Com o objetivo de avaliar os equinos alojados no Jóquei Clube de São Paulo, Brasil, quanto a presença de anticorpos contra Theileria equi e Babesia caballi, foram testadas 180 amostras de soro sanguíneo por meio da técnica de C-ELISA (Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), metodologia atualmente recomendada pela OIE (Organização Internacional de Epizootíases) por ter alta sensibilidade e especificidade. A frequência de animais com sorologia positiva para Theileria equi foi de 6,66% (12/180), para Babesia caballi foi de 22,3% (40/180) e para infecção concomitante foi de 6,66% (12/180). Os resultados sorológicos obtidos por este estudo revelam que 35,5% (64/180) dos animais possuem anticorpos contra a babesiose equina sendo que a maioria dos animais acometidos tem dois e três anos de idade e portanto estão há menos tempo no hipódromo. Fatores como a ausência de carrapatos vetores, o uso de terapias babesicidas repetidas e o longo tempo de permanência dos animais no Jóquei após o tratamento, favorecem a diminuição dos títulos de anticorpos sem que ocorra reinfecção. Esses fatores podem justificar o menor número de animais com sorologia positiva para a doença nos cavalos com idade acima de quatro anos. Considerando-se esses resultados sugere-se que os animais sejam avaliados sorologicamente ao ingressarem no Jóquei Clube de São Paulo para que o uso de medicamentos contra a doença seja feito de forma adequada e para que os sinais clínicos compatíveis com babesiose equina em animais sorologicamente negativos sejam melhor avaliados e considerados em diagnósticos diferenciais. / In order to evaluate the presence of antibodies against Theileria equi and Babesia caballi in horses kept at the Jockey Club in São Paulo city, Brazil, a total of 180 samples of blood serum was tested using the Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (C-ELISA test). This methodology has been recommended by the International Organization of Epizooties (IOE) due to its high sensitivity and specificity. The frequency of seropositive animals for Theileria equi, Babesia caballi and for both was 6.66% (12/180), 22.3% (40/180) and 6.66% (12/180), respectively. Serological results showed that 35.5% of the animals (64/180) had antibodies against equine piroplasmosis; they were from two to three years old and were at the Jockey Club for a shorter period of time. Factors such as absence of thick vectors, repeated therapy using babesicidal drugs and the long period of time that the animals stayed in the Jockey Club after treatment favoured the lowering of antibody titers with no reinfection. These factors might be responsible for the fewer number of animals with positive serology for the disease in horses over four years of age. Based on these findings, animals should be serologically evaluated at the time of entrance into the Jockey Club so that the use of drugs against the disease be performed properly and clinical signs suggestive of equine babesiosis in serologically negative animals be better evaluated and considered for differential diagnosis.

Anticorpos monoclonais (AcMo) anti-β2GPI foram obtidos de hibridomas produzidos pela fusão de linfócitos de camundongos com células SP2-O, de mieloma murino. A imunização foi realizada com proteína purificada de plasma humano, por cromatografia de afinidade em resina Sepharose-Heparina 6 Fast Flow (GE Healthcare). Os AcMo produzidos pelos hibridomas K257, K2II-3, K233, K22, K237 e K2124 foram estudados quanto à sua capacidade de reconhecer o antígeno adsorvido em suporte sólido (dot-blot, imunoblot, ELISA direto) e em solução (ELISA indireto). Todos os clones foram cultivados e expandidos in vivo (ascite) e in vitro (cultura convencional). Pretende-se a substituição da expansão in vivo pela produção em biorreator. Os AcMo produzidos reconheceram a β2GPI em imunoblot com sensibilidade e especificidade variáveis. O desempenho dos AcMo K22 e K2124 no reconhecimento da proteína adsorvida em placas de ELISA (Maxisorp, NUNC), mostrou-se promissor para o desenvolvimento de um teste ELISA direto (sanduíche), em substituição ao ELISA indireto (competição) atualmente utilizado. O AcMo K22 mostrou reatividade semelhante à do anticorpo comercial 5F7 (ICN) em todos os testes realizados. Tanto o anticorpo produzido pelo clone K22 quanto seus fragmentos Fab, obtidos através de digestão enzimática, foram utilizados para identificação e quantificação da proteína em plasma e tecidos de ratos submetidos a um modelo de sepse e translocação bacteriana. Os resultados obtidos demonstram que a modulação das concentrações plasmáticas de β2GPI e sua distribuição hepática dependem da intensidade e da via de infecção, e sugerem a presença de imunocomplexos da proteína in vivo. / β2-glycoprotein I (β2GPI) detection is important for the accurate diagnostic of autoimmune and chronic inflammatory disease. This project was designed in order to obtain specific monoclonal antibodies (MoAb) that could replace or add to the commercially available 5F7. It is intended to achieve a convenient in vitro production, in the near future. The β2GPI antigen was purified from human plasma through Heparin-Sepharose 6 FF (GE Healthcare) affinity chromatography. Six different hybridomas were generated after the fusion of immunized mouse lymphocytes with SP2-O murine myeloma cells. The anti-β2 GPI MoAb K257, K2II-3, K233, K22, K237, and K2124 were purified after clone expansion from ascites (in vivo) and conventional cellular culture (in vitro). MoAb reactivity was evaluated towards the β2GPI antigen either adsorbed to solid phase support (Dot-Blot, imunoblot, direct ELISA), or in solution (indirect ELISA). All clones were positive in immunoblot. MoAb K237, K257 e K2124 recognized cleaved forms of the protein. The K22, K2124 and K257 MoAb were promising for the development of direct ELISA. Best sensibility was obtained with K22 AcMo in comparison to commercial reference 5F7 (ICN) in all tests. Both AcMo K22 and its digestion product K22Fab, could be applied in assays for β2GPI on plasma and tissues of rats with good performance.

