênicos (%). Utilizou-se microscopia eletrônica de varredura (MEV) para identificar se as estruturas formadas a partir dos explantes apresentavam características embriogênicas. Constatou-se que a cultivar Jureia é mais sensível e o meio adicionado de ANA mais propenso à oxidação. Quanto à formação de calos embriogênicos, constatou-se que a cultivar Luau tem maior potencial embriogênico e estabeleceu-se o seguinte protocolo de indução à embriogênese somática, para as duas cultivares estudadas: segmentos nodais devem permanecer 75 dias, no escuro, em meio ESA (Pierik 1976, modificado) suplementado com 7,5 μM de ANA. Experimento 2: Objetivou-se a seleção de marcadores ISSR para caracterização molecular das cultivares de antúrio Sublime, Luau, Jureia e Maré, a partir de amostras de folhas oriundas de plantas estabelecidas in vitro, obtidas de organogênese indireta, e de amostras de calos embriogênicos. Foi realizada a extração de DNA das amostras coletadas, revelando DNA de boa qualidade. Foi feita a PCR de18 marcadores ISSR e os produtos da reação foram visualizados por eletroforese. Os fragmentos revelados no gel de agarose foram transformados em dados binários [1– presença de banda; 0 – ausência de banda], possibilitando agrupar as amostras em termos de distância genética em um dendrograma. Constatou-se que os marcadores ISSR utilizados apresentaram polimorfismo, sendo eficientes para caracterizar as amostras de antúrio estudadas. Foram identificados marcadores cultivar-específicos. Sublime revelou-se como a cultivar geneticamente mais estável, e Maré, como a mais instável. Estes resultados proporcionam novas perspectivas para a propagação in vitro, bem como são úteis para o melhoramento genético e proteção da identidade genética das cultivares de antúrio estudadas.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-15T11:32:31Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3004941 bytes, checksum: 89b867d49d37280ee8347b0689e68d9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T11:32:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3004941 bytes, checksum: 89b867d49d37280ee8347b0689e68d9f (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A presença de variabilidade genética entre as cultivares de soja é fator determinante para o sucesso de programas de melhoramento da cultura. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética entre genótipos de soja, estabelecer coleções nucleares e definir estratégias para extração de coleções de melhoramento para teores de óleo e de proteína. A caracterização dos acessos ocorreu por meio de 21 caracteres morfoagronômicos avaliados em experimentos conduzidos em dois locais, utilizando o delineamento de blocos aumentados (DBA). A estimação da diversidade foi realizada por meio do método de agrupamento UPGMA utilizando como medida de dissimilaridade a distância Euclidiana média. No estabelecimento das coleções nucleares utilizou-se inicialmente a estratégia que definiu um número de indivíduos que representasse a média e a variância de todas as características quantitativas, calculada na população original de cada local. A formação dessas coleções aconteceu mediante alocação de acessos tomados ao acaso do conjunto de genótipos analisados. Foram avaliados os impactos das coleções nucleares na manutenção da média e variância original. A estruturação de coleções de melhoramento foi realizada seguindo a estratégia de estratificação dos acessos em relação ao ciclo total e seleção destes, dentro de cada estrato de ciclo, com alta média para cada caractere em questão e divergentes. As análises estatísticas foram realizadas por meio do Programa Computacional GENES. Foi possível verificar variância genética significativa, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F para a maioria dos caracteres quantitativos avaliados no local 1. No local 2 sete dos caracteres apresentaram diferença significativa. Na matriz de dissimilaridade para os dados quantitativos, a distância Euclidiana entre os acessos variou de 0,3753 a 3,2529 no local 1, e de 0,3679 a 3,4008 no local 2. No local 1 os pares de acessos mais divergentes e mais similares foram o BAGSUFV106/BAGSUFV36 (dii’= 3,2529) e BAGSUFV157/BAGSUFV159 (dii’= 0,3753) respectivamente. No local 2 o par BAGSUFV48/BAGSUFV16 (dii’= 3,4008) foram os mais dissimilares e BAGSUFV59/BAGSUFV16 (dii’= 0,4211) os mais similares. Para o conjunto de caracteres qualitativos, os pares de acessos mais divergentes e similares foram os BAGSUFV38/BAGSUFV75 (dii’= 298,0604) e BAGSUFV2/BAGSUFV22 (dii’= 7,9876), respectivamente. O método de agrupamento UPGMA proporcionou a formação de 57 grupos, sendo trinta destes, composto por apenas um acesso. O número de acessos determinado para compor a coleção nuclear de cada local foi de 80 genótipos. Destes 80, a porcentagem de acessos comuns aos dois ambientes foi de apenas 48,75%. A coleção nuclear do local 1 não foi capaz de representar a variância original somente para o caráter número de hastes laterais. No local 2 a manutenção das variâncias originais não verificada para os caracteres diâmetro do hipocótilo, número hastes laterais e anglo de acamamento. Para as características qualitativas as classes formato do folíolo lanceolado estreito e hábito de crescimento prostrado foram as únicas não representadas pela coleção nuclear do ensaio 1 e 2, respectivamente. Na estruturação da coleção de melhoramento houve uma tendência, no local 1, da alocação de genótipos com maiores teores de óleo e proteína no grupo de ciclo tardio. Já no local 2 esta tendência ocorreu para os genótipos pertencentes ao grupo de ciclo médio. Analisando cada ciclo de maturação verificou-se que o genótipo BAGSUFV23, para o caractere teor de óleo, foi coincidente em ambos os locais. O mesmo ocorreu para os genótipos BAGSUFV17 e BAGSUFV15, em relação ao teor de proteína. Para o ciclo médio o genótipo comum para teor de óleo foi o BAGSUFV50 e para proteína o BAGSUFV82. No grupo do ciclo tardio foi verificado o maior número de genótipos coincidentes para o teor de óleo, sendo eles: BAGSUFV131, BAGSUFV115, BAGSUFV33 e BAGSUFV53. Neste grupo não houve acessos comuns para o caractere teor de proteína. Conclui-se que existe diversidade genética entre os acessos de soja avaliados, foi possível obter coleções nucleares para cada local e, a estratégia adotada se mostrou eficientes na estruturação das coleções de melhoramento. / The presence of genetic variability among soybean cultivars is a decisive factor for the success of crop improvement programs. The objective of this study was to evaluate the genetic diversity among soybean genotypes, establish nuclear collections and define strategies to extract improvement collections for oil and protein content. The characterization of the accessions occurred through 21 morphoagronomic characters evaluated in experiments conducted in two locations, using the augmented block design (DBA). The estimation of diversity was performed using the UPGMA grouping method, using as measure of the dissimilarity the average Euclidean distance. In the establishment of core collections was used initially the strategy that has defined a number of individuals who represent the mean and the variance of all quantitative characteristics, calculated on the original population of each location. The