La memòria que es presenta està composta per dos treballs d'investigació que tot i estar relacionats, formen cadascun un capítol independent. En la primera part del treball s'ha realitzat l'estudi del proteoma de Mycoplasma penetrans mitjançant electroforesis bidimensional i espectrometria de masses. S'ha generat un mapa de referència del proteoma d'aquest patogen humà, que compren els rangs de pH de 4 a 11 en tres finestres, de 4 a 7, de 6 a 9 i de 7 a 11NL (No lineal). Mitjançant tinció especifica s'ha obtingut el fosfoproteoma d'aquest organisme en el rang de pH de 4 a 7, i també s'han determinat els llocs específics de fosforilació de dos proteïnes, un transportador ABC i el Factor de elongació Tu. En la segona part del treball s'ha realitzat l'anàlisi del proteoma de Mycoplasma genitalium, ampliant la informació ja existent sobre el proteoma d'aquest patogen humà. S'ha analitzat el proteoma d'aquest organisme en fase de creixement estacionaria final utilitzant gradients estrets de pH. Per aquest micoplasma també s'ha generat una imatge del fosfoproteoma en el rang de pH de 4 a7, i s'ha pogut, també, determinar el lloc específic de fosforilació d'una proteïna implicada en l'adhesió d'aquest micoplasma, la proteïna P110. / La memoria que se presenta está formada por dos trabajos de investigación que todo y estar relacionados entre si, forman cada uno un capítulo independiente. En la primera parte del trabajo se ha realizado un estudio del proteoma de Mycoplasma penetrans mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Se ha generado un mapa de referencia del proteoma de este patógeno humano, que comprende el rango de pH de 4 a 11 en tres ventanas, de 4 a 7 de 6 a 9 y de 7 a 11NL (no lineal). Mediante tinción específica se ha obtenido el fosfoproteoma de este organismo en el rango de pH de 4 a 7, y también se han determinado los sitios específicos de fosforilación de dos proteínas, un transportador ABC y el Factor de elongación Tu. En la segunda parte del trabajo se ha realizado un análisis del proteoma de Mycoplasma genitalium, ampliando la información ya existente sobre el proteoma de este patógeno humano. Se ha analizado el proteoma de este organismo en la fase de crecimiento estacionaria final utilizando gradientes estrechos de pH. Para este micoplasma también se ha generado una imagen del fosfoproteoma en el rango de pH de 4 a 7, y se ha podido determinar también, el sitio específico de fosforilación de una proteína implicada en la adhesión de este micoplasma, la proteína P110. / The report herein presented is composed of two research works that although they are related, they form an independent chapter. In the first part of this research the proteome of Mycoplasma penetrans has been analyzed using the combination of two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. A proteome reference map of this human pathogen has been constructed including the pH ranges of 4 to 11 in three windows, from 4 to 7, from 6 to 9 and from 7 to 11NL (Non lineal). With a specific phosphoprotein staining method, the phosphoproteome of this microorganism has been obtained in the pH range of 4 to 7. The specific phosphorylation sites have been characterized for two proteins, an ABC transporter and the Elongation Factor Tu. In the second part of this research, the proteome of Mycoplasma genitalium has been analyzed, extending the previous information of the proteome of this human pathogen. The proteome of this microorganism has been analyzed in the final stationary growth phase using narrow pH gradients. The phosphoproteome has been also analyzed for this microorganism using the specific phosphoprotein staining in the pH range of 4 to 7. The specific phosphorylation site has been characterized in a protein involved in adhesion, the protein P110.

