L'émergence des zoonoses est à relier directement avec les perturbations générées par l'Homme sur son environnement naturel à plus ou moins grande échelle. Sur l'ensemble des zoonoses émergentes chez l'Homme, la majorité provient d'animaux sauvages. L'étude du rôle de la faune sauvage dans la circulation des agents pathogènes est donc cruciale en particulier quand les interfaces faune sauvage/Homme sont fortes. L'objectif de cette thèse a été de comprendre par des approches éco-épidémiologiques à large échelle, la circulation d'agents pathogènes dans les populations d'un oiseau sauvage en contact étroit avec l'Homme, le goéland leucophée (Larus michahellis). Le premier chapitre présente les différentes méthodes utilisées dans la surveillance d'agents pathogènes ainsi que leurs limites lorsqu'elles sont menées en populations naturelles. Ce chapitre met en évidence au travers d'une étude portant sur les virus influenza aviaires, que la quantification des anticorps maternels dans les œufs est un outil efficace. Le second chapitre consiste à élargir l'échelle spatiale de l'étude afin de mettre en évidence plus finement les facteurs éco-épidémiologiques influençant la transmission des virus influenza aviaires dans et entre les populations de goéland leucophée de l'ouest méditerranéen. Enfin, le dernier chapitre repose sur la comparaison des patrons d'expositions obtenus pour des agents pathogènes au mode de transmission vectoriel : les flavivirus. Cette thèse permet de mettre en évidence les patrons d'exposition de certains agents pathogènes (virus influenza aviaire et flavivirus) et d'appréhender les facteurs éco-épidémiologiques potentiellement impliqués dans leurs circulations. Les résultats permettent d'envisager de futurs axes de recherches, nécessaires pour évaluer plus précisément la dispersion de ces virus en Méditerranée. / The emergence of zoonotic diseases is directly linked to the noise generated by humans on the natural environment to a greater or lesser extent. Of all the emerging zoonoses in humans, the majority comes from wild animals. The study of the role of wildlife in the circulation of pathogens is crucial, especially when wildlife/human interfaces are prominent. The aim of this thesis is to understand, using large scale eco-epidemiological approaches, the circulation of pathogens in a close to human population of wild bird, the yellow-legged gull (Larus michahellis). The first chapter presents the different methods used in the monitoring of pathogens and their limitations when they are conducted in natural populations. This chapter further highlights, through a study of avian influenza viruses, that the quantification of maternal antibodies in eggs is an effective tool. The second chapter expands the spatial scale of the study to highlight the finer eco-epidemiological factors influencing the transmission of avian influenza viruses within and between populations of Western Mediterranean yellow-legged gull. Finally, the last chapter is based on the comparison of exposition patterns obtained for vectorial transmission mode pathogens: flaviviruses. This thesis highlights patterns of exposure for certain pathogens (avian influenza virus and flaviviruses) and enables the understanding of the eco-epidemiological factors potentially involved in their circulations. The results allow to consider future areas of research needed to more accurately assess the dispersion of these viruses over the Mediterranean.

La périostine est une protéine matricellulaire préférentiellement exprimée aux sites de contraintes mécaniques, notamment le périoste, et dans le stroma associé à de nombreux types de cancers. En premier lieu, nous nous sommes attachés à évaluer la pertinence de cette protéine en tant que biomarqueur du métabolisme osseux et de la réaction stromale dans les métastases osseuses. Nous avons développé le premier dosage ELISA de la périostine circulante chez la souris présentant des caractéristiques analytiques (spécificité, précision) conformes aux exigences réglementaires. Ce dosage nous a permis de préciser l’implication de la périostine dans le métabolisme osseux et les métastases osseuses de cancer du sein. Nos données in vitro et in vivo suggèrent que la périostine n’est pas un indice direct du remodelage osseux, contrairement aux marqueurs biologiques conventionnels, mais une composante de l’ossification primaire. Nous avons aussi montré dans les métastases osseuses d’origine mammaire que la périostine est surexprimée par les cellules stromales de la métastase, comme cela a pu être observé au niveau des tumeurs primaires. Enfin, nous avons confirmé par une approche bioinformatique la relation étroite entre périostine et réaction stromale dans la plupart des tumeurs chez l’Homme. La périostine et d’autres protéines conjointement exprimées pourraient donc constituer un panel de marqueurs biologiques de la progression tumorale, certains pouvant se révéler comme nouvelles cibles thérapeutiques en oncologie. / Periostin is a matricellular protein preferentially expressed at sites subjected to mechanical constraints, including the periosteum, and in the stroma associated to several tumor types. We first aimed to evaluate the relevance of periostin as a biomarker of bone metabolism or stromal reaction in bone metastases. We developed the first ELISA for serum periostin in mouse with analytical characteristics (specificity, precision) that are in accordance with regulatory standards. This ELISA allowed us to specify further the involvement of periostin in bone metabolism and breast cancer bone metastases. Our in vitro and in vivo data suggested that periostin is a component of primary ossification rather than a direct index of bone remodeling, unlike conventional bone markers. In breast cancer bone metastases, we also showed that periostin is overexpressed by stromal cells associated with bone metastasis, in agreement with its localization in the stroma of primary tumors. Finally, using bioinformatics analyses of large datasets from various tumors in human, we confirmed the close relationship between periostin and the stromal reaction. Periostin and other co-expressed proteins could therefore constitute a set of biological markers of cancer progression, and/or appear as potential therapeutic targets.