formation of these collections happened through the allocation of acesses taken at random from the set of analyzed genotypes. It was evaluated the impacts of nuclear collections in maintaining of the mean and original variance. The structure of the improvement collections was carried out following the strategy of the stratification of the acesses in relation to the total cycle and selection of these, within each stratum of the cycle, with a high average for each trait in question and divergent. The statistical analyzes were performed using the Genes Computational Program. It was possible to verify significant genetic variance at 5% probability by the F test for most quantitative traits evaluated at the location 1. On site 2, seven of the characters showed significant difference. In dissimilarity matrix for quantitative data, the Euclidean distance between accessions ranged from 0,3753 to 3,2529 on site 1, and from 0,3679 to 3,4008 on site 2. In the site 1 the pairs of the acesses more divergent and more similar were BAGSUFV106 / BAGSUFV36 (dii'= 3,2529) and BAGSUFV157 / BAGSUFV159 (dii'= 0,3753), respectively. In the site 2, the pair BAGSUFV48 / BAGSUFV16 (dii'= 3,4008) were the most dissimilar and BAGSUFV59 / BAGSUFV16 (dii' = 0,4211) the most similar. For the set of the qualitative characters, the pairs of the acesses more divergent and similars were BAGSUFV38 / BAGSUFV75 (dii'= 298,0604) and BAGSUFV2/BAGSUFV22 (dii'= 7,9876), respectively. The UPGMA grouping method provided the formation of 57 groups, where thirty of these,being composed of just one access. The number of acesses determined to compose the core collection of each site was 80 genotypes. From these 80, the percentage of common accesses to both environments was only 48,75%. The nuclear collection of the site 1 was not able to represent the original variance only to the character number of lateral rods. In the site 2 the maintenance of the original variances was not checked for the characters of hypocotyl diameter, number of side rods and angle of lodging. For the qualitative characteristics, the classes leaflet format narrow lanceolate and prostrate growth habit were the only ones that was not represented by the core collection of test 1 and 2, respectively. In structuring the collection of the improvement there was a trend, in place 1, of the allocation of genotypes with higher levels of oil and protein in the group of late cycle. Already in site 2, this trend occurred for genotypes belonging to the average cycle group. Analyzing each maturation cycle it was found that the BAGSUFV23 genotype, to the oil content character, was similar in the both locations. The same was true for BAGSUFV17 and BAGSUFV15 genotypes in relation to the protein content. For the mean cycle, the common genotype for oil content was BAGSUFV50 and to the protein the BAGSUFV82 genotype. In the group of the late cycle it was found the largest number of matching genotypes to the oil content, as follows: BAGSUFV131, BAGSUFV115, BAGSUFV33 and BAGSUFV53. In this group there was not common access to the protein content character. It is concluded that there is genetic diversity among the accessions evaluated of soybean, it was possible to obtain nuclear collections for each site and, the strategy adopted proved effective in the structuring of improving collections.

Dyckia distachya Hassler é uma espécie rara, endêmica e exclusiva de ambientes reofíticos. Originalmente, essa bromélia ocorria em ilhas e margens rochosas da bacia do rio Uruguai, possuindo distribuição disjunta ao longo de 617 km, nos rios Pelotas e Uruguai, na divisa dos estados do Rio Grande do Sul e de Santa Catarina. Entretanto, devido ao aproveitamento do potencial hidrelétrico dessa bacia hidrográfica, sete das oito populações de D. distachya foram extintas, sendo conhecida atualmente apenas uma população na natureza. Visando a preservação dessa espécie, indivíduos foram coletados durante a construção das hidrelétricas e mantidos em coleções ex situ. Posteriormente, parte desses indivíduos resgatados foi introduzida em locais semelhantes aos de sua ocorrência natural. Neste contexto, este estudo foi realizado com o objetivo de avaliar o sucesso reprodutivo e aspectos genéticos da única população natural e de populações introduzidas, para obter informações que auxiliem na elaboração de estratégias de conservação para essa espécie. No Capítulo II é apresentado o estudo do sucesso reprodutivo da única população natural conhecida e de quatro populações introduzidas de D. distachya. Também foram avaliados a produção média de flores, frutos e sementes; o número médio de indivíduos reprodutivos e vegetativos; a germinação das sementes e a viabilidade do pólen; o tamanho médio dos genets e o número médio de ramets por genet. Os resultados mostraram diferenças significativas entre as populações introduzidas e a natural para todas as variáveis analisadas, sendo observado maior investimento em reprodução sexual nas populações introduzidas e maior investimento em propagação clonal na população natural. A produção média de flores, frutos e sementes foi superior nas populações introduzidas (34,1; 37,5; 87; respectivamente) quando comparadas com a população natural (2,7; 5,9; 31; respectivamente). A viabilidade do pólen também foi superior nas populações introduzidas (92 %) em relação a natural (47,9 %). Entretanto, o número médio de ramets por genet e o tamanho médio dos genets foi superior na população natural (297,6 e 2,172 m², respectivamente) quando comparado com a média das populações introduzidas (5,9 e 0,122 m², respectivamente). A introdução dessa bromélia deve ser levada em consideração em programas de conservação, visto que as populações introduzidas estudadas parecem estar conseguindo se estabelecer em seu novo habitat, tendo sido observado inclusive o recrutamento de novos indivíduos através de sementes. No Capítulo III foram investigados a diversidade genética, o sistema de cruzamento e o fluxo de pólen da espécie em estudo, nas quatro populações introduzidas e na natural, utilizando marcadores moleculares microssatélites. Para as cinco populações, foram coletadas amostras de 130 indivíduos reprodutivos, das quais 50 foram utilizadas como plantas-mãe, provendo 700 plântulas. As populações introduzidas apresentaram altos níveis de diversidade genética ( O = 0,466) comparadas com a natural ( O = 0,167). A estimativa da taxa de fecundação cruzada nas populações introduzidas não diferiu de um ( m = 0,965), indicando que D. distachya é uma bromélia alógama. Porém, na população natural, esse valor foi diferente ( m = 0,520), sugerindo a ocorrência de algum tipo de perturbação nesse ambiente. O fluxo de pólen é mais restrito na população natural ( FT = 0,296) do que nas introduzidas ( FT = 0,089). A dispersão de pólen ocorre a curtas distâncias, parecendo ser influenciada pela combinação da densidade e da distribuição espacial dos indivíduos reprodutivos. Baseado nestes resultados, sugerimos que os índices de diversidade genética e fluxo de pólen sejam monitorados em longo prazo, na tentativa de evitar a redução da diversidade genética, a seleção local e a deriva genética. Além disso, recomendamos a criação de novas áreas de introdução, intermediárias as existentes, promovendo a formação de