La concentració de proteïnes dels vins blancs és de l'ordre de miligrams per litre. Aquestes proteïnes presenten en el vi càrrega elèctrica positiva degut a que tenen un punt isoelèctric superior al pH del vi. Aquesta càrrega les fa reaccionar amb les substàncies carregades negativament en el vi, especialment polifenols i alguns clarificants addicionats. Aquestes proteïnes influeixen negativament en la qualitat dels vins degut a la tendència a precipitar i produir enterboliments però confereix al vi propietats positives pel que respecta a la estabilització de l'escuma en els vins escumosos i a la influència sobre la volatilitat de les molècules responsables de la aroma dels vins blancs, augmentant llur permanència. El treball realitzat ha consistit en la posta a punt d'un mètode de separació de les proteïnes dels vins per mitjà de tècniques de cromatografia en columna a baixes pressions, coneguda com FPLC. Aquest mètode te una gran precisió i repetibilitat. Així es poden separar les proteïnes del vi en una proteïna de 60 kDa i un nombre variable en una franja de 20 a 30 kDa, que presenten diferent càrrega elèctrica. La fracció de inferior massa molecular presenta un perfil de separació segons la carrega elèctrica diferent per las cinc varietats viníferes estudiades: chardonnay, pinot noir, macabeu, xarel.lo i parellada. S'observa una disminució de la concentració de proteïna durant el procés de vinificació que afecta a totes les fraccions separades; no obstant aquesta davallada és major a les fraccions de 20 a 30 kDa de més càrrega elèctrica positiva, el que s'explica per una més gran reactivitat en front als compostos amb carrega negativa en el vi. S'ha estudiat la influència del temps de contacte amb els baixos fins de fermentació sobre les diferents fraccions de proteïnes sense observar cap variació significativa pel fraccionament estudiat. Al llarg de la maduració s'ha detectat un increment de la concentració de proteïna a la fracció de baixa massa molecular, mentre que la fracció de 60 kDa es manté en concentracions similars en el període estudiat. D'aquesta fracció de 20 a 30 kDa s'ha constatat un increment més gran de les proteïnes amb menys càrrega elèctrica. Després d'analitzar el fraccionament de la fracció de 20 a 30 kDa per bescanvi catiònic de les cinc varietats viníferes durant dos anys s'han observat perfils característics per cada varietat vinífera que permeten classificar-les en funció de les fraccions obtingudes, el que fa pensar en una possible eina per la caracterització varietal. / Proteins are present in white wines in small amounts (a few milligrams per litre). These proteins have a positive electric charge because their isoelectric point is higher than the pH of the wine. This charge makes them react with the negatively-charged substances in the wine, particularly polyphenols or fining agents. These proteins have a negative effect on the wine quality due to their tendency to precipitate and produce cloudiness but they are also positive because they stabilize the foam in sparkling wines and increase the permanence of the molecules responsible for the aroma of white wines.The study consisted of establishing a method for separating proteins from wines using column chromatography techniques at low pressures known as FPLC. This method has high precision and repeatability. Thus the proteins in wine can be separated into a protein of 60 kDa and a variable number of proteins ranging from 20 to 30 kDa, which have different electrical charges. The fraction with the lowest molecular weight has a separation profile which depends on the electrical charge for the five grape varieties studied: Chardonnay, Pinot Noir, Macabeo, Xarel·lo and Parellada.The protein concentration decreases during the vinification process in all the separated fractions. However, this decrease is more pronounced in the fractions from 20 to 30 kDa which had larger positive charges because they react more to the negatively-charged compounds in the wine. The effect of the contact time between the low fermentation fines and the different protein fractions was studied but no significant variation in the fractioning studied was observed. Throughout the maturation the protein concentration was seen to increase in the low molecular weight fraction, while the concentration of the 60 kDa fraction hardly changed. In the 20 to 30 kDa fraction there was a greater increase in proteins with less electrical charge. The fractioning of the 20 to 30 kDa fraction by cationic exchange of the five grape varieties was analyzed for two years and characteristic profiles were observed for each variety which enables them to be classified according to the fractions obtained. This suggests that it may be a possible tool for characterizing varieties.