A contaminação da água para consumo humano por toxinas produzidas por cianobactérias é um problema de saúde pública e das autoridades em todo o mundo. Microcistina-LR (MCLR) é uma cianotoxina heptapeptídica cíclica que inibe as proteínas fosfatases PP1 E PP2A nos hepatócitos. Microcistinas são produzidas por diversos gêneros de cianobactérias e mais de 70 variações estruturais têm sido caracterizadas em florações naturais. Por serem haptenos, as microcistinas são incapazes de induzir uma resposta imune em animais. Conseqüentemente, foi necessário aplicar métodos de conjugação envolvendo a adição de uma proteína carreadora, mcKLH (cationized Keyhole Limpet Hemocyanin). Portanto, o objetivo inicial desta tese foi o de obter anticorpos monoclonal (em camundongos) e policlonal (em coelho) anti- MCLR. Com relação ao anticorpo monoclonal foram obtidos 9 hibridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232), sendo que apenas 5 se mostraram estáveis (k29, k317, k248, k284, k2232). Estes foram selecionados para serem isotipados, expandidos em líquido ascítico, purificados em coluna cromatográfica de proteína-A e titulados. Dentre estes cinco hibridomas secretores de anticorpos, o clone k317 foi o que melhor reconheceu (mais específico) a toxina MCLR. Os anticorpos do sobrenadante de meio de cultura do hibridoma e o fluido ascítico purificado foram identificados pelo ensaio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) previamente padronizado. Mesmo sensibilizando a placa de ELISA com diferentes antígenos, tais como MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR e MCLA, o clone 17 foi o que apresentou melhor linearidade frente às variantes de microcistina. Portanto, o clone 17 (isótipo IgG1) obtido é muito promissor e será usado para detecção de MCLR na água para consumo humano através do desenvolvimento de um kit de ELISA competição. Com relação ao anticorpo policlonal, o antígeno de imunização foi MCLR-mcKLH, enquanto que o antígeno de sensibilização foi MCLR-cBSA para o ensaio de titulação de anticorpos de classe IgG por ELISA indireto. Na seqüencia, foi padronizado um ensaio ELISA competição utilizando somente a toxina MCLR como antígeno de sensibilização. Este método Caseína foi padronizado, validado e comparado com o kit comercial Abraxis®. O kit ELISA competição que utiliza anticorpo policlonal, nomeado como método Caseína, foi avaliado quanto Limite Inferior de Quantificação, Especificidade, Seletividade, influência do metanol no ensaio, Recuperação, Linearidade, Precisão, Exatidão e Robustez. Este método de triagem apresentou excelente resultado quando comparado ao kit comercial Abraxis®, pois foi capaz de detectar tanto variantes de microcistinas como nodularinas no ambiente aquático. O ensaio ELISA competição utilizando anticorpo policlonal anti-MCLR foi submetido à patente pela Agência USP de Inovação (I.N.P.I. 018090046230). / The contamination of drinking water by cyanobacterial toxins is a public health issue and a concern for water authorities throughout the world. Microcystin-LR (MCLR) is a hazardous cyclic heptapeptide cyanotoxin, which inhibits protein phosphatase PP1 and PP2A in hepatocytes. Microcystins are produced by several genera of cyanobacteria and presents more than 70 structural variations characterized in natural blooms. As haptens, microcystins are unable to invoke an immune response in animals. Consequently, the application of conjugation methods with an additional carrier protein, the KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) was necessary. The main objective of this study was to obtain monoclonal (in mice) and polyclonal (in rabbits) antibodies for reacting against MCLR. In what refers to monoclonal antibodies, 9 hybridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232) were obtained; however only 5 were stables (k29, k317, k248, k284, k2232). These were selected to be isotyped, expanded in ascitic fluid, purified by protein-A column chromatography and then, they were titrated. Out of these five antibody-secretor hybridomas, clone k317 was the best to recognize (more specific) the MCLR toxins. Antibodies in hybridoma cell culture supernatant and purified ascites fluid were identified by ELISA assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) as prior standardized. Even when sensitizing ELISA