metapopulações. Um estudo mais aprofundado na população natural também deve ser realizado para saber o que realmente está ocorrendo naquele ambiente para serem tomadas medidas efetivas de conservação. / Dyckia distachya Hassler is a rare, endemic and exclusive species of rheophytic environments. Originally, this bromeliad occurred on islands and rocky shores of the Uruguay River basin, having disjunct distribution over 617 km in Pelotas and Uruguay rivers, bordering the states of Rio Grande do Sul and Santa Catarina. However, due to the exploitation of the hydroelectric potential of this basin, seven of the eight populations of D. distachya were extinguished, being currently known only one population in nature. Aiming the preservation of this species, individuals were collected during the construction of hydroelectric and maintained in ex situ collections. Later, some of these rescued individuals were introduced in similar places to their natural occurrence. In this context, this study was carried out to evaluate the reproductive success and genetic aspects of the only natural population and introduced populations, to obtain information to assist in the development of conservation strategies for this species. In Chapter II is presented the study of reproductive success of the only known natural population and four introduced populations of D. distachya. Were also evaluated the average production of flowers, fruits and seeds; the average number of reproductive and vegetative individuals; seed germination and pollen viability; the average size of genets and the average number of ramets per genet. The results showed significant differences between natural and introduced populations for all variables analyzed, being observed higher investment in sexual reproduction in the introduced populations and greater investment in clonal propagation in the natural. The average production of flowers, fruits and seeds were higher in introduced populations (34.1; 37.5; 87; respectively) when compared with the natural population (2.7; 5.9; 31; respectively). Pollen viability was also higher in introduced populations (92 %) in relation to natural (47.9 %). However, the average number of ramets per genet and the average size of the genets were higher in the wild population (297.6 and 2,172 m², respectively) when compared to the average of the introduced populations (5.9 and 0.122 m², respectively). The introduction of this bromeliad should be considered in conservation programs, since the introduced populations studied seem to be getting to settle in their new habitat, having been observed including the recruitment of new individuals from seeds. In Chapter III were investigated the genetic diversity, mating system and pollen flow of this species in the four introduced populations and natural one, utilizing microsatellite markers. For the five populations, samples from 130 reproductive individuals were collected, of which 50 were used as mother plants, providing 700 seedlings. Introduced populations showed high levels of genetic diversity ( O = 0.466) compared with the natural ( O = 0.167). The estimated outcrossing rate in introduced populations did not differ from one ( m = 0.965), indicating that D. distachya is an alogamous bromeliad. However, in natural population, this value was different ( m = 0.520), suggesting the occurrence of some kind of disturbance in this environment. Pollen flow is more restricted in natural population ( FT = 0.296) than in introduced ( FT = 0.089). The pollen dispersal occurs over short distances, appearing to be influenced by the combination of density and spatial distribution of reproductive individuals. Based on these results, we suggest that the rates of genetic diversity and pollen flow should be monitored in the long term, in an attempt to avoid a reduction in genetic diversity, site selection and genetic drift. Additionally, we recommend the creation of new areas of introduction, intermediate of those already existing, promoting the formation of metapopulations. A further study in natural population must also be done to find out what is really occurring in that environment for effective conservation measures are taken.

Melanophryniscus dorsalis, conhecido popularmente por flamenguinho, pertence à família Bufonidae (Anura) e apresenta coloração aposemática, com uma linha vermelha médio-dorsal num fundo preto e manchas vermelhas na parte ventral. A espécie possui tamanho pequeno, hábito de vida diurno e reprodução explosiva ligada a grandes precipitações. Seu habitat é caracterizado por campos ou vegetação baixa de dunas em solo arenoso nas zonas costeiras do Rio Grande do Sul e sul de Santa Catarina. É considerada como vulnerável nas listas vermelhas da IUCN, brasileira e do estado do Rio Grande do Sul e em perigo no estado de Santa Catarina. Acredita-se que a espécie tenha sofrido declínios populacionais e sua principal ameaça seja a perda e degradação do habitat devido à urbanização. A fragmentação causada pela degradação do habitat pode levar a um isolamento das populações, e consequente diminuição na dispersão, aumento da endogamia e redução da variabilidade genética, podendo ocasionar diminuição do fitness, bem como a capacidade de adaptação a mudanças ambientais. Com o objetivo de avaliar a diversidade genética e estruturação populacional de M. dorsalis, foram desenvolvidos marcadores microssatélites e aplicados em populações da espécie ao longo de sua distribuição. Primers foram desenhados para nove loci de microssatélites desenvolvidos, e caracterizados em 35 indivíduos pertencentes a duas populações. Estes nove loci foram utilizados em 80 espécimes, oriundos de 10 locais amostrados entre Laguna (SC) e Rio Grande (RS) englobando toda a distribuição conhecida. A heterozigosidade média observada variou entre 0,47 e 0,64 e o número médio de alelos entre 3,33 e 6,44 nas populações amostradas. Os resultados obtidos mostraram um indício na estruturação genética influenciada por canais d’água como barreiras geográficas ao fluxo gênico, proporcional à distância entre as margens de cada rio ou canal avaliado. O isolamento por distância também foi um fator de diferenciação genética entre as populações amostradas. Foi observada evidência de endogamia em várias localidades, que pode estar relacionada ao modo de reprodução explosiva da espécie. Porém, as três populações testadas para gargalo de garrafa não apresentaram resultados significativos com exceção da localidade de Ilha dos Marinheiros para um dos modelos de mutação testados, podendo estar relacionado ao isolamento de uma pequena população num ambiente insular e a uma distância considerável das demais populações. Mesmo não demonstrando efeitos de gargalo, é necessária especial atenção à espécie pela constante degradação e fragmentação de seu habitat. As populações devem ser tratadas como diferentes unidades de manejo devido a sua estruturação genética apresentada e vê-se a necessidade da criação de mais unidades de conservação ao longo da distribuição de M. dorsalis, para a conservação efetiva da diversidade genética. / Melanophryniscus dorsalis, known as “flamenguinho”, belongs to the Bufonidae Family (Anura), has aposematic color with a red middorsal line in a black background and red spots on their ventral portion. The