La Tesi Doctoral amb el títol "Tècniques de preconcentració combinades amb l'electroforesi capil·lar per a la determinació d'antibiòtics beta-lactàmics" s'ha basat en el desenvolupament de diferents estratègies per a millorar la sensibilitat de l'electroforesi capil·lar. Aquestes estratègies s'han aplicat a la determinació d'antibiòtics beta-lactàmics en diferents matrius.Els antibiòtics beta;-lactàmics són uns fàrmacs àmpliament utilitzats tant en humans com en animals amb finalitats terapèutiques i profilàctiques. A més, en veterinària també s'empren com a promotors del creixement. Degut al seu extens ús i a que sovint no són completament metabolitzats per l'individu tractat amb aquests fàrmacs, ha sorgit la problemàtica de la seva presència en el medi ambient i en productes alimentaris de consum humà a baixos nivells de concentració. Això ha provocat l'aparició de resistències a aquest tipus d'antibiòtics fet que va lligat a la pèrdua d'eficàcia bacteriana. Així doncs, és important el desenvolupament de mètodes analítics per tal de controlar la presència d'aquests compostos a baixos nivells de concentració.L'electroforesi capil·lar (CE) és una interessant estratègia per a la determinació d'aquests antibiòtics degut al seu elevat poder de separació, bona resolució i gran eficàcia. A més, els volums de reactius, solvents orgànics i mostra que habitualment s'empren són molt baixos i això es tradueix en un baix cost econòmic i un mínim impacte mediambiental. Tot i això, l'CE presenta una limitació important que és la limitada de sensibilitat en la determinació d'analits a baixos nivells de concentració. Amb l'objectiu de millorar la sensibilitat de la tècnica, en la present Tesi Doctoral s'han estudiat diferents estratègies per tal de preconcentrar els analits i així incrementar la seva concentració prèviament a la separació electroforètica.D'entre les diferents opcions per a preconcentrar els analits es destaquen les tècniques electroforètiques, basades en la variació de la mobilitat dels analits en diferents medis, i les tècniques cromatogràfiques que consisteixen, fonamentalment, en la retenció dels analits en un sorbent d'extracció en fase sòlida (SPE) i la posterior elució en un volum de solvent més petit que el de la mostra. En la present Tesi Doctoral s'han aplicat els dos tipus de tècniques en diferents modalitats. Pel que fa a l'aplicació de les tècniques electroforètiques, les diferents opcions estudiades es van establir en funció del mode de separació electroforètica emprat i en el cas de les tècniques cromatogràfiques el paràmetre que es va tenir en compte, va ser el tipus d'acoblament entre l'SPE i l'CE. Finalment, per tal de millorar encara més la sensibilitat de l'CE es va emprar la combinació d'una tècnica electroforètica i una cromatogràfica.Així doncs, s'han avaluat diferents tècniques electroforètiques de preconcentració en la determinació d'antibiòtics beta-lactàmics per electroforesi capil·lar per zones (CZE), cromatografia de microemulsió electrocinètica (MEEKC) i cromatografia micel·lar electrocinètica (MEKC). Tots els sistemes emprats s'han basat en la introducció d'un gran volum de mostra i la posterior eliminació de la matriu de la mostra de forma que en tots els casos s'han millorat els límits de detecció obtinguts.Pel que fa a les tècniques de preconcentració cromatogràfiques, les diferents combinacions entre l'SPE i el sistema electroforètic que s'han utilitzat són: l'off-line, l'in-line i l'on-line. En tots els casos s'ha aconseguit una important millora de la sensibilitat dels mètodes d'anàlisi ja que els límits de detecció obtinguts emprant l'etapa d'SPE són considerablement més baixos. A diferència de les tècniques electroforètiques, en aquest cas, la preconcentració sovint implica una neteja de la matriu de la mostra de forma que ha estat possible l'aplicació dels mètodes desenvolupats a mostres reals tal com aigües de riu o residuals d'hospital i fins i tot matrius biològiques com plasma de vaca. / The thesis entitled "Combination of preconcentration techniques with capillary electrophoresis for determining beta-lactam antibiotics" has been focused in the development of several strategies for improving sensitivity in capillary electrophoresis. These strategies have been applied for determining beta-lactam antibiotics in different matrices. beta-Lactam antibiotics are a family of drug compounds widely used in human and veterinary medicine with therapeutic