Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-10T21:23:06Z No. of bitstreams: 1 2017_LigianedeOliveiraLeme.pdf: 1254618 bytes, checksum: 056b35332f8c0d914e9ba088b6e79b03 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-26T15:37:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LigianedeOliveiraLeme.pdf: 1254618 bytes, checksum: 056b35332f8c0d914e9ba088b6e79b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T15:37:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LigianedeOliveiraLeme.pdf: 1254618 bytes, checksum: 056b35332f8c0d914e9ba088b6e79b03 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / O sucesso da criopreservação de embriões bovinos é essencial para melhor aproveitamento de embriões produzidos em excesso, para o estabelecimento de bancos de germoplasma e para comercialização de genética. Neste estudo, foi analisada a alteração na expressão de genes induzida pelo procedimento de vitrificação por Cryotop em blastocistos bovinos usando lâminas de microarranjo EmbryoGENE. Embriões bovinos produzidos in vitro em estágio de blastocisto (144 a 156 horas pós-inseminação) foram vitrificados com Cryotop e não vitrificados (controle). Após 4 horas de cultivo, embriões que re-expandiram ou evoluíram para o estágio de blastocisto expandido foram usados para análises do microarranjo e para quantificação em reação de cadeia de polimerase em tempo real (qPCR). As análises da expressão global revelaram 43 genes diferencialmente expressos em embriões vitrificados comparados aos do grupo controle (p<0,05). Um total de 9 genes foram validados por qPCR, dos quais o FOSL1, envolvido no processo de apoptose, mostrou expressão diferencial (p<0,05) para ambos os métodos, estando super-expresso em embriões vitrificados. Os resultados sugerem que a apoptose tem um papel fundamental na resposta de embriões ao processo de vitrificação. Considerando que a resposta à vitrificação está muito relacionada à qualidade do embrião, levantou-se a hipótese de que a seleção dos embriões para a vitrificação poderia influenciar também a diferença na proporção macho:fêmea, devido a velocidade de desenvolvimento e tolerância ao estresse. Por isso, na segunda etapa deste estudo, foi avaliado o efeito de touros na cinética do desenvolvimento embrionário e na resposta dos embriões à criopreservação. Para isso foram utilizados 5 touros e comparou-se além da produção de embriões, a resposta à criopreservação pelo método Cryotop dos embriões produzidos. Inicialmente, embriões em estágio de blastocisto foram vitrificados (144 a 156 horas pós-inseminação), para avaliação da criotolerância relativa aos touros; enquanto que embriões em estágio de blastocisto expandido foram removidos do cultivo no D6, D7 e D8, e sexados, para avaliação da cinética de desenvolvimento. Na segunda etapa, embriões em estágio de blastocisto expandido foram vitrificados (168 horas pós-inseminação). Todos os embriões (re-expandidos, evoluídos para o estágio de blastocisto eclodido e degenerados), de ambos tratamentos, com 24 horas de cultivo pós-vitrificação foram usados para sexagem. Os resultados sugerem que a escolha do touro, apesar de não interferir na cinética de desenvolvimento embrionário (p>0,05), afeta a produção de blastocistos e também a resposta à criopreservação (p<0,05). E ainda, que os touros que produzem embriões mais crioresistentes nem sempre são os que produzem maior taxa de embriões PIV. Além disso, embriões macho e fêmea têm a mesma capacidade de resposta à vitrificação por Cryotop. / The cryopreservation success of bovine embryos is essential for the better use of excess produced embryos, for the establishment of germplasm banks and genetics commercialization. In this study, gene expression alteration induced by the Cryotop vitrification procedure in bovine blastocysts using EmbryoGENE microarray slides was analyzed. Bovine in vitro produced embryos at blastocyst stage (144 to 156 hours postinsemination) were vitrified with Cryotop and non-vitrified (control). After 4 hours of culture, re-expanded or expanded blastocyst stage embryos were submitted to microarray analyzes and real time polymerase chain reaction (qPCR) quantification. Global gene expression analysis revealed 43 differentially expressed genes in vitrified embryos compared to control group (p <0.05). Nine genes in total were evaluated by qPCR, of which FOSL1, involved in apoptosis process, showed differential expression (p <0.05) for both methods, being overexpressed in vitrified embryos. The results suggest that apoptosis plays a key role in embryos response of vitrification process. Considering that vitrification response is closely related to embryo quality, it was hypothesized that embryos selection for vitrification could also influence the difference in male:female ratio due to developmental speed and stress tolerance. Therefore, in the second stage of this study, the bull´s influence on embryo developmental kinetics and embryo response to cryopreservation was evaluated. For this, five bulls were taken and embryos cryopreservation by Cryotop method was compared in addition to embryo production. Initially, blastocyst stage embryos were vitrified (144 to 156 hours post-insemination), to evaluate the cryotolerance relative to the bulls; while expanded blastocyst stage embryos were removed from culture at D6, D7 and D8, then sexed for developmental kinetics. As a second experiment, expanded blastocyst stage embryos were vitrified (168 hours post-insemination). All embryos (re-expanded, hatched blastocyst stage e, and degenerated) of both treatments, with 24 hours post-vitrification culture were used for sexing. The results suggest that sire´s choice, although not interfering in embryonic development kinetics, affects the blastocysts rates and the cryopreservation response. Besides, bulls producing more cryoresistent embryos are not always the ones that produce the highest IVP embryo rate. In addition, male and female embryos have the same Cryotop vitrification response.