species has small body size, diurnal habits and explosive breeding during heavy rainfalls. Its habitat is characterized by restricted dunes environment with little vegetation cover, along the seacoast of Rio Grande do Sul and south of Santa Catarina states. The species is considered as vulnerable in IUCN’s, Brasilian’s and Rio Grande do Sul state’s Red Lists and endangered in the Red List of Santa Catarina state. It is believed that M. dorsalis has undergone population declines and is being threatened mainly for the loss and decline of its habitat due to urbanization. Fragmentation caused by these factors may lead to populations’ isolation and less migration between populations, higher levels of inbreeding and genetic variability reduction, and may cause lower fitness, as also less adaptability toward climate changes. The objective in this study was to evaluate genetic diversity and population structure of M. dorsalis, throughout its distribution. For that, microsatellite markers were developed and characterized into 35 individuals belonging to two populations. Primers were designed for nine microsatellite loci, which were used into 80 specimens from ten distinct localities between Laguna (SC) and Rio Grande (RS). Mean observed heterozygosity ranged from 0.47 to 0.64 while the mean number of alleles, from 3.33 to 6.44 on sampled populations. Results recovered showed an evidence of genetic structure influenced by water channels as geographic barriers for gene flow, according to their range between shores. Isolation by distance was also a factor of genetic differentiation among populations sampled. Evidence of inbreeding was observed in several localities, which might be related to species’ explosive breeding behavior. Although, the three populations tested for bottlenecks didn’t show significant results with exception of Ilha dos Marinheiros locality for one of mutational models tested. This may be connected to the isolation of a small population in an island. Even without demonstrating bottleneck effects, careful attention toward the species is necessary. Populations must be treated separately as different management units due to the genetic structure observed and there’s a need for the creation of more conservation units throughout M. dorsalis distribution in order to conserve genetic diversity effectively.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-08-29T17:40:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InfluênciaReinfecçãoDiferentes.pdf: 2091635 bytes, checksum: 69f0c3e3e0a81e034878f8f2c832ddf1 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-09-29T23:49:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InfluênciaReinfecçãoDiferentes.pdf: 2091635 bytes, checksum: 69f0c3e3e0a81e034878f8f2c832ddf1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-29T23:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InfluênciaReinfecçãoDiferentes.pdf: 2091635 bytes, checksum: 69f0c3e3e0a81e034878f8f2c832ddf1 (MD5) Previous issue date: 2013 / A diversidade e severidade dos sintomas observados na doença de Chagas estão relacionados a inúmeros fatores, dentre eles: cepa do parasito, imunidade do hospedeiro, tempo de infecção e reinfecções. Considerando que a reinfecção está presente no ciclo natural da doença de Chagas e que a diversidade genética de populações do Trypanosoma cruzi apresenta influência no desenvolvimento da infecção, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência de reinfecções por dois clones em camundongos experimentalmente infectados e/ou reinfectados, por meio de análises parasitológicas, fenotipagem de células mononucleares do sangue periférico e histopatologia dos músculos cardíaco e esquelético. Os animais foram agrupados conforme as características a seguir: 1) não infectados (NI); 2) infectados pelo clone P209 (AP1); 3) infectados pelo clone IVV (AP2); 4) primoinfectados pelo clone P209 e posteriormente reinfectados (RE1); 5) primoinfectados pelo clone IVV e posteriormente reinfectados (RE2). O nível de parasitemia foi estimado diariamente e 155 dias após o inóculo inicial os animais foram eutanasiados. Foi observada mortalidade apenas entre os animais primoinfectados com o clone P209 (AP1 e RE1). Houve prolongamento da parasitemia entre os animais reinfectados, não sendo os níveis parasitêmicos característicos da fase aguda, sugerindo o desenvolvimento de uma resistência após a primoinfecção. A imunofenotipagem do sangue periférico mostrou aumento no percentual de monócitos entre os animais primoinfectados com o clone P209 (AP1 e RE1) e redução no percentual de linfócitos TCD4+ entre os primoinfectados com o IVV (AP2 e RE2). Animais dos grupos primoinfectados pelo clone IVV (AP2 e RE2), apresentaram infiltrado inflamatório (músculos cardíaco e esquelético), em comparação com o grupo controle (NI), o que pode estar relacionado ao recrutamento dos linfócitos TCD4+ para o foco inflamatório. Os camundongos do grupo RE2 também apresentaram maior deposição de colágeno em ambos os tecidos, processo que indica a reparação do tecido lesionado pela inflamação. Em conjunto estes dados sugerem que a sequência de inoculações, bem como a genética do parasito, possuem grande importância, influenciando diretamente o curso da infecção. ____________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The diversity and severity of symptoms observed in Chagas disease are related to different factors, including: parasite strain, host immunity, time of infection and reinfections. Considering the role of reinfection and genetic diversity of populations of Trypanosoma cruzi as factors that influence the disease development, the aim of this study was to evaluate the influence of reinfections by two clones of T. cruzi (P209 and IVV) in experimentally infected/reinfected mice through parasitological, phenotyping of peripheral blood mononuclear cells and histopathology of cardiac and skeletal muscles. The animals were grouped in five groups: 1) uninfected (NI), 2) infected with P209 (AP1), 3) infected with IVV (AP2), 4) primoinfected by P209 and subsequently reinfected (RE1), 5) primoinfected by IVV and then reinfected (RE2). The level of parasitemia was evaluated daily and after 155 days after first inoculum the animals were euthanized. Mortality occurred only among animals primoinfected with P209 (AP1 and RE1). There was a prolongation of parasitemia among reinfected animals, being the parasitemia levels smaller than the acute stage levels, suggesting the development of resistance after the first infection. Immunophenotyping of peripheral blood showed an increase in the percentage of monocytes among animals primoinfected with P209 (AP1 and RE1) and reduction in the percentage of CD4+ T cells among primoinfected with IVV (AP2 and RE2). Animal groups primoinfected by IVV (AP2 and RE2), presented inflammatory infiltrate (cardiac and skeletal muscles) compared with the control group (NI), which may be related to the recruitment of CD4+ T cells to the inflammatory site. The mice RE2 group also presented collagen deposition in both tissues, a process that indicates the repair of injured tissue by inflammation. Based on these data we suggest that the sequence of inoculations as well as the genetic of parasite have great importance directly influence the course of infection.