and prophylactic aims. Moreover, in veterinary medicine they have been used as growth promotors. However, abusive and inappropriate use of antibiotics has led to unexpected problems. On the one hand, they are thought to be responsible for the appearance of bacterial strains that are resistant to antibiotics. As a result, antibiotics can not treat infections efficiently. On the second hand, the presence of antibiotics in the food chain can lead to allergic reactions in certain patients. Therefore, it is important to control their presence in different samples.Capillary electrophoresis (CE) is a good strategy for the determination of these antibiotics due to its high efficiency, resolution and separation power. Moreover, the amount of reagents, organic solvents and sample needed are really small which makes this technique in a cheap and green one. However, CE presents an important drawback, it lacks sensitivity when low concentration levels are needed. To solve this, in the thesis, several strategies have been studied in order to preconcentrate the analytes and then increase their concentration prior to the electrophoretic separation.Among the different options for preconcentrating analytes it is important to emphasize the electrophoretic-based and the chromatographic-based techniques. The first ones are based on the principle of focusing the analytes according to their different velocities in two separate zones inside the capillary. Of the chromatographic techniques, solid-phase extraction (SPE) is the most important and allows a large sample volume with low concentration to be converted into a low sample volume with higher concentration.Both, electrophoretic and chromatographic-based techniques have been applied in this thesis for improving sensitivity. Regarding to the application of the firsts ones, different separation modes were studied. When the chromatographic preconcentration was used, the studies differ in how they combine SPE and CE. In this way different preconcentration techniques have been evaluated by capillary zone electrophoresis (CZE) and micellar and microemulsion electrokinetic chromatography (MEKC, MEEKC). In all the cases, a large sample volume has been introduced into the capillary and then, the sample matrix has been removed in a way that the detection limits decreased.As far as chromatographic preconcentration is concerned, the combinations studied between SPE and CE were: off-line, in-line and on-line. Unlike when the electrophoretic preconcentration is used, by using the chromatographic-based one, the sample preconcentration usually involves a sample clean-up. So, it allows the analysis of real samples like river water, hospital sewage water or even biological matrices like cow plasma. Detection limits considerably decreased so, a great improvement in sensitivity has been achieved. Finally, in order to increase even further the sensitivity in CE, the combination of electrophoretic and chromatographic techniques has been studied.

La Electroforesis Capilar en Fase Micelar (MECC) es una nueva técnica de separación desarrollada a partir de la Electroforesis Capilar en Zona (CZE) y basada en principios tanto cromatográficos como electroforéticos, capaz de separar compuestos aniónicos y neutros conjuntamente: mientras que para los compuestos neutros el fundamento de la separación es similar al de la cromatografía líquida, para los compuestos aniónicos la separación está basada principalmente en sus diferentes movilidades electroforéticas.La presente tesis doctoral se ha planteado con el objetivo principal de profundizar en esta técnica analítica y estudiar su aplicación en la determinación de compuestos de interés medioambiental, concretamente herbicidas de las familias de los fenoxiácidos y las fenilureas y productos derivados de su degradación. Para ello se ha dividido la memoria en 5 capítulos:En el capítulo 1º se realiza una introducción de la técnica CZE, estudiándose fundamentos teóricos de separación y detección y su instrumentación. Finalmente se realiza un pequeño estudio experimental de separación de varios herbicidas fenoxiácidos. Con ello se obtiene una base teórica y experimental sobre la Electroforesis Capilar necesaria para el capítulo 2º, en el cual se profundiza en el análisis mediante MECC. En este capítulo se estudian las bases teóricas de esta técnica y se aplica en la resolución de una mezcla de herbicidas fenoxiácidos y fenilureicos. El