Introdução e objetivo: Elastase-1 fecal (EL-1) é um teste não invasivo que serve para avaliar a função pancreática exócrina. Neste estudo, buscou-se avaliar e quantificar a concentração da EL-1 fecal em pacientes com Fibrose Cística (FC), portadores da mutação ΔF508, e padronizar o teste Elastase monoclonal para a população estudada. Métodos: Estudo transversal prospectivo, com pacientes portadores de FC. Foram coletadas amostras de fezes para a quantificação da concentração da EL-1fecal pelo teste ELISA. A avaliação antropométrica baseou-se no percentil de IMC para crianças de 2 a 18 anos e percentil de P/E para crianças menores de 2 anos. Foi feita uma revisão nos prontuários dos pacientes para identificar a mutação da FC e coletar informações a respeito da dose da enzima administrada. Os desfechos analisados foram a insuficiência pancreática exócrina (IP) e sua intensidade, definida pela atividade da EL-1 fecal < 200μg/g. Resultados: Cinquenta e um pacientes com idade entre 4 meses e 17 anos participaram do estudo, divididos em 3 grupos: 17 homozigotos, 17 heterozigotos e 17 não ΔF508. A média de idade foi de 9,11 anos (± 4,74) e 62,8% eram do sexo masculino. As enzimas pancreáticas foram utilizadas em 46 pacientes (90,2%). Pacientes com o teste da EL-1 fecal com valores abaixo de 100μg/g representaram um total de 80,4% (n=41), sendo 17 homozigotos (41,5%), 14 heterozigotos (34,1%) e 10 com ausência de ΔF508 (24,4%). Houve associação estatisticamente significativa entre os homozigotos e a concentração da EL-1 fecal < 100μg/g. Todos os pacientes considerados IP pelo teste da EL-1 fecal faziam terapia de reposição enzimática (41 - 100%). Dez pacientes (19,6%) estavam com concentração da EL-1 fecal >200μg/g e, desses, 5 utilizavam enzimas pancreáticas. Onze pacientes (21,6%) apresentaram-se desnutridos, 10 (19,6%) em risco nutricional e 30 (58,8%) eutróficos. Não houve relação estatisticamente significativa entre estado nutricional, mutações e IP. Conclusões: A atividade de EL-1 fecal < 100 μg/g, indicativa de IP grave pelo teste, foi observada em 17/17 (100%) pacientes homozigotos para a mutação ΔF508 e em 14/17 (82,3%) heterozigotos para a mesma mutação. Não houve relação entre os valores de EL-1 fecal e o estado nutricional, avaliados pelo percentil do P/E para < 2 anos e percentil do IMC para >de 2 anos. O teste EL-1 fecal é de fácil execução e pode ser feito com uma pequena amostra de fezes; neste estudo, revelou-se útil na avaliação pancreática dos pacientes com FC. / Introduction and Objective: The fecal Elastase-1 (EL-1) is a noninvasive test used to assess exocrine pancreatic function. This study aims to assess and quantify the concentration of fecal Elastase -1 in patients with cystic fibrosis ΔF508 mutation carriers and to standardize the testing Elastase monoclonal test in our study group. Methods: Cross-sectional study with patients diagnosed with Cystic Fibrosis, being treated by the Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Feces were collected for the quantification of Elastase concentration by ELISA. Nutritional assessment was calculated by percentile of BMI for children aged 2 to 18 years and percentile P / E for children under 2 years. Patient charts were reviewed to identify the cystic fibrosis mutation and to collect information about the dose of enzyme administered. The results analyzed were the exocrine pancreatic insufficiency and its intensity, defined by the activity of fecal EL-1 <200μg/g. Results: Fifty-one patients with ages ranging from 4 months to 17 years participated in the study and were divided into 3 groups: 17 homozygotes, 17 heterozygotes and 17 non ΔF508. The average age was 9.11 years (± 4.74) and 62.8% were male. The pancreatic enzymes were used in 46 (90.2%) patients. Patients with Elastase test with values below 100μg/g represented a total of 80.4% (n = 41) and 17 (41.5%) homozygous, 14 heterozygous (34.1%) and 10 with no ΔF508 (24.4%). There was a statistically significant association between the homozygous and the concentration of fecal EL-1 <100μg/g. All patients identified as PI by the EL-1 fecal test were in enzyme replacement therapy 41 (100%). Ten patients (19.6%) had a concentration of EL-1 fecal >200 μg / g, and 5 of pancreatic enzymes used. Eleven (21.6%) patients were malnourished, 10 (19.6%) were at nutritional risk and for 30 (58.8%) the nutritional status was normal. There was no significant relationship between nutritional status, mutations and pancreatic insufficiency. Conclusion: The activity of EL Fecal -1 <100 μg/g indicative of severe PI by the test, was observed in 17/17 (100%) patients homozygous for the mutation ΔF508 and 14/17 (82.3%) heterozygous for the same mutation. There was no association between the levels of fecal EL-1 and nutritional status assessed by the percentile of the P/E < 2 years and BMI percentile for >2 years. The fecal Elastase-1 test can be easily performed with a small stool sample and proved useful in the pancreatic evaluation of patients with cystic fibrosis.