As mutações de resistência aos anti-retrovirais e a diversidade genética do HIV-1 são os principais obstáculos na luta contra a AIDS. O objetivo deste estudo foi descrever a diversidade genética do gene pol do HIV-1 bem como determinar o perfil de mutação de resistência às drogas em indivíduos infectados e sob falha terapêutica no estado do Rio Grande do Sul. Foram colhidas 183 amostras de plasma de pacientes infectados com HIV-1 durante o período de outubro de 2004 a setembro de 2005 para a realização do teste de resistência genotípica no Laboratório da Rede Nacional de Genotipagem do Rio Grande do Sul (Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde). Para a genotipagem foi utilizado o sistema ViroseqTM (Celera Diagnostic-Abbott, EUA). A subtipagem e a avaliação das mutações de resistência para o HIV-1 foram baseadas no gene pol (região da protease e da transcriptase reversa). O subtipo B (53,2%) foi o mais prevalente nos pacientes HIV-1 acompanhados para avaliação de falha terapêutica no Rio Grande do Sul, seguido pelo subtipo C (31.6%) e subtipo F (6.5%). Dos genomas que formaram um grupo monofilético com o subtipo C, 32% tiveram um segmento curto do subtipo B na região da transcriptase reversa, formando um subgrupo com um padrão similar de recombinação e carreando uma nova assinatura de aminoácidos para a região da transcriptase reversa. Outros padrões de recombinação também foram observados (8.2%). Nenhum parâmetro laboratorial ou características sócio-demográficas foi associado a qualquer subtipo específico. Todos os pacientes infectados com vírus recombinantes foram provenientes da região metropolitana. O perfil genotípico das mutações de resistência associadas aos inibidores da transcriptase reversa mostrou uma alta freqüência da mutação M184V seguida das mutações associadas à timidina. A mutação K103N foi a mais prevalente para os inibidores da transcriptase reversa não nucleosídicos e o perfil de mutações associado aos inibidores da protease, mostrou as mutações L63P, M36I/V, e L10V/I como as mais prevalentes. Uma clara associação entre os subtipos e mutações de resistência e polimorfismos associados aos inibidores da protease e da transcriptase reversa foi observada. A manutenção do programa de genotipagem para pacientes infectados pelo HIV-1 é importante para o manejo da terapia anti-retroviral e para o monitoramento da peculiar epidemia molecular do HIV-1 nesta região do Brasil. / The anti-retroviral resistance mutations and viral genetic diversity are the main obstacles in the fight against AIDS. The objectives of the present study are to describe the genetic diversity of HIV-1 pol gene and to determine the drug resistance profile among infected individuals failing highly active antiretoviral therapy in the state of Rio Grande do Sul, Brasil. Plasma samples from 183 patients were collected during the years 2004 and 2005 to perform the viral resistance genotyping at RENAGENO Laboratory from Rio Grande do Sul (Fundação de Produção e Pesquisa em Saúde). Viral resistance genotyping was performed using ViroseqTM Genotyping System (Celera Diagnostic-Abbott, US). The subtyping and evaluation of the anti-retroviral resistance mutations were based on polymerase gene (pol) sequences (protease and reverse transcriptase- RT regions). The subtype B was the most prevalente (53.2%) in HIV-1 patients from Rio Grande do Sul failing HAART, followed by subtype C (31.6%) and subtype F (6.5%). Thirty-two percent of the genomes clustering in clade C have a small clade B segment at the reverse transcriptase, forming a sub-cluster within clade C with a similar CB recombinant structure and carrying new amino acid signatures. Other mosaic genomes were also observed (8,2%). No laboratory parameter or social-demographic issues was associated with any specific subtype. However the infected individuals whit pol recombinants viruses were founded only in metropolitan region. The genotyping profile associated to the reverse transcriptase inhibitors showed a high frequency of the M184V mutation followed by the timidine-associated mutations. The K103N mutation was the most prevalent for the non-nucleoside RT inhibitor and the resistance associated to protease inhibitor showed the minor L63P, M36I/V and L10V/I mutations as the most prevalent. A clear association between subtype and drug resistance mutations or molecular polymorphisms was observed in this study at protease and transcriptase genes. The maintenance of resistance genotyping programs for HIV-1 patients failing HAART is of great importance for the management of ARV therapies and to monitor the peculiar HIV-1 molecular epidemy in this region of Brazil.

Vriesea gigantea é uma espécie endêmica da Mata Atlântica, podendo ser encontrada desde o estado do Espírito Santo até o Rio Grande do Sul. A espécie é perene, diplóide e autocompatível. Suas populações naturais estão sendo rapidamente reduzidas por dois motivos principais: pela ação antrópica, que modifica seu habitat natural, e pela coleta predatória e ilegal de plantas da natureza. Os processos que formaram a extraordinária diversidade de espécies nas regiões Neotropicais ainda são pouco conhecidos. A Mata Atlântica tem sido considerada um dos maiores centros de biodiversidade, o que torna a sua conservação prioritária. A variabilidade intra-específica tem sido aceita como foco para a conservação. Além disto, a fertilidade das plantas tem grande importância conservacionista, sendo a viabilidade do pólen (qualidade do pólen) um importante componente do sucesso reprodutivo. Com o objetivo de estudar a diversidade genética em Vriesea gigantea, 11 marcadores de microssatélites foram desenvolvidos e os resultados publicados conjuntamente com aqueles obtidos para outros quatro loci caracterizados para uma espécie próxima, Alcantarea imperialis (Capítulo 2). Treze novos pares de primers de microssatélites nucleares foram testados em 22 espécies de bromélias, indicando que estes marcadores serão úteis em inúmeros estudos com outras espécies desta mesma família. Os marcadores nucleares de microssatélites foram utilizados para estudar os padrões de diversidade genética de Vriesea gigantea ao longo de toda a distribuição geográfica da espécie, em 429 indivíduos, amostrados em 13 populações (Capítulo 3). Os resultados indicaram uma tendência latitudinal de diminuição da diversidade genética do Norte para o Sul, consistente com o padrão histórico de expansão da Floresta Atlântica. A expansão da espécie parece ter sido impedida pela diminuição do fluxo gênico nas populações marginais. Além disso, a história evolutiva das populações marginais difere muito. O centro de diversidade genética para V. gigantea (São Paulo e Rio de Janeiro) coincidiu com o centro de diversidade e centro de endemismo de muitas espécies de animais e plantas da mata Atlântica. A correlação entre a diversidade genética de V. gigantea e a de espécies do gênero Vriesea indicou que ambas foram moldadas pelas mesmas forças históricas: alterações climáticas do Pleistoceno. As análises de distância genética revelaram três grupos geograficamente separados e as análises bayesianas revelaram a presença de outros dois grupos, referentes às populações marginais, os quais são de grande importância para estabelecer estratégias de conservação da espécie. Complementando as análises do genoma nuclear, foram seqüenciadas 21 regiões do genoma de cloroplasto, produzindo um total de cinco regiões plastidiais polimórficas (quatro microssatélites e um SNP – Single Nucleotide Polymorphism). As regiões de microssatélites de cloroplastos polimórficas foram isoladas pela primeira vez em Bromeliaceae. Os cinco marcadores plastidiais foram examinados em 192 indivíduos de 13 populações, com objetivo de inferir a história filogeográfica da espécie (Capítulo 4). Os principais resultados indicaram uma forte estrutura filogeográfica e um reduzido fluxo gênico entre as populações de V. gigantea. A razão de 3,3 indicou assimetria entre o fluxo de pólen e sementes, sendo o fluxo gênico via semente menos eficaz do que via pólen, resultando em uma maior estruturação do genoma do cloroplasto do que do genoma nuclear (microssatélites nucleares). A rede de haplótipos revelou dois grupos filogeográficos distintos: Norte e Centro-Sul. A análise da distribuição de mismatch mostrou que populações da região Norte são mais estáveis e devem ter tido um crescimento