Orientador: Helen Barbosa Raiz Engler / Banca: Paulo Cesar Correa Borges / Banca: Maria Cherubina de Lima Alves / Resumo: A ideia que versa essa dissertação é do esplêndido que a Reprodução Humana Assistida (RHA), traz a possibilidade de fazer um filho em um casal isento de fertilidade. Diante do que se percebe em termos de avanços da tecnociência do crescente número de casais em situação de infertilidade o foco desta pesquisa é a Doação de embriões criopreservados. Mormente existam em outros países leis específicas que regulem a RHA, o Brasil dispõe apenas de uma Lei da engenharia genética - Lei de Biossegurança, n. 11.105, 24/03/2005, o que faz com que profissionais da área se deparem com diversos desafios éticos. Há de se ressaltar, que polêmicas quanto à valoração do embrião em toda a sociedade brasileira permeiam está seara, mais especificamente, a questão da pesquisa com célulastronco embrionárias. É ainda ressaltante dizer da escassez de pesquisas e publicações nesta área, em especial, no que diz respeito às implicações emocionais da Doação de embriões. Para tanto, os objetivos desta pesquisa perfazem a compreensão dos aspectos bioéticos envolvidos na problemática da Reprodução Humana Assistida, bem como o estudo dos aspectos éticos vividos pela Equipe Técnico-administrativa de uma Clínica de Reprodução Humana do Estado de São Paulo, responsável pelo tratamento de Reprodução Humana Assistida de casais que tiveram embriões excedentários após serem submetidos ao tratamento de Fertilização in vitro e a reflexão sobre a dimensão subjetiva vivida pela Equipe Técnico-administrativa de uma Clíni... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The idea that discusses dissertation is from the splendid which the Assisted Human Reproduction (AHR) brings: the possibility of a child in free couple fertility. Given what is perceived in terms of advances of techno science of the growing number of couples in infertility situation, the focus of this research is the cry preserved embryo donation. Especially exist in other countries, specific laws that govern the RHA, Brazil has only a law of genetic engineering - Insecurity Law, n.11.105, 24/03/2005 - with the result that health professionals are experiencing with several ethical challenges. It is noteworthy that controversies regarding the valuation of the embryo in Brazilian society permeate this harvest, more specifically the issue of research with embryonic stem cells. It is also remarking to say the lack of research and publications in this area, particularly with regard to the emotional implications of the donation of embryos. Therefore, the objectives of this research account for the understanding of bioethical issues involved in the issue of Assisted Human Reproduction, and the study of ethical issues experienced by Technical and Administrative Team of a Human Reproduction Clinic of São Paulo, responsible for handling Assisted Human reproduction of couples who have surplus embryos after being subjected to the treatment of in vitro fertilization and reflection on the subjective dimension lived by Technical and Administrative Team of a Human reproduction Clinic of São Paulo, responsible for the treatment of Assisted Human Reproduction of couples who had surplus embryos after being subjected to the treatment of fertilization in vitro and reflection on the subjective dimension experienced by the Technical and Administrative Team of a clinic of Human Reproduction of São Paulo State, responsible for the treatment of Assisted Human Reproduction of couples who had surplus embryos after being... / Mestre

In recent years, in dairy cattle, while it was observed a gradual increase in productivity, a decrease occurred in the reproductive efficiency. Several factors, such as increased incidence of diseases, higher susceptibility to heat stress and increase of dry matter intake, have been awarded as possible causes for the decrease in fertility. Increased dry matter intake is associated with increased liver blood flow, which is associated with an increase in liver metabolism of steroid hormones. Given the high metabolism of steroid hormones in high producing dairy cows, six studies were carried out, which in this thesis are divided in three chapters, involving hormone supplementation in lactating dairy cows. The first study aimed to increase the synchronization rate of dairy cows submitted to a fixed time artificial insemination (FTAI) estradiol (E2)/progesterone (P4)-based protocol. For this purpose, two experiments were performed, the first (n = 44 cows) compared a 2.0 vs 3.0 mg of estradiol benzoate (EB) associated to a P4 implant at the beginning of the protocol. The second experiment (n = 82 cows) performed presynchronization with GnRH prior to the onset of a FTAI protocol to produced different follicular development stages at the time of E2/P4: emergence vs. dominance. Daily ultrasound and hormone evaluations were performed. Other four experiments are described in the second (n = 1070 cows) and third (n = 1498 cows) chapter, which have been developed to evaluate the effect of P4 supplementation after ovulation in lactating dairy cows. In general, these studies evaluated the effect of supplementation on the corpus luteum (CL) development and function, mRNA abundance for interferon stimulated genes (ISG), on fertility of cows subjected to AI after estrus detection or FTAI protocol, or to embryo transfer. Increasing the EB dose from 2.0 for 3.0 mg did not improve emergence wave synchronization. In fact, it induced luteolysis in a larger number of cows. Altering the stage of the estrous cycle of the cows at the beginning of the E2/P4-based FTAI protocol did not improve synchronization of wave emergence. Post ovulation P4 supplementation did not affect CL development and function, and did not increase the mRNA abundance for ISG. Cows subjected to AI after estrus detection or after an E2/P4-based FTAI protocol did not have increased fertility. However when P4-supplemented cows were subjected to a GnRH-based FTAI protocol there was an improvement in the fertility of about 8%. Thus, we can concluded that regardless of the EB dose or stage of the estrous cycle at beginning of the E2/P4-based FTAI protocol, still there are cows that fail to have a synchronized emergence of a new wave and/or to ovulate at the end protocol. Additionally, depending on the protocol used, P4 supplementation may increase the fertility of dairy cows, but compromises the fertility when embryos are transferred. / Nos últimos anos, em rebanhos leiteiros, foi observado um aumento acentuado da produtividade acompanhado de uma diminuição da eficiência reprodutiva das vacas lactantes. Diversos fatores, como o aumento da incidência de doenças, da suscetibilidade ao estresse térmico e da ingestão de matéria seca, têm sido atribuídos como possíveis causas para esse decréscimo na fertilidade. Aumento da ingestão de matéria seca está associado maior fluxo sanguíneo hepático, que por sua vez está relacionado com aumento da metabolização hepática de diversas moléculas, entre elas os hormônios esteroides. Tendo em vista o alto metabolismo destes hormônios nas vacas leiteiras, foram realizados seis estudos, que na presente tese estão divididos em três capítulos, envolvendo suplementação hormonal em vacas leiteiras lactantes. O primeiro capítulo teve como objetivo aumentar a taxa de sincronização de vacas leiteiras ao protocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) à base de estradiol (E2)/progesterona (P4). Para isso foram realizados dois experimentos, sendo o primeiro (n = 44 vacas) utilizando dose de 2.0 ou 3.0 mg de benzoato de estradiol (BE) associado a um dispositivo de P4, no início do protocolo. No segundo (n = 82 vacas), foi realizada uma pré-sincronização com GnRH para iniciar o protocolo de IATF em diferentes estágios foliculares: recrutamento vs. dominância. Avaliações ultrassonográficas e dosagens hormonais foram feitas. Outros 4 experimentos, descritos no segundo (n = 1070 vacas) e no terceiro (n = 1498 vacas) capítulo, foram desenvolvidos para avaliar o efeito da suplementação de P4 após a ovulação em vacas leiteiras. Nesses estudos, foram avaliados os efeitos desta suplementação na formação e função do corpo lúteo (CL), na expressão de genes estimulados por interferon (ISG), na fertilidade de vacas submetidas a IA, através da observação de estro ou de protocolo de IATF, e em receptoras de embrião. A dose de 3.0 mg de BE, além de não aumentar a taxa de sincronização da emergência de uma nova onda folicular, induziu luteólise em um maior número de vacas que a dose de 2.0 mg. Independente da fase do ciclo estral, no início do protocolo a base de E2/P4, houve falhas na indução na sincronização da emergência e de ovulação. A suplementação com P4 após a ovulação não alterou a formação e função do CL, mas também não aumentou a expressão de ISG. Vacas submetidas a IA após detecção de estro ou submetidas à IATF em protocolos a base de E2/P4 não apresentaram aumento na fertilidade, no entanto quando submetidas ao protocolo de IATF à base de GnRH foi observado em torno de 8% de incremento de fertilidade. Contudo, receptoras de embrião suplementadas com P4 tiveram menor fertilidade. Assim, concluiu-se que independente da dose de EB ou do momento do ciclo estral em que se inicia o protocolo de IATF à base de E2/P4 há falhas de emergência de uma nova onda e/ou de ovulação ao final do protocolo. Além disso, dependendo do protocolo utilizado, a suplementação com P4 pósovulação pode aumentar a fertilidade de vacas submetidas à IATF, contudo compromete a fertilidade de receptoras de embrião.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-26Bitstream added on 2014-06-13T19:48:39Z : No. of bitstreams: 1 paes_mcf_me_jabo.pdf: 990222 bytes, checksum: f08cd87c9c978169ebdb4fdbd5287e5d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Astronotus ocellatus é originário da Bacia Amazônica, climatizado e disseminado, desde 1938, em açudes e rios do Nordeste brasileiro, pelo Departamento Nacional de Obras Contra as Secas. Trata-se de um peixe de grande potencial, devido a características adequadas para pesca esportiva, cultivado como ornamental e com uma carne saborosa e apreciada pela população do Norte e Nordeste do Brasil. Existem na literatura atual poucos estudos a respeito da biologia reprodutiva dessa espécie. Embora seja de desova parcelada e se reproduza bem em cativeiro, estudos de reprodução artificial têm suma importância para diversas pesquisas de biologia e desenvolvimento embrionário, cujos eventos devem ser acompanhados numa faixa de tempo conhecida e assim contribuir para uma melhor compreensão do cultivo, manejo e controle da espécie. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a resposta do Astronotus ocellatus a aplicação de dois hormônios estimuladores de reprodução (gonadodropina coriônica humana - HCG e extrato de hipófise de carpa - EHC) e estudar a estrutura, ultraestrutura e morfometria de seus ovos e larvas. Foram utilizados 16 casais de reprodutores pertencentes ao Centro de Aqüicultura da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal (SP) e quatro desovas ocorridas naturalmente nos viveiros. Observouse que cinco das dezesseis fêmeas responderam ao estímulo hormonal, sendo três com HCG e duas com EHC. Dos machos, apenas um respondeu positivamente ao HCG. O acará-açu possui ovos demersais, adesivos, pouco resistentes ao tato, de formato ovóide pouco acentuado. “In vivo” apresentaram coloração amarelada, quando fertilizados, e branca opaca, quando não fertilizados, com grande esfera vitelina e pequeno espaço perivitelino. As desovas apresentaram ovos com valores médios variando de 1,75±0,056 a... / Astronotus ocellatus is a fish from the Amazon Basin, adapted and widely reared since 1938 in ponds and rivers of Brazilian northeast region by the Departamento Nacional de Obras Contra as Secas. This fish has a great potential due to appropriate characteristics for sporting fishing, reared as ornamental and owning a very tasty meat being appreciate by the people in north and northeast regions of Brazil. Despite having all these adjectives for aquaculture there are a few studies about reproductive biology of this species. Although spawning does not occur at once and reproduction in captivity is well successful, studies about artificial reproduction are extremely important for several researches in biology and early embryonic development of which events must be followed in a known lack of time and like this to contribute for a better understanding of rear conditions, management and control of the species. Therefore, this present research aimed to assess the Astronotus ocellatus responses to administration of two kinds of reproductive hormones (Human Chorionic Gonadotropin - HCG and carp hypophysis extract – CHE) and studying the structure, ultrastructure and morphometry of its eggs and larvae. Sixteen couples from Centro de Aqüicultura of Universidade Estadual Paulista, Campus of Jaboticabal (SP) and four spawnings occurred naturally in ponds were also catched. Five of sixteen females responded to hormonal stimuli, three of them with HCG and two with CHE. In relation to males, only one responded favorably to HCG. Acará-açu females have demersal and adhesive eggs, somewhat resistant to the touch, discreet egg shape-like, yellowish colour “in vivo” and when fertilized and white opalescent without fertilization, with a large vitelline sphere and a small space between yolk and chorion. The spawnings presented eggs with average values of 1,75±0,056 ...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:48:51Z : No. of bitstreams: 1 lopes_ts_me_jabo.pdf: 688516 bytes, checksum: 27e94cbe3ca54f1add6bd864e9eea47c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo do trabalho foi acompanhar os efeitos durante o resfriamento, em quatro estádios de desenvolvimento embrionário de pacu, Piaractus mesopotamicus, em dois tempos de estocagem, seis e 10 horas. Embriões em quatro estádios de desenvolvimento (blastoderme, 64 células - 1,4-horas pós-fertilização, hpf; 25% do movimento de epibolia - 5,2-hpf; fechamento do blastóporo – 8-hpf e; aparecimento da vesícula óptica - 13,3-hpf) foram expostos a uma solução crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M). A seguir, os embriões passaram por curva de resfriamento de 1°C por minuto até -8°C, onde foram mantidos nos dois períodos de estocagem. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, as taxas de eclosão dos embriões foram avaliados para cada tratamento, com seis repetições, comparando-se com o controle que não foi resfriado. O número total de larvas estimadas para as duas primeiras fases do desenvolvimento ontogenético (1,4- e 5,2- hpf) foi estatisticamente menor que nas demais fases. Entretanto, os estádios de 8 e 13,3- hpf não diferiram entre si (49,90%±6,71 e 55,24%±6,71), respectivamente, encontrando-se mais próximas ao controle (90,67%±6,56). Além disso, a permeabilidade das membranas, estimada através do diâmetro dos embriões, variou estatisticamente do controle para seis e 10 horas de estocagem, quando utilizado os estádios de 1,4 e 5,2-hpf, enquanto para os demais não houve diferença. Da mesma forma, pode-se verificar que houve correlação negativa entre o número total de larvas e o diâmetro do embrião. Sendo assim, a utilização dos estádios embrionários de 8 e 13,3-hpf são os mais recomendados para o resfriamento de embriões de pacu estocados até 10 horas, a -8°C. / The objective of this research was to verify the effects of cooling of embryos of pacu, Piaractus mesopotamicus, in four stages of development, for two stocking periods. The stages of embryo development were: at blastoderm, ~64 cells - 1.4 hours after fertilization (haf); at 25% of the epiboly movement - 5.2 haf; at blastoporous closing - 8.0 haf; and at optical vesicle appearing - 13.3 haf. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution containing methanol (10%) and sucrose (0.5M). After that, embryos were submitted to a cooling curve (-1oC/min) until -8oC and then kept at -8oC for six or ten hours. Also, for each stage of embryo development a control group with not cooled embryos was used to compare the eclosion rates. The total number of larvae estimated for the first two stages of ontogenetic development (1.4 and 5.2-haf) was lower compared to the other stages. There was no difference for the total number of larvae between the stages 8.0 e 13.3-haf (49.90%±6.71 and 55.24%±6.71, respectively). Therefore, the utilization of the embryonary stages of 8.0 and 13.3-haf are recommended for cooling pacu embryos stored up to 10 hours at -8 ° C.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 900721 bytes, checksum: 0d4b7180008697c9c3cf7bf1ac4f5f23 (MD5) Previous issue date: 2010-05-11 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The donkeys were used for different functions until the introduction of motors, while they had declined. Through the years, they had managed to recover some breeds, like the Pega, which is preferably by brazilian breeders to produce interbreed strong and gait. Thus, in order to create a research line in jenny&#8217;s embryology, the objective was to adapt non-surgical embryo collection technique in Pêga breed, study the follicular dynamics, morphology and diameter of jenny&#8217;s embryos harvested eight days after ovulation. The study of follicular dynamics showed that the average diameter of the preovulatory follicle was 37.4±4mm. Significant differences (P>0.05) were observed between diameters in the six days leading up to ovulation. The non-surgical technique proved effective and, a total of 35 uterine flushings were obtained from 21 embryos (two morula, eight blastocysts and eleven expanded blastocysts), of which 19 embryos were classified as grade I and two as grade II. The average diameter for the fresh embryos was 316.7±81.7&#956;m. Treatment with glycerol caused an average reduction of 18.3% of the diameter, fixation in glutaraldehyde caused a mean reduction of 41.3% of the diameter for the control group and 25.3% of the diameter of the embryo after passage through the glycerol for the treatment group. After washing in phosphate buffer there was an average increase of 33.9% for the two groups. Statistical analysis for the variation in diameter showed no difference (P>0.05) between the initial diameter and diameter obtained during the processing steps. In light (LM) and transmission electron (TEM) microscopy was not observed to preserve the structure of the embryo due to inadequate penetration of the resin inside it. Electron microscopy showed that thickness of the capsule influence the rate of penetration of the resin, concluding that the preparation techniques of jenny&#8217;s embryos handle for TEM should be better studied. / Os jumentos foram utilizados para diferentes funções até o momento da introdução de motores (carros, caminhões, entre outros), momento no qual deixaram de ser usados. Com os anos, algumas raças conseguiram se recuperar, como a Pêga, que é de preferência de criadores brasileiros por gerar híbridos fortes e de andamento marchado. Assim, com o propósito de criar uma linha de pesquisa em embriologia de asininos, o objetivo deste trabalho foi adaptar a técnica não-cirúrgica de coleta de embriões para jumentas da raça Pêga, acompanhar o crescimento folicular durante o estro até a ovulação, avaliar o estádio embrionário, morfologia e diâmetro dos embriões coletados oito dias após a ovulação. O acompanhamento da dinâmica folicular mostrou que a média para o diâmetro do folículo pré-ovulatório foi de 37,4 ± 4mm. Houve diferença (p<0,05) entre os diâmetros nos seis dias que antecederam a ovulação. A técnica de coleta não-cirúrgica mostrou-se eficaz e, no total de 35 lavados uterinos, foram obtidos 21 embriões (duas mórulas, oito blastocistos e onze blastocistos expandidos), dos quais 19 embriões foram classificados como grau I e dois como grau II. O diâmetro médio para os embriões a fresco foi de 316,7±81,7 &#956;m, menor que aquele obtido para égua. O tratamento com glicerol causou redução média de 18,3% do diâmetro, a fixação em glutaraldeído causou redução média de 41,3% do diâmetro para o grupo controle e de 25,3% diâmetro do embrião após passagem pelo glicerol para o grupo tratado. Após lavagem em tampão fosfato houve um aumento médio de 33,9% para os dois grupos estudados. A análise estatística para a variação do diâmetro mostrou não haver diferença (p<0,05) entre o diâmetro inicial e os diâmetros obtidos durante as etapas de processamento. Nas microscopias de luz e eletrônica de transmissão não se observou a preservação da estrutura do embrião devido a penetração inadequada da resina no interior do mesmo. A microscopia eletrônica mostrou que a espessura da cápsula influenciou a taxa de penetração dos meios, concluindo que as técnicas de preparo dos embriões de jumentas da raça Pêga para microscopia devem ser melhores estudadas.

