La multi-résistance aux drogues des bactéries est un problème majeur en clinique. L’un des mécanismes de résistance consiste à effluer les composés toxiques hors de la cellule grâce à des protéines de la membrane interne nommées pompes d’efflux. Ces protéines appartiennent à cinq familles (MFS, RND, MATE, SMR et ABC) et peuvent fonctionner en association avec deux autres types de protéines (protéine du périplasme et protéine de la membrane externe) pour former un canal. Dans le cadre d’une thématique de recherche basée sur l’étude des mécanismes de résistance auxdrogues de la bactérie pathogène Legionella pneumophila, une approche bioinformatique menée sur lesgénomes de trois souches séquencés (souches Lens, Paris et Philadelphia) a permis d’identifier des protéinespouvant participer à l’efflux. Notre but a été de vérifier l’implication de ces protéines dans la résistance auxdrogues et dans la virulence de Legionella en ciblant un ou plusieurs gènes codant pour des composants desystèmes d’efflux. Pour inactiver les gènes, nous avons choisi une stratégie de recombinaison homologue. Lesrecombinants ont été testés pour leur sensibilité à des composés toxiques afin de voir si les gènes ciblés jouentun rôle dans l’efflux d’E. coli. Un de ces mutants, le mutant MF201, altéré pour le gène codant pour une protéinehomologue à TolC chez E. coli s’est avéré être 2 à 16 fois plus sensible aux drogues testées comparé à lasouche sauvage. De plus, ce mutant présente un défaut important de virulence dans Acanthamoeba castellanii,Dictyostelium discoideum et les macrophages U937. Ce premier résultat implique que la protéine TolC-like deLegionella aurait un rôle clef dans la relation hôte pathogène et sous-tend un lien entre multi-résistance auxdrogues et virulence. Par ailleurs une étude de l’expression des gènes codant pour des pompes à efflux a étéinitiée afin de comprendre leur rôle au cours du cycle infectieux de Legionella. / Bacterial multi-drug resistance is of major concern in the case of clinic. One of the resistance mecanisms used by bacteria is the efflux of noxious compounds out of the cell thanks to inner membran proteins called efflux pumps. This proteins belong to five families (MFS, RND, MATE, SMR and ABC) and can function in close association with two partners (periplasmic protein and outer membrane protein) to form a canal. In our new research axis based on the study of the drug resistance of the bacterium Legionella pneumophila, we conducted a bioinformatical approach to identify efflux pumps proteins coded by the sequenced genome of three strains (strains Lens, Paris and Philadelphia). Our goal was to study the role of this proteins in Legionella drug resistance and in its virulence. The bioinformatic approach data allowed us to choose one or several genes coding for potential efflux pump components for genetic invalidation by an homologousrecombination strategy. The bacterial mutants were exposed to different noxious compounds in order to know ifthe target genes invalidated were implicated in the efflux of drugs. One of this mutants, strain MF201, which isdeleted for the gene encoding a protein homologous to E. coli TolC protein, revealed to be 2 to 16 times moresensitive to the drug tested compared to the wild-type strain. Furthermore, this mutant showed an importantvirulence defect in Acanthamoeba castellanii, Dictyostelium discoideum and U937 macrophages. This first resultsmeans that the TolC-like protein of Legionella could be a key factor in host-pathogen interaction and stronglysuggests a link between multi-drug resistance and virulence. We also initiated a transcriptomic approach to studyefflux pump genes expression in order to understand their role during the infectious cycle of Legionella.

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student: Adéla Janoušková Supervisor: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Title of diploma thesis: Study on impact of selected protein kinase inhibitors on drug resistance mediated by cytochromes P450 Pharmacokinetic drug resistance often leads to failure of an anticancer therapy. One of the mechanisms is increased efflux of drugs from tumour cells, whereas some studies suggest that increased drug conversion to an inactive metabolite might be another contributing mechanism. The aim of this work was to define the possible role of CYP3A4 and CYP2C8 enzymes in the phenomenon of pharmacokinetic resistance and to investigate the possibility of its modulation by new targeted drugs. In the first part, we used the MTT proliferation method together with HepG2 cells stably transduced with particular human enzymes and demonstrated significant involvement of CYP3A4 in docetaxel resistance. In the following part, we examined the inhibitory effects of four selected tyrosine kinase inhibitors on the CYP3A4 activity in intact cells using a commercial kit. Cobimetinib and dabrafenib showed significant inhibitory activity, while osimertinib and brivanib did not. In the final part, we demonstrated the ability of the first two...

