Diese Arbeit beschäftigt sich mit der prognostischen und prädiktiven Bedeutung der Serummessung des shed antigens des Onkoproteins HER-2/neu (s-HER-2/neu) für Mammakarzinompatientinnen in unterschiedlichen Erkrankungsstadien sowie unter verschiedenen Formen der Systemtherapie inklusive der Behandlung mit dem monoklonalen Antikörper Herceptin. Hierbei wurde der Stellenwert von s-HER-2/neu mit weiteren biochemischen Serummarkern (s-EGFR, s-uPA, CA 27.29) und etablierten Prognosefaktoren des Mammakarzinoms verglichen. Da HER-2/neu zu verschiedenen Zeitpunkten der Erkrankung mit verschiedenen Methoden an unterschiedlichen Materialien bestimmt werden kann, mußte schwerpunktmäßig auch die differentielle Wertigkeit von s-HER-2/neu im Vergleich zu Methoden der HER-2/neu-Bestimmung am Tumormaterial untersucht werden. Hierbei wurde insbesondere hinterfragt, ob die verschiedenen Methoden der HER-2/neu-Diagnostik stets zum gleichen Ergebnis führen, welche biologischen und technischen Ursachen möglichen Diskordanzen zugrunde liegen, und welche Konsequenzen diese Diskordanzen für die Therapiewahl (vor allem mit Herceptin beim metastasierten Mammakarzinom) mit sich bringen. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: - Grenzwerte: s-HER-2/neu: 50 ng/ml mit großer Wahrscheinlichkeit auch eine HER-2/neu-Überexpression am Tumorgewebe aufweisen. - Insgesamt 70% der Patientinnen mit HER-2/neu-negativen Tumoren hatten bei der späteren Fernmetastasierung einen erhöhten s-HER-2/neu-Spiegel. Diese Zunahme des Nachweises der HER-2/neu-Positivität zwischen Gewebenachweis am Primärtumor und dem Serumnachweis im Stadium IV ist nicht zufällig (p=0,001) und allenfalls teilweise durch den Einfluß der Tumormasse erklärbar. Klonale Veränderungen müssen in Erwägung gezogen werden. / This work focuses on the prognostic and predictive impact of the determination of the shed antigen of the oncoprotein HER-2/neu in serum (s-HER-2/neu) for breast cancer patients in different stages of the disease as well as under different forms of systemic therapy including treatment with the monocloncal antibody Herceptin. The biological meaning of s-HER-2/neu was compared to other serum markers (s-EGFR, s-uPA, CA 27.29) and established prognostic markers in breast cancer. As HER-2/neu can be measured at different times during the course of the disease using different methods and material, the differential meaning of s-HER-2/neu had to be investigated in relation to methods of HER-2/neu determination in tissue. Key questions were whether different methods of HER-2/neu testing lead to the same result, what biological and/or technical reason may lead to discordances, and if so, which are the consequences of these discordances for therapeutic decision making (before all Herceptin therapy in metastatic breast cancer). The results of the investigations are as follows: - Cut-offs of normal: s-HER-2/neu: 50 ng/ml are most probably HER-2/neu-positive in tissue. - Altogether, 70% of the patients with HER-2/neu negative tumors showed elevated s-HER-2/neu concentrations at later metastatic spread. This increase of the number of HER-2/neu positivity between tissue determination at the primary tumor and the serum results at stage IV disease cannot be explained by pure coincidence (p=0.001) and can only in part be explained by the influence of tumor burden . Clonal changes during the course of the disease must be considered.

Submitted by Verônica Esteves (vevenesteves@gmail.com) on 2017-09-28T17:28:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Carolina Barbara - AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NO.pdf: 2844302 bytes, checksum: d3ce9355ae4a9633c9b9e0c88ce683c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Verônica Esteves (vevenesteves@gmail.com) on 2017-09-28T17:29:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Carolina Barbara - AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NO.pdf: 2844302 bytes, checksum: d3ce9355ae4a9633c9b9e0c88ce683c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-28T17:29:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Carolina Barbara - AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NO.pdf: 2844302 bytes, checksum: d3ce9355ae4a9633c9b9e0c88ce683c5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS-Fiocruz) / Cerca de 10-15% das causas de mortalidade e morbidade materna em países desenvolvidos e 37% das causas de morte obstétricas diretas no Brasil podem ser associadas à pré-eclâmpsia. A pré-eclâmpsia é uma patologia multissistêmica definida por uma hipertensão associada a uma proteinúria, após a 20ª semana de gestação. As manifestações clínicas desta doença podem se apresentar como uma síndrome materna ou fetal e de acordo com a gravidade podem ser classificadas em leve ou severa e de início precoce ou tardio. Apesar do conhecimento limitado sobre esta patologia, existem fortes evidências de envolvimento do componente genético na etiologia da pré-eclâmpsia. O fator de crescimento epidérmico (EGF) desempenha um papel importante na regulação do crescimento, proliferação e diferenciação celular, através da ligação ao seu receptor, o EGFR. Acredita-se que este fator esteja relacionado com a regulação do crescimento e da função placentária durante a gestação. Variações na sequência do DNA desses genes podem levar a uma alteração nos níveis de transcrição gênica e, como consequência, ser responsável por mudanças nos níveis de produção e/ou atividade desses fatores. O polimorfismo EGF +61 G>A está associado com a produção in vitro da proteína EGF e os polimorfismos EGFR -216 G>T e -191 C>A estão correlacionados a mudanças na atividade do promotor e na expressão de RNAm desse gene. O objetivo geral do nosso estudo foi avaliar uma possível associação entre polimorfismos funcionais nos genes EGF (+61 G>A) e EGFR (-216 G>T e -191 C>A) e a susceptibilidade à pré-eclâmpsia severa na população de gestantes do Estado do Rio de Janeiro, através de um estudo caso-controle. Como objetivos específicos, além de analisarmos uma possível interação entre os polimorfismos no desenvolvimento da pré-eclâmpsia severa, buscamos associar os polimorfismos ao histórico familiar da doença. O estudo foi composto por dois grupos, pareados por etnia: um grupo caso composto por 98 mulheres com pré-eclâmpsia severa e um grupo controle com 98 mulheres saudáveis. Os polimorfismos EGF (+61 G>A) e EGFR (-216 G>T e -191 C>A) foram avaliados pela reação em cadeia da polimerase seguida por análise de polimorfismos por tamanho de fragmentos de restrição (PCR-RFLP). As variáveis categóricas, frequências alélicas e genotípicas foram comparadas através do teste do exato de Fisher, e o teste t de Student foi utilizado para comparação das variáveis contínuas em cada grupo. Os resultados demonstram que o alelo A do polimorfismo -191 do gene EGFR está associado com a susceptibilidade à pré-eclâmpsia severa (p<0,05). Não houve associação significativa entre os outros polimorfismos (EGF +61 G>A e EGFR -216 G>T) e a susceptibilidade à pré-eclâmpsia severa (p>0,05), assim como também não foi encontrada relação entre a interação dos polimorfismos, histórico familiar e o desenvolvimento da pré-eclâmpsia severa. Além desses resultados, também foram encontradas diferenças significativas ao avaliarmos as características demográficas e clínicas entre os grupos. Este é o primeiro estudo a avaliar associações entre pré-eclâmpsia severa e os polimorfismos -216 G>T e -191C>A do gene EGFR e o primeiro estudo na população brasileira a investigar a associação do polimorfismo EGF +61 G>A e a doença. Com esse achado, podemos sugerir que o polimorfismo, o -191C>A do gene EGFR, possa ser o responsável por alguma regulação na produção do EGFR, e que através dessa regulação possa desempenhar algum papel importante na susceptibilidade à pré-eclâmpsia severa em mulheres do Estado do Rio de Janeiro. / About 10-15% of maternal deaths in development countries and approximately 37% of direct obstetrics deaths in Brazil can be assigned to preeclampsia. Preeclampsia is a multisystem disorder that usually occurs after 20 week of pregnancy and it is determined by the presence of hypertension associated with proteinuria. The clinical findings of preeclampsia can manifest as either a maternal syndrome or fetal syndrome. In addition, the preeclampsia can be classified as mild to severe, and in early or late-onset preeclampsia. Despite the limited knowledge of this pathology, there is a strong evidence of involvement of the genetic component in the etiology of preeclampsia. The epidermal growth factor (EGF) plays an important role in regulating cell growth, proliferation and differentiation, through binding its receptor, EGFR. Evidences suggest that this growth factor and its receptor are involved in growth regulation of placental function during the pregnancy. Variations in the DNA sequence in the EGF and EGFR genes can lead to an altered gene transcription and consequently can be responsible for changes in production and/or activity of these factors. The EGF +61 G>A polymorphism is significantly associated with in-vitro EGF protein production and the EGFR -216 G>T and -191 C>A polymorphisms are correlated with changes in promoter activity and expression of EGFR mRNA. The aim of this study was to verify the association between EGF +61 G>A, EGFR -216 G>T and -191 C>A polymorphisms and susceptibility to severe preeclampsia in the population of Rio de Janeiro through a case-control design. The specific objectives were to assess the association between these polymorphisms and the history family of preeclampsia, and also to analyze a possible interaction among these polymorphisms on the development of severe preeclampsia. The study was composed by two groups matched by ethnicity: the case group with 98 women with severe preeclampsia and the control group with 98 healthy women. Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism analyses (PCR-RFLP) were performed to genotype EGF +61 G>A, EGFR -216 G>T and -191 C>A polymorphisms. Categorical variables, allelic and genotype frequencies were compared in each group applying Fisher´s exact test and a Student t test was used for continuous variables. The results showed that the A allele of the -191 C>A polymorphism of the EGFR gene is associated with susceptibility to severe preeclampsia (P<0,05). There were no significant association between severe preeclampsia and +61 G>A EGF and -216 G>T EGFR polymorphisms (P>0,05), as well as no correlation was found between the interaction of these polymorphisms, history family and the development of severe preeclampsia. We also found differences when we evaluated demographic and clinical characteristics between the two groups. This is the first study to assess the associations between -191 C>A and -216 G>T EGFR genetics polymorphisms and severe preeclampsia and the first study in Brazilian population to investigate the association between +61 G>A EGF polymorphism and severe preeclampsia. These findings suggest that the polymorphism-191C>A of the EGFR gene may be responsible for some regulation in the production of the EGFR, and that through this regulation this polymorphism might play an important role in the susceptibility to severe preeclampsia in women from Rio de Janeiro.

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Introduction : Le traitement des cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) EGFR mutés repose sur les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) du récepteur de l’Epidermal Growth Factor (EGFR). Cependant tous les patients traités par ITK EGFR finissent par présenter une progression tumorale, du fait de mécanismes de résistance comme l’amplification du gène codant pour le récepteur tyrosine kinase MET. Il n’existe actuellement aucune donnée sur les modifications phénotypiques induites par l’activation de MET dans ce contexte. L’objectif de cette thèse est de déterminer si l’amplification de MET, lors de la résistance aux ITK EGFR dans les CBNPC EGFR mutés, confère aux cellules tumorales un phénotype plus agressif et modifie l’histoire naturelle de la maladie.Méthodes : Les capacités de prolifération, de croissance sans ancrage, de formation de sphéroïdes, de résistance à l’anoïkis et de migration ont été étudiées in vitro dans la lignée HCC827, dérivée d’un CBNPC EGFR muté, et dans sa lignée fille HCC827-GR6 (GR6) devenue résistante aux ITK EGFR via une amplification du gène MET. L’expression de la vimentine, de ZEB1, et de la E-cadherine a également été étudiée dans les deux lignées cellulaires afin d’évaluer l’impact de l’amplification de MET sur la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). In vivo la croissance tumorale et le potentiel métastatique ont respectivement été analysés dans des modèles murins de xénogreffe ectopique et d’injection intracardiaque. Enfin les données cliniques de patients issus de 15 centres avec un CBNPC EGFR muté métastatique, présentant une forte surexpression de MET en immunohistochimie (score 3+) ou une amplification de MET en FISH sur une re-biopsie réalisée après la progression sous ITK EGFR ont été analysées rétrospectivement. Résultats : In vitro, l’amplification de MET induisait une augmentation significative de la prolifération, de la croissance sans ancrage, de la formation de sphéroïdes, de la résistance à l’anoïkis et de la migration. En présence d’un inhibiteur de MET, le PHA-665752, ces différentes propriétés biologiques étaient réduites de façon significative dans les cellules GR6 porteuses de l’amplification de MET. Il était également mis en évidence dans les cellules GR6 une augmentation de l’expression de la vimentine et de ZEB1. In vivo, l’amplification de MET augmentait significativement la croissance tumorale et le potentiel métastatique. Un traitement par crizotinib, ITK ciblant MET, diminuait de façon significative le potentiel métastatique des cellules porteuses de l’amplification de MET. Enfin les patients atteints d’un CBNPC EGFR muté, porteur d’une amplification de MET à la résistance à l’ITK EGFR, présentaient une durée jusqu’à apparition de nouvelles métastases plus courte après progression sous ITK EGFR que les patients avec une forte surexpression de MET sans amplification génique. Conclusion L’amplification de MET dans un contexte de résistance aux ITK EGFR est associée à un phénotype tumoral plus agressif. Ces résultats plaident en faveur d’une utilisation précoce d’inhibiteurs de MET en association avec les ITK EGFR afin d’éviter l’émergence d’un clone tumoral résistant plus agressif. / Introduction: Treatment of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) mutated non-small cell lung cancers (NSCLC) relies on EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKI). However, all patients treated with EGFR TKI eventually present tumor progression, due to mechanisms of resistance such as the MET amplification. There is currently no data on phenotypic changes induced by MET activation in this context. The objective of this thesis is to determine whether the MET amplification during EGFR TKI resistance in the EGFR mutated NSCLC induces a more aggressive phenotype in tumor cells and alters the natural history of the disease.Methods: Proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration were studied in vitro in the HCC827 cell line, derived from an EGFR mutated NSCLC, and in its daughter cell line HCC827-GR6 (GR6) which became resistant to EGFR TKI through MET amplification. The expression of vimentin, ZEB1, and E-cadherin was evaluated in these cellular models in order to investigate an epithelial to mesenchymal transition (EMT) process induced by the MET amplification. In vivo, the tumor growth and the metastatic potential were analyzed by subcutaneous xenograft and intracardiac injection in mouse models. Finally, the clinical data of patients from 15 centers with a metastatic EGFR mutated NSCLC, exhibiting high MET overexpression in immunohistochemistry (score 3+) or MET amplification assessed by FISH on a re-biopsy performed after TKI EGFR progression were analyzed retrospectively.Results: In vitro, the MET amplification induced a significant increase in proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration. Treatment with PHA-665752, a MET TKI, significantly reduced these biological properties in the GR6 cells harboring the MET amplification. An increase in the expression of vimentin and ZEB1 was also observed in the GR6 cells. In vivo, the MET amplification significantly increased the tumor growth and the metastatic potential. Treatment with crizotinib, another MET TKI, significantly decreased the metastatic potential of cells carrying MET amplification. Finally, patients with an EGFR mutated NSCLC, displayed a time to new metastases after TKI EGFR progression shorter than patients with high MET overexpression without MET amplification.Conclusion: The MET amplification during EGFR TKI resistance is associated in EGFR muted NSCLC with a more aggressive tumor phenotype. These results argue for the early use of MET inhibitors in combination with EGFR TKIs to avoid the emergence of a more aggressive resistant tumor clone.

La migration cellulaire dirigée est un processus crucial lors du développement embryonnaire, de la cicatrisation, de la réponse immunitaire mais aussi lors de la formation de métastases. La réussite de ces processus nécessite que les cellules perçoivent un signal asymétrique, l'interprète et s'oriente pour migrer de façon dirigée. In vivo, la migration est dirigée par de nombreux signaux du microenvironnement cellulaire. L'hypoxie, ou diminution du niveau d'oxygène tissulaire, est une caractéristique importante de l'environnement cellulaire dans l'embryon et dans les tumeurs solides. Du fait de la limitation de la diffusion de l'oxygène, l'hypoxie génère in vivo des gradients d'oxygène. Nous avons développé une méthode originale dans laquelle des cellules épithéliales génèrent elles-mêmes gradient d'oxygène in vitro. Et de façon très intéressante, ces cellules sont capables de migrer de façon directionnelle vers des concentrations en oxygène plus élevées. Cette capacité d'aérotaxie est indépendante de la respiration mitochondriale et des acteurs de réponse à l'hypoxie. Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) seraient les médiateurs de la réponse migratoire au gradient. La production asymétrique de ROS entre l'avant et l'arrière des cellules serait à l'origine de l'activation différentielle du récepteur EGFR et de la persistance des cellules vers des concentrations plus importantes en oxygène. Cette capacité chimio-attractante de l'oxygène, connue chez les bactéries, mais non décrite pour des cellules eucaryotes, pourrait jouer un rôle majeur lors du développement embryonnaire et dans la dissémination métastatique / Cell migration is a crucial process during embryonic development, wound healing, immune system but also metastasis. Success of these processes relies on the capacities of cells to sense an asymmetric signal, interpret it and orient themselves to migrate in a directed manner. In vivo, migration is guided by several signals from the cellular microenvironment. Hypoxia, or decrease in the level of tissue oxygen, is an important feature of the cellular environment in the embryo and in solid tumors. Owing to the limitation of oxygen diffusion, hypoxia often generates oxygen gradients in vivo. We have developed an original method in which epithelial cells themselves generate oxygen gradient in vitro. And interestingly, these cells are able to migrate directionally to higher oxygen concentrations. This aerotaxis ability is independent of mitochondrial respiration and hypoxia response pathway. The reactive oxygen species (ROS) would mediate the migratory response to the gradient. The asymmetric production of ROS between the front and the back of the cells would be at the origin of the differential activation of the EGFR receptor and the persistence of cells towards higher oxygen concentrations. This chemoattractant capacity of oxygen, known in bacteria, but not described for eukaryotic cells, could play a major role in embryonic development and in metastatic dissemination

Contrôle de la signalisation oncogénique du mutant L858R de l'EGFR par la protéine suppresseur de tumeur p14ARF dans les adénocarcinomes pulmonaires. Le récepteur à l'EGF (EGFR) est un oncogène puissant impliqué dans le développement des cancers du poumon. Dans ces cancers, la présence de mutations activatrices de l'EGFR (majoritairement L858R et Del19) est un facteur prédictif de réponse aux agents pharmacologiques qui ciblent spécifiquement ce récepteur (EGFR-TKI). Cependant, l'association entre réponse thérapeutique et mutation est plus complexe que prévue, soulignant la nécessité d'approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans développement de ces cancers. Nous avons précédemment montré que la quasi-totalité des tumeurs pulmonaires avec des mutations activatrices de l'EGFR présente une expression faible ou indétectable de la protéine suppressive de tumeur p14ARF. Ces résultats nous ont conduites à émettre l'hypothèse que l'expression de p14ARF était un frein essentiel à l'expansion clonale de ces cellules. Nous décrivons pour la première fois une relation fonctionnelle entre p14ARF et du mutant L858R de l'EGFR dans laquelle p14ARF inhibe la croissance de cellules exprimant ce mutant en induisant leur apoptose. Les effets suppresseurs de tumeur de p14ARF impliquent une fonction pro-apoptotique originale de STAT3 qui conduit à l'inhibition de l'expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. De plus, nous montrons que les cellules EGFR-L858R maintiennent leur avantage de croissance en inhibant l'expression de p14ARF et la signalisation pro-apoptotique STAT3/Bcl-2 qui en découle. Nos résultats identifient également p14ARF comme une nouvelle cible transcriptionnelle de STAT3, mettant ainsi en évidence une boucle de rétrocontrôle positif entre ces deux protéines qui pourrait entretenir la signalisation pro-apoptotique médiée par STAT3. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que la réactivation de la voie p14ARF/STAT3/Bcl-2 pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique dans le traitement de ces cancers. / Control of EGFR-L858R oncogenic signaling pathway by the p14ARF tumor suppressor in lung adenocarcinoma. The EGF receptor (EGFR) is a strong oncogene involved in lung carcinogenesis. In these cancers, sensitivity to inhibitors of the EGFR tyrosine kinase activity (EGFR-TKI) has been shown to be related to the presence of activating mutations in the TK domain of EGFR (mainly L858R and Del19). However, the association between mutations and responsiveness to EGFR-TKI based treatment is more complex than previously envisioned, underlying the pressing need to study thoroughly the molecular mechanisms of lung cancer growth. We previously showed that almost all lung cancer with EGFR activated mutations has very low or undetectable levels of the p14ARF tumor suppressor protein. These results led us to postulate that expression of p14ARF is an efficient break against clonal proliferation of these cells. We report for the first time a relationship between p14ARF and mutant EGFR-L858R in which p14ARF inhibits the growth of EGFR-L858R expressing cells by inducing apoptosis. The p14ARF tumor suppressor effects involve an original STAT3 pro-apoptotic function that drives the inhibition of the anti-apoptotic Bcl-2 protein. Moreover, we show that the EGFR-L858R mutant maintains their survival and proliferation characteristics by inhibiting p14ARF expression and consequently the STAT3/Bcl-2 pro-apoptotic pathway. Our results also identify p14ARF as a new transcriptional target of STAT3, therefore providing evidence of a positive feed-back loop that could maintain STAT3 pro-apoptotic pathway. Based on these data, we suggest that manipulation of this pathway could be a therapeutic strategy for lung cancer treatment.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VivianeAOM_DISSERT.pdf: 3188421 bytes, checksum: 338aa2ec46045198a33e6eea1db0d483 (MD5) Previous issue date: 2014-02-13 / The radicular cysts (RCs) and dentigerous (DCs), despite having different etiologies, form a pathological cavity lined by epithelium, which grows due to the buildup of fluid inside, as the surrounding bone is reabsorbed and the epithelium will being induced to proliferate. The epithelial proliferation, which has been identified as one of the key processes in the growth of odontogenic cystic lesions, is influenced by growth factors such as EGFR (epidermal growth receptor factor) and podoplanin (PDPN), many of which may have its production stimulated mainly during inflammatory processes. The objective of this research was to evaluate and compare the immunohistochemical expression of EGFR and PDPN in 30 cases of RCs and 30 cases of DCs, semiquantitatively, in light microscopy, associating it with the degree of inflammation, cellular localization of immunostaining and with the immunostained epithelial layers. Data were statistically analyzed by Chi-square test and Fisher exact test, considering a significance level of 5 %. The results showed high immunoreactivity of both proteins in the lesions studied, only statistically significant difference was observed in immunostaining of PDPN (p=0.033), which proved higher in RCs. The other analyzed parameters showed no relevant significant differences. We conclude that, as EGFR and PDPN showed high immunoreactivity in cystic lesions analyzed, these proteins participate the pathogenesis of these lesions through the epithelial stimulation process, despite having different etiologies. Furthermore, it can infer that the higher immunostaining of PDNP in RCs that DCs showed no distinction indicator between the two lesions, regarding their etiologies, once this protein also showed a considerable expression in DCs, independent of the intensity of the inflammatory infiltrate / Os cistos radiculares (CRs) e dent?geros (CDs), apesar de possu?rem etiologias diferentes, formam uma cavidade patol?gica revestida por epit?lio, a qual cresce em fun??o do ac?mulo de l?quido em seu interior, ? medida que o osso ao redor ? reabsorvido e o epit?lio vai sendo induzido a proliferar. A prolifera??o epitelial, que tem sido apontada como um dos processos determinantes no crescimento das les?es c?sticas odontog?nicas, ? influenciada por fatores de crescimento como o EGFR (receptor do fator de crescimento epid?rmico) e a podoplanina (PDPN), muitos dos quais podem ter sua produ??o estimulada principalmente durante processos inflamat?rios. O objetivo desta pesquisa foi avaliar e comparar a express?o imunoistoqu?mica do EGFR e da PDPN em 30 casos de CRs e 30 casos de CDs, de forma semiquantitativa, em microscopia de luz, associando-a com o grau de inflama??o, localiza??o celular da imunocolora??o e com as camadas epiteliais imunomarcadas. Os dados foram avaliados estatisticamente por meio de testes do Qui-quadrado e Exato de Fisher, considerando-se um n?vel de signific?ncia de 5%. Os resultados mostraram que houve elevada imunorreatividade das duas prote?nas nas les?es estudadas, sendo observada apenas diferen?a estat?stica significativa na imunoexpress?o da PDPN (p=0,033), que se mostrou mais elevada nos CRs. Os demais par?metros analisados n?o demonstraram diferen?as significativas relevantes. Conclui-se que, como o EGFR e a PDPN apresentaram elevada imunoexpress?o nas les?es c?sticas analisadas, essas prote?nas participam da patog?nese dessas les?es atrav?s da estimula??o epitelial, apesar de apresentarem etiologias diferentes. Al?m disso, pode-se inferir que a maior imunomarca??o da PDPN em CRs do que em CDs n?o se mostrou indicador de distin??o entre as duas les?es, com rela??o ?s suas etiologias, uma vez que nestes ?ltimos essa prote?na tamb?m apresentou express?o consider?vel, independente da intensidade do infiltrado inflamat?rio

Les traitements des cancers des VADS reposent sur la chirurgie, la radiothérapie, et la chimiothérapie. Malgré ces traitements, la survie globale des patients à 5 ans est de l’ordre de 50%. Les causes d’échec thérapeutique sont dues au profil de résistance des tumeurs. Le ciblage de l’axe EGFR/mTOR/HIF-1 par une combinaison de rapalogues et d’anti-EGFR a montré son efficacité sur certaines tumeurs solides. L’objet de ce travail de thèse a été de caractériser l’impact d’une combinaison de drogues à faibles doses sur des lignées cellulaires des VADS au moyen d’une approche pharmacologique et moléculaires. Nos résultats montrent que la combinaison de la rapamycine (5nM) au cetuximab (2,5μg/ml) diminue la survie clonogénique des cellules et permet une inhibition du facteur de transcription HIF-1α. Cette combinaison de drogue améliore l’efficacité de la radiothérapie. En revanche, l’induction de HIF-2a induite par le traitement provoque la résistance des cellules aux traitements par, et une rechute rapide des tumeurs in vivo. L’inhibition de HIF-2 permet une inhibition de la survie cellulaire d’environ 100% dans un modèle résistant. / Management of HNSCC relies on surgery, radiotherapy, and chemotherapy. Despite these treatments, the 5 years overall survival of patient is lower than 50%. Main causes of therapeutic failure are due to the profile of resistance of tumors. The efficacy of a combination rapalogues and anti-EGFR therapies in targeting the EGFR/mTOR/HIF-1 axis in solid tumors was shown previously. In this PhD work, we have evaluated the impact of a low-dose drug combination on head and neck cancer cells lines with a pharmacological and molecular approach. We show that the combination of rapamycine (5nM) and cetuximab (2,5μg/ml) efficiently inhibits the HIF-1 transcription factor and impairs cell clonogenic survival. The efficacy of radiation therapy is improved by this drug combination. However, cell resistance to the treatment is acquired via the induction of HIF-2 in our resistant model cell line. This induction is associated with more tumor relapse in tumors mice xenograft. The inhibition of HIF-2 achieves a dramatic drop of cell clonogenic survival to < 1%.

Ce travail doctoral est centré sur la régénération du foie en conditions normales et au cours de la stéatose hépatique. Ces dernières décennies, de nombreux travaux ont utilisé des modèles d’invalidations géniques afin d’identifier les acteurs important au cours de la régénération hépatique. Dans ce contexte, il avait été observé que des animaux dont le signal de l’hormone de croissance était inhibé présentait un défaut majeur de prolifération hépatocytaire après hépatectomie. Dans un premier temps, notre laboratoire s’est donc intéressé à comprendre comment l’hormone de croissance contrôle la régénération hépatique au niveau moléculaire. Pour cela, nous avons pratiqué des hépatectomies sur des animaux dépourvus en récepteur de l’hormone de croissance (GHrKO). Nous avons ainsi montré que l’hormone de croissance jouait un rôle majeur au cours de la régénération hépatique en contrôlant l’expression d’EGFR ainsi que l’activation de Erk1/2. Dans un second temps, je me suis intéressée à une situation pathologique associée à une dérégulation de la voie de l’hormone de croissance : la stéatose hépatique. De façon intéressante, de nombreux modèles murins de stéatose hépatique présentent également une inhibition importante de la prolifération après hépatectomie partielle. Chez l’Homme, cette maladie (NAFLD pour Non alcoholic fatty liver disease) représente un facteur de risque lors de transplantations hépatiques et de résections majeures du foie. Grâce à l’analyse quantifiée de plusieurs paramètres issue de biopsies de patients obèses, nous avons montré l’existence d’une forte corrélation entre stéatose hépatique et diminution de l’expression de l’EGFR sur l’Homme. Nous avons également pratiqué des hépatectomies sur deux modèles de stéatose, l’un génétique (ob/ob) l’autre induit par un régime déficient en méthionine et choline (MCD). Les cinétiques de régénération post hépatectomie nous ont permis de confirmer un défaut de régénération hépatique chez les souris ob/ob et MCD. D’autre part, l’étude de ces modèles de stéatose nous a amenés à valider la dérégulation de la voie de l’hormone de croissance et la diminution transcriptionnelle de l’EGFR avant et après hépatectomie partielle. En parallèle, nous avons souligné l’implication de la voie inhibitrice de prolifération TGF-β, dans l’altération de la prolifération hépatocytaire des animaux ob/ob. En effet, de nombreux acteurs de cette voie sont surexprimés après l’hépatectomie partielle, participant certainement au défaut de régénération plus drastique observé sur ce modèle. Pour finir, nous avons également montré que l’injection sur une courte période d’hormone de croissance sur les animaux ob/ob restaure la prolifération hépatocytaire post hépatectomie. Ce sauvetage phénotypique est associé à une réexpression transcriptionnelle et protéique de l’EGFR. A terme, ces travaux nous amènent à proposer que la dérégulation de l’axe hormone de croissance/EGFR représente un mécanisme général associé à la stéatose hépatique et responsable du défaut de régénération du foie lié à cette maladie. / This doctoral work focused on liver regeneration in physiological conditions and during steatosis. These last decades, several studies used gene invalidation models to identify important actors during the liver regeneration. In this context, it had been observed that animals displaying a defect of growth hormone pathway had a drastic defect of liver regeneration after partial hepatectomy. Initially, we started this work by focusing on understanding how growth hormone controls liver regeneration at the molecular level. To do so, we performed partial hepatectomies on animals deleted for the growth hormone receptor gene (GHrKO). These results showed that growth hormone plays a central role in the control of liver regeneration through the expression of EGFR and the activation of Erk1/2. Secondly, we focused our attention on a pathological situation showing a defect of growth hormone signaling : hepatic steatosis. Interestingly, many mice models of hepatic steatosis also present a drastic inhibition of hepatocytes proliferation after partial hepatectomy. In Humans, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) represents an important risk factor regarding liver transplantations and resections. Through quantified analysis of several parameters from obese patient biopsies, we showed the existence of a strong correlation between hepatic steatosis and decrease in EGFR expression on humans. We also performed partial hepatectomies on two models of hepatic steatosis, one being genetic (ob/ob) and the other one being induced by a methionine choline deficient diet (MCD). Kinetics of regeneration post hepatectomy led us to confirm the defect of liver regeneration in on ob/ob and MCD mice. Moreover, the study of these steatotic models allowed us to corroborate the downregulation of the growth hormone signaling and the transcriptional decrease of EGFR expression. We also underlight the importance of TGF-β, a signaling pathway inhibiting proliferation, in the liver regeneration defect observed in ob/ob mice. Indeed, many members of this pathway have been found to be upregulated after partial hepatectomy, possibly being involved in the drastic regeneration defect observed in ob/ob mice. To finish, we also showed that growth hormone injections on a small period of time in ob/ob mice were capable of rescuing hepatocyte proliferation post hepatectomy. This phenotypic rescue was associated with a reexpression of EGFR at the transcription and protein level. This work led us to propose that the defect of the growth hormone/EGFR pathway represents a general mechanism associated with hepatic steatosis and is responsible for the liver regeneration defect linked to this disease.

La taille finale des organismes dépend de la vitesse et de la durée de croissance. Ces paramètres sont contrôlés par différentes hormones. La production d'hormone stéroïdienne détermine la fin de la période de croissance en déclenchant la maturité sexuelle, alors que la vitesse de croissance est régulée par la voie de signalisation de l’insuline/IGF (IIS). La vitesse de croissance des organismes est influencée par la nutrition. En effet, des défauts de croissance sont observés chez les individus souffrant de carence protéique chronique. La nutrition contrôle la croissance grâce à la voie de signalisation de l’insuline/IGF. Cependant, le mécanisme par lequel la nutrition contrôle la voie IIS est complexe et reste à élucider. Afin d’explorer cette régulation, le laboratoire utilise Drosophila melanogaster comme modèle d’étude. Chez la drosophile, il existe 8 insulin-like peptides (Dilps). Parmi eux, Dilp2 est la principale insuline promouvant la croissance systémique. Elle est produite par des neurones spécialisés appelés les Insulin Producing Cells (IPC), homologues des cellules béta du pancréas. La sécrétion de Dilp2 dans l’hémolymphe, équivalent du sang chez les vertébrés, est précisément ajustée en fonction de la nutrition. Cette régulation implique une communication inter-organe avec le corps gras, homologue du foie et du tissu adipeux blanc. Selon les conditions nutritionnelles, plusieurs signaux dérivés du corps gras (FDS) sont sécrétés et contrôlent la sécrétion de Dilp2. Ces FDS agissent directement ou indirectement sur les IPCs, via des relais neuronaux. Mon projet de thèse avait pour but de découvrir et d’étudier de nouvelles cibles neuronales contrôlant l’activité sécrétrice des IPCs, et par conséquent la croissance systémique, en fonction de la nutrition. J’ai identifié une paire de neurones inhibiteurs des IPCs, que l’on a nommé IPC-Connecting Neurons (ICN). Actifs en carence en acides aminés, ils inhibent la sécrétion des Dilps. J’ai montré que la signalisation EGFR réprime l’activité de ces neurones en condition nourrie, ce qui augmente la sécrétion des Dilps et par conséquent la taille des individus. Cette activation est due à un nouveau ligand d’EGFR : Growth Blocking Peptide (GBP). J’ai montré que ce ligand de type EGF possède des propriétés particulières puisqu’il agit de façon endocrinienne. En effet, en condition nourrie, GBP est sécrété par le corps gras dans l’hémolymphe, et atteint les ICN afin d’activer la signalisation EGFR. En conclusion, nous proposons que GBP produit par le corps gras en condition nourrie active la voie EGFR dans les neurones ICN, lève l’inhibition exercée sur les IPCs et stimule la sécrétion des Dilps. Cependant, les mécanismes moléculaires par lequel le couple GBP/EGFR inhibe l’activité neuronale des ICNs reste à élucider. Ce travail a permis d’identifier un nouveau mode de régulation de la sécrétion des insulines et de la croissance des organismes en fonction de la disponibilité et de la qualité nutritionnelle. / Body growth is tightly regulated by nutrient availability. Upon nutritional shortage, animals harmoniously reduce their body size by modulating the activity of the insulin/IGF signaling pathway (IIS). To understand how nutrition controls the IIS, we used Drosophila melanogaster as a model. Drosophila has a conserved IIS with 8 insulin-like peptides (Dilps), a unique insulin receptor and a conserved downstream signaling cascade. Among the Dilps, Dilp2 is the main growth-promoting factor. Dilp2 is produced by specialized neurons located in the brain, the Insulin-Producing-Cells (IPCs), functionally related to vertebrate beta cells. Dilp2 secretion is precisely adjusted in response to nutrition: it is released in the hemolymph under normal nutrient condition, but not upon dietary amino acid scarcity. This regulation requires several inter-organ cross-talks between the producing neurons and the fat body, which is the equivalent of the vertebrate white adipose tissue and liver. Depending on diet composition, several fat-derived signals (FDS) are secreted into the hemolymph and control Dilp2 secretion from the IPCs. These FDS act either directly or indirectly through a neuronal relay, to control the IPCs secretory activity. The aim of my PhD project was to better understand these regulations and to discover new neuronal relay controlling the IPCs secretory activity and body growth, according to nutrition. I identified a pair of neurons harboring synaptic connections with the IPCs (IPC-connecting neurons, ICNs). I determined that the ICNs activity is maximal upon amino acids shortage and is required to exert a blockage of the neighbouring IPCs. Moreover, in rich nutrient conditions, EGFR signaling prevents activation of the ICNs, allowing Dilp2 release from the IPCs. GBP1 and 2 are EGF-like peptides produced by the fat body in response to amino acids, and they can modify insulin release. However, the neural circuitries at play are unknown. I demonstrated that GBPs are atypical ligands for the EGF receptor (EGFR), with endocrine function. Using ex-vivo brain culture, I showed that the presence of the fat body-derived GBP1 in the hemolymph activates EGFR signaling in the ICNs and alleviates their inhibitory input on the IPCs, allowing Dilp2 release and therefore body growth. In conclusion, I identified a novel neural circuitry responding to fat-derived EGF-like GBPs, coupling dietary amino acids to the release of insulin-like peptides and systemic growth.