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-25. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:53Z : No. of bitstreams: 1 000866056.pdf: 919821 bytes, checksum: 345a1b2e0d1838ead9a919f9d70b8236 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O acetato de deslorelina promove uma contracepção de longa duração segura e eficaz, porém a reversibilidade espontânea é progressiva e assincrônica. O objetivo geral foi avaliar os efeitos do acetato de deslorelina sobre a produção in vivo e in vitro de embriões de gatas domésticas. Para tanto foram realizados 2 experimentos. Experimento 1: Objetivou-se avaliar a taxa de produção de embriões in vitro em gatas tratadas com acetato de deslorelina. Foram utilizadas 21 fêmeas (Tratado n=11 e Controle n=10). Onze gatas receberam um implante de deslorelina (4,7mg/animal) e o tratamento durou 6 meses. Após o tratamento, todas as fêmeas (Tratado e Controle) foram submetidas à OSH para que seus ovários fossem incluídos em rotinas de produção de embriões in vitro (PIV). A taxa de recuperação de COC foi submetida ao teste t de Student. As taxas de clivagem e blastocisto foram expressas em porcentagem e submetidas ao teste exato de Fisher. Todas as análises foram realizadas no programa GraphPad v5.0, P<0.05. Uma gata apresentou galactorréia e foi retirada do grupo experimental. Foram obtidos 184 COC grau I, a taxa de clivagem foi em média de 55,97% (total de 103 mórulas) e de blastocisto de 33,99% (total de 33 blastocistos) no grupo Controle. Já no grupo Tratado foram obtidos 83 COC grau I e a taxa de clivagem foi em média 60,24% (total de 50 mórulas) e de blastocisto foi de 36% (total de 18 blastocistos). Só houve diferença estatística entre os grupos na taxa de recuperação de COC grau I. A taxa de recuperação de COC foi menor em gatas tratadas, porém a PIV apresentou taxas similares à de fêmeas não tratadas. Devem-se considerar as variações individuais no grupo tratado. Experimento 2: Objetivou-se avaliar a produção de embriões in vivo, a taxa de concepção, bem como a presença de receptores de estrógeno e progesterona no útero, e receptores de LH e FSH em ovários de gatas submetidas ao tratamento com... / Deslorelin acetate promotes a long, safe and efficient contraception; however reversibility is consider progressive and asynchronous. We aim to evaluate the effects of deslorelin acetate on in vitro and in vivo embryo production in domestic cats. For that 2 experiments were performed. Experiment 1: The objective was to investigate the effect of contraceptive treatment with deslorelin acetate in in vitro embryo production and oocyte recovery in domestic queens. Twenty one queens (Treated n=11 and Control n=10) and one tom were used. Eleven queens were treated with deslorelin acetate (4.7mg/animal) during 6 months. Thereafter all females (treated and control) were spayed and the ovaries were included in in vitro embryo production routines (PIV). Rate of COC recovery was submitted to t test. Cleavage and blastocyst rate were expressed in percentage and submitted to Fisher's exact test. All analyses were performed in GraphPad Pisma v5.0 program, P < 0.05. One female developed galactorrhoea and was removed from experimental group. In Control group we recovered 18.4±3.21 of COC I, cleavage rate was 55.97% and blastocyst rate was 33.99%.In Treated group we recovered 8.3±1.15 of COC I, cleavage rate was 60.24% and blastocyst rate was 36%. Statistical difference was only observed in COC recovery, were treated cats had fewer than control group. Although we didn't found differences on embryo production, individual variation must be considered. Experiment 2: We aimed to evaluate in vivo embryo production, trough pregnancies, and also identify estrogen (ER-α) and progesterone (PgR) receptors in uterus and FSH (FSH-R) and LH (LH-R) receptors in ovaries from queen treated with deslorelin acetate. We used 25 queens and one tom, 15 queens were treated with deslorelin acetate (4.7mg/animal) for 3 months. After that, all implants were removed and estrous and ovulation was induced. After 24hs five queens were maintained with one tom and mating was ... / FAPESP: 11/23318-0

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA13MA124.pdf: 602522 bytes, checksum: 06d330f3a4de037875d96b3831ac2b65 (MD5) Previous issue date: 2013-10-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The equine industry has grown considerably in recent years in Brazil. In this aspect, the Crioula breed has emerged as one of the greatest creations in number and genetic quality of animals. Because of this, there is a greater demand for biotechnology for breeding horses. The conventional superovulatory protocols with high hormonal doses, has shown less efficient when evaluating the relation between the number of ovulations and embryo recovery rates. Dose reduction of equine pituitary extract (EPE) could be an alternative to ensure that one or more embryos can be recovered at each collection procedure. There is few information about reproductive physiology of the Crioula mare, and practically there is no data of how that category of animal responds to superovulation and embryo transfer. Thus, this study aimed to compare the superovulatory response of embryos donor mares of Quarter Horse (QH) and Crioula breed using a protocol with low dose of equine pituitary extract (EPE). Eight QH mares and 6 Crioula mares were used in the 2011/2012 and 2012/2013 seasons. These mares were in perfect health and reproductive conditions. The mare follicular control was performed daily with the aid of ultrasound. Were monitored 3 consecutive estrous cycles in each mare, being where all mares have passed for all the treatments. Every donor mare received a dose of PGF2a before beginning each protocol. Control Group - monitoring of follicle growth