ancestral (antigas), enquanto que as populações da porção Centro-sul estão em expansão (jovens). No Capítulo 5, a fertilidade de plantas das populações do sul foi analisada através do número cromossômico, comportamento meiótico e viabilidade do pólen. A maioria das células-mãe-de-pólen apresentou comportamento meiótico regular, o que está de acordo com a alta viabilidade dos grãos de pólen (84 - 98%) registrada para todas as populações investigadas. Estes resultados indicaram que as plantas das populações analisadas são potencialmente férteis. Apesar da alta viabilidade dos grãos de pólen observada, foram constatadas diferenças significantes entre populações. / V. gigantea is a diploid, perennial and self-compatible bromeliad species endemic to Atlantic Rainforest of southeastern and southern Brazil. Its wild populations have been reduced by anthropogenic disturbance such as habitat destruction and illegal collection. The processes that have shaped the extraordinary species diversity in Neotropical rainforests are poorly understood, and knowledge about patterns of genetic diversity across species’ ranges is scarce. Brazilian Atlantic Rainforest has been considered one of the major biodiversity hotspots for conservation. Intraspecific variation has increasingly been accepted as a focus for conservation. Another issue also of conservation meaning is plant fertility. The quality of pollen produced by a plant is an important component of reproductive success. In order to start studying genetic diversity in Vriesea gigantea a set of 11 nuclear microsatellite markers were developed, and the results published together with four loci characterized for a closed-related species, Alcantharea imperialis (Chapter 2). These fifteen new nuclear microsatellite pair primers were tested in 22 bromeliads species indicating that these markers will be useful in numerous other taxa. Using nuclear microsatellite markers patterns of genetic diversity on V. gigantea were studied all across its geographic distribution in Atlantic Rainforest in a large sampling of 429 plants from 13 populations (Chapter 3). The main results indicated latitudinal trend of decreasing diversity from North to South away from the equator, consistent with historical range expansion from the Northern half of the present distribution range. Further species expansion appears to be impeded by lack of gene flow at the current range margins, and the nature of range limits differs greatly between North and South. The center of genetic diversity for V. gigantea (São Paulo and Rio de Janeiro) coincided with centers of species diversity and endemism for most animals and plants of the Atlantic Rainforest. Significant correlation between genetic diversity in V. gigantea and species diversity in the Vriesea genus suggested that both were shaped by the same historical forces: climatic changes of the Pleistocene. Distance-based genetic analysis revealed three geographically defined clusters, and a Bayesian analysis revealed two additional genetic clusters of conservation relevance. To obtain a more ancient scenario, 21 chloroplast regions were sequenced and screened producing a total of five polymorphic plastid regions (four microsatellites and one SNP - Single Nucleotide Polymorphism). Polymorphic chloroplast microsatellites markers were isolated for Bromeliaceae for the first time. The five cpDNA markers were examined in 192 individuals from 13 populations to infer the phylogeographical history of the species (Chapter 4). The key results indicated a strong phylogeographic structure and a reduced gene flow among populations of Vriesea gigantea. A ratio of 3.3 indicated an asymmetry between pollen and seed flow, being gene flow via seed less efficient than via pollen, resulting in a stronger genetic structure for chloroplast genome than nuclear genome (inferred by nuclear SSR). Haplotype network revealed two major phylogeographic groups: Northern and Central- Southern. Mismatch distribution analysis showed that populations from the Northern region are stable and should have an ancestral growth (“older”), while the populations from Central-Southern region are in expansion range (“younger”). In Chapter 5, the plant fertility of southern populations was analyzed by assessing: chromosome number, meiotic behavior, and pollen viability. Most of pollen mother cells showed a regular meiotic behavior. In accordance, high pollen viability (84-98%) was recorded for all investigated populations. These results indicated that plants from all populations analyzed are fertile. Despite the overall high pollen viability, significant differences were detected among populations.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2017. / Submitted by Raiane Silva (raianesilva@bce.unb.br) on 2017-07-19T16:38:29Z No. of bitstreams: 1 2017_AlcebiadesRenatoNepomuceno.pdf: 2512848 bytes, checksum: ada98e573a9febea0d42de372a5d6347 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-19T15:33:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_AlcebiadesRenatoNepomuceno.pdf: 2512848 bytes, checksum: ada98e573a9febea0d42de372a5d6347 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T15:33:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_AlcebiadesRenatoNepomuceno.pdf: 2512848 bytes, checksum: ada98e573a9febea0d42de372a5d6347 (MD5) Previous issue date: 2017-09-19 / A aquicultura é uma atividade que vem crescendo de forma acentuada tanto no Brasil como no mundo. Dentre as espécies de peixes marinhos da costa brasileira, o bijupirá (Rachycentroncanadum, Linnaeus, 1766), comumente conhecido como cobia, é uma das que mais apresenta potencial para o incremento na produção pesqueira. Tendo ganhado espaço no cenário econômico de vários países e a fim de garantir a comercialização legal e aliviar possíveis conflitos e impactos ao meio ambiente, a caracterização dos perfis genéticos dos peixes de cultivo e de populações selvagens podem reduzir os potenciais impactos genéticos negativos. Neste contexto, a informação sobre a estrutura genética do cobia é essencial para otimização da gestão da pesca e formação de plantéis de reprodutores nos diversos sistemas de cultivo. Desta forma, este estudo se propôs a analisar a diversidade e estruturação genética de populações naturais e de cultivo do cobia no Brasil. Com intuito de avaliar quanto da diversidade genética do cobia é observado nos espécimes selvagens do nordeste brasileiro, foram avaliados as relações filogenéticas com populações selvagens do cobia do Atlântico ocidental e de regiões Indo-Pacíficas a partir da análise de seqüências do DNA mitocondrial (mtDNA). As análises foram realizadas a partir de 1.525 pares de bases (pb) envolvendo duas regiões do mtDNA (Cytb e ATP6). Foi evidenciada uma baixa diversidade genética entre as populações das diferentes bacias oceânicas. Uma maior proximidade genética entre as amostras do Atlântico Norte e Sul (FST = 0,020; p = 0,063) foi observada. Contudo, a existência de SNP’sem sítios específicos do mtDNA nas populações do Atlântico evidenciaram maior diferenciação genética destas com às amostras Indo-Pacíficas (FST = 0,842; p = 0,000). A estruturação genética do cobia no Brasil foi avaliada a partir da diversidade haplotípica e nucleotídica das sequências do mtDNA associadas a marcadores de microssatélites. As análises de diversidade molecular (AMOVA) realizada par-a-par entre grupos formados por espécimes selvagens e os de cultivo demonstraram a existência de uma diversidade molecular de 76% entre espécimes dentro destes dois grupos (FST = 0,2304; p = 0,00). Dos vinte locos de microssatélites analisados, quinze mostraram-se polimórficos nos dois grupos. De modo geral, os grupos de espécimes apresentaram uma heterozigose próxima à esperada, sendo consideradas em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Contudo, um nível moderado de diferenciação populacional foi observado entre estes grupos (фst = 0,07231; p = 0,000). A maior diferenciação foi observada entre espécimes selvagens coletados na região litorânea do Piauí e os provenientes do sistema de cultivo de Pernambuco (фst = 0,10156; p = 0,000). As análises do mtDNA e dos marcadores de microssatélites convergiram para uma baixa diversidade genética entre os espécimes selvagens e de cultivo. Contudo, uma estruturação de dois pools gênicos (k = 2), sendo um formado por animais de cativeiro e o outro formado