La sénescence induite par chimiothérapie permet l’arrêt pérenne de la division des cellules tumorales. Néanmoins, ce mécanisme de suppression tumorale peut être neutralisé par certaines cellules traitées, ce qui se traduit généralement par une rechute des patients. Récemment, nous avons décrit dans des cellules colorectales un mécanisme d’échappement à la sénescence induite par le SN-38 dépendant de la protéine de survie MCL1. Cette étude montre que les cellules sénescentes (PLS) favorisent la prolifération des cellules non-sénescentes (PLD) par l’intermédiaire de signaux mitogéniques activant la kinase Cdk4 et par conséquent la reprise de la division. Nous démontrons que Cdk4 inhibe Rb par phosphorylation de la sérine 780, permettant l’activation des fonctions transcriptionnelles des facteurs E2F sur les gènes du cycle cellulaire. La perte d’activité de Cdk4 par ARN interférence ou par le Palbociclib réduit l’émergence de clones proliférants. La méthyltransférase EZH2 est une cible de E2F exclusivement exprimée par les PLD et son expression dépend de l’activité de Cdk4. Par ailleurs, l’utilisation d’ARN interférence dirigé contre EZH2 ou des inhibiteurs chimiques DNZepA et GSK343 réduit également l’émergence de clones proliférants. Enfin, son inhibition potentialise à la fois l’arrêt de la division et la sénescence en réponse au Palbociclib dans les cellules ayant échappé au SN-38. Ainsi, ces travaux ont permis de mettre en évidence un rôle important de EZH2 en tant qu’effecteur de Cdk4 dans le mécanisme d’échappement au SN-38, une voie susceptible d’apporter des nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement du cancer. / Chemotherapy-induced senescence enables to trigger a durable division arrest of tumor cells. However, this tumor suppressor mechanism is neutralized in some treated cells leading mostly to cancer relapse in patients. Recently, we have described a MCL1-dependent mechanism of escape in SN-38-induced senescence from colorectal cell lines. In this study, we showed that senescent cells (PLS cells) promoted the non senescent cells (PLD cells) proliferation through mitogenic signals stimulating Cdk4 kinase activity and subsequently the cell cycle. We demonstrated that Cdk4 phosphorylated Rb on the serine 780 to inhibit its activity, allowing E2F- family transcriptional functions activation on cell cycle targets. Loss of Cdk4 expression or activity induced by RNA interference or Palbociclib reduced the emergence of proliferating clones. TheEZH2-methyltransferase, a E2F transcriptional target, is only expressed by PLD cells and this expression depends on Cdk4 activity. Moreover, loss of EZH2 expression or activity, by RNA interference or by DZNepA and GSK343 inhibitors, reduced the emergence of proliferating cells. Finally, EZH2 inhibition promotes both cell division arrest and senescence in response to Palbociclibin the SN-38-escaped cells. To conclude, this study enabled to highlight a major role of EZH2 as effector of Cdk4 in the escape mechanism induced by SN-38 a signaling pathway offering newtargeted cancer therapies.

Orientador: Ewerton Garcia de Oliveira Mima / Resumo: Candida albicans (Ca) é o principal fungo patógeno humano, responsável por infecções como a candidose orofaríngea e a candidemia. Essas infecções estão fortemente associadas com a formação de biofilmes. O uso abusivo de antifúngicos tem levado ao desenvolvimento de resistência fúngica. As terapias direcionadas aos biofilmes, principalmente contra a matriz extracelular (MEC), são relevantes para o desenvolvimento de novos tratamentos mais eficazes. Um dos agentes que tem demonstrado ação antibiofilme é a N-acetilcisteína (NAC). Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a ação da NAC em biofilmes in vitro de C. albicans susceptível (CaS) e resistente ao fluconazol (CaR). Culturas planctônicas de CaS e CaR foram cultivadas e submetidas ao teste de susceptilidade à NAC. Foram determinadas também a curva de inativação de ambas as cepas sob ação da NAC, seu efeito na formação do biofilme e no biofilme maduro. Por fim, foi avaliada a ação NAC na composição da MEC do biofilme, por meio da quantificação de peso seco total e do precipitado, polissacarídeos solúveis em água (WSP) e álcali (ASP), proteínas do sobrenadante e do precipitado e DNA extracelular (eDNA). Os dados obtidos foram analisados descritivamente e pelos testes ANOVA/Welch e Tukey/Gomes-Howell ou Kruskal-Wallis (=0,05). A concentração inibitória mínima da NAC com redução de 90% (CIM90) foi de 25 mg/mL para ambas as cepas. Apesar de não ter sido encontrado nenhum valor de concentração fungicida mínima (CFM), a NAC redu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Candida albicans is the main fungal pathogen in humans, responsable for local and systemic infections, such as oropharyngeal candidiasis and candidemia. These fungal infections are associated with biofilm formation. The abusive use of antifungals has led to the development of fungal resistance. The therapies towards the biofilms, mainly against the matrix, are relevant for the development of more effective new treatments. One of the agents that have demonstrated antibiofilm action is N-acetylcysteine (NAC). Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect in vitro of NAC on biofilms of C. albicans susceptible (CaS) and resistant to fluconazole (CaR). CaS and CaR were submitted to the susceptibility test to NAC. The time-kill curves of NAC and its effect on biofilm formation and mature biofilms were also determined for both strains. Finally, the effect of NAC on the composition of the biofilms matrix was evaluated [total and pellets’s dry weight, water (WSP) and alkali soluble polysaccharides (ASP), supernatant and pellet’s proteins, and extracellular DNA (eDNA)]. The data were descriptively analyzed and submitted to the ANOVA/Welch and Tukey/Gomes-Howell or Kruskal-Wallis tests (= 0.05). The minimum inhibitory concentration of NAC with 90% of reduction (MIC90) was 25 mg/mL. Although no minimum fungicidal concentration (MFC) value was found, NAC reduced (p≤ 0,001) the fungal viability by 1.81 to 4.06 log10 for both strains. In the time-kill curves, only concentrati... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Ensaios clínicos indicam haver diferenças regionais na eficácia do tratamento da doença de Chagas com (BZ) e Nifurtimox (NFX). Transportadores ABC desempenham um papel importante na resistência a drogas. Evidências indicam que o transportador TcABCG1 é superexpresso em cepas resistentes a BZ. O objetivo geral foi obter evidências para o envolvimento de TcABCG1 no fenótipo de resistência a BZ. Determinamos a classificação de seis cepas em suscetíveis e resistentes a BZ, e o efeito de três inibidores de transportadores ABC de eucariotos. Transfectamos em CL Brener os genes TcABCG1 de cepas resistentes. Nas culturas transfectadas com os genes de Silvio e YuYu verificamos aumento da resistência a BZ e a NFX, e aumento da abundância relativa de transcritos de TcABCG1. Genes ABC ortólogos aos de T. cruzi foram identificados em tripanossomas africanos e Leishmania spp. Dados referentes à análise filogenética e classificação dos transportadores ABC de T. cruzi nas oito subfamílias das proteínas ABC de eucariotos são apresentados. / Clinical trials indicate regional differences in the efficacy of Chagas disease treatment with (BZ) and nifurtimox (NFX). ABC transporters play an important role in drug resistance. Evidences indicate that TcABCG1 is overexpressed in BZ-resistant strains. The overall aim was to obtain evidence for the involvement of TcABCG1 in the BZ resistance phenotype. We determined the classification of six BZ susceptible and resistant strains and the effect of three eukaryotic ABC transporters inhibitors. We transfected TcABCG1 genes from resistant strains in CL Brener. In cultures transfected with Silvio and YuYu genes we observed an increased resistance to BZ and NFX, and increased relative abundance for TcABCG1 transcripts. ABC orthologue genes to those of T. cruzi were identified in African trypanosomes and Leishmania spp. Data relating to classification and phylogenetic analysis of T. cruzi ABC transporters in eight eukaryotic ABC proteins subfamilies are presented.

O gênero Acinetobacter tem sido implicado em grande variedade de infecções hospitalares, principalmente em Unidades de Terapia Intensiva. O tratamento de infecções por Acinetobacter spp. é geralmente realizado com imipenem embora não haja ensaios clínicos randomizados que embasem esta recomendação. No caso de resistência a esta classe, situação cada vez mais freqüente, as opções mais estudadas são as polimixinas e ampicilinasulbactam. Diante da escassez de dados sobre o assunto, estudos que avaliem o tratamento de infecções por Acinetobacter spp resistente a carbapenem são necessários. Realizou-se um estudo de coorte retrospectivo de pacientes com infecção causada por Acinetobacter spp. resistente a carbapenem, internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas (HC-FMUSP) e no Hospital do Servidor Público Estadual (HSPE) no período de 1996 a 2004. Foram considerados como casos os pacientes com diagnóstico de infecção hospitalar baseado em critérios estabelecido pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC) somado ao isolamento de Acinetobacter spp. resistente a carbapenem obtidos de materiais estéreis ou lavado bronco-alveolar.Não foram incluídos casos de infecção do trato urinário. Foi realizada a análise dos prontuários dos pacientes e foram coletadas informações clínico-demográficas, tratamento utilizado, sinais, sintomas e exames auxiliares no diagnóstico da infecção e no decorrer do tratamento. Foram avaliados três desfechos: mortalidade até o final do tratamento, mortalidade até o final da internação e evolução clínica. Oitenta e dois pacientes (30%) receberam polimixina B ou E, oitenta e cinco (31%) foram tratados com ampicilina-sulbactam, 99 (36%) não receberam tratamento específico. As características clínico-demográficas dos grupos foram semelhantes. A mortalidade durante a internação foi de 78% e boa resposta clínica foi observada em 50% dos pacientes tratados. Na análise multivariada de fatores associados à má evolução clínica, início do tratamento após 72 horas do isolamento e piora da função renal durante o tratamento foram estatisticamente significativos. Pontuação de Apache II >= 15, início do tratamento após 72 horas do isolamento; piora da função renal durante o tratamento; presença de choque séptico e uso de polimixina foram variáveis associadas com óbito até o final do tratamento. As variáveis independentemente associadas com óbito durante a internação foram: idade >= 58 anos, presença de choque séptico no dia do início do tratamento e pontuação de Apache II >=15. Concluiu-se que para o tratamento de infecções causadas por Acinetobacter spp. resistente a carbapenem, ampicilinasulbactam foi superior a polimixinas considerando mortalidade