plate with different antigens, as MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR and MCLA, clone 17 presented the best linearity against microcystin variants. Therefore, the obtained clone 17 (isotype IgG1) is a promising clone and shall be used for detecting MCLR in drinking water through the development of a competitive ELISA immunoassay kit. In what refers to the polyclonal antibody, MCLR-mcKLH was used as immunization antigen, while MCLR-cBSA was used as sensitizing antigen for the IgG titration assay by indirect ELISA. In the sequence, a competition ELISA assay was standardized using the MCLR toxin as sensitizing antigen. This Casein method was standardized, validated and compared to the commercial kit Abraxis®. The competition ELISA kit using polyclonal antibody, known as Casein method, was analyzed concerning its Quantification Inferior Limit, Specificity, Selectivity, methanol influence of the assay, Recuperation, Linearity, Precision, Accuracy and Robustness. This screening method reached excellent results if compared to the commercial kit Abraxis®, for being able to detect both the microcystins variants and the nodularins in aquatic environmental. The competition ELISA assay using anti-MCLR polyclonal antibody was submitted to the grant of a patent by USP Innovation Agency (INPI 018090046230).

Sete suínos com 2 meses de idade foram infectados experimentalmente com cerca de 200.000 ovos de T. solium administrados por via oral. Ao término do experimento (140 dias) os animais não apresentaram aspectos clínicos de cisticercose pelo exame de inspeção da língua; portanto eles poderiam ser classificados como animais saudáveis pelos exames usuais de inspeção utilizados em matadouros. Todos os animais foram sacrificados e a musculatura, cérebro e órgãos viscerais foram seccionados em finos pedaços para a procura de cistos. O número de cisticercos encontrados em cada animal variou de 1 a 85 (média 33,7 e desvio padrão 31,3), caracterizando-os como animais com infecção branda. Amostras de sangue dos animais infectados experimentalmente foram submetidas a imunoensaios para a pesquisa de anticorpos (ELISA Indireto, utilizando como antígeno o líquido vesicular de Taenia crassiceps; imunoblot 18/14, oriundo de antígeno de Taenia crassiceps purificado com anticorpos monoclonais e imunoblot LLGP, utilizando glicoproteínas de T. solium purificadas com lentil lectina) e para pesquisa de antígeno (ELISA Sanduíche e ELISA Direto, ambos utilizando o anticorpo monoclonal anti-ES-Tcra). O teste ELISA Direto não apresentou reatividade em qualquer amostra de soro dos diferentes animais infectados no momento do abate (t140). Foi encontrada positividade de 71% e 57%, respectivamente, para os testes ELISA Indireto para a pesquisa de anticorpos e ELISA Sanduíche para a pesquisa de antígenos nestes tempos. Pelo imunoblot (IB) 18/14 e IB LLGP, respectivamente 5 (71 %) e 6 (86%) dos animais infectados experimentalmente foram positivos no t140. O uso de ensaios imunoenzimáticos para a detecção de anticorpos específicos (IB) somados ao ELISA Sanduíche para pesquisa de antígeno permitiu que todos os animais com infecção branda fossem detectados. Dessa forma, o uso de ensaios imunoenzimáticos para detecção de anticorpos e/ou antígenos mostrou-se mais útil que o exame clínico e/ou post-mortem para a triagem de cisticercose suína em animais com infecção branda. / Seven 2-month-old swine were orally experimentally infected with approximately 200,000 eggs of Taenia solium. At the end of the experiment (140 days) the animals did not show clinical aspects of cysticercosis or parasites in tongue inspection; therefore they could be mistaken as healthy animals by usual inspection exams used in slaughterhouses. All of them were slaughtered and their whole muscles, brain and visceral organs were cut into thin slices searching for cysts. The number of cysts found in each animal varies from 1 to 85 (mean value 33.7 and standard deviation 31.3) characterizing them as slightly infected animals. Blood samples of experimentally infected animals were submitted to immunoassays for antibody detection (Indirect ELISA, using vesicular fluid antigen from Taenia crassiceps; immunoblot 18/14, from T.crassiceps antigen purified by monoclonal antibodies and immunoblot LLGP, using lentil lectin purified glycoproteins