As viroses causam perdas significativas na cultura do melão. Dentre essas, o vírus do mosaico amarelo da abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus- ZYMV) possui grande importância para a cultura e é encontrado em todos os locais de plantio de cucurbitáceas. O controle desse vírus através da resistência genética é a forma mais eficiente de manejo. O acesso PI414723 é a única fonte de resistência de meloeiro ao ZYMV. Essa resistência é oligogênica e supostamente condicionada por três genes dominantes: Zym-1, Zym-2 e Zym-3. A localização cromossômica do gene Zym-1 já foi confirmada no grupo de ligação 2, próximo ao marcador CMAG36. Entretanto, a localização de Zym-2 ainda carece de confirmação experimental, muito embora existam evidências de sua localização no grupo de ligação 10 (LGX). Sendo assim, um dos objetivos do presente trabalho foi confirmar a localização do gene Zym-2 através de análises de ligação com marcadores microssatélites (SSRs). Para tanto, foi utilizada uma população F2 derivada do cruzamento PI414723 x \'Védrantais\'. As plantas foram inoculadas mecanicamente com o isolado RN6-F, patótipo 0, duas vezes em um intervalo de 24 h. A confirmação da infecção e a quantificação dos títulos virais nas plantas F2 foram realizadas através do teste PTA-ELISA. O DNA genômico das plantas foi extraído da primeira folha verdadeira e utilizado nas reações de PCR com primers específicos para SSRs selecionados pertencentes ao LGX. Observou-se uma distribuição assimétrica de classes de absorbância e maior frequência de indivíduos F2 na classe com menor valor (0,1 a 0,2), sugerindo a existência de um gene de efeito maior. O teste chi-quadrado mostrou que todos os marcadores segregaram na frequência esperada (1:2:1), exceto o marcador CMCT134b. A ligação do Zym-2 aos marcadores foi confirmada por meio de regressão linear simples. Dos marcadores analisados, a regressão linear foi significativa para MU6549 e CMBR55, com p-valores de 0,011 e 0,0054, respectivamente. As análises de ligação mostraram que as ordens e as distâncias entre os marcadores condizem com os mapas presentes na literatura. Um segundo objetivo do estudo foi o de avaliar a reação ao ZYMV de 42 acessos de meloeiro oriundos da região Nordeste do Brasil, com o intuito de explorar novas fontes de resistência. Foram realizados dois experimentos utilizando a mesma metodologia citada anteriormente. O título viral médio entre os acessos variou de 0,123 a 0,621 no experimento 1 e de 0,019 a 0,368 no experimento 2. Alguns acessos apresentaram consistentemente baixos títulos virais, próximos aos do acesso resistente PI414723 e dos controles negativos (plantas não inoculadas da cultivar \'Védrantais\'). Portanto, estes acessos mostram-se como potenciais fontes de resistência ao vírus para o emprego em programas de melhoramento. / Viruses cause significant losses in the melon crop. Among these, Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) is of great importance and is ubiquitous in cucurbit crops. The control of this virus through genetic resistance is the most efficient management strategy. PI414723 is the only source of resistance to ZYMV in melon. This resistance is oligogenic and is supposed to be conditioned by three dominant genes: Zym-1, Zym-2 and Zym-3. While the chromosomal location of Zym-1 gene has been determined to be close to the CMAG36 marker in linkage group 2, the location of Zym-2 still lacks experimental confirmation, although there is some preliminary evidence that it is located in the linkage group 10 (LGX). Thus, one objective of this study was to confirm the chromosomal location of Zym-2 through linkage analysis with microsatellite markers (SSRs). To this, F2 plants population derived from the cross PI414723 x \'Védrantais\' were used as a segregating population. The plants were mechanically inoculated twice with isolate RN6-F, pathotype 0, at an interval of 24h. Confirmation of the infection and the quantification of viral titers in F2 plants were conducted using the PTA-ELISA technique. Plant genomic DNA was extracted from the first true leaf and used in PCR reactions using specific primers for selected SSRs belonging to LGX. An asymmetric distribution of absorbance classes was observed as well as a higher frequency of F2 individuals in the classes with lower values (0.1 to 0.2), confirming the presence of the major gene Zym-1. The chi-square test showed that all markers segregated according to the expected frequency (1: 2: 1), except for the CMCT134b marker. Linkage analysis among markers showed that the orders and distances between markers were consistent with published linkage maps. Linkage of Zym-2 to the markers was investigated by simple linear regression. Of the analyzed markers, the linear regression was significant for MU6549 and CMBR55, with p-values of 0.011 and 0.0054, respectively. Thus, the location of Zym-2 was determined in LGX. A second objective of the study was to evaluate the reaction to ZYMV of 42 melon accessions from the Northeastern Brazil, in order to discover new sources of resistance. For this, two experiments were conducted using the same inoculation and evaluation procedures previously described. The mean viral titer between accessions ranged from 0.123 to 0.621 in experiment 1 and between 0.019 to 0.368 in the experiment 2. Some accessions consistently showed low viral titers, similar to the resistant access PI414723 and the negative controls (non-inoculated plants of the cultivar \'Védrantais\'). Therefore, these accessions are potential sources of resistance to be employed in breeding programs.

O vírus do mosaico amarelo da abobrinha (Zucchini yellow mosaic virus - ZYMV) é provavelmente um dos mais dinâmicos e prejudiciais vírus emergentes de plantas. Desde sua primeira detecção na Itália e na França em 1973 e 1979, respectivamente, o ZYMV tem sido reportado em mais de 50 países variando de condições climáticas tropicais a temperadas em todos os continentes, exceto na Antártida. No Brasil esse potyvirus foi constatado primeiramente nos Estados de São Paulo e Santa Catarina, no início da década de 90 e posteriormente nos Estados do Ceará, da Bahia, do Rio Grande do Norte, do Pará, do Mato Grosso do Sul e do Maranhão. É provável que atualmente ocorra em todos os estados brasileiros onde se cultivam cucurbitáceas. Embora ocorra no Brasil há mais de 20 anos, pouco se conhece sobre as características biológicas, sorológicas e moleculares dos isolados até então encontrados no país. Esse projeto de pesquisa teve por objetivo cobrir parcialmente essa lacuna para fornecer subsídios para programas de melhoramento genético. Foram utilizados 11 isolados coletados em diversos estados brasileiros. A caracterização biológica consistiu no estudo da reação de diversas espécies vegetais inoculadas mecanicamente. A caracterização sorológico consistiu na marcação da proteína capsidial dos isolados com o antissoro policlonal contra o vírus. A caracterização molecular foi feita por meio da análise das sequências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos do gene da proteína capsidial dos isolados. A reação das espécies variou de acordo com o isolado inoculado. Análises de RFLP mostraram que a enzima de restrição Hpa II permitiu diferenciar o isolado fraco ZYMV-M da maioria dos isolados severos. O peso molecular da proteína capsidial dos isolados analisados foi em torno de 36 KDa, típico da proteína capsidial desse potyvirus. A identidade de nucleotídeos do gene da proteína capsidial entre os isolados brasileiros do ZYMV variou de 93% a 100% e a de aminoácidos deduzidos variou de 97% a 100%. Comparados com as sequências correspondentes de isolados do ZYMV de diferentes origens geográficas a identidade de nucleotídeos variou de 82% a 99%, enquanto a de aminoácidos deduzidos ficou entre 87% e 99%. Na árvore filogenética os isolados brasileiros do ZYMV pertencem ao grupo A, subdivisões I ou II, indicando uma variação entre os isolados. Nenhum evento de recombinação foi detectado nos isolados brasileiros. / Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) is probably one of the most dynamics and economically important emerging plant viruses. Since it was first report in Italy and France in 1973 and 1979, respectively, ZYMV has been found in over than 50 countries ranging from tropical to temperate climate conditions in all continents, except in Antartida. In Brazil this potyvirus was first reported in the beginning of 90´s in São Paulo and Santa Catarina States, and then in Ceará, Bahia, Rio Grande do Norte, Pará, Mato Grosso do Sul and Maranhão states. Probably it occurs in all Brazilian states which grow cucurbit species. Although ZYMV occurs in Brazil for more than 20 years, there is little information about the biological, serological and molecular characteristics for the isolates found in the country. The purpose of this work was to cover partially this gap to provide subsidies for genetic breeding programs. Eleven isolates collected in several Brazilian states were used. The biological characterization consisted in the study of the reaction of several vegetal species mechanically inoculated with the virus. The serological characterization consisted in the identification of the molecular weight of the coat protein through western blot analysis. The molecular characterization was done by the analyses of nucleotides and deduced amino acids sequences for the coat protein gene. The host reaction showed slight variation according to the virus. RFLP analyses showed that restriction enzyme HpaII allowed differentiate the mild ZYMV-M isolate from the majority of severe isolates. The coat protein molecular weight for all studied isolates was about 36 KDa, typical of the coat protein of this potyvirus. The nucleotide identity of the coat protein gene among the ZYMV Brazilian isolates ranged from 93% to 100%, and the deduced amino acids sequences ranged from 97% to 100%. Compared to corresponding sequences of ZYMV isolates from different geographical locations the nucleotide sequences identity ranged from 82% to 99%, while the deduced amino acids sequences ranged from 87% to 99%. Phylogenetic analysis place the Brazilian isolates of ZYMV into the group A, subdivision I or II, showing some diversity between the isolates. No recombination event was detected in the Brazilian isolates.

O Vírus do Nilo Ocidental, do inglês West Nile virus (WNV) é um patógeno emergente que é amplamente distribuído na América do Norte e Central. A recente introdução na América do Sul chamou a atenção para a propagação do WNV em países Latino Americanos. O ciclo de transmissão envolve mosquitos, pássaros, cavalos e seres humanos. A avaliação sorológica realizada nestes estudo foi composta por 678 soros de equídeos e 478 soros de aves, realizada por meio do ensaio ELISA de bloqueio específico para WNV e somente as amostras com resultados positivos foram confirmadas por testes de neutralização por redução em placas (PRNTs). A análise molecular foi realizada em soros de 1.241 equídeos saudáveis e em 63 macerados de cérebros de equídeos que morreram de encefalite e obtiveram resultados previamente negativos para outros patógenos. Também testamos swabs de 3.445 aves pelo método molecular, além de amostras de 24 morcegos e 11 onças. As amostras analisadas foram coletadas em diferentes biomas do Brasil. Identificamos pelo ELISA anticorpos para o WNV em treze equídeos e cinco pássaros e o teste de PRNT90 confirmou positividade para o WNV em quatro amostras de equídeos coletadas em 2009 em uma região entre a Amazônia e o Pantanal. Nenhuma das amostras de aves positivas pelo ELISA foram confirmadas por PRNT90. Das 4.784 amostras testadas por RT-PCR, penas duas apresentaram resultados positivos para a detecção, sendo uma ave residente na região do Pantanal e um anatídeo na região do Maranhão, respectivamente. A circulação do WNV é confirmada pela presente pesquisa em larga escala, mesmo na ausência da detecção de casos clínicos. / West Nile virus (WNV) is an emergent pathogen that is widely distributed in North and Central America. The recent introduction in South America has focused attention on the spread of WNV across Southern American countries. The transmission network involves mosquitoes, birds, horses and humans. The serological evaluation of sera from 678 equids and 478 birds was performed using a WNV-specific blocking ELISA, and only the positive results were confirmed by plaque reduction neutralisation tests (PRNTs). Molecular analysis was performed on sera from 1241 healthy equids and on 63 macerates of brains from equids that died of encephalitis and had previously tested negative for other pathogens. We also tested swabs from 3.445 birds, 24 bats and 11 phanteras. The samples analysed were collected in different biomes of Brazil. We identified WNV antibodies by ELISA in thirteen equids and five birds, and PRNT90 confirmed WNV positivity in four equid samples collected in 2009 in an area between the Amazon and the Pantanal. None of the ELISA positive bird samples were confirmed by PRNT90. Of the 4.784 samples tested by RT-PCR, only two were positive for the detection, a resident bird in the Pantanal region and a duck in the region of Maranhão, respectively. WNV circulation is confirmed by this large scale survey even in the absence of detection of clinical cases.

A vinca (Catharanthus roseus) é uma planta perene, arbustiva, pertencente à família Apocinaceae, cujas folhas e raízes possuem propriedades medicinais. A presença de sintoma de mosaico e deformação foliar em plantas dessa espécie, associados com a presença de partículas alongadas e flexuosas, característica de vírus pertencentes ao gênero Potyvirus, conduziu a estudos complementares para a identificação e caracterização desse vírus. No estudo da gama parcial de hospedeiras foram testadas 28 espécies, envolvendo oito famílias botânicas. Catharanthus roseus e Nicotiana benthamiana apresentaram sintomas de mosaico foliar e Chenopodium amaranticolor e C. quinoa apresentaram lesões locais cloróticas nas folhas inoculadas. A transmissão do vírus com afídeos foi avaliada com as espécies Aphis gossypii, Myzus nicotianae e Toxoptera citricidus. Apenas Aphis gossypii e Myzus nicotianae transmitiram o vírus. O antissoro policlonal produzido contra este potyvirus reagiu com o vírus homólogo e com o Passionfruit woodiness virus (PWV) e Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), mas não com o Lettuce mosaic virus (LMV), Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W), Potato virus Y (PVY) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). O peso molecular da proteína capsidial (CP) foi de aproximadamente 34 kDa. A reação de PCR realizada com os oligonucleotídeos universais de potyvirus e oligonucleotídeos específicos posteriomente confeccionados amplificaram três fragmentos de aproximadamente 0,8, 1,0 e 1,4 Kb, os quais após o seqüênciamento geraram um fragmento de 1654 nucleotídeos (nt) da região 3' terminal do genoma, que inclui parte do gene da replicase viral (Nib), a região codificadora completa do gene da proteína capsidial (CP), seguida de 286 nt da região 3' não traduzida (3'NTR). A identidade da seqüência de nucleotídeos do gene da CP variou de 67,0 a 76,0%, quando comparada com as de outros membros da família Potyviridae. A maior identidade foi com o Omphalodes virus Y (76,0%). A identidade dos aminoácidos deduzidos da proteína capsidial variou de 62,0 a 71,0%, sendo a maior com East Asian Passiflora virus (71%). Para a região não traduzida (3'NTR) a identidade variou de 16,8 a 28,6%. Em conjunto esses dados indicam que este vírus é uma nova espécie dentro do gênero Potyvirus, para o qual se propõe o nome de Vírus do mosaico do Catharanthus (Catharanthus mosaic virus - CatMV). / Catharanthus roseus is known as the common periwinkle or Madagascar periwinkle. It is a perennial, evergreen herb in the family Apocynaceae, which was originally native to the island of Madagascar, although both name and classification are contradictory in some literature. The plants grow up to 80 cm high; have glossy, dark green leaves and bloom during summer. The flowers range from white to hot pink to purple. The species has historically been used in popular medicine to treat a wide assortment of human diseases, as it contains more than 150 useful alkaloids. Plants of C. roseus exhibiting mosaic symptoms followed by malformation of the leaf blades and flower variegation were collected from a garden at the University of São Paulo, School of Agriculture (Piracicaba, State of São Paulo, Brazil). Preliminary electron microscopy exams of negatively stained leaf sap revealed that the symptoms were associated with potyvirus-like particles. The objective of the present work was to obtain further biological, immunological and molecular data to better characterize this species of the genus Potyvirus, family Potyviridae. Of 28 plant species from eight botanical families inoculated mechanically with this potyvirus, only C. roseus and Nicotiana benthamiana developed systemic mosaic, whereas Chenopodium amaranticolor and C. quinoa exhibited only chlorotic local lesions. The virus was transmitted by Aphis gossypii and Myzus nicotianae, but not by Toxoptera citricidus. Polyclonal antiserum raised against this potyvirus reacted with the homologous virus, Passion fruit woodiness virus (PWV) and Cowpea aphid borne mosaic virus (CABMV) in PTA-ELISA. The molecular mass of the coat protein (CP) was approximately 34 kDa. RT-PCR from viral RNA amplified a fragment of approximately 1654 nucleotides (nt) at the 3'-terminal of the viral genome, containing portion of the replicase gene (Nib), the entire CP gene and the 3' untranslated region (3'UTR) (286 nt). When the nucleotide sequence of the CP gene was compared with other members of the Potyviridae family, identities varied from 67.0 to 76.0%. The highest identity was with Omphalodes virus Y. Identity of the deduced amino acid of the CP varied from 62.0 to 71.0%, with the highest for East Asian Passiflora virus. For the 3' UTR, identities varied from 16.8 to 28.6%. The name Catharanthus mosaic virus (CatMV) is proposed for this new potyvirus.

Die parasitische Milbe Sarcoptes scabiei, die im Stratum corneum ihres Wirtes lebt, ist weit verbreitet. Eine zuverlässige Diagnose mittels herkömmlicher Techniken ist unzulänglich. Serologische Tests unter Verwendung von Gesamtantigen sind aufwändig und teuer in der Herstellung, und Kreuzreaktionen mit freilebenden Milben können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten. In dieser Arbeit wurde eine cDNA-Bank aller Entwicklungsstadien von S. scabiei var. suis erstellt. Unter Verwendung eines humanen Skabies-positiven Sammelserums wurden 61 rekombinante immunreaktive Klone von S. scabiei isoliert, und das Protein von sieben dieser Klone als Diagnostikkandidaten wurde aufgereinigt. Die identifizierten Sequenzen zeichnen sich z. T. durch das Vorhandensein repetitiver Bereiche aus. Die rekombinanten Proteine wurden im ELISA unter Verwendung von Human- und Schweineseren auf ihre Sensitivität geprüft. Die Antigene zeigten signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen mit den humanen Positiv- bzw. Negativseren, während dies bezüglich der Reaktion mit den porzinen Seren, nur für vier der Antigene der Fall war. Unspezifische Reaktionen mit E. coli-Protein sowie GST bei einem als Fusionsprotein exprimierten Antigen erwiesen sich als störend. 42.6% der isolierten Klone enthalten eine repetitive zentrale Region, deren offener Leserahmen hauptsächlich für die Aminosäuren Glutamat und Lysin kodiert. Obwohl sie große Homologien aufweisen, unterscheiden sich die Transkripte sowohl im zentralen Bereich als auch am 3´-Ende voneinander. Mittels der Southern Blot-Analyse konnte in Sarcoptes nur eine Genkopie detektiert werden, während dieses Gen in Dermatophagoides-Milben nicht nachgewiesen werden konnte. Auf Grund der Spezifität des Antigens für die parasitischen Milben könnte dieses Antigen für die Serodiagnostik besonders geeignet sein. Anhand von immunhistochemischen Untersuchungen wurden entsprechende Proteine in einer Organstruktur, bei der es sich vermutlich um die Hoden der Milben handelt, detektiert. In dieser Arbeit wurden rekombinante Antigene für die Serodiagnostik der Sarcoptes-Infektion bereitgestellt. Es wurde gezeigt, dass das Expressionssystem E. coli als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von Sarcoptes-Infektionen möglicherweise ungeeignet ist. / The parasitic mite Sarcoptes scabiei, which lives in the Stratum corneum of the host, is prevalent worldwide. Reliable diagnosis using conventional methods is unsatisfying. Serological tests using the total antigen are labour intensive and expensive to produce, and moreover there exist unspecific crossreactions against house dust mites, which lead to false positive results. We expect an improvement of serological diagnosis using specific recombinant antigens of the Sarcoptes-mites. In this work, we constructed a cDNA-library of all stages from S. scabiei var. suis. Using scabies-positive pooled human sera, we isolated 61 recombinant immunoreactive clones and purified the protein of seven clones as potential candidates for diagnosis. The identified sequences are partially characterized by the presence of repetitive domains. The recombinant proteins were tested for their sensitivity in the ELISA, using positive and negative human- and porcine sera. There exist significant differences between the reactions of the positive and negative sera for all the seven antigens using human sera. In contrast, with the porcine sera, significant difference could be detected only in four antigens. Reactions against of E. coli-protein and the GST in the fusionprotein caused problems of unspecific background. 42.6% of the isolated clones contain a repetitive central region, and the ORF mainly encodes the aminoacids glutamate and lysine. Altough there exist high homologies, the sequences of the transcripts differ in the central region and at the 3´-end. By southern blot analysis we could show one copy of the gene, while it was not detected in the genome of the free-living Dermatophagoides-mites. As for the specificity for the parasitic mites, the antigens might be good candidates for immunodiagnosis. In immunohistochemical studies the proteins were detected in a paired structure in the posterior part of the mites opisthosoma, which might be the testis. In this study, recombinant antigens of S. scabiei were produced and tested for the use in immunodiagnosis. It was shown, that the E. coli-expression system might be unsuitable for the production of recombinant antigens for their use in immunodiagnosis of Sarcoptes-infections.

A cana-de-açúcar é cultivada em diversos países do mundo. O Brasil é atualmente o maior produtor mundial de cana-de-açúcar e o maior exportador dos produtos derivados dessa espécie, tais como açúcar e etanol. A cultura da cana-deaçúcar apresenta muitos problemas fitossanitários que prejudicam a produção, entre eles o causado pelo vírus do mosaico da cana-de-açúcar (Sugarcane mosaic virus, SCMV). O mosaico da cana-de-açúcar vem sendo controlado com o uso de variedades e híbridos resistentes. No entanto, frequentemente notam-se plantas sintomáticas nas avaliações de novos clones de cana-de-açúcar, em viveiros de mudas e plantios comerciais. Diante desse fato, o presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterização biológica e molecular de isolados do SCMV que induzem sintomas variados em plantas de cana-de-açúcar plantadas nos municípios de Assis, Piracicaba e Ribeirão Preto, SP. Nove isolados, identificados por causarem sintomas fraco, intermediário e severo de mosaico foram coletados em cada localidade. Um isolado que causa mosaico listrado também foi coletado em Piracicaba. Todos os isolados foram estabelecidos na variedade SP86155. A caracterização molecular foi feita por meio da analise das sequências de nucleotídeos e de amino ácidos deduzidos do gene da proteína capsidial dos isolados. Também foram diferenciados por meio da análise de polimorfismo de comprimento de fragmentos. A caracterização biológica foi realizada por testes de proteção entre alguns dos isolados. As sequências parciais de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidos do gene da proteína capsidial de cada isolado foram comparadas entre si e com outras sequências correspondentes de isolados de diferentes regiões geográficas. As identidades das sequências de nucleotídeos variam de 94 a 100%, entre os isolados estudados. Quando as mesmas sequências foram comparadas com as sequências de nucleotídeos do gene da proteína capsidial de outros isolados do SCMV as identidades variaram de 79 a 98%. Para as sequências de amino ácidos deduzidos as identidades variaram de 94 to 100%, entre os isolados estudados e de 81 to 98% quando comparadas com as de outros isolados do SCMV. Análise filogenética agrupou os 10 isolados com outros isolados brasileiros do SCMV (JAU - 1, RIB - 1 e PIR - 2 e FER - 1) e com os isolados dos E.U.A. originalmente denominados estirpes A, B, D e E. Analises de RFLP mostraram que a enzima de restrição HinfI foi a que melhor diferenciou os isolados e por isso permitiu a análise da proteção. As plantas inoculadas com os isolados fracos de Piracicaba, Ribeirão Preto e Assis ficaram protegidas contra a invasão sistêmica dos isolados severos dos mesmos locais e contra o isolado que causa mosaico listrado de Piracicaba. Falhas na proteção ocorreram em plantas infectadas com o isolado Piracicaba intermediário e desafiadas com os isolados Ribeirão Preto severo e Assis severo. Em conjunto esses resultados indicam que os dez isolados estudados são estirpes do SCMV que induzem sintomas diferenciados. / Sugarcane crop is raised in several tropical countries around the world. Brazil is the largest producer of sugarcane, as well as the largest exporter of ethanol and sugar, which are outputs of sugarcane processing. The sugarcane production faces several sanitary problems and among them is the mosaic disease caused by the potyvirus Sugarcane mosaic virus (SCMV). Traditionally, resistant varieties and hybrids are used for the control of SCMV. However, new cases of symptomatic plants have been reported in commercial crops and in seedling production facilities. Based on this fact, the present work aims to do both molecular and biological characterization of isolates of SCMV which causes different symptoms in sugarcane crops in the regions of Assis (SP), Piracicaba (SP) and Ribeirão Preto (SP). Nine isolates identified as causing mild, intermediate and severe mosaic were collected in each of the three areas. One isolate which causes striped mosaic was also collected in the Piracicaba area. All isolates were established in the variety SP86155 by mechanical inoculation. The molecular characterization was done through the analysis of nucleotide and deduced amino acid sequences for the coat protein gene. Likewise the isolates were differentiated through the analysis of restriction fragment length polymorphism (RFLP) for further use on biological characterization through cross protection tests between the isolates. The partial nucleotide and deduced amino acid sequences for the coat protein gene were compared among themselves and with corresponding sequences for other isolates from different geographical regions. The identity of the nucleotide sequences ranged from 94 to 100% among the studied isolates. When compared with the corresponding nucleotide sequences of other isolates of SCMV the identities ranged from 79 to 98%. The identity of the deduced amino acids sequences ranged from 94 to 100% among the studied isolates, and from 81 to 98% when compared with isolates form different geographical regions. Phylogenetic analysis grouped all 10 isolates with other Brazilian isolates do SCMV (JAU-1, RIB-1 e PIR-2 e FER-1), as well as with isolates from the U.S.A, originally named strains A, B, D e E. RFPL analyses pointed out that the restriction enzyme Hinfl did the best differentiation of the isolates and was further used for the evaluation of the cross protection tests. Plants inoculated with mild isolates remained protected against the severe isolates and also against the isolate which causes the stripped mosaic. Fails on cross protection occurred when plants infected with the isolate Piracicaba intermediate were challenged with isolates Ribeirão Preto and Assis severe. Together these data indicate that the 10 studied isolates are strains of SCMV that induce different symptoms.

No Brasil a citricultura está entre as culturas de maior importância. A produtividade dessa cultura no país ainda é considerada baixa e esse fato se deve, em parte, a diversas pragas e doenças. Dentre as doenças, tem-se a tristeza, causada pelo Citrus tristeza virus (CTV). Esse patógeno também pode estar relacionado com outra importante doença da cultura, a morte súbita dos citros (MSC). Com isso, o CTV ganhou ainda maior expressão. Uma alternativa para controlar viroses de plantas é a obtenção de plantas transgênicas resistentes a esses patógenos. Este trabalho objetivou caracterizar com análise molecular e avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja Valência (Citrus sinensis L. Osbeck), contendo fragmentos do genoma do CTV, em três construções gênicas diferentes. A transgenia das plantas foi confirmada por análises de Southern blot. A transcrição do transgene foi avaliada por RT-PCR. O material foi inoculado com duas borbulhas infectadas pelo isolado Pêra- IAC, enxertadas no porta-enxerto abaixo do ponto de enxertia da copa transgênica, e pelo vetor Toxoptera citricida infectado. Após quatro semanas da inoculação, para avaliar a resistência ao vírus, brotações da copa transgênica foram submetidas ao teste de ELISA sanduíche indireto com anticorpo monoclonal contra a proteína da capa protéica do CTV. Os resultados indicaram variação na resistência à translocação do vírus nas diferentes construções transgênicas utilizadas e entre clones de uma mesma planta. Todas as linhagens transgênicas inoculadas indicaram a presença do vírus em pelo menos uma das três repetições avaliadas, quando inoculadas por enxertia. Quando inoculadas pelo vetor algumas plantas apresentaram todos os seus clones com baixos valores de absorbância, indicando uma possível resistência ao patógeno. / In Brazil, citrus is one of the most important cultures. The productivity of this culture in the country is still considered low and this fact is due to several pests and diseases that affect the crop. Among the diseases there is the tristeza, caused by Citrus tristeza virus (CTV). This pathogen can also be related with another important disease, the citrus sudden death. Therefore, CTV acquired much more significance. This work aimed to characterize with molecular analysis and to evaluate the resistance to CTV of transgenic Valência plants (Citrus sinensis L. Osbeck), containing genomic fragments of CTV, in three different transgenic constructs. The plants were confirmed as transgenic by Southern blot. The transcription of the transgene was evaluated by RT-PCR. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud inoculation with two infected bubbles, and by the infected vector Toxoptera citricida. After four weeks of inoculation, the evaluation of viral replication in the transgenic seious was done by ELISA indirect sandwich with monoclonal antibody against the CTV coat protein. The results indicated variation of the resistance to the translocation of the virus between the different transgenic constructs used and between clones of the same plant. All the inoculated plants indicated the presence of the virus in, at least, one of the three evaluated clones, when inoculated by grafting. When inoculated by the vector some plants had all their clones with low values of virus, indicating a possible resistance to the pathogen.

A Leishmaniose visceral é um problema que cresce no Estado de São Paulo afetando o homem e o cão. Os exoantígenos da membrana das leishmanias são liberados no meio de cultura. Os exoantígenos são importantes na indução da imunidade mediada pelas células T e B estimulando a produção elevada de anticorpos. Realizamos uma avaliação comparativa por ELISA e Immunoblotting de exoantígenos e antígenos totais de L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis e L. (L.) chagasi, no diagnóstico da leishmaniose visceral humana e canina. Obteve-se por ELISA sensibilidade de 100% para ambos os preparados antigênicos independente da espécie de Leishmania. A melhor especificidade em humanos e cães foi com os exoantígenos. O exoantígeno da L. (L.) chagasi teve a melhor especificidade e média de absorbâncias comparadas aos das outras espécies (p<0.005). Para o hospedeiro humano o ELISA com exoantígenos, não discriminou pacientes com leishmaniose cutânea e ou mucocutânea. O Immublotting dos exoantígenos de L. (L.) chagasi (IBleish) apresentou 100% de sensibilidade e especificidade para os cães. Os dados do IBleish-L. (L.) chagasi demonstraram a possibilidade de sua utilização como método confiável para a confirmação do diagnóstico da leishmaniose canina. / The visceral leishmaniasis is a new problem that grows in the State of São Paulo, affecting men and dogs. The exoantigens from the membrane of the Leishmania, are released out of culture medium. The exoantigens are important in the induction of immunity mediated by T and B cells, stimulating the production of antibodies. This work was carried out an evaluation of ELISA and Immunoblotting using comparatively exoantigens and total antigens of L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis and L. (L.) chagasi for the diagnosis of canine and human visceral leishmaniasis. ELISA sensitivity was 100% for all different antigens, independent of the species of Leishmania employed. The best specificity for both human and dogs were obtained with exoantigens. Exoantigen from L. (L.) chagasi was what showed the best specificity and mean absorbance compared to those of other species (p<0.05). The ELISA with exoantigens for the human host not discriminate individuals with leishmaniasis cutaneous or mucocutaneous. The Immunoblotting that used the exoantigens of L. (L.) chagasi (IBleish) showed 100% sensitivity and specificity for the dogs. The IBleish-L. (L.) chagasi showed the possibility of its use as a reliable method to confirm the diagnosis of canine leishmaniasis.