O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto do tratamento periodontal não cirúrgico sobre a atividade de elastase e o volume de fluido gengival nos pacientes portadores de periodontite crônica e agressiva generalizadas. Foram avaliados 18 pacientes com periodontite crônica (idade média 48,6 DP 7,5 anos), e 11 com periodontite agressiva (idade média 27,9 DP 6,54 anos). Foram utilizados os parâmetros clínicos de avaliação de profundidade de bolsa à sondagem (PB) (mm), nível de inserção (NI) (mm) e sangramento à sondagem (SS). As medidas clínicas e as amostras de fluido gengival foram colhidas a partir dos cinco sítios mais profundos (P) e de cinco sítios rasos com gengivite (G) de cada paciente, antes e 90 dias após o término do tratamento. As etapas clínicas obedeceram ao seguinte cronograma: seleção e exame periodontal; coleta de fluido gengival; tratamento periodontal; reavaliação, compreendendo o exame periodontal e coleta de fluido gengival. O tratamento levou, em média, 4 sessões de 40 minutos cada por paciente, com intervalo de 1 semana entre elas. As consultas para reavaliação foram feitas 90 dias após o término do tratamento. O teste de Wilcoxon foi utilizado para comparar os dados antes e depois do tratamento e o teste não pareado de Mann-Whitney U-test foi utilizado para comparar os grupos de periodontite crônica e agressiva. A amostra analisada antes e após o tratamento não apresentou diferenças significativas entre o grupo com periodontite crônica e agressiva, que responderam de forma similar a todos os indicadores avaliados, exceto para a profundidade de bolsa à sondagem nos sítios rasos com gengivite (p = 0,039) e para o sangramento à sondagem (p = 0,021) nos sítios profundos, ambos mais reduzidos na periodontite crônica após o tratamento. A elastase apresentou, após o tratamento, redução significativa nos sítios profundos, para a periodontite crônica (p = 0,012) e agressiva (p = 0,02). Em relação ao volume de fluido gengival, houve significativa redução após o tratamento nos pacientes com periodontite crônica e agressiva, tanto nos sítios rasos (p = 0,03 e p = 0,03) como nos profundos (p &#706; 0,001 e p = 0,003), respectivamente. Concluindo, os grupos com periodontite crônica e agressiva generalizadas comportaram- se de maneira semelhante frente à terapia mecânica não cirúrgica. Ainda, a terapia periodontal mecânica não cirúrgica mostrou redução significativa do volume de fluido gengival em todos os sítios analisados, e da atividade neutrofílica, nos sítios profundos, associada a reduções significativas em todos os indicadores clínicos analisados após o tratamento. / The aim of this study was to investigate the impact of non-surgical mechanical treatment on elastase activity and gingival crevicular fluids (GCF) volume of patients with untreated generalized chronic and aggressive periodontitis. Eighteen patients with generalized chronic periodontitis (mean age 48,6 SD 7,5 years old) and eleven with generalized aggressive periodontitis (mean age 27,9 SD 6,54 years old) were evaluated. The clinical parameters adopted were pocket probing depth (PPD) (mm); attachment level (AL) (mm) and bleeding on probing (PB). Clinical measures and GCF were collected from the 5 deepest sites (P) and from 5 shallow sites with gingivitis (G) from each patient of each group, before and 90 days after non- surgical periodontal treatment. There were adopted the following clinical steps: patients selection and periodontal exam; GCFs collection; periodontal treatment; re- evaluations, comprising periodontal exams and GCFs collection. The periodontal treatment lasted about about 4 sections with 40 minutes each, 1 section per week. Re-evaluations were performed 90 days after completion of the treatment. Wilcoxons statistic test compared the data before and after treatment and Mann-Whitneys non parametric U-test was used to compared chronic and aggressive periodontitis groups. There were no significant differences for all clinical parameters analysed before and after treatment,except for pocket probing depth on shallow sites (p = 0,039) and for bleeding on probing (p = 0,021) on deep sites, both in lower levels in chronic periodontitis after treatment. The elastases activity showed, after treatment, a significant reduction on deep sites for chronic (p = 0,012) and aggressive (p = 0,02) periodontitis. In concern to GCFs volume, there was significant reduction on both chronic and aggressive periodontitis, in shallow (p = 0,03 e p = 0,03) and in deep pockets (p &#706; 0,001 e p = 0,003), respectively, after treatment. In conclusion, both groups responded simmilarly to the mechanical non- surgical treatment. Moreover, non- surgical periodontal treatment showed significant reductions on GCFs volume on all analysed sites and reduction on neutrophilics activity, on deep sites followed by the significant reduction on clinical indicators after treatment.

Introdução e objetivo: Elastase-1 fecal (EL-1) é um teste não invasivo que serve para avaliar a função pancreática exócrina. Neste estudo, buscou-se avaliar e quantificar a concentração da EL-1 fecal em pacientes com Fibrose Cística (FC), portadores da mutação ΔF508, e padronizar o teste Elastase monoclonal para a população estudada. Métodos: Estudo transversal prospectivo, com pacientes portadores de FC. Foram coletadas amostras de fezes para a quantificação da concentração da EL-1fecal pelo teste ELISA. A avaliação antropométrica baseou-se no percentil de IMC para crianças de 2 a 18 anos e percentil de P/E para crianças menores de 2 anos. Foi feita uma revisão nos prontuários dos pacientes para identificar a mutação da FC e coletar informações a respeito da dose da enzima administrada. Os desfechos analisados foram a insuficiência pancreática exócrina (IP) e sua intensidade, definida pela atividade da EL-1 fecal < 200μg/g. Resultados: Cinquenta e um pacientes com idade entre 4 meses e 17 anos participaram do estudo, divididos em 3 grupos: 17 homozigotos, 17 heterozigotos e 17 não ΔF508. A média de idade foi de 9,11 anos (± 4,74) e 62,8% eram do sexo masculino. As enzimas pancreáticas foram utilizadas em 46 pacientes (90,2%). Pacientes com o teste da EL-1 fecal com valores abaixo de 100μg/g representaram um total de 80,4% (n=41), sendo 17 homozigotos (41,5%), 14 heterozigotos (34,1%) e 10 com ausência de ΔF508 (24,4%). Houve associação estatisticamente significativa entre os homozigotos e a concentração da EL-1 fecal < 100μg/g. Todos os pacientes considerados IP pelo teste da EL-1 fecal faziam terapia de reposição enzimática (41 - 100%). Dez pacientes (19,6%) estavam com concentração da EL-1 fecal >200μg/g e, desses, 5 utilizavam enzimas pancreáticas. Onze pacientes (21,6%) apresentaram-se desnutridos, 10 (19,6%) em risco nutricional e 30 (58,8%) eutróficos. Não houve relação estatisticamente significativa entre estado nutricional, mutações e IP. Conclusões: A atividade de EL-1 fecal < 100 μg/g, indicativa de IP grave pelo teste, foi observada em 17/17 (100%) pacientes homozigotos para a mutação ΔF508 e em 14/17 (82,3%) heterozigotos para a mesma mutação. Não houve relação entre os valores de EL-1 fecal e o estado nutricional, avaliados pelo percentil do P/E para < 2 anos e percentil do IMC para >de 2 anos. O teste EL-1 fecal é de fácil execução e pode ser feito com uma pequena amostra de fezes; neste estudo, revelou-se útil na avaliação pancreática dos pacientes com FC. / Introduction and Objective: The fecal Elastase-1 (EL-1) is a noninvasive test used to assess exocrine pancreatic function. This study aims to assess and quantify the concentration of fecal Elastase -1 in patients with cystic fibrosis ΔF508 mutation carriers and to standardize the testing Elastase monoclonal test in our study group. Methods: Cross-sectional study with patients diagnosed with Cystic Fibrosis, being treated by the Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Feces were collected for the quantification of Elastase concentration by ELISA. Nutritional assessment was calculated by percentile of BMI for children aged 2 to 18 years and percentile P / E for children under 2 years. Patient charts were reviewed to identify the cystic fibrosis mutation and to collect information about the dose of enzyme administered. The results analyzed were the exocrine pancreatic insufficiency and its intensity, defined by the activity of fecal EL-1 <200μg/g. Results: Fifty-one patients with ages ranging from 4 months to 17 years participated in the study and were divided into 3 groups: 17 homozygotes, 17 heterozygotes and 17 non ΔF508. The average age was 9.11 years (± 4.74) and 62.8% were male. The pancreatic enzymes were used in 46 (90.2%) patients. Patients with Elastase test with values below 100μg/g represented a total of 80.4% (n = 41) and 17 (41.5%) homozygous, 14 heterozygous (34.1%) and 10 with no ΔF508 (24.4%). There was a statistically significant association between the homozygous and the concentration of fecal EL-1 <100μg/g. All patients identified as PI by the EL-1 fecal test were in enzyme replacement therapy 41 (100%). Ten patients (19.6%) had a concentration of EL-1 fecal >200 μg / g, and 5 of pancreatic enzymes used. Eleven (21.6%) patients were malnourished, 10 (19.6%) were at nutritional risk and for 30 (58.8%) the nutritional status was normal. There was no significant relationship between nutritional status, mutations and pancreatic insufficiency. Conclusion: The activity of EL Fecal -1 <100 μg/g indicative of severe PI by the test, was observed in 17/17 (100%) patients homozygous for the mutation ΔF508 and 14/17 (82.3%) heterozygous for the same mutation. There was no association between the levels of fecal EL-1 and nutritional status assessed by the percentile of the P/E < 2 years and BMI percentile for >2 years. The fecal Elastase-1 test can be easily performed with a small stool sample and proved useful in the pancreatic evaluation of patients with cystic fibrosis.

O presente estudo tem como objetivo investigar a ação da insulina no desenvolvimento da resposta inflamatória aguda e crônica do enfisema pulmonar induzido por elastase pancreática de porco (EPP). Ratos machos da raça Wistar (aloxana, 42 mg/kg, i.v., 10 dias) e ratos controle foram instilados com solução salina fisiológica contendo EPP (0.25 UI/0.2 mL, pulmão direito) ou salina (pulmão esquerdo). Foram realizadas as seguintes análises: a) número de leucócitos presentes no lavado broncoalveolar dos animais, 6 h após a instilação com salina ou elastase (fase aguda); b) diâmetro médio alveolar (m), quantificação das fibras elásticas e colágenas (%), análise radiográfica do volume pulmonar e número de macrófagos alveolares (mm2) 50 dias após instilação com salina ou EPP (fase crônica). Ratos diabéticos apresentaram uma redução de 42% no número de neutrófilos presentes no lavado broncoalveolar, um aumento de 20% do diâmetro médio alveolar, um aumento de 15% do volume pulmonar e uma diminuição de 33% das fibras elásticas nos septos alveolares, sem alteração na quantidade de fibras colágenas. Não houve diferença no número de macrófagos. Tratamento dos ratos diabéticos com 4 UI de insulina NPH, 2 h após a instilação de elastase restaurou completamente o número de neutrófilos do lavado broncoalveolar. O diâmetro médio alveolar, volume pulmonar e a fração de área de fibras elásticas presentes nos septos alveolares foram semelhantes aos valores observados nos ratos controle, após o tratamento com 4 UI de insulina 2 h após a instilação, seguida de 2 UI/dia pelos próximos 50 dias. Além disso, observou-se aumento do número de macrófagos em ratos diabéticos tratados com insulina. Os resultados sugerem que a insulina modula o desenvolvimento das fases aguda e crônica do enfisema pulmonar induzido por EPP, assegurando uma reparação e remodelamento tecidual dentro dos limites da normalidade / The present study was undertaken to investigate the role of insulin in the development of acute and chronic inflammatory responses in porcine pancreatic elastase (PPE)-induced pulmonary emphysema. Diabetic male Wistar rats (alloxan, 42 mg/kg, i.v., 10 days) and control rats were instilled with physiological saline solution containing PPE (0.25 IU/0.2 mL, right lung) or saline only (left lung). The following analyses were performed: a) number of leukocytes in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of the animals, 6 h after saline or PPE instillation (acute phase); b) mean alveolar diameter (m), quantification of elastic and collagen fibers (%), radiographic analyses of lung volume, and number of alveolar macrophages (mm2) 50 days after saline or PPE instillation (chronic phase). Relative to controls, alloxan-induced diabetic rats presented 42% reduction in the number of neutrophils in BAL fluid, 20% increase in mean alveolar diameter, 15% increase in lung volume, 33% decrease of elastic fibers in alveolar septa, without changes in the content of collagen fibers. There were no differences in the number of macrophages. Treatment of diabetic rats with 4 IU neutral protamine Hagedorn (NPH) insulin, 2 h before elastase instillation restored the number of neutrophils in BAL fluid. Mean alveolar diameter, lung volume, and elastic fibers in alveolar septa matched the values observed in control rats, after treatment with 4 IU NPH insulin 2 h before instillation, followed by 2 IU/day for the next 50 days. Furthermore, increased number of macrophages was observed in insulin-treated diabetic rats. Data presented suggest that insulin modulates the development of acute and chronic phases of PPE-induced pulmonary emphysema, assuring normal repair and tissue remodeling.

INTRODUÇÃO: O comprometimento pancreático em pacientes com Doença de Crohn (DC) é objeto de poucos estudos, porém as poucas séries sobre o assunto indicam um acometimento de uma parcela significativa dos pacientes, variando de 1,2% a 58%. O ultra-som endoscópico (EUS) apresenta a vantagem de apresentar uma sensibilidade muito maior que o ultra-som abdominal e a tomografia computadorizada. Quando comparado à colangiopancreatografia retrógrada endoscópica, este possui, além de uma maior sensibilidade, um índice de complicações significativamente menor. OBJETIVOS: Avaliar a incidência de alterações pancreáticas ao ultra-som endoscópico em pacientes com Doença de Crohn, correlacionando com fatores clínicos, bioquímicos e endoscópicos. MÉTODOS: Cinqüenta e um pacientes com DC, com idade entre 18 e 60 anos (média de 38 anos), sem história prévia de doença pancreática, diabetes mellitus ou alcoolismo, foram submetidos ao exame de EUS. O grupo controle foi formado por 20 pacientes submetidos ao EUS e que não apresentavam história de doença pancreato-biliar ou de Crohn. Dados clínicos, endoscópicos e laboratoriais foram coletados para posterior correlação. Onze variáveis ecoendoscópicas foram analisadas, tanto ductais quanto parenquimatosas. Os pacientes com três ou mais alterações foram submetidos à colangiorressonância magnética (CRNM). Para análise da função pancreática, foi realizado dosagens de elastase fecal em 39 pacientes. RESULTADOS: Dos pacientes analisados, 56% pertenciam ao sexo feminino, com tempo médio de diagnóstico da enfermidade de 7 anos e índice de atividade da doença (CDAI) médio de 102. Dois pacientes, (3,9%) apresentaram quatro alterações ecoendoscópicas, três pacientes, (5,9%) possuíram três alterações, 11 pacientes, (21,5%) tiveram duas alterações e 13 pacientes, (25,5%) apresentaram apenas uma alteração ao EUS. As alterações parenquimatosas totalizaram 39 achados, contra 11 alterações ductais. Apenas três pacientes (16%) do grupo controle apresentaram uma alteração ecoendoscópica (p<0,001). Os pacientes com três ou mais alterações ao EUS realizaram a CRNM, que não mostrou alterações em nenhum dos casos. Quatro pacientes, (10%) apresentaram dosagens de elastase fecal compatíveis com insuficiência pancreática exócrina, sem apresentar correlação com a ecoendoscopia. O único fator preditivo correlacionado com o número de alterações ao EUS foi doença ileal exclusiva. CONCLUSÕES: Os pacientes com DC possuíram uma alta incidência de anormalidades na morfologia pancreática (aproximadamente 10% com três ou mais alterações no EUS). Estas alterações foram localizadas predominantemente em parênquima, o que pode justificar a falta de correlação com a CRNM / BACKGROUND: Pancreas injury usually is not mentioned as an extra-intestinal manifestation of Crohns disease, but the few available series suggest pancreatic injury in a significant proportion of these patients, ranging from 1.2% to 58% in this series. Endoscopic ultrasound (EUS) presents the advantage of having a much higher sensitivity than the abdominal ultrasound or computadorized tomography in evaluating pancreas abnormalities. Compared to the endoscopic retrograde cholangiopancreatography, EUS has at least an equal sensitivity, with a lower complication rate. AIMS: To evaluate the incidence of pancreatic alterations by means of the EUS in Crohns disease, correlating them with clinical, endoscopic and biochemical data. METHODS: Fifty one patients with Crohns disease, age between 18 and 60 years-old (mean = 38), without previous history of pancreatic disease, diabetes mellitus or alcoholism, were submitted to EUS. The control-group was formed by 20 patients submitted to EUS with no previous history of pancreatic or Crohns disease. Clinical, endoscopic and biochemical data were collected in order to determine possible predictive factors. Eleven variables were analyzed, both in pancreatic parenchyma and ducts. The patients with 3 or more alterations were submitted to magnetic resonance. Pancreatic function was determined using fecal elastase assay in 39 patients. RESULTS: Of the 51 analyzed patients, 56% were female, with mean diagnosis time of seven years (1-25) and Crohns disease Activity Index (CDAI) of 102 (20-419). Two patients (3.9%) presented 4 alterations in the EUS exam, 3 (5.9%) presented 3 alterations, 11 (21.5%) had 2 alterations and 13 (25.5%) had 1 alteration in the EUS, which were statistically significant when compared to the control-group, in whom only 16% presented 1 exam alteration (p<0.001). The parenchymal abnormalities were more common, totalizing 39 findings when compared to 11 ductal abnormalities. The patients with 3 or more alterations in the exam were submitted to magnetic resonance; however, pancreatic lesions were not detected. Four patients (10%) had low fecal elastase measurement, suggestive of exocrine pancreatic insufficiency. None of these patients had significant pancreatic alterations in EUS. The only predictive factor that correlated with the number of alterations in EUS was isolated ileal disease. CONCLUSIONS: Patients with Crohns disease had a higher incidence of pancreatic abnormalities (10% with 3 or more alterations in endoscopic ultrasound) in comparison to the control-group. These alterations were found most frequently in the pancreatic parenchyma, which might explain the lack of correlation with the magnetic resonance, which is more prone to detect duct abnormalities. The only predictive factor to these alterations on EUS was ileal disease

Chronic wounds are a major financial and clinical burden causing the deaths of millions per year. Over expression of elastase is well documented as the main culprit that delays the normal wound repair process within chronic wounds. The aim of this thesis is to design a responsive chronic wound dressing based on the hydrogel polymer, PEGA (polyethylene glycol acrylamide) in the form of particles to mop-up excess elastase by exploiting polymer collapse in response to elastase hydrolytic activity within sample fluids mimicking the environment of chronic wounds. PEGA particles were functionalised with enzyme cleavable peptides (ECPs) containing charged residues. Upon cleavage the charge balance changes, causing polymer swelling and consequent elastase entrapment. The pH range of chronic wounds is reported in the range of 5.45 - 8.65. Due to its pI which is around 8.3, within this range elastase exist both in its cationic and anionic forms. To accommodate a hydrogel dressing that could selectively entrap excess elastase both in its cationic and anionic, oppositely charged ECPs were designed. In its cationic form, elastase was found to have a high preference of cleaving ECPs and penetrating into PEGA particles bearing negative charges. In contrast, in its anionic form the opposite effect was observed, wherein elastase preferred to cleave ECPs and penetrate PEGA particles bearing positive charges. The diffusion, accessibility and entrapment of elastase into functionalised PEGA particles was explored using various fluorescence microscopy techniques. Removal of the charged residue by elastase showed a reduction in particle swelling causing the pores of PEGA particles to become restricted. In this manner, cleaved PEGA particles prevented the accessibility of molecules with a molecular weight as low as 20 kDa into the cleaved PEGA particles. Since elastase has a molecular weight of 25.9 kDa the collapsing of the pores within PEGA particles entrapped elastase inside the interior of cleaved PEGA particles. In its cationic form (at pH 7.4) elastase was found to penetrate and become trapped more into both negative and positive PEGA particles compared to neutral particles. The negative particles were shown to trapped cationic elastase within 2 minutes compared to the positive particles. In contrast, the neutral particles failed to retain and encapsulate elastase as the fluorescence inside the neutral particles was found to decrease. Coinciding with these observations, after sample fluids containing elastase were treated with functionalised PEGA particles, the residual elastase activity in sample fluids was reduced more by the charged PEGA particles compared to neutral particles. The cell culture studies demonstrated that the elastase activity observed in human dermal fibroblasts (HDF) was also reduced more by the charged particles compared to the neutral particles. However, the positive particles were found to significantly reduced HDF-elastase activity compared to both the negative and neutral PEGA particles. Overall, this thesis exemplifies that on the basis of charge selective cleaving of ECPs coupled to PEGA particles can be exploited to selectively remove excess proteases such as elastase from sample fluids mimicking the environment of chronic wounds.

Introdução: A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) está freqüentemente associada a comorbidades crônicas como a doença cardiovascular, o diabetes mellitus e a hipertensão. O presente estudo tem por objetivo investigar as alterações morfológicas e funcionais no coração secundárias ao enfisema pulmonar em ratos diabéticos. Métodos: Ratos Wistar machos adultos (200 ± 20 g, n = 36) foram destinados à avaliação ecocardiográfica, análise morfométrica do coração e pulmões e análise da taxa de sobrevida. O diabetes mellitus foi induzido por aloxana (42 mg/kg, iv) 10 dias antes da indução do enfisema pulmonar por instilação de elastase (0,25 UI/100 g de peso corpóreo). Um grupo de ratos diabéticos recebeu tratamento com insulina NPH (4 UI antes da elastase, seguido de 2 UI/dia, 50 dias). Os experimentos foram realizados 50 dias após a instilação. Resultados: Ratos diabéticos e respectivos controles instilados com elastase apresentaram aumentos similares no diâmetro médio alveolar, cujos valores correlacionam-se positivamente com aumentos na espessura da parede (p=0,0022), na área da cavidade (p=0,0001) e espessura dos cardiomiócitos (p=0,0001) do ventriculo direito (VD). Ratos tornados diabéticos por injeção de aloxana exibiram redução na espessura da parede do ventrículo esquerdo (VE), no septo interventricular (IV) e na espessura dos cardiomiócitos. Estas variáveis morfométricas associaram-se à redução da fração de encurtamento do VE (p < 0,05) e a aumento no tempo de relaxamento isovolumétrico do VE (p < 0,05). A taxa de sobrevida reduziu-se de 80% em ratos diabéticos a 40% em ratos diabéticos instilados com elastase (p < 0,05). Conclusões: O diabetes por aloxana em ratos não modifica a hipertrofia do VD secundária ao enfisema pulmonar, porém induz disfunção ventricular esquerda. A manifestação de ambas as doenças, diabetes mellitus e enfisema pulmonar, reduz substancialmente a taxa de sobrevida, enfatizando a condição de comorbidade na coexistência de diabetes e DPOC / Background: Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is often associated with chronic comorbid conditions of cardiovascular disease, diabetes mellitus and hypertension. This study aimed to investigate morphological and functional alterations of the heart secondary to chronic emphysema in diabetic rats. Methods: Adult male Wistar rats (200 ± 20 g, n=36) were used for echocardiographic measurements, morphometric analyses of the heart and lungs, and survival rate. Diabetes mellitus was induced by alloxan (42 mg/kg, iv) 10 days before the induction of pulmonary emphysema by the instillation of elastase (0.25 IU/100 g body weight). A group of diabetic rats was treated with NPH insulin (4 IU before elastase, plus 2 IU/day, 50 days). Experiments were performed 50 days after instillation. Results: Both elastase-instilled diabetic rats and matching controls exhibited similar increases in mean alveolar diameter, which are positively correlated with increases in RV wall thickness (p=0.0022), cavity area (p=0.0001), and cardiomyocyte thickness (p=0.0001). Alloxan-diabetic rats demonstrated a reduction in left ventricular (LV) wall, IV septum, and cardiomyocyte thickness, associated with a reduction in LV fractional shortening (p<0.05), and an increase in LViv relaxation time (p < 0.05). Survival rate decreased from 80% in diabetic rats to 40% in elastase-instilled diabetic rats. Conclusions: Alloxan diabetes did not affect RV hypertrophy secondary to chronic emphysema, but induced LV dysfunction. The association of diabetes and emphysema substantially reduced the survival rate, emphasizing the comorbid condition of the coexistence of diabetes and COPD

Neutrophile Granulocyten wirken als einer der ersten Abwehrmechanismen gegen invasive Mikroorganismen im angeborenen Immunsystem von Mammalia. Aktiviert durch inflammatorische Signale verlassen diese Granulocyten das vaskuläre System und migrieren durch das Gewebe zum Infektionsherd. Dort binden sie die Mikroorganismen, phagozytieren und eliminieren diese schließlich mit hoher Effizienz. Humane Neutrophile Elastase (NE) ist Bestandteil der neutrophilen Granula und spielt eine entscheidende Rolle im Abbau von Virulenzfaktoren enteroinvasiver Bakterien, einschließlich der Shigella Virulenzfaktoren IpaB (invasion antigen plasmid B) und IcsA (intracellular spread A). NE gehört zu der Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, die sich durch Sequenz- und Strukurähnlichkeit auszeichnen, jedoch sehr unterschiedliche biologische Funktionen aufweisen. Cathepsin G (CG) ist wie NE eine Chymotrypsin-ähnliche Serinprotease und ebenfalls in neutrophilen Granula lokalisiert. Allerdings zeigt CG keine Aktivität gegenüber Virulenzfaktoren von Shigella. Obwohl die Kristallstrukturen von CG und NE fast identisch sind, konnten einzelne oder mehrere Aminosäuren in der Substratbindungsspalte identifiziert werden, die zwischen den beiden Enzymen differieren. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Spezifität von NE gegenüber Virulenzfaktoren in diesen Unterschieden codiert sein könnte. Daher wurden diese Aminosäuren durch die analogen CG Aminosäuren oder durch Alanin ersetzt. Der Vergleich der funktionellen Eigenschaften der NE Mutanten mit wildtyp NE zeigte, dass die Aminosäuren an den Positionen 98 und 216-224 entscheidend für die Substratspezifität von NE sind. Die NE Mutanten N98A, 216-218 und 216-224 waren nicht mehr in der Lage, die Virulenzfaktoren IcsA und IpaB sowie das NE Peptidsubstrat abzubauen. Stattdessen haben diese Mutanten die Fähigkeit erlangt, das CG Peptidsubstrat abzubauen. Zusammenfassend konnten wir Aminosäuren in NE identifizieren, die sowohl die Spezifität von NE für das Peptidsubstrat als auch für die Virulenzfaktoren von Shigella flexneri determinieren. / Neutrophil granulocytes are one of the first lines of defense of the mammalian innate immune system against invading microorganisms. In response to inflammatory stimuli, neutrophils migrate from the blood stream to infected tissues where they bind, engulf and inactivate microorganisms efficiently. Human neutrophil elastase (NE), a neutrophil granule component, is a key host defense protein that rapidly destroys virulence factors of enteroinvasive pathogens including IpaB (invasion plasmid antigen B) and IcsA (intracellular spread A) from Shigella. NE belongs to the family of chymotrypsin-like serine proteases with sequence and structural similarity but with very different biological functions. Cathepsin G (CG) is another abundant chymotrypsin-like serine protease in neutrophil granules. However, in contrast to NE, CG does not cleave virulence factors of Shigella. The crystallographic structures of NE and CG are very similar but we identified single or multiple residues in the substrate-binding cleft to differ in these two enzymes. We hypothesized that NE specificity for bacterial virulence factors resides within these structural differences. Therefore these specific residues in NE were replaced with the analogous amino acids of CG or with alanine. By comparing the functional properties of these NE mutants to wildtype NE we were able to show that the amino acids at position 98 and 216-224 are crucial for the substrate specificity of NE. The NE mutants N98A, 216-218 and 216-224 did not cleave the virulence factors IcsA and IpaB as well as the NE peptide substrate but cleaved the CG peptide substrate. In summary, we identified residues in NE that determine the specificity of NE for the peptide substrate and for the Shigella flexneri virulence factors.

Introdução: As citocinas desenvolvem papel importante na fisiopatologia da DPOC. Estudos sugerem que a IL-17 modula respostas inflamatórias e infecciosas, podendo ser alvo para o tratamento da inflamação pulmonar. Objetivos: Avaliar os efeitos preventivos e terapêuticos do anti IL-17 num modelo de lesão pulmonar induzida pela elastase em camundongos C57Bl6. Métodos: Foram utilizados 32 camundongos C57Bl6, machos, com idade entre 6 e 8 semanas e peso médio de 20-28 gramas, divididos em 4 grupos: 1. GRUPO SAL: os animais receberam solução salina intra-peritoneal (IP) 3 horas antes de serem submetidos à instilação intra-traqueal (IT) de salina, e salina IP nos dias 25, 26 27 e 28 pós instilação IT de salina; 2. GRUPO ELASTASE CONTROLE (EC): receberam salina IP 3 horas antes de receberem elastase IT, e salina IP nos dias 25, 26, 27 e 28 pós instilação de elastase; 3. GRUPO ELASTASE + ANTI IL-17 PREVENTIVO (EP): receberam anti IL-17 IP 3 horas antes de receberem elastase IT, e salina IP nos dias 25, 26, 27 e 28 pós instilação de elastase; 4. GRUPO ELASTASE + ANTI IL-17 TERAPÊUTICO (ET): receberam salina IP 3 horas antes de receberem elastase IT, e anti IL-17 IP nos dias 25, 26, 27 e 28 pós instilação de elastase. No 29º dia, os animais foram anestesiados, traqueostomizados, conectados ao aparelho FlexiVent (Scireq, Montreal, Canadá), e foram avaliados: resistência do sistema respiratório (Rrs), elastância do sistema respiratório (Ers), resistência de vias aéreas (Raw), resistência do parênquima pulmonar (Gtis), elastância do parênquima pulmonar (Htis), óxido nítrico exalado (NOex), e obtida a contagem das células totais do fluido do lavado broncoalveolar (FLBA). Depois, os animais foram exsanguinados, coração e pulmão foram retirados em bloco. Os pulmões foram fixados com formaldeído 4% a uma pressão constante de 20 cmH2O, por 24 horas. Após esse período, os pulmões foram mantidos em álcool 70% por até 36 horas, e em seguida foram preparados para o processamento histológico para avaliação de MMP9, MMP12, TIMP-1, TGF-beta, lumican, biglicano, decorina, fibronectina, iNOS, eNOS, isoprostano 8-iso-PGF-2alfa, NF-Kb, IL-17, IL-1beta, IL-8, TNF-alfa, neutrófilos, e fibras colágenas e elásticas em vias aéreas e septos alveolares. Foi analisado também o intercepto linear médio (Lm). Resultados: Em relação aos parâmetros Rrs, Ers, Raw, Htis, NOex e número de células totais no FLBA houve aumento no grupo EC em comparação ao grupo SAL (p < 0,05). O tratamento preventivo e terapêutico com anti IL-17 diminuiu os valores de Rrs, Ers, Raw e Htis (p < 0,05). Não houve diferença entre os grupos em relação ao Gtis. Em ambos os tratamentos houve redução do NOex comparados ao grupo EC (p < 0,05). Quanto ao número de células totais no FLBA, houve redução no grupo ET em relação ao EC e EP (p < 0,05), porém não houve diferença entre os grupos EC e EP. Ao realizar a contagem do diferencial de células do FLBA, houve redução apenas no número de macrófagos no grupo ET (p < 0,05). O tratamento preventivo e terapêutico com anti IL-17 também diminuiu o número de células positivas para NF-kb, iNOS, MMP9, MMP12, TGF-beta, isoprostano 8-iso-PGF-2alfa, TNF-alfa,IL-8, IL-1beta e IL-17, e contagem de neutrófilos em vias aéreas e nos septos alveolares quando comparados do grupo EC (p < 0,05), assim como a fração de volume de fibras colágenas, decorina e lumican em vias aéreas, e fibras elásticas e fibronectina no parênquima pulmonar (p < 0,05). Houve aumento do intercepto linear médio no grupo EC comparado ao SAL, e o tratamento com anti IL-17 diminuiu esses valores nos grupos EP e ET (p < 0,05). Houve redução de fibras colágenas em septos alveolares e biglicano em vias aéreas no grupo EP, e redução de células positivas para eNOS em vias aéreas somente no grupo ET em relação ao grupo EC (p < 0,05). Não houve diferença entre os grupos EC, EP e ET nos resultados de TIMP-1, fibronectina em vias aéreas e lumican nos septos alveolares. Conclusão: O anticorpo monoclonal anti IL-17 neste modelo de tratamento, tanto administrado de forma preventiva (atuando no bloqueio imediato da ação da elastase) quanto de forma terapêutica (depois das alterações estabelecidas pelas lesões iniciais), contribuiu para melhora da maioria dos parâmetros funcionais avaliados na mecânica pulmonar, inflamação, remodelamento da matriz extracelular e a resposta ao estresse oxidativo nos septos alveolares e nas paredes das vias aéreas neste modelo de lesão pulmonar induzida pela elastase administrada por via intra-traqueal / Introduction: Cytokines play an important role in the pathophysiology of COPD. Studies suggest that IL-17 modulates inflammatory and infectious responses and may be targeted for treatment of pulmonary inflammation. Objectives: To evaluate preventive and therapeutic effects of antiIL-17 in a model of lung injury induced by elastase in C57Bl6 mice. Methods: Thirtytwo male C57Bl6 mice, aged 6 to 8 weeks and mean weight of 20-28 grams, were divided into 4 groups: 1. SAL GROUP: animals received intra-peritoneal saline (IP) 3 hours before being submitted to intra tracheal (IT) instillation of saline, and IP saline on days 25, 26, 27 and 28 after saline IT instillation; 2. ELASTASE CONTROL (EC) GROUP: received IP saline 3 hours prior to IT elastase, and IP saline on days 25, 26, 27 and 28 post elastase instillation; 3. ELASTASE + PREVENTIVE ANTI IL-17 (EP) GROUP: received anti IL-17 IP 3 hours before receiving IT elastase, and IP saline on days 25, 26, 27 and 28 post elastase instillation; 4. ELASTASE + THERAPEUTIC ANTI IL-17 (ET) GROUP: received IP saline 3 hours before receiving elastase IT, and anti IL- 17 IP on days 25, 26, 27 and 28 post elastase instillation. On 29th day, the animals were anesthetized, tracheostomized, connected to FlexiVent apparatus (Scireq, Montreal, Canada), and evaluated: respiratory system resistance (Rrs), respiratory system elastance (Ers), airway resistance (Raw), pulmonary parenchyma resistance (Gtis), pulmonary parenchyma elastance (Htis), exhaled nitric oxide (NOex), and total bronchoalveolar lavage fluid (FLBA) cell count. Afterwards, the animals were exsanguinated, heart and lung were removed in block. The lungs were fixed with 4% formaldehyde at a constant pressure of 20 cmH2O for 24 hours, maintained in 70% alcohol for up to 36 hours and then prepared for histological processing for MMP9, MMP12, TIMP-1, TGF-Beta, lumican, biglycan, decorin, fibronectin, iNOS, eNOS, isoprostane 8-iso-PGF-2Alpha, NF-kb, IL-17, IL-1Beta, IL- 8, TNF-Alpha, neutrophils, and collagen and elastic fibers in airways and alveolar septa. The mean linear intercept (Lm) was also analyzed. Results: In relation to the parameters Rrs, Ers, Raw, Htis, NOex and number of total cells in FLBA, there was an increase in EC group compared to SAL group (p < 0.05). Preventive and therapeutic treatment with anti IL-17 decreased the values of Rrs, Ers, Raw and Htis (p < 0.05). There was no difference between groups regarding to Gtis. In both treatments there was NOex reduction compared to EC group (p < 0.05). Regarding the number of total cells in FLBA, there was reduction in ET group in relation to EC and EP (p < 0.05), but there was no difference between EC and EP groups. When counting the FLBA cell differential, there was reduction only in number of macrophages in ET group (p < 0.05). Preventive and therapeutic treatment with anti IL-17 also decreased the number of positive cells for NF-kb, iNOS, MMP9, MMP12, TGF-Beta, isoprostane 8-iso-PGF-2Alpha, TNF-Alfa, IL-8 , IL-1Beta and IL-17, and number of neutrophils, in airways and alveolar septa when compared to EC group (p < 0.05), as well as the volume fraction of collagen fibers, decorin and lumican in airways, and elastic fibers and fibronectin in alveolar septa (p < 0.05). There was increase in mean linear intercept in EC group compared to SAL, and treatment with anti IL-17 decreased the values of Lm in EP and ET groups (p < 0.05). There was reduction of collagen fibers in alveolar septa and biglycan in airways in EP group, and reduction of positive cells for eNOS in airways only in ET group in relation to EC group (p < 0.05). There was no difference between EC, EP and ET groups in results of TIMP-1, fibronectin in airways and lumican in alveolar septa. Conclusion: Anti IL-17 monoclonal antibody in this treatment model, both administered as a preventive way (acting on the immediate block of elastase action) and therapeutically (after changes established by the initial lesions), contributed to improvement of most functional parameters evaluated in pulmonary mechanics, inflammation, remodeling of extracellular matrix and response to oxidative stress in alveolar septa and airways in this model of lung injury induced by intratracheal elastase.

A ruptura do aneurisma da aorta abdominal está entre as principais causas de óbito. A alta morbi-mortalidade associada à ruptura e tratamento dos aneurismas representa um grande desafio aos médicos e um alto risco aos pacientes. Apesar dos modelos experimentais serem úteis para compreendermos, treinarmos, testar novos métodos diagnósticos e terapêuticos para esta doença, os modelos existentes até o momento ainda não são os ideais. Nos modelos existentes, os animais são muito pequenos e não representam a doença nos humanos, ou o procedimento envolve laparotomia, ou o comportamento do aneurisma criado não é semelhante ao de um aneurisma verdadeiro. Desenvolvemos, a partir de uma abordagem minimamente invasiva, um método eficiente de induzirmos a formação de um aneurisma verdadeiro na aorta abdominal infrarrenal de porcos Large White. Os animais foram submetidos a indução química a partir de uma aplicação por via endovascular de cloreto de cálcio a 25% ou elastase pancreática suína. Os animais controles foram submetidos a tratamento com soro fisiológico (NaCl 0,9%). Todos os animais foram submetidos à mesma técnica operatória, sob anestesia geral. Os animais foram acompanhados com exames ultrassonográficos com Doppler semanalmente, e as aortas colhidas para testes biomecânicos e análise histológica após 4 semanas. Apesar das aortas tratadas com elastase apresentarem apenas dilatação, estudos de imagens, histológicos e biomecânicos mostraram que as aortas tratadas com cloreto de cálcio evoluíram para aneurismas verdadeiros, com comportamento biomecânico semelhante ao dos aneurismas de humanos. Estes resultados/achados indicam que a abordagem endovascular para a indução de aneurisma é factível e não ocasiona uma fibrose retroperitoneal / Abdominal aortic aneurysms rupture are among the main causes of death. The high morbidity and mortality associated with aneurysm rupture and repair represents a challenge for surgeons and high risk for patients. Although experimental models are useful to understand, train, and develop new treatment and diagnostic methods for this disease, animal models developed to date are far from ideal. Animals are either too small and do not represent the pathology of humans, or the procedures employ laparotomy, or the aortic behavior does not resemble that of a true aneurysm. We developed a novel, less invasive and effective method to induce true aortic aneurysms in Large White pigs. Animals were submitted to an endovascular chemical induction using either calcium chloride (25%) or swine pancreatic elastase. Controls were exposed to saline solution. All animals were operated on using the same surgical technique under general anesthesia. They were followed weekly with ultrasound examinations and at 4 weeks the aorta was harvested. Although elastase induced only arterial dilation, imaging, histological, and biomechanical studies of the aorta revealed the formation of true aneurysms in animals exposed to calcium chloride. Aneurysms in the latter group had biomechanical failure properties similar to those of human aneurysms. These findings indicate that the endovascular approach is viable and does not cause retroperitoneal fibrosis