of T. solium) and for antigen detection (Sandwich ELISA and Direct ELISA, both using monoclonal antibodies anti-ES-Tcra). The Direct ELISA assay did not show any reactivity with all serum samples from the different animals at the slaughtered moment (t140). The positivity was 71% and 57% by the Indirect ELISA for searching antibodies and by the Sandwich ELISA for searching antigens, respectively. By immunoblot (IB) 18/14 and IB LLGP 5 (71 %) and 6 (86%) experimentally infected animals were positive at t140, respectively. The use of immunoassays for detecting specific antibodies (IB) together with Sandwich ELISA for antigen detection allow the detection of all slightly infected animals. Thus, the use of immunoassays for antibodies and/or antigen detection showed they are more useful than usual clinical examination and/or tongue palpation for screening cysticercosis in slightly infected pigs.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_francine_sinnott.pdf: 966836 bytes, checksum: 31b75fbc3400564832438403aff0c6e0 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Neosporosis is a disease caused by the obligate intracellular parasite Neospora caninum, causing reproductive disorders, such abortions and sltillbirths in several animals, being considered a major cause of abortion in cattle worldwide. The serological standard diagnosis is indirect fluorescent-antibody test (IFAT), but due to morphological and antigenic similarities of N. caninum with other protozoa of the phylum Apicomplexa, such as Toxoplasma gondii and Sarcocystis spp., false positive results may occur. To improve the diagnosis of this disease and reduce cross-reactions with other coccidian, the use of specific recombinant proteins of N. caninum has been described. The Nc-p43 surface protein encoded by the gene NcSRS2 is specific of the parasite and is present in tachyzoites and bradyzoites of N. caninum. Indirect ELISA format assays have been developed for the diagnosis of neosporosis, however the blocking ELISA may present additional level of specificity. In this context, the objective of this study was develop and standardize a blocking ELISA (b-ELISA) for the diagnosis of bovine neosporosis. To this end, NcSRS2 gene, previously cloned into plasmid vector, was used to produce the recombinant protein (rNc-p43) in prokaryotic expression system Escherichia coli. The purified protein was used to produce a polyclonal antibody (pAb/rNc-p43) in rabbit and this was further purified and characterized by indirect ELISA. For the development of the b-ELISA were used a total of 152 cattle sera (71 negative and 81 positive) and 10 positive cattle sera for toxoplasmosis, all previously confirmed by IFI. As controls, a pool of all positive sera and a pool of all negative sera were used, in addition to a normal calf serum, confirmed by IFAT, used with negative reference sera. The percent inhibition for each sample was determined by comparing the optical density (OD) mean of test sera to the OD mean of negative reference sera. The cut-off value was determined as the percent inhibition of negative pool. The results suggest that the b-ELISA is a tool that can be used for diagnosis of bovine neosporosis, with a sensitivity of 98.7% and specificity of 88.7% when compared with the IFAT. Antibodies against T. gondii present in positive samples for toxoplasmosis were not able to recognize the rNc-p43. The b-ELISA showed that serum samples positive for N. caninum is able to prevent the binding of pAb/rNc-p43, enabling detect different class of antibodies in a single assay. This technique is / Neosporose é a doença causada pelo parasito intracelular obrigatório Neospora caninum, causando problemas reprodutivos, como abortos e mortalidade neonatal em diversos animais, sendo considerada uma das principais causas de abortos em bovinos em todo o mundo. O diagnóstico sorológico padrão é a imunofluorescência indireta (IFI), porém devido a semelhanças morfológicas e antigênicas de N. caninum com outros protozoários do filo Apicomplexa, como Toxoplasma gondii e Sarcocystis spp., pode ocorrer resultados falsos positivos. Para melhorar o diagnóstico desta parasitose e diminuir as reações cruzadas com outros coccídeos, à utilização de proteínas recombinantes específicas de N. caninum vem sendo descrita. A proteína de superfície Nc-p43 codificada pelo gene NcSRS2 é específica do parasito e está presente em taquizoítos e bradizoítos de N. caninum. Ensaios no formato ELISA indireto vêm sendo desenvolvidos para o diagnóstico da neosporose, no entanto os ELISAs de bloqueio podem apresentar nível adicional de especificidade. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e padronizar um ELISA no formato bloqueio (b-ELISA) para o diagnóstico da neosporose bovina. Para tal, o gene NcSRS2, previamente clonado em vetor plasmidial, foi utilizado para produzir a proteína recombinante (rNc-p43) em sistema de expressão procarioto Escherichia coli. A proteína purificada foi utilizada para produzir um anticorpo policlonal (pAb/rNc-p43) em coelho e este foi posteriormente purificado e caracterizado através de ELISA indireto. Para o desenvolvimento do b-ELISA foram utilizados um total de 152 soros bovinos (71 negativos e 81 positivos) e 10 soros bovinos positivos para toxoplasmose, todos previamente confirmados por IFI. Como controles, um pool de todos os soros positivos e um pool de todos os soros negativos foi utilizado, além de um soro normal de terneiro, confirmado através de IFI, utilizado como controle negativo referencial. O percentual de inibição de cada amostra foi determinado pela comparação da média da densidade óptica (DO) de cada soro teste com a média da DO do controle negativo referencial. O ponto de corte foi determinado pelo percentual de inibição do pool negativo. Os resultados obtidos sugerem que o b-ELISA é uma ferramenta que pode ser utilizada no diagnóstico da neosporose bovina, com sensibilidade de 98.7% e especificidade de 88.7%, quando comparado com a IFI. Os anticorpos contra T. gondii presentes nas amostras positivas para toxoplasmose não foram capazes de reconhecer a rNc-p43. O b-ELISA demonstrou que as amostras de soros positivas para N. caninum são capazes de impedir a ligação do pAb/rNc-p43, possibilitando a detecção de diferentes classes de anticorpos em um único ensaio. Esta técnica pode ser uma alternativa de triagem para a detecção de anticorpos contra N. caninum em populações de bovinos.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_diene_de_borba_pacheco.pdf: 1130271 bytes, checksum: e77a03d669b55e89749bb0d6922531eb (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Neosporosis is a disease caused by the apicomplexan parasite Neospora caninum, which is closely related to Toxoplasma gondii. N. caninum infection represents an important cause of reproductive failure in sheep, goats, horses, and cattle worldwide. The diagnosis of neosporosis is based on the detection of pathogen-specific antibodies in animal sera or the presence of tissue cysts. However, morphological similarities and serological cross-reactivity between N. caninum and T. gondii can result in the misdiagnosis. In this study, the N. caninum tachyzoite surface protein Ncp-43 was expressed in a recombinant form to elicit polyclonal antibodies (pAb) response. The pAb was purified and conjugated to horseradish peroxidase (HRP) or fluorescein isothiocyanate (FITC) to detect the recombinant and native Ncp-43 proteins, respectively. The pAb and pAb/HRP were able to recognize rNcp-43 by Dot blot and ELISA, and pAb/FITC immunolabeled the apical complex of tachyzoites. A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (b-ELISA) was performed to evaluate pAb/HRP as a diagnostic tool. The mean percent inhibition for the positive and negative serum samples from cattle with neosporosis was significantly different (P < 0.0001). These results suggest that the pAb may bind to the same epitopes of Ncp-43 as anti-N. caninum antibodies in the positive samples tested. The b-ELISA using the pAb/HRP can facilitate diagnostic testing for neosporosis, since fewer steps are involved and cross-reactivity with secondary antibodies is avoided. In summary, this report describes the production of antibodies against N. caninum, and evaluates the potential of these tools for the development of new diagnostic tests for neosporosis. / Neosporose é a doença causada pelo parasito apicomplexa Neospora caninum, o qual é intimamente relacionado a Toxoplasma gondii. A infecção por N. caninum representa uma importante causa de falha reprodutiva em ovinos, caprinos, equinos e bovinos ao redor do mundo. O diagnóstico da neosporose é baseado na detecção de anticorpos específicos contra o patógeno em soros, ou a presença de cistos teciduais em animais. No entanto, as semelhanças morfológicas e a possível reatividade sorológica cruzada entre N. caninum e T. gondii pode resultar no diagnóstico errôneo. Neste estudo, a proteína de superfície Ncp-43 de taquizoítos de N. caninum, foi expressa de forma recombinante em Escherichia coli e utilizada para produção de anticorpos policlonais (pAb). O pAb foi purificado e conjugado a peroxidase (HRP) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) para detectar as proteínas recombinantes e nativas Ncp-43, respectivamente. pAb e pAb/HRP foram capazes de reconhecer rNcp-43, o que foi avaliado pelas técnicas de Dot blot e ELISA enquanto pAb/FITC se mostrou eficiente na imunomarcação do complexo apical de taquizoítos. Um ensaio imunoenzimático de bloqueio (b-ELISA) foi realizado para avaliar a performance do pAb/HRP como ferramenta de diagnóstico. A porcentagem de inibição média para as amostras de pool de soros positivos e o pool de negativos de bovinos com neosporose foi significativamente diferente (P <0,0001). Estes resultados sugerem que o pAb pode ligar-se aos mesmos epítopos da Ncp-43 que os anticorpos anti-N. caninum de amostras positivas testadas. O b-ELISA utilizando o pAb/HRP representa uma opção interessante aos testes de diagnóstico disponíveis para a neosporose, uma vez que menos passos estão envolvidos na sua realização e seu formato evita a reatividade cruzada com anticorpos anti-espécie específicos. Em resumo, este trabalho descreve a produção de anticorpos contra N. caninum, e avalia o potencial dessas ferramentas para o desenvolvimento de novos testes diagnósticos para neosporose.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_itaua_leston_araujo.pdf: 980896 bytes, checksum: 4007b4d62827e236b56c4fe512f94f29 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Glycoprotein D (gD) is essential for attachment and penetration of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) into susceptible cells, and is a major target of host immune systems, inducing strong humoral and cellular immune responses. The immunogenicity of recombinant BoHV-5 (rgD5) expressed in Pichia pastoris was evaluated in bovines. Vaccines formulated with 100 μg rgD5 dose and adjuvants (Montanide ISA50V2 or Aluminum Hydroxide) with or without inactivated BoHV-5 or rgD5 without adjuvants were administered intramuscularly. A commercial vaccine was also used as control. The vaccine formulation rgD5 + ISA50V2 stimulated humoral immune responses after two doses, and higher titer of neutralizing antibodies were obtained in all three oil-based adjuvants formulations when compared to Hydroxide Aluminium adjuvant or the commercial vaccine. The vaccine BoHV-5 + rgD5 + ISA50V2 stimulated titers of neutralizing antibodies approximately 8 log2, which demonstrated higher correlations on the Indirect ELISA. Together, the results suggest that the recombinant gD5 conserved neutralizing epitopes and was able to stimulate a efficient humoral immune response in bovines. / A glicoproteína D (gD) é essencial para ligação e penetração de herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) em células suscetíveis, e é um alvo importante do sistema imune do hospedeiro, induzindo respostas imunes humoral e celular. A imunogenicidade da glicoproteína D recombinante de BoHV-5 (rgD5) expressa em Pichia pastoris foi avaliada em bovinos. Vacinas formuladas com 100 μg de rgD5 por dose e adjuvante a base de óleo (Montanide ISA50V2) ou hidróxido de alumínio, com ou sem adição de BoHV-5 inativado foram administradas via intramuscular, e uma vacina comercial utilizada como controle. A vacina rgD5 + ISA50V2 estimulou resposta imune humoral após duas doses, e os mais elevados títulos de anticorpos neutralizantes foram obtidos em todas as três formulações de adjuvantes à base de óleo quando comparado com a formulação de vacinas de adjuvante de hidróxido de alumínio e vacina comercial. A vacina BoHV-5 + rgD5 + ISA50V2 estimulou títulos de anticorpos neutralizantes aproximadamente a 8 log2, demonstrando correlação significativa com o ELISA indireto. Em conjunto, os resultados sugerem que a rgD5 conservou epítopos neutralizantes e foi capaz de estimular uma resposta imune humoral eficiente em bovinos.