up to the time of ovulation; EPE group - monitoring of follicular growth. When the follicles reached 20 mm in diameter was administrated 7 mg EPE twice daily with an interval of 12h until the moment of ovulation induction. When most of the follicles achieved a diameter 35 mm, the ovulation was induced by administration of 2500UI hCG; Post EPE Group - same procedure as the control group. Donors were inseminated every 48 hours until the time of ovulation. On the eighth day post-ovulation embryo collection was performed. Data were analyzed using PROC GLM of the SAS statistical package. The variables were submitted by the Tukey test and means of least squares adjusted for multiple comparisons using the Tukey-Kramer test, with significance level of 5%. Values are presented as mean ± SD. The rate of follicular growth in different breeds, showing a mean of 10.1 and 7.7 days for Crioulas and QH mares, respectively (p <0.01). Difference was observed between breeds (p = 0.005) in the number of days on treatment with EPE with mean 6.6 and 4.7 days for the Crioula and QH breed. In the mares treated with EPE, there was an increase in the number of 6 ovulations (p <0.01) with a mean of 2.00 ± 0.53 and 3.33 ± 2.06 for Crioulas and QH mares respectively, when compared to the control and post-EPE groups (QH - control 1.12 ± 0.35, post-EPE 1.42 ± 0.53; Crioula - control and post-EPE 1.16 ± 0.40). The embryo recovery rate per ovulation in mares treated with EPE was 75% (27/36) versus 56.25% (9/16) in the control group (n = 14) and 88.23% (15/17) in post EPE (n = 13) group. Treatment with EPE resulted in the recovery of 1.1 ± 0.8 embryo for QH mares and 3.0 ± 2.0 embryos for the Crioula mares, while the control group 0.5 ± 0.5 and 0.8 ± 0.4 (QH and Crioula, respectively). The therapy with EPE in the dose of 7 mg bid proved effective, increasing the incidence of multiple ovulations in mares and was able to increase the number of embryos recovered by washed compared to the control group. The Crioula mares showed better superovulatory response and embryo recovery rate compared with mares of Quarter Horse / A indústria equina tem crescido consideravelmente no Brasil nos últimos anos. Neste aspecto, a raça Crioula tem se destacado como uma das maiores criações em número e qualidade genética de animais. Devido a isso existe uma maior procura por biotecnologias aplicadas a reprodução de equinos. Os protocolos convencionais superovulatórios, com altas doses hormonais, tem se mostrado menos eficientes quando se avalia a relação entre o número de ovulações e a recuperação embrionária. A redução da dose de extrato de pituitária equina (EPE) pode ser uma alternativa para garantir que um ou mais embriões possam ser recuperados em cada procedimento de coleta. Existem poucas informações sobre a fisiologia reprodutiva da égua Crioula, e praticamente não há relatos de como esta categoria de animais responde a técnica de superovulação e transferência de embriões. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo comparar a resposta superovulatória de éguas doadoras de embriões das raças Quarto de Milha (QM) e da raça Crioula utilizando um protocolo com baixa dose de extrato de pituitária equina (EPE). Para realização deste experimento foram utilizadas 8 éguas da raça QM e 6 éguas da raça Crioula, em perfeitas condições sanitárias e reprodutivas, nas estações de 2011/2012 e 2012/2013. Os animais foram submetidos a um controle folicular diário com o auxílio do ultrassom, sendo acompanhados 3 ciclos estrais consecutivos em que todas as éguas passavam por todos os tratamentos. Todas as éguas doadoras receberam uma dose de PGF2&#945; antes de iniciarem os protocolos. Grupo Controle monitoramento do crescimento folicular até o momento da ovulação; Grupo EPE monitoramento do crescimento folicular, e a partir da presença de folículos com cerca de 20 mm de diâmetro foi realizada a administração de 7 mg de EPE, duas vezes ao dia com intervalo de 12hs até o momento da indução da ovulação. Quando a maioria dos folículos atingiram um diâmetro igual ou superior a 35 mm foi induzida a ovulação através da administração de 2500UI de hCG; Grupo Pós-EPE mesmo procedimento do grupo controle. As doadoras foram inseminadas a cada 48h até o momento da ovulação. No oitavo dia pós-ovulação foi realizada a coleta de embriões. Os dados foram analisados utilizando o PROC GLM do pacote estatístico SAS. As variáveis foram submetidas ao teste de Tukey e as médias dos quadrados mínimos ajustados para comparação múltipla utilizando o teste de Tukey-Kramer, com nível de significância de 5%. Os valores estão sendo apresentados como médias ± SD. Um dos 4 parâmetros avaliados foi a taxa de crescimento folicular nas diferentes raças trabalhadas, apresentando uma média de desenvolvimento de 10,1 e 7,7 dias para as Crioulas e QM, respectivamente (p<0,01). Houve diferença entre as raças (p=0,005) no número de dias em tratamento com EPE com média de 6,6 e 4,7 dias para a raça Crioula e QM. Nas éguas tratadas com EPE, houve um incremento no número de ovulações (p<0,01), com média de 2,00±0,53 e 3,33±2,06 para éguas QM e Crioulas, respectivamente, quando comparados ao grupo controle e pós-EPE (QM controle 1,12±0,35; pós- EPE 1,42±0,53; Crioula controle e pós- EPE 1,16±0,40). A taxa de recuperação embrionária por ovulação nas éguas tratadas com EPE foi de 75% (27/36) contra 56,25% (9/16) do grupo controle (n=14) e 88,23% (15/17) no grupo pós EPE (n=13). O tratamento com EPE resultou na recuperação de 1,1 ± 0,8 embrião para as éguas QM e 3,0 ± 2,0 embriões para as éguas Crioulas, enquanto o grupo controle 0,5 ± 0,5 e 0,8 ± 0,4 (QM e Crioula, respectivamente). O tratamento com EPE na dose de 7 mg b.i.d mostrou-se efetivo, aumentando a incidência de ovulações múltiplas em éguas e foi capaz de elevar o número de embriões recuperados por lavado comparado ao grupo controle. As éguas Crioulas apresentaram melhor resposta superovulatória e taxa de recuperação embrionária comparado com as éguas da raça Quarto de Milha