durante o tratamento. / Acinetobacter spp. is a cause of a number of infections, mainly in the ICU setting. Antimicrobials drugs frequently reported as active against Acinetobacter spp include carbapenems, colistin, ampicillin/sulbactam, amikacin, rifampin and tetracyclines and currently carbapenens are considered the main antimicrobial treatment. Unfortunately, over the past years there has been a worldwide increase in infections caused by carbapenem-resistant Acinetobacter. This poses a therapeutic challenge as few treatment options are avaible. We performed a retrospective review of the case records of patients from 1996 to 2004 who had nosocomial infections caused by carbapenem-resistant Acinetobacter spp. from 2 large teaching hospitals. Diagnosis of infection was based on CDC criteria plus the isolation of Acinetobacter from a usually sterile site or from broncoalvelolar lavage. Urinary tract infections were not included. We collected data on demographic and clinical features, treatment, signs and symptoms from medical records. We evaluate 3 outcomes: mortality until the end of treatment, in-hospital mortality and clinical outcome. Eighty two patients received polymyxins (30%), 85 were treated with ampicilin-sulbactam (31%) and 99 (36%) did not receive any of these antibiotics. The demographic and clinical characteristics of the groups were similar. Multivariate analysis showed that treatment with polymyxins, Apache II score >= 15; septic shock; treatment delay and renal failure were independent predictors of mortality. On multivariate analysis, age >= 58 years, presence of septic shock and Apache II score >=15 were prognosis factors for mortality during hospitalization. Multiple logistic regression analysis revealed that Apache II >=15 and renal failure during treatment were associated with treatment failure. In conclusion, ampicillin-sulbactam was superior to polymyxin considering mortality during treatment.

A malária é responsável por cerca de 207 milhões de casos e 627 mil óbitos em todo o mundo. No Brasil, em 2013, foram registrados mais de 167 mil casos. Um dos grandes desafios para o controle da doença é o desenvolvimento de resistência aos antimaláricos. Dentre as cinco espécies que podem causar malária em seres humanos, Plasmodium falciparum é a que apresenta maior habilidade de desenvolver resistência a quase todas as classes de medicamentos utilizados no tratamento. Estudos com marcadores moleculares têm associado mutações em diversos genes à resistência aos antimaláricos. A mutação K76T no gene pfcrt é relacionada à resistência à cloroquina. Mutações em pfmdr1 e aumento de seu número de cópias foram associados à resistência a diversos antimaláricos, como quinino, mefloquina e derivados de artemisinina. A resistência aos antifolatos é associada a mutações nos genes pfdhfr e pfdhps. Mutações nos genes pfATPase6 e pfAP2-u têm sido relacionadas à diminuição de sensibilidade à artemisinina. O monitoramento dessas mutações e suas associações às respostas in vivo e in vitro aos antimaláricos pode contribuir para a escolha de terapêutica para o controle da doença. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil genético relacionado à resistência em P. falciparum ao longo de 27 anos. Foram analisadas amostras de P. falciparum coletadas no período entre 1984 e 2011, de pacientes atendidos em serviços de saúde nos estados do Pará e São Paulo, com infecções provenientes principalmente de países da América do Sul e África. A análise do gene pfcrt mostrou frequência de 100% da mutação K76T nas amostras de países da América do Sul ao longo das décadas analisadas. Este resultado é concordante com o fenótipo de resistência à cloroquina observado em 100% das amostras testadas in vitro para sensibilidade a este antimalárico. Amostras de países africanos apresentaram o genótipo selvagem em infecções únicas ou mistas. Com relação ao gene pfmdr1, a análise do códon 86 mostrou surgimento do mutante 86Y na última década em amostras da América do Sul e ocorrência de alelos selvagens e mutantes em amostras da África. Na análise do códon 1246 foi observada predominância do mutante 1246Y nas amostras sul-americanas e do selvagem D1246 nas africanas. Com relação ao gene pfdhfr, as amostras brasileiras apresentaram frequência de 100% dos mutantes 51I e 108N. O mutante 59R não foi observado no período 1980-1990, mas estava presente em 22,6% das amostras de 2000-2010. A análise do gene pfdhps das amostras brasileiras mostrou frequência de 100% do mutante 437G em todas as décadas e diminuição da frequência de 540E no período 2000-2010 em relação aos anteriores. O sequenciamento do gene pfATPase6 revelou a ocorrência de mutações que já haviam sido relatadas anteriormente, porém seu papel na resistência aos derivados de artemisinina ainda não foi elucidado. Na análise do gene pfAP2-? foram observadas duas novas mutações. Não foram observadas associações entre as mutações estudadas e a resposta in vivo e in vitro à mefloquina, quinino e derivados de artemisinina. Este estudo permitiu a avaliação do perfil genético de P. falciparum, com análise de marcadores moleculares relacionados à resistência a diversos antimaláricos, em amostras coletadas ao longo de 27 anos em que o parasito foi submetido à pressão de diferentes esquemas terapêuticos adotados no Brasil / Malaria is responsible for 207 million cases and 627 thousand deaths worldwide. In Brazil, in 2013, more than 167 thousand cases were reported. The major challenge for malaria control is the emergence and spread of resistance to antimalarials. Among the five species able to cause malaria in humans, Plasmodium falciparum presents ability to develop resistance to almost all classes of drugs for malaria treatment. Studies with molecular markers have associated mutations in several genes to antimalarial resistance. The mutation K76T in pfcrt is related to chloroquine resistance. Polymorphisms in pfmdr1 and increased copy number were associated to several antimalarials resistance, such as quinine, mefloquine and artemisinin derivatives. Resistance to antifolates is associated to mutations in pfdhfr and pfdhps genes. Mutations in pfATPase6 and pfAP2-u were linked to decreased sensibility to artemisinins. The monitoring of these mutations and their association with in vivo and in vitro responses may contribute to the choice of therapeutics for malaria control. The aim of the present study was to analyze the genetic profile related to resistance in P. falciparum over twenty-seven years. Samples collected from 1984 to 2011 from patients enrolled at health facilities in Para and Sao Paulo States were assessed. The origin of infections was mainly from South America and Africa countries. Pfcrt analysis showed that all samples from South America countries harbored the K76T mutation over the four decades, in agreement with the resistant phenotypic response of samples tested in vitro for chloroquine. African samples presented the wild type in mixed or single infections. Regarding to the pfmdr1 gene, the emergence of the mutant 86Y was observed in the last decade in South American samples and occurrence of both, mutant and wild type, in African ones. The analysis of 1246 showed only the mutant 1246Y in South American samples and the wild type D1246 in samples from Africa. Regarding to pfdhfr gene, the frequency of mutants 51I and 108N was 100% in Brazilian samples. The mutant 59R was not observed in the period 1980-1990 and it was present in 22.6% in samples from 2000-2010. The mutant 437G of pfdhps gene was observed in 100% of Brazilian samples in all decades and the frequency of mutant 540E decreased in the period 2000-2010 when compared to 1980-1990. The sequence analysis of pfATPase6 gene showed mutations previous described, but their role in artemisinin resistance is not well defined. Two novel mutations were observed in pfAP2-? gene. No association between the polymorphisms studied and in vivo or in vitro responses to mefloquine, quinine and artemisinin derivatives was observed. This study enabled the knowledge of P. falciparum genetic profile regarding to mutations related to resistance in samples collected over twenty-seven years, when the parasite was exposed to selective pressure of several therapeutic schemes adopted in Brazil

A infecção de corrente sanguínea (ICS) causada por bactérias multirresistentes tem alta mortalidade em pacientes receptores de transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH). A Pseudomonas aeruginosa é um dos agentes mais frequentes e de difícil tratamento nessa população de pacientes. Objetivos: Avaliar características clínicas, microbiológicas e moleculares de 30 isolados de P. aeruginosa resistente à carbapenêmicos (PARC) em ICS de pacientes submetidos a TCTH e a presença de sinergismo antimicrobiano in vitro. Métodos: Os dados clínicos foram obtidos retrospectivamente de prontuários médicos e registrados em banco de dados. Análises bivariadas e multivariadas foram realizadas para avaliar determinantes de desfechos clínicos e uma curva de sobrevida foi construída. Determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) dos antimicrobianos por meio de microdiluição, foram realizados ensaios de sinergismo por método de checkerboard e time-kill, avaliação da clonalidade por eletroforese em campo pulsado e detecção de genes codificadores de mecanismos de resistência e virulência por reação em cadeia de polimerase. O sequenciamento do genoma completo (WGS) dos principais clones foi realizado por Nextera XT, utilizando a tecnologia Illumina MiSeq. Resultados: A maioria dos pacientes era do gênero feminino, com mediana de idade de 48 anos. Neutropenia foi presente em 93% dos pacientes e colonização prévia por PARC em 32%. A mortalidade em 14 dias foi 68%; a maioria dos pacientes que morreram foram transplantados alogênicos (79% vs. 17% entre receptores de transplante autólogo; p=0,012). Pacientes tratados com duas ou três drogas não apresentaram diferença estatisticamente significante na mortalidade até 14 dias após a ICS. Foram avaliados 30 isolados bacterianos. Todos apresentaram alto nível de resistência ao meropenem (MERO): CIM90 > 512 ug/mL; dois terços eram resistentes à amicacina (AMK) (CIM 2-512 ug/mL) e todos mantinham sensibilidade à colistina (COL). Muitos isolados (17/30) alcançaram efeito sinérgico in vitro pelo método time-kill com a combinação MERO mais COL, mas não com AMK. Nenhum antagonismo foi observado. Houve menor mortalidade em pacientes cujo isolado apresentou sinergismo entre COL e MERO quando comparados a pacientes portadores de isolados sem sinergismo, sem significância estatística. O gene de carbapenamase mais identificado foi blaSPM e 6 isolados apresentaram blaSPM e blaKPC. Os isolados apresentaram genes relacionados com virulência, tais como toxA, exoS e lasB; pacientes com ICS causada por P. aeruginosa que abrigava o gene lasB apresentaram maior risco de evoluir para o óbito. O WGS