Protéolyse du facteur von Willebrand et cardiopathies à forces de cisaillement élevées: nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques Dans la première partie de ce travail, nous mettons en évidence l’intérêt d’une immunothérapie spécifique à base d’anticorps monoclonal pour la prévention de la dégradation du facteur von Willebrand (VWF) sous assistance circulatoire mécanique à flux continu. Via un anticorps monoclonal murin ciblant le domaine D4 du VWF et inhibant partiellement l’interaction VWF-ADAMTS13, une inhibition partielle de la dégradation du VWF est observée sur sang total dans un modèle ex-vivo d’assistance circulatoire mécanique.Dans la seconde partie, nous avons étudié l’influence de soudaines variations de l’intensité des forces de cisaillement sur la multimérisation du VWF dans 3 modèles in-vivo: un modèle lapin de sténose de l’aorte ascendante, à l’initiation d’une assistance ventriculaire gauche par une pompe à flux continu chez des patients en insuffisance cardiaque terminale et lors d’un remplacement valvulaire aortique par voie percutané chez des patients avec un rétrécissement aortique sévère. Les variations observées du profil multimérique sont très dynamiques survenant quelques minutes après les modifications des conditions de flux. Notre étude met ainsi en évidence une nouvelle application potentielle du VWF comme biomarqueur d’anomalies de flux dans les cardiopathies à forces de cisaillement élevées. Un monitoring en temps réel du VWF pourrait notamment avoir un intérêt en cardiologie interventionnelle pour les techniques percutanées utilisées pour le traitement du rétrécissement aortique.La dernière partie de ce travail porte sur le développement d’un test ELISA pour le diagnostic des formes acquises ou constitutionnelles de maladie de Willebrand secondaire à une protéolyse excessive du VWF par l’ADAMTS13. Ce test pourrait constituer une alternative intéressante aux actuelles méthodes électrophorétiques pour le diagnostic et la prise en charge de ces pathologies hémorragiques. / In the first part of the thesis, we describe a novel approach based on antibody-based therapy to prevent the acquired von Willebrand factor (VWF) degradation observed in continuous-flow mechanical circulatory assist device therapy. Via a murine monoclonal antibody directed against VWF D4 domain and thus interfering with VWF-ADAMTS13 binding, a partial inhibition of VWF degradation is observed in whole blood using an ex vivo circulatory assist device model. In the second part of the thesis, we investigated the relationship between acute changes in shear stress and variations in VWF multimeric profile in three distincts models in vivo: in a rabbit aortic banding model, in end-stage heart failure patients at initiation of continuous-flow ventricular assist device therapy and in severe aortic stenosis patients undergoing percutaneous aortic valve procedures. Variations in VWF multimeric profile in those settings are highly dynamic occuring within minutes after changes in shear stress status. Our study highlights that VWF could be used as a biomarker of blood flow in high shear cardiovascular disorders. A bedside VWF-monitoring could be of clinical interest in interventional cardiology for percutaneous aortic valve procedures used in severe aortic stenosis.The last part of the thesis focused on the development of an ELISA-based diagnosis of constitutive or acquired VWF disorders associated with an increased ADAMTS13-mediated VWF proteolysis. Such assay might represent an attractive alternative to electrophoresis-based assays in the diagnosis and management of such bleeding disorders.

As zoonoses urbanas, doenças que afetam muitos indivíduos em países tropicais, especialmente crianças, são infecções que podem ser adquiridas pelo homem através do contato com animais de estimação, pela ingestão de carne ou água contaminada. Para sua prevenção, é fundamental a educação para medidas de higiene e profilaxia com relação ao manuseio dos alimentos, animais de estimação e higiene pessoal. Isto poderia ser feito através de ensino intensivo, ministrado por profissionais treinados durante o primeiro ciclo do Ensino Fundamental. No presente trabalho, estudamos este tipo de ensino e a prevalência destas doenças, usando a toxoplasmose como modelo, em 164 alunos do primeiro ciclo do ensino fundamental da Escola Estadual Antonio de Pádua Vieira, com coleta de saliva. Foi desenvolvido ELISA de alta sensibilidade em saliva concentrada por etanol. Após 12 (doze) meses, a fixação do conteúdo foi avaliada por questionário. Havia uma prevalência de 50% de contato com Toxoplasma gondii nessa população, mostrando a relevância do problema. As crianças sob intervenção mostraram fixação do conhecimento, para ambas as fontes principais de contaminação mostrando a importância da intervenção, em comparação com crianças sem intervenção. As crianças sem toxoplasmose mostraram uma melhor eficiência na fixação da informação. Nossos dados sugerem que intervenções curtas têm um grande efeito de fixação de informações em escolares e que a saliva pode ser um material para a detecção de contato com a toxoplasmose. / Urban zoonoses affect large proportion of the population in tropical countries, specially school children. Those infections could be acquired by contact with pets, or ingestion of water or meat contaminated by agents. Education in preventive hygiene measures, as adequate cleaning and cooking are essential in this age group. Intensive teaching during short interventions by trained personal could be effective. Here, we study this type of educational intervention, using toxoplasmosis as a model, in 164 school children in the first years of elementary grades in a public São Paulo school, E.E.P.G. Antonio de Pádua Vieira, with saliva sampling. We had standardize a specific anti T. gondii IgG assay in etanol concentrade saliva. After 12 months, the knowledge of this population was tested by questionnaire. There are a 50% prevalence of contact with T.gondii during the intervention, showing the importance of zoonosis in this group. After one year, most children who assisted the intervention recalled correctly the main transmission ways of the zoonosis, showing fixation by short intervention, as compared to non-intervened shoolchildren of the same age group. Children who had no contact with T.gondii show higher recall proportion. Our data suggest that shorts interventions are effective in the knowledge fixation in schoolchildren and that saliva, a non invasive sampling, could be an alternative material for detection of contact with toxoplasmosis.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lundia Bin.pdf: 419626 bytes, checksum: 784b66188ef611a6dd9abf0fdddd231f (MD5) Previous issue date: 2013-08-23 / Toxocariasis is an important zoonosis mainly transmitted by ingestion of embryonated T. canis eggs, a parasite of dogs, present in soil. The nematode larvae can migrate by a variety of organs e may cause disturbances, including respiratory, hepatic, neurological, cardiac and ophthalmic problems. Diagnostic of toxocariasis is based on detection of anti-Toxocara antibodies, particularly IgG, by ELISA. Avidity of IgG has been employed in order to evaluate the phase of infection of a disease. However, experimental studies regard to toxocariasis are scarce in literature. This study aimed to evaluate the Toxocara canis-IgG avidity in experimentally infected rabbits, before and after lactation, and of their offsprings. Seventeen nullipar white New Zealand female rabbits were distributed in two groups. In experimentally infected group, 12 animals were inoculated by oral route with 1,000 T. canis embryonated eggs, whereas five animals were uninfected (control group). Blood samples collections were performed on +7, +14, +21 and +28 days post-infection (dpi) and on the first day following the weaning (60 dpi) in order to obtaining serum for ELISA analysis. ELISA indirect test was run in order to obtain the anti- T. canis antibody reactivity index (RI) as well as the avidity index (AI). Seroconversion was observed on 14 dpi, and all the evaluated animals showed a high AI, excepting one animal (on 14 dpi). After the weaning period, all the studied rabbit showed seroconversion. All the studied bunnies were considered positive for ELISA and showed a high AI. Nevertheless, both RI and AI of mothers were significantly higher than their offspring. According to the results, it was possible to demonstrate the vertical transmission of T. canis larvae. In addition, the negative correlation between the RI obtained from the rabbits and the bunnies pointed out the possibility of passive protection due to the maternal transfer of antibodies. / A toxocaríase é uma importante zoonose transmitida principalmente pela ingestão de ovos embrionados de T.canis, um parasito de cães, presente no solo. A larva do nematódeo pode migrar por vários órgãos do corpo e ocasionar distúrbios, como problemas respiratórios, hepáticos, neurológicos, cardíacos e oftálmicos. O diagnóstico é realizado principalmente com a detecção de anticorpos, em especial de Imunoglobulinas da classe G (IgG), pela técnica de ELISA. A avidez de IgG tem sido utilizada para avaliar a fase de infecção de uma doença. No caso da toxocaríase, estudos experimentais são escassos na literatura. O objetivo do estudo foi o de avaliar a avidez de anticorpos anti-Toxocara canis em coelhas infectadas experimentalmente, antes e após lactação, e de suas progênies. Foram utilizadas 17 coelhas da linhagem Nova Zelândia, brancas, nulíparas, distribuídas em dois grupos. No grupo experimental, doze coelhas foram infectadas, oralmente, com 1.000 ovos larvados de T. canis. O segundo grupo, constituído por cinco coelhas serviu como controle. Nos dias 7, 14, 21 e 28 pós-infecção (DPI) e no primeiro dia após o desmame (60 DPI), foram coletadas amostras de soro para análise. O teste de ELISA indireto foi realizado para avaliar a o índice de reatividade (IR) de anticorpos IgG anti-T. canis e para cálculo do índice de avidez (IA). A soroconversão nos animais ocorreu a partir do 140 DPI. Com exceção de um animal (aos 14 DPI), todos os IA foram classificados como de alta avidez. Após lactação, (60 DPI), todos os animais foram considerados como ELISA positivo. Em relação aos filhotes todos os animais foram sororreagentes e apresentaram alto IA. Entretanto, tanto o IR quanto o IA das fêmeas foram significativamente maiores que da sua progênie. Os resultados demonstraram a transmissão vertical de larvas. A correlação negativa entre os valores da IR das coelhas e de seus filhotes sugere a possibilidade de proteção passiva pela transferência de anticorpos maternais.