estudio de la técnica MECC se completa en el capítulo 3º, donde se optimiza la separación de la mezcla de los herbicidas adicionando a la disolución de trabajo diferentes alcoholes alifáticos. Se discuten las variaciones experimentales observadas y se desarrolla un modelo teórico que explica estas variaciones. En este modelo entran en juego factores como las características fisico-químicas de las micelas y sus variaciones cuando están en contacto con alcoholes lineales.En el capítulo 4º intentamos superar una de las mayores limitaciones de la Electroforesis Capilar que es la falta de sensibilidad. Para ello se desarrollan sistemas de pre-concentración de la muestra on-line, basados en la inyección de grandes volúmenes de muestra y la posterior eliminación de parte la matriz que contiene esta muestra, y sistemas de pre-concentración off-line mediante columnas de extracción en fase sólida de carbono grafitizado. Con estos dos procedimientos de concentración se consigue llegar a las sensibilidades necesarias para utilizar el sistema MECC en el análisis de pesticidas de muestras medioambientales.Toda la información obtenida en los capítulos anteriores es aplicada en el capítulo 5º en un estudio de degradación de varios herbicidas fenoxiácidos y fenilureicos. Para ello se tuvo en cuenta diversas vías de degradación como son la fotodegradación o la hidrólisis, y diferentes condiciones ambientales. Con este estudio se consiguieron datos relevantes en la comprensión de los mecanismos de degradación de los herbicidas estudiados: cinéticas de reacción y constantes de velocidad de degradación, productos de derivados de la fotodegradación y la hidrólisis, etc. / Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC) is a new separation technique developed from Capillary Zone Electrophoresis (CZE) and based on chromatographic and electrophoretic principles. It is able to separate anionic and neutral compounds simultaneously. The separation of neutral compounds by MECC is similar to that by Liquid Chromatography. For anionic compounds, the separation is largely based on its different electrophoretic mobilities. The main objective of this doctoral thesis is to study this analytical technique and its application in the determination of compounds of environmental interest, concretely, phenylurea and phenoxyalkyl acid herbicides and products derived of their degradation. The thesis has been divided in 5 chapters: In the 1st chapter, it is carried out an introduction of CZE procedure, being considered theoretical principles of separation and detection and their instrumentation. It finishes by performing a brief experimental study of separation of several phenoxyalkyl acid herbicides. We obtain a theoretical and experimental basis about Capillary Zone Electrophoresis required in 2nd chapter, in which we examine the analytical technique MECC. In this chapter, the theoretical principles of this technique are developed and applied in the resolution of a mixture of phenylurea and phenoxyalkyl acid herbicides. The study of MECC is completed in 3rd chapter, where the separation of the mixture of herbicides is optimised adding aliphatic alcohols. The observed experimental variations are discussed and explained by a theoretical model. In this model, it is explained factors like the physico-chemical characteristics of the micelles and their variations when they are in contact with aliphatic alcohols. In the 3rd chapter, we try to overcome one of the biggest limitations in the Capillary Electrophoresis: the sensibility. We develop on-column sample pre-concentration systems, based on the injection of a very large volume of sample and the elimination of the sample matrix. We also expose off-column sample pre-concentration systems by means of solid phase extraction cartridge of graphitized carbon black. With these concentration procedures, it was possible to achieve the necessary sensibilities to use MECC system in environmental analysis. All the information obtained in previous chapters is applied in 5th chapter in a degradation study of several phenylurea and phenoxyalkyl acid herbicides. We kept in mind various degradation processes like photodegradation or hydrolysis and different environmental conditions. We reach interesting data to the understanding of degradation mechanisms of the determined herbicides: kinetic of reaction and degradation constants, products derived of photodegradation and hydrolysis, et cetera.

La nucleoplasmina (NP) és la proteïna majoritària del nucli dels oòcits i ous no fecundats de la granota "Xenopus laevis" i altres amfibis. Es tracta d'una proteïna acídica amb tres trams acídics principals (A1, A2, A3). La NP participa en la remodelació de la cromatina durant la fecundació, mediatitzant la descondensació de la cromatina espermàtica i facilitant l'acoblament de nucleosomes gràcies a la seva funció de xaperona molecular. En el decurs d'aquest treball s'ha continuat l'estudi dels diferents recombinants de la NP de què disposem, posant especial èmfasi en la forma mutant r-NP142, que es caracteritza pel fet que té el tram acídic principal A2 molt exposat. Interessava determinar la influència de diferents condicions en l'estabilitat i el grau de pentamerització de la molècula. En aquesta mateixa línia es va estudiar el paper de les Cys de la NP en la pentamerització. Mitjançant mutagènesi dirigida es van substituir les Cys per Ser i es va observar que concretament la mutació de la Cys 45 afavoria la monomerització de la forma r-NP142, però no afectava l'oligomerització de les formes r-NP i r-NP121, les quals romanien pentamèriques. Aquests resultats suggereixen que no hi hauria ponts disofre en l'estructura pentamèrica de la nucleoplasmina. La caracterització estructural de la nucleoplasmina es va intentar abordar a diferents nivells. A nivell de l'estructura secundària, es van utilitzar tècniques de dicroisme circular. Concretament es va determinar que el mutant r-NP142 C45S tenia una estructura plegada a l'atzar (random coil). D'altra banda, per a ordres estructurals superiors es van utilitzar tècniques de microscòpia electrònica i tècniques cristal·logràfiques. Un altre objectiu d'aquest treball va ser la caracterització de les interaccions de l'NP amb histones del nucli del nucleosoma. Estàvem especialment interessats a veure si la interacció NP-histones era fonamentalment de tipus electrostàtic o bé podria tractar-se d'algun altre tipus d'interacció. Mitjançant ultracentrifugació analítica i gradients de sacarosa es va poder determinar que la NP podia unir els quatre tipus d'histones nucleosòmiques. Aquesta unió tindria una estequiometria corresponent a 1 mol de pentàmer de NP per mol d'octàmer d'histones. Cal destacar que la NP pot unir també histones tripsinitzades (sense les cues bàsiques) mantenint la mateixa estequiometria que per al cas de les histones natives. Així mateix, la forma r-NP121 (sense el tram acídic A2) és capaç d'unir histones natives amb la mateixa estequiometria descrita per als casos anteriors. Aquests experiments indiquen que la interacció NP-histones no seria predominantment electrostàtica. Un altra línia de treball va ser estudiar la presència o no d'una NP-like a l'extracte d'oòcits de l'estrella de mar "Echinaster sepositus". S'ha trobat una proteïna majoritària que presenta les propietats de ser termoestable, acídica i parcialment resistent al sulfat amònic. Aquesta proteïna és reconeguda pels anticossos policlonals antinucleoplasmina obtinguts en ous de gallina. D'altra banda, no és capaç de descondensar nuclis espermàtics que contenen protamina.El darrer objectiu del treball va ser l'estudi estructural de la proteïna ?0. La ?0 és específica del nucli espermàtic de l'equinoderm "Holothuria tubulosa" i presenta propietats intermèdies entre les protamines i les histones. La cristal·lització d'una molècula d'aquestes característiques aportaria informació sobre l'estructura de les proteïnes que participen en la compactació de la cromatina i podria obrir un nou camí per a la cristal·lització de les protamines i dels complexos NP-protamina. / Nucleoplasmin (NP) is the most abundant protein found in the nuclei of oocytes and nonfertilized eggs of "Xenopus laevis" and other amphibians. It is an acidic protein with three main acidic tracts (A1, A2, A3). NP is involved in the remodelation of chromatin during fecundation, facilitating nucleosome assembly as a molecular chaperone.In the present work we have continued the study of different recombinant forms of nucleoplasmin which were obtained in our lab, specially the form r-NP142 which has the main acidic tract A2 very exposed. We were interested in how different conditions could affect the stability and pentamerization of the molecule. In this way we studied the importance of Cys in NP pentamerization. We used site directed mutagenesis in order to change Cys for Ser. We observed that the mutation of Cys 45 favoured the monomerization of r-NP142, but this change didn't affect the oligomerization of the forms r-NP and r-NP121, which remained pentameric. These results suggest the absence of disulfide bridges in the pentameric structure of nucleoplasmin. The structural characterization of nucleoplasmin has been studied at different levels. At the secondary structure level we have used circular dichroism techniques and we have determined that the mutant r-NP142 C45S is in random coil conformation. For higher structural levels we have used electron microscopy and crystallographic techniques.Another objective of this work was the characterization of the interactions between NP and nucleosomal core histones. We were specially interested in knowing if the interaction was fundamentally electrostatic. Using analytical ultracentrifugation and sucrose gradient experiments we could determine that NP can bind the four types of nucleosomal histones. This binding would have an stoichiometry equal to 1 mol of NP pentamer per mol of histone octamer. It is important to note that NP can bind trypsinated histones (without the basic tails) maintaining the same stoichiometry as in the case of native histones. In the same way, the r-NP121 form (without the acidic tract A2) is capable of binding native histones with the same stoichiometry described for the other cases. These result indicates that the interaction NP-histones is not mainly electrostaticaly driven.Another objective of this work was the study of the presence of some NP-like proteins in oocyte extracts of the starfish "Echinaster sepositus". We have found a very abundant protein which is termoestable, acidic and partially resistant to ammonium sulphate. This protein is recognized by policlonal antinucleoplasmin antibodies which were obtained in hen eggs. However, it is not able to decondense spermatic nuclei which contain protamine.The last objective of the present work was the structural study of the protein ?0 which is specific of the nuclei of the echinoderm "Holothuria tubulosa" and has intermediate properties between histones and protamines. The crystallization of a molecule like ?0 could bring information about the structure of proteins that participate in chromatin condensation and could offer a new way for the crystallization of protamines and NP-protamine complexes.

La MDMA és cap de sèrie dels entactògens. El seu consum provoca toxicitat aguda i neurodegeneració a mig/llarg termini del sistema serotoninèrgic. Es postula que la bioactivació metabòlica podria ser responsable del desenvolupament de neurotoxicitat.La MDMA té un centre estereogènic. Es consumeix com a racemat, però els enantiòmers tenen perfils farmacològics diferenciats. A més, la MDMA té una depuració metabòlica enantioselectiva i autoinhibible (CYP2D6). Aquesta tesi presenta l'enantioselectivitat de la depuració metabòlica de la MDMA en consumidors recreatius participants d'un assaig clínic (dosi: 100 mg).Es sintetitzà material de referència i es desenvolupà metodologia per a l'anàlisi enantioselectiu i diastereoselectiu dels compostos.S'estudià l'enantioselectivitat en el metabolisme fins a 48h post-administració, obtenint-se raons (R)-MDMA/(S)-MDMA>1 i en augment amb el temps. Les raons del metabòlits majoritaris foren pràcticament constants i properes a 1, possiblement degut a la inhibició metabòlica del CYP2D6 i a la participació d'altres enzims no enantioselectius. / La MDMA es la cabeza de serie de los entactógenos. Su consumo provoca toxicidad aguda y neurodegeneración serotonérgica a medio/corto plazo. Se postula que una bioactivación metabólica podría ser responsable del desarrollo de neurotoxicidad.La MDMA tiene un centro estereogénico. Se consume como racemato, pero los enantiómeros tienen perfiles farmacológicos diferenciados. Además, presenta depuración metabólica enantioselectiva y autoinhibible (CYP2D6).Esta tesis presenta la enantioselectividad de la depuración metabólica de la MDMA en consumidores recreativos participantes de un ensayo clínico (dosis: 100 mg).Se sintetizó material de referencia y se desarrolló metodología para el análisis enantioselectivo y diastereoselectivo de los compuestos.Se estudió la enantioselectividad en el metabolismo hasta 48h post-administración, obteniéndose relaciones (R)-MDMA/(S)-MDMA>1 y en aumento con el tiempo. Las relaciones de los metabolitos mayoritarios fueron prácticamente constantes y cercanas a 1, posiblemente debido a la inhibición metabólica del CYP2D6 y a la participación de otros enzimas no enantioselectivos. / MDMA is the head of entactogenic compounds. Its consumption causes acute toxicity and mid/long term serotonergic neurodegeneration. It is postulated that a metabolic bioactivation may be responsible for development of neurotoxicity.MDMA has a stereogenic center. It is consumed as a racemate, but its enantiomers have different pharmacological profiles. Also, MDMA presents an enantioselective and self-inhibited metabolic disposition (CYP2D6).The present thesis shows data about enantioselective metabolic disposition of MDMA in recreative consumers that participated in a clinical trial (dose: 100 mg).It was synthesised reference material and it was developed methodology for both enantioselective and diastereoselective analysis MDMA and its main metabolites.It was studied the enantioselectivity in the metabolism after 48h post-administration. (R)-MDMA/(S)-MDMA ratios were >1 and increasing over time. Major metabolites ratios were practically constant and close to 1, possibly because of the metabolic inhibition of CYP2D6 and the role of other non-enantioselective enzymes.

L'adenocarcinoma pancreàtic és una neoplàsia amb mal pronòstic per la que no existeixen marcadors específics. En aquesta tesi s'han estudiat possibles alteracions de les estructures glucídiques de la ribonucleasa pancreàtica humana (RNasa 1) de sèrum amb l'objectiu de determinar el seu ús diagnòstic. S'han descrit les estructures glucídiques de la RNasa 1 sèrica i de línies cel·lulars endotelials, i s'ha observat un increment en la proporció d'estructures biantenàries amb Fc en la RNasa 1 sèrica de pacients amb càncer de pàncreas, fet que podria ser d'utilitat diagnòstica. També, donada la gran similitud entre les estructures glucídiques descrites per la RNasa 1 sèrica i per l'endotelial, l'origen de la RNasa 1 sèrica sembla ser principalment endotelial. La RNasa 1 també s'ha avaluat per electroforesi bidimensional i s'ha establert una correlació entre el contingut d'àcid siàlic i el seu pI, fet que pot ajudar a la interpretació dels mapes bidimensionals d'altres glicoproteïnes. / Pancreatic adenocarcinoma has one of the highest mortality rates of all neoplasias and it has no specific markers. In this work, possible alterations in the glycan structures of human pancreatic ribonuclease (RNase 1) present in serum are investigated with the aim of determining its diagnostic utility. Serum and endothelial RNase 1 glycan structures have been described and an increase of biantennary structures with Fc in serum RNasen 1 from pancreatic cancer patients could be observed, what can be of diagnosis utility. Also, due to the high similarity between serum RNase 1 and endothelial RNase 1 glycan structures, it was concluded that endothelium can be the main producer of serum RNase 1. RNase 1 was also evaluated by two-dimensional electrophoresis and a correlation between the sialic acid content and the observed pI decrease could be establish, what may be very significant for understanding and interpreting two-dimensional maps from other glycoproteins.

El càncer de pàncrees és altament agressiu i representa la cinquena causa de mort al mon occidental. Anteriorment, en el nostre laboratori, vam identificar que el receptor tissular del plasminogen (tPA) hi està sobre-expressat i juga un paper important el la progressió tumoral. En la present tesi hem profunditzat en l'estudi del mecanisme molecular de tPA i seus receptors en aquest càncer. En primer lloc hem caracteritzat en detall la interacció de tPA amb Annexina A2 (principal receptor de tPA en endoteli i altament expressada en pàncrees) demostrant que les dades publicades sobre la seqüència responsable de la interacció no eren correctes. A més a més hem caracteritzat les proteïnes de lisats cel·lulars pancreàtics que interaccionen amb tPA mitjançant un assaig pull down i posterior anàlisi proteòmic. de tot identificant un conjunt de possibles lligands de tPA. D'entre aquests hem seleccionat galectina 1, una lectina que mai s'ha descrit que interaccioni amb tPA, per realitzar la caracterització bioquímica i funcional del seu paper com a nou lligand de tPA en càncer de pàncrees. / Pancreatic cancer is a highly aggressive disease and represents the fifth cause of death in occidental world. Our laboratory has previously reported tissue type plasminogen activator (tPA) over expression in this cancer and its role in tumoral progression. During the present thesis we have studied tPA and its molecular mechanism through its receptors in this tumor.We have first characterized tPA interaction with annexin A2 (its main receptor in endothelium and highly expressed in pancreas). Our results showed that published data about the sequence responsible of this interaction was not correct. We have also identified a set of new putative tPA receptors in pancreatic cell lisates using a pull down assay and proteomic analysis. One of the proteins identified was galectin 1, a lectin with not know relation with tPA. We performed a biochemical and functional characterization of the interaction between these two proteins in pancreatic cancer.