mostrou que os clones abrigavam SPM-1, Tn4371, mutações em porinas, em partes das bombas de efluxo, nas proteínas ligadores de penicilina (PBP) e pertenciam a ST277. Conclusão: As ICS por PARC cursaram com alta mortalidade em pacientes submetidos à TCTH. Houve uma grande proporção de resultados positivos para sinergismo entre os antimicrobianos in vitro, mas não foi possível demonstrar benefício estatisticamente significante no uso da terapia combinada com três drogas. Os clones carreavam SPM-1, Tn4371 e pertenciam a ST277 / Bloodstream infection (BSI) has high mortality in hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients and Pseudomonas aeruginosa is an important and challenging organism. Objectives: To evaluate clinical, microbiological and molecular features of carbapenem-resistant P. aeruginosa (CRPA) isolates from BSI identified among HSCT patients and address in vitro synergy of antibiotic combination. Methods: Patient medical records were retrospectively reviewed and registered in a database. We used bivariate and multivariate analyzes to investigate determinants of clinical outcomes, and demonstrated overall mortality using a survival curve. We determined minimal inhibitory concentrations (MIC) for antimicrobials and in vitro synergies using checkerboard and time-kill assays, pulsed-field electrophoresis (PFGE) for clonality assessment and polymerase chain reaction (PCR) to detect carbapenamases and virulence genes were performed for all isolates. Whole genome sequence (WGS) of main clones was performed by Nextera XT, using Illumina MiSeq technology. Results: Most patients were female, median age was 48 years old. Main baseline disease was acute leukemia and 68% received allogeneic HSCT. 93% of patients had neutropenia and 32% had prior CRPA gut colonization.14-day mortality was 68%; mortality was higher among allogeneic HSCT recipients compared to autologous HSCT recipients (79% vs. 17% p = 0,012). Patients treated with two or three drugs did not present a statistically significant difference in 14-day mortality after BSI. In total, 30 bacterial isolates were analyzed; all presented a high resistance level to meropenem (MERO): MIC90 > 512ug/mL; two thirds were also resistant to amikacin (AMK) (MIC 2-512 ug/mL) and all were susceptible to colistin (COL). Many (17/30) isolates achieved in vitro synergistic effect in time-kill assay with the association of MERO and COL, but synergistic effect was not observed with AMK, by time-kill. No antagonistic effect was observed. There was a tendency towards better survival in patients whose CRPA isolate had in vitro synergy between COL and MERO without statistical significance. The most frequent carbapenamase gene identified was blaSPM, and six co-harboured both blaKPC and blaSPM. Isolates presented genes related to virulence factors such as toxA, exoS and more patients with BSI caused by P. aeruginosa harbouring gene lasB evolved to death. WGS analysis showed that clones harboured SPM-1, Tn4371 and belonged to ST277. They also presented mutations in genes related with porins and efflux pumps, as well in penicillin binding proteins (PBPs). Conclusion: CRPA BSI as associated with high mortality in HSCT recipients. A large proportion of isolates had in vitro synergy; however, we could not demonstrate statistically significant benefit in the use of combination therapy. Clones carried SPM-1, Tn4371 and belonged to ST277

A resistência aos antimicrobianos é um problema global. O planejamento de estratégias preventivas depende da acurácia das informações sobre sensibilidade aos antimicrobianos e, portanto, da qualidade dos laboratórios de microbiologia. O objetivo deste estudo foi avaliar a proporção dos laboratórios que apresentavam condições mínimas de funcionamento, executavam rotina básica, executavam procedimentos relacionados a qualidade, interagiam com a Comissão de Controle de infecção Hospitalar e possuíam recursos avançados; avaliar as características associadas com condições mínimas de funcionamento, execução da rotina básica, execução de procedimentos relacionados a qualidade, interação com a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar e possuir recursos avançados; classificar os laboratórios em níveis de qualidade. Um estudo foi realizado para avaliar os laboratórios de microbiologia que serviam todos os hospitais brasileiros com mais de 10 leitos de terapia intensiva ou os hospitais sentinela. Os coordenadores dos laboratórios foram entrevistados entre abril de 2002 e dezembro de 2005 e responderam sobre fontes de financiamento, infraestrutura, recursos humanos equipamentos, procedimentos, controle de qualidade e biossegurança. Quinhentos e trinta hospitais foram identificados e 467 laboratórios foram visitados pelos entrevistadores. Os laboratórios foram classificados como: nível 0: ausência de condições mínimas de funcionamento; nível 1: condições mínimas de funcionamento, mas execução inadequada da rotina básica; nível 2: condições mínimas de funcionamento e execução adequada da rotina básica; nível 3: condições mínimas de funcionamento, execução adequada da rotina básica e execução de procedimentos relacionados a qualidade hospitalar; nível 4: condições mínimas de funcionamento, execução adequada dos procedimentos de rotina básicos, execução dos procedimentos relacionados a qualidade, interação com a Comissão de Controle de Infecção hospitalar, mas ausência de recursos avançados; nível 5: condições mínimas de funcionamento, execução adequada dos procedimentos de rotina básicos, execução de procedimentos relacionados a qualidade hospitalar, interação com a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar e presença de recursos avançados. Oitenta e cinco porcento dos laboratórios foram considerados nível 0, 7% nível 1, 6% nível 2, 1% nível 3, 1% nível 5. Nenhum laboratório foi considerados nível 4. Vinte laboratórios não realizavam coloração de Ziehl-Neelsen; 21 não tinham bico de Bunsen; 271 não tinham uma cabine de segurança biológica; 81 não tinam um formulário de requisição padrão e 3 não tinham meio ágar sangue. Mais de 20% dos laboratórios que não possuíam uma cabine de segurança biológica tinham sistemas automatizados. Hospitais sentinela (p<0,001); hospitais públicos (p:0,01); hospitais universitários (p<0,001) e localização em capitais (p:0,001) foram as características associadas com presença de condições mínimas de funcionamento. Hospitais sentinela (p:0,002), universitários (p:0,019), localizados em capitais (0,039), região geográfica (p:0,039) e laboratórios que serviam mais de um hospital (p<0,001) foram as características associadas com execução adequada da rotina básica. Hospitais sentinela (p:0,01) e localizados em capitais (p<0,001) foram as características associadas com execução de procedimentos relacionados a qualidade hospitalar. Hospitais públicos (p:0,01), localizados em cidades do interior (p:0,008), não terceirizados (p:0,01) e a região geográfica (p<0,001) foram as características associados com presença de interação com a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar. Hospitais sentinela (p:0,03), públicos (p:0,04), universitários (p:0,01), localizados em capitais (p<0,001) e laboratórios que servem mais de um hospital (p:0,01) foram associados com presença de recursos avançados. Em conclusão, a maioria dos laboratórios não tinha condições mínimas de funcionamento. Esta avaliação de qualidade pode direcionar investimentos e projetos educacionais no país / Antimicrobial resistance is a global problem. To plan preventive strategies, the accuracy of the information on infections and antimicrobial susceptibility is very important, requiring quality in microbiology laboratories. The objective of this study was to evaluate the proportion of laboratories that have minimal functioning conditions, execute basic routine, execute procedures related to quality, collaborate in Department of Hospital Infection Control and have advanced resources; evaluate the characteristics associated with minimal functioning conditions, basic routine execution, execution of procedures related to quality, collaboration in Department of Hospital Infection Control and advanced resources; classification of laboratories according to quality level. A survey was carried out to evaluate microbiology laboratories that served all Brazilian hospitals with at least 10 intensive care beds or that served hospitals involved in the government program of adverse event notification related to healthcare products. From April 2002 through December 2005 laboratory coordinators were interviewed about financing; infrastructure; human resources; equipment; procedures; quality control and safety. 530 hospitals were identified and 467 laboratories were visited by the interviewers. Laboratories were classified as: Level 0: no minimal functioning conditions; Level 1: minimal functioning conditions, but no execution of basic routine; Level 2: minimal functioning conditions and execution of basic routine; Level 3: minimal functioning conditions, execution of basic routine and execution of quality procedures; Level 4: minimal functioning conditions, execution of basic routine, execution of quality procedures and collaboration with the Department of Hospital Infection Control, but no advanced resources; Level 5: minimal functioning conditions, execution of basic routine, execution of procedures related to quality, collaboration with the Department of Hospital Infection Control and advanced resources. Findings: 85% of laboratories were considered Level 0; 7% Level 1; 6% were Level 2; 1% were Level 3 and 1% were Level 5. None were Level 4. Twelve laboratories did not perform Ziehl-Neelsen staining; 21 did not have Bunsen burners; 271did not have biological safety cabinets; 81 did not have standardized requisition forms and 3 did not have blood agar medium. More than 20% of laboratories without safety cabinets had automated systems. Hospitals part of the government adverse event notification program (p<0.001); public hospitals (p:0.01); teaching hospitals (p<0.001) and location in state capitals (p:0.001) were associated with having minimal conditions. Hospitals part of the government adverse event notification program (p:0.002), teaching hospitals (p:0.019), location in state capitals (p:0.039), laboratories serving more than one hospital (p<0.001) and geographic region (p:0.039) were associated with basic routine execution. Hospitals part of the government adverse event notification program (p:0.01) and location in state capitals (p<0.001) were associated with quality procedures execution. Public hospitals (p:0.01), location outside state capitals (p:0.008), serving hospitals that doesn\'t contract third part microbiology services (p:0.01) and geographic region (p<0.001) were associated with collaboration in Department of Hospital Infection Control. Hospitals part of the government adverse event notification program (p:0.03), public (p:0.04), teaching hospitals (p:0.01), location in state capitals (p<0.001) and serving more than one hospital (p:0.01) were associated with advanced resources. In conclusion, most laboratories did not have minimal functioning conditions. This quality assessment should guide investments and educational projects in the country

Introdução: a utilização de luvas de látex para procedimentos é essencial nas atividades que envolvem risco biológico no cuidado à saúde, no entanto ainda é controversa a segurança microbiológica das luvas de procedimento, considerando sua exposição ambiental. Objetivos: quantificar as Unidades Formadoras de Colônias (UFC) das luvas de látex para procedimentos em momentos distintos (início, meio e fim das caixas) na situação real e controle de enluvamento; avaliar a contaminação das luvas conforme o tempo de exposição ambiental das caixas; isolar o microrganismo mais freqüente e determinar o perfil de sensibilidade aos antibióticos. Material e Método: trata-se de um estudo comparativo e prospectivo realizado em uma unidade de terapia intensiva de um hospital-escola. Após aprovação do comitê de ética em pesquisa, procedeu-se à coleta das amostras microbiológicas das luvas de látex por meio da digito-pressão em placas de Petri, preparadas com meio de cultura Mueller Hinton (MH). Esse procedimento foi realizado em 31 caixas de luvas de látex para procedimentos em diferentes momentos (início, meio e fim das caixas) e em situação real de enluvamento e controle. O Etest® foi utilizado na determinação do perfil de sensibilidade aos antibióticos (Ciprofloxacina®, Oxacilina®, Cefepime®, Gentamicina®, Amicacina® e Vancomicina®). Os dados foram submetidos a análise estatística por meio do Teste de Cochran e Spearman, considerando nível de significância de a=0,05. Para comparação do número de UFC, realizou-se análise de variância (ANOVA) com medidas repetidas. Resultados: totalizaram-se 372 placas de Petri, das quais 186 foram obtidas na situação real de enluvamento e 186 no controle. A média de UFC foi de 4,7, na situação controle, e de 6,2 na situação real de enluvamento, não demonstrando diferenças estatisticamente significantes (p=0,601). Em relação à avaliação dos pares de luvas no início, meio e fim da caixa na situação real de enluvamento e controle, não foram evidenciadas diferenças significantes no crescimento microbiano (UFC). Na associação entre o tempo de abertura ao término da caixa de luvas e o número de UFC, tanto na situação real de enluvamento quanto no controle, não houve correlação (p=0,63). Quanto aos microrganismos, a bactéria Staphylococcus spp. foi a mais freqüente. Com relação ao perfil de sensibilidade, 13 cepas (24,8%) apresentaram resistência a pelo menos 2 antibióticos; destas, 3 (5,5%) tiveram resistência a vancomicina. Conclusão: os resultados corroboraram a hipótese inicial da pesquisa quanto à segurança microbiológica das luvas de látex para procedimentos considerando os baixos valores de UFC. / Introduction: the use of latex gloves is essential and unquestionable in activities that involve biological risk in the health care. However, it is still controversial the microbiological safety of gloves for procedures considering their environmental exposition. Objectives: quantify the Colony-Forming Units (CFU) of latex gloves for procedures in different moments (beginning, middle and end of boxes) in real situation and gloving control; evaluate the contamination of gloves regarding the boxes time of environmental exposition; isolate the most frequent microorganism and determine the sensibility profile to antibiotics. Material and Method: It is a comparative and prospective study performed in an intensive therapy unit of a school hospital. After approval of the committee of ethics in research the collection of microbiological sample of latex gloves through digital pressure in Petri plaques prepared with culture media Mueller Hinton (MH) was initiated. This procedure was performed in 31 latex gloves boxes for procedures in different moments (beginning, middle and end of boxes) and, in real gloving and control situations. The Etest® was used to determine the sensibility profile of antibiotics (Ciprofloxacin®, Oxacillin®, Cefepime®, Gentamicin®, Amikacin® e Vancomycin®). The data was statistically analyzed through the Cochran and Spearman test considering a level of significance of a=0,05. Analysis of variance (ANOVA) with repetitive measures was used for the comparison of number of UFC. Results: a total of 372 Petri plaques were obtained, 186 in real gloving situation and 186 in the control situation. The CFU average was 4,7 in the control situation, and 6,2 in the real gloving situation, with no statistically significant differences (p=0,601). There was no evidence of significant differences in the microbial growth (UFC) in the evaluation of gloves pairs in the beginning, middle and end of boxes in both the real and control situations. There was no correlation (p=0.63) in the association between time of opening and finishing the box of gloves with the number of CFU, both in the real and control situations. The Staphylococcus spp. was the most frequent microorganism. Regarding the sensibility profile, 13 strains (24.8%) were resistant to at least two antibiotics; from these three (5.5%) resisted Vancomycin®. Conclusion: The results obtained support the initial hypothesis regarding the microbiological safety of latex gloves for procedures considering the low levels of CFU.