por espécimes de vida livre, foi identificada. Fato importante quando observamos que a atividade de cultivo de espécimes marinha é recente no Brasil e que políticas voltadas para conservação dos estoques naturais devem ser realizadas. Com base nessas diferenças genéticas, discussões sobre a comercialização de reprodutores do cobia entre as diversas empresas aquícolas devem ser analisadas, principalmente quando se diz respeito a reprodutores de origem Indo-Pacíficas. / Aquaculture is an activity that has grown significantly in Brazil and worldwide. Among the species of marine fish of the Brazilian coast, bijupira (Rachycentroncanadum, Linnaeus, 1766), commonly known as cobia, is one of the ones that presents the greatest potential for the increase in fish production. Having gained space in the economic landscape of several countries and in order to ensure legal commercialization and to alleviate possible conflicts and impacts on the environment, the characterization of the genetic profiles of farmed fish and wild populations may reduce potential negative genetic impacts. In this context, information on the genetic structure of cobia is essential for optimizing fishery management and training breeding stock in the various cropping systems. Thus, this study aimed to analyze the diversity and genetic structuring of natural populations and cobia cultivation in Brazil. In order to evaluate how much of the genetic diversity of cobia is observed in the wild specimens of the Brazilian northeast, the phylogenetic relationships with wild populations of cobia of the western Atlantic and of the Indo-Pacific regions were analyzed from mtDNA sequences. The analyzes were performed from 1,525 base pairs (bp) involving two regions of mtDNA (Cytb and ATP6). There was a low genetic diversity among the populations of the different ocean basins. Greater genetic proximity between North Atlantic and South Atlantic samples (FST = 0,020; p = 0,063) was observed. However, the existence of SNP’s at specific mtDNA sites in the Atlantic populations showed a greater genetic differentiation of these with Indo-Pacific samples (FST = 0,842; p = 0,000). The genetic structure of cobia in Brazil was evaluated from the haplotype and nucleotide diversity of the mtDNA sequences associated with microsatellite markers. Molecular diversity analyzes (AMOVA) performed in pairs between groups of wild and cultivated specimens demonstrated the existence of a 76% molecular diversity between specimens within these two groups (FST = 0,2304; p = 0,00). Of the twenty microsatellite loci analyzed, fifteen were polymorphic in both groups. In general, the groups of specimens showed a heterozygosity close to that expected, being considered in Hardy-Weinberg equilibrium. However, a moderate level of population differentiation was observed among these groups (фst= 0,07231; p = 0,000). The highest differentiation was observed among wild specimens collected in the coastal region of Piaui and those from the Pernambuco farming system (фst = 0,10156; p = 0,000). Analyzes of mtDNA and microsatellite markers converged to low genetic diversity between wild and cultivated specimens. However, a structuring of two gene pools (k = 2), one consisting of captive animals and the other formed by free-living specimens, was identified. This is an important fact when we observe that the activity of growing marine specimens is recent in Brazil and that policies aimed at the conservation of natural stocks must be carried out. Based on these genetic differences, discussions on the commercialization of cobia breeders among the various aquaculture companies should be analyzed, especially when it comes to breeders of Indo-Pacific origin.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-26T20:04:04Z No. of bitstreams: 1 2016_SaluanaRochaCraveiro.pdf: 3241510 bytes, checksum: 02323233a9f77526e278dded20e15f95 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-10T17:19:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_SaluanaRochaCraveiro.pdf: 3241510 bytes, checksum: 02323233a9f77526e278dded20e15f95 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-10T17:19:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_SaluanaRochaCraveiro.pdf: 3241510 bytes, checksum: 02323233a9f77526e278dded20e15f95 (MD5) / Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus (ChinNPV) é um vírus patogênico à lagarta falsa-medideira, Chrysodeixis includens (Walker, 1858), uma praga polífaga que ataca 174 plantas hospedeiras, incluindo soja e algodão. Os baculovírus formam um grande grupo de vírus de DNA fita dupla circular, que infectam insetos da ordem Lepidoptera, Hymenoptera e Diptera. Para uma melhor compreensão da virulência, evolução e biologia molecular de ChinNPV, este trabalho teve como objetivo determinar a sequência completa do genoma e a diversidade genética de sete isolados de ChinNPV (IA a IG). A diversidade genética foi inicialmente investigada por meio de análise das variações presentes nos core genes pif-2, lef- 9 e helicase de isolados de ChinNPV e de outros Alphabaculovirus. O gene pif-2 de ChinNPV recebeu destaque por, em contraste com o esperado, apresentar um grande número de polimorfismos não-sinônimos com a identificação de dois sítios sob pressão diversificadora. Os genomas dos isolados de ChinNPV (IA a IG) possuem tamanho variando de 138.869 a 140.859 bp e conteúdo de CG ~ 39%. Um total de 142 ORFs foram identificadas incluindo 37 core genes, 102 genes encontrados em outros baculovírus, 3 genes bro e duas ORFs únicas (Psin5 e Psin8). Homologous repeats (hrs), típicas de baculovírus, estão ausentes no genoma de ChinNPV. Os genomas dos isolados de ChinNPV têm alta similaridade com identidade mínima de 96,4% e, polimorfismos, indels e pequenos fragmentos foram observados ao longo dos genomas. Dois homólogos ao gene p26 (p26a e p26b) foram encontrados em ChinNPV. O padrão de agrupamento observado no cladograma da proteína P26 de NPVs indica que a aquisição do gene ocorreu em três eventos independentes de captura dentro da família Baculoviridae. ChinNPV tem uma sequência genômica distinta comparada a outros baculovírus sequenciados. As sete novas sequências do genoma completo de ChinNPV determinadas aqui constituem uma importante ferramenta para o melhor entendimento dos fatores de virulência, interação inseto-hospedeiro e da variação fenotípica observada em populações de baculovírus. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus (ChinNPV) is a virus pathogenic to the soybean looper, Chrysodeixis includens (Walker, 1858), a polyphagous pest that attacks 174 host plants including soybean and cotton. Baculoviruses are a large group of circular doublestranded DNA viruses that infect insects of the orders Lepidoptera, Hymenoptera and Diptera. In order to better understanding the virulence, evolution and molecular biology of ChinNPV, this study aimed to determine the complete genome sequence and genetic diversity of seven ChinNPV (IA to IG) isolates. Genetic diversity was initially investigated by analyzing variation present in the pif-2, lef-9 and helicase core genes in ChinNPV and other Alphabaculovirus isolates. The pif-2 gene unexpectedly showed a large number of non-synonymous polymorphisms with two sites identified to be under diversifying selection. The ChinNPV (IA to IG) genomes range in length between 138,869 and 140,859 bp and GC content of ~39% A total of 142 ORFs were identified including 37 baculovirus core genes, 102 genes found in other baculoviruses, three bro genes and two ORFs unique to ChinNPV (Psin5 and Psin8). The typical baculoviral homologous repeats (hrs) are absent in the ChinNPV genome. The ChinNPV genomes have high similarity with minimal identity of 96.4% and polymorphisms, indels and small fragment insertions throughout the genome were observed. Two p26 gene homologs (p26a and p26b) were found in the ChinNPV genome. The clustering pattern seen in the cladogram of NPV P26 protein indicates that the acquisition of these genes occurred in three independent capture events within the family Baculoviridae. ChinNPV has a distinct genomic sequence compared to other baculoviruses sequenced so far. The seven new ChinNPV whole genome sequences determined herein constitute an important tool for a better understanding of virulence factors, insect-host interaction and phenotypic variation observed in baculovirus populations.

Submitted by CARLOS ANTÓNIO MATOS null (cmatos62@yahoo.com.br) on 2017-05-23T17:44:16Z No. of bitstreams: 1 Tese_Carlos_Antonio_Mato_2017.pdf: 2145169 bytes, checksum: a2aa0c6111ab05dde2597a7a07b2c0a7 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-23T18:34:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 matos_ca_me_jabo.pdf: 2145169 bytes, checksum: a2aa0c6111ab05dde2597a7a07b2c0a7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-23T18:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 matos_ca_me_jabo.pdf: 2145169 bytes, checksum: a2aa0c6111ab05dde2597a7a07b2c0a7 (MD5) Previous issue date: 2017-04-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A babesiose é uma doença infecciosa economicamente importante que afeta o gado bovino em todo o mundo, endêmica e importante causa de morbidade e mortalidade em bovinos no Brasil. A doença é causada por Babesia bigemina e B. bovis, protozoários parasitas intraeritrocíticos do filo Apicomplexa, agentes de enorme importância econômica em regiões tropicais e subtropicais. Merozoitos de B. bovis possuem em sua superfície, pelo menos, cinco glico-proteínas, que pertencem à família de antígenos variáveis de superfície do merozoíto (VMSA). A família VMSA de B. bovis inclui os genes msa-1, msa-2a1, msa-2a2, msa-2b e msa-2c. Estes antígenos são altamente imunogênicos e contêm epítopos sensíveis à neutralização e, por conseguinte, têm sido considerados como antígenos candidatos para o desenvolvimento de vacinas de subunidades contra B. bovis. No entanto, estes antígenos de superfície são geneticamente diversificados entre diferentes isolados de B. bovis, O que resulta em diferenças antigénicas entre vários isolados de B. bovis. A fim de avaliar a resposta imune humoral contra B. bovis e a diversidade genética de antígenos de superfície de merozoítos de B. bovis, amostras de soro e DNA de sangue de 30 bezerras, sendo 15 da Fazenda Pesagro, Seropédica, Rio de Janeiro, e outras 15 da Fazenda Germânia, Taiaçu, São Paulo, foram obtidas trimestralmente, desde o nascimento até aos 12 meses de idade. Os Anticorpos IgG para B. bovis foram detectados pelos testes de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto (IELISA). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi utilizada com o objetivo de avaliar a diversidade genética de B. bovis, com base em genes que codificam antígenos de superfície de merozoítos (MSAs). Os resultados da sorologia demonstram que, a partir dos seis meses de idade, todas as bezerras foram soropositivas para B. bovis. Entre as 150 amostras de DNA testadas para a presença de três fragmentos de genes de msa de B. bovis, amplicons positivos foram obtidos em 14 amostras para msa-1, 24 para msa-2b e 34 para msa-2c de bezerras da Fazenda Pesagro e em 9 amostras para msa-1, 28 para msa-2b e 34 para msa-2c em amostras de bezerras da Fazenda Germânia. O sequenciamento foi realizado pelo método de Sanger para os fragmentos de genes msa-2b (n = 3), msa- 2c (n = 5) de Seropédica e msa-1 (n = 2), msa-2b (n = 5), msa-2c (n = 5) de Taiaçu. A análise filogenética foi realizada pelo método de Máxima verossimilhança e modelos GTR + G, GTR + G + I e GTR + G+ I para MSA-1, MSA-2b e MSA-2c, respectivamente. As sequências de MSAs dos genes msa-2b e msa-2c de Seropédica posicionaram-se em dois clados, enquanto que as sequências de MSAs dos genes msa-1 e msa-2b de Taiaçu posicionaram-se em dois clados, e sequências do gene msa-2c agruparam-se em um único clado. Os resultados da sorologia mostram que foi atingida a estabilidade endêmica em ambas as fazendas. Com base nas sequências do gene msa-2b, amplificadas no presente estudo, e a análise filogenética, pode-se afirmar que as amostras de B. bovis das fazendas Pesagro e Germânia dividem-se em dois grupos genotipicos, havendo um genótipo compartilhado por ambas as fazendas. / Babesiosis, an economically important infectious disease that affects cattle worldwide, is endemic and important cause of morbidity and mortality of cattle in Brazil. The disease is caused by Babesia bigemina and B. bovis, apicomplexan intraerythrocytic protozoa parasites, which are agents of huge economic importance in tropical and subtropical regions. B. bovis merozoites present at least five (glyco-) proteins on their surfaces, which belong to a family of variable merozoite surface antigens (VMSA). The members of the VMSA family consist of merozoite surface antigen msa-1, msa-2a1, msa-2a2, msa-2b, and msa-2c. These antigens are highly immunogenic and contain neutralization-sensitive epitopes, and therefore have been considered as candidate antigens for developing subunit vaccines against B. bovis. However, these surface antigens are genetically diverse among different isolates of B. bovis, which results in antigenic differences among various B. bovis isolates. In order to evaluate the humoral immune response against B. bovis and genetic diversity of merozoite surface antigens of B. bovis, serum and DNA blood samples of 30 dairy calves, 15 from Seropedica, state of Rio de Janeiro, and the other 15 from a herd located in Taiaçu, state of São Paulo were obtained quarterly, since the birth up to 12 months of age. IgG antibodies to B. bovis were detected by Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) and Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay (ELISA) tests. Polymerase Chain Reaction (PCR) was used aiming to assess the genetic diversity of B. bovis, based on genes that encode merozoite surface antigens (MSAs). The serology results demonstrate that up to six months of age all calves were seropositive to B. bovis. Among the 150 DNA blood samples tested for the presence of three B. bovis-msa gene fragments, positive amplicons were obtained in 14 samples for msa-1, 24 samples for msa-2b and 34 for msa-2c from calves of Pesagro herd, 9 samples for msa-1, 28 for msa-2b and 34 for msa-2c from calves of Germânia herd. Sequencing, by Sanger method, was performed for msa-2b (n=3), and msa-2c (n=5), genes fragments of Seropedica and msa-1(n=2), msa-2b (n=5), and msa-2c (n=5), genes fragments of Taiaçu. The phylogenetic analysis was performed by Maximum Likelihood method and models GTR+G, GTR+G+I and GTR+G+I for MSA-1, MSA-2b and MSA-2c, respectively. The Seropedica MSAs sequences namely msa-2b and msa-2c were positioned in two clades, and a Taiaçu MSAs sequence, that is msa-1 and msa-2b, were positioned in two clades, while msa-2c sequences were all grouped in only one clade. Serology results show that endemic stability has been achieved in both farms. Based on the msa-2b gene sequences amplified in the present study, and the phylogenetic analysis, it can be stated that the B. bovis samples from the Pesagro and Germânia farms are classified into two genotypic groups, having one genotype shared by both farms.