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-29Bitstream added on 2014-06-13T20:59:31Z : No. of bitstreams: 1 monteiro_ba_me_botfmvz.pdf: 1690076 bytes, checksum: 2290265393e1a80a119df41bc5967502 (MD5) / Células-tronco embrionárias (CTEs) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna, obtidas de blastocistos pré-implantados. Devido à sua pluripotência podem se diferenciar nos derivados das três camadas germinativas, endoderma, ectoderma e mesoderma, tanto in vitro como in vivo. O objetivo deste trabalho foi isolar e cultivar células da MCI de blastocistos equinos frescos e refrigerados, e caracterizar o cultivo destas células por meio da expressão dos marcadores Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Para tal foram utilizadas 10 éguas, das quais foram obtidos 40 embriões, divididos em dois grupos, sendo o Grupo 1 de embriões frescos, totalizando 26 embriões, e o Grupo 2 de embriões refrigerados, totalizando 14 embriões. No grupo 1 de embriões frescos, 73,1% das MCIs aderiram à monocamada dois dias após o cultivo, 65,4% mantiveram-se aderidas 4 dias após o cultivo, 19,2% foram submetidas à primeira passagem e nenhuma foi submetida à segunda passagem. Já no Grupo 2 de embriões refrigerados, 85,7% das MCIs aderiram á monocamada 2 dias após o cultivo, 85,7% das células permaneceram aderidas à monocamada 4 dias após o cultivo, 21,4% foram submetidas à primeira passagem, e 7,1% à segunda passagem. As colônias de CTEs equinas obtidas de embriões frescos foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Já as colônias de CTEs obtidas de embriões refrigerados foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 e SSEA-4. As células da MCI quando isoladas dos blastocistos equinos frescos e refrigerados, foram capazes de formar colônias semelhantes à colônias de CTEs. Quando cultivadas sobre monocamada de fibroblastos equinos e inativadas com Mitomicina C, apresentaram crescimento celular e foram capazes de formar colônias de CTEs... / Embryonic stem cells are pluripotent cells, derived from inner cell mass, obtained from pre-implanted blastocysts. Because of their pluripotency, they can differentiate into derivatives of three germ layers, endoderm, ectoderm and mesoderm, both in vitro as in vivo. The aim of this study was to isolate and culture inner cell mass (ICM) cells from fresh and cooled equine blastocysts and characterize stem cells culture obtained from fresh and cooled equine embryos, by the expression of pluripotency markers as Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. For this, 10 mares were used, from which were obtained 40 embryos, divided into two different groups, Group 1 from fresh embryos, with a total of 26 embryos, and Group 2 from cooled embryos, with a total of 14 embryos. In Group 1 of fresh equine embryos, 73,1% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 65,4% maintained adhered four days after culture, 19,2% were submitted to first passage and none were submitted to second passage. Whereas in the Group 2 of cooled embryos, 85,7% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 85,7% maintained adhred to the monolayer 4 days after culture, 21,4% were submitted to first passage and 7,1% to second passage. The equine embryonic like-stem cells obtained from fresh embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. While the embryonic like-stem cells obtained from cooled embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 and SSEA-4. The ICM cells when isolated from fresh and cooled equine blastocysts were capable to form embryonic stem cells-like colonies. When they were cultured under an equine fibroblasts monolayer and inactivated with Mitomycin C, showed cellular development and were able to form colonies. Equine embryonic... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-05Bitstream added on 2014-06-13T18:58:51Z : No. of bitstreams: 1 000735355.pdf: 1354100 bytes, checksum: e69296eb81e8a6cd0752363e21364dad (MD5) / O excessivo acúmulo lipídico que acontece ao longo da produção in vitro de embriões (PIVE) tem sido apontado como prejudicial à criopreservação. Como o soro fetal bovino (SFB) é um dos fatores que provoca maior impacto neste acúmulo, e pelo mesmo ser de composição indefinida, procura-se substituí-lo nos meios de cultivo. Entre os possíveis substitutos, está o composto semi-definido, livre de ácidos graxos, a albumina sérica bovina (BSA). O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da BSA e/ou SFB na MIV sobre o acúmulo lipídico nos oócitos e embriões bovinos, e para isso, cinco experimentos foram realizados. No primeiro experimento, demostrou-se que o meio contendo SFB possui dezoito vezes mais lipídeos que o meio contendo apenas BSA como fonte proteica. No segundo experimento, confirmou-se que, ao contrário da maturação in vivo, a maturação in vitro (MIV) provoca acúmulo lipídico, sendo este acúmulo mais acentuado no grupo suplementado exclusivamente com SFB, comparado ao grupo suplementado com BSA, sem observar-se diferença nos tamanhos das gotas oocitárias entre os grupos. Oócitos maturados na presença do SFB apresentaram melhores taxas de maturação nuclear e citoplasmática, porém, mostraram diferenças com relação à quantidade e migração de lipídeos e mitocôndrias em comparação àqueles obtidos após maturação in vivo. Nos experimentos III e IV, observou-se que, além de não levar a uma esperada diminuição da quantidade de lipídeos nos blastocistos produzidos, a BSA na MIV levou a menores taxas de desenvolvimento embrionário. Sobre o tamanho das gotas embrionárias, constatou-se que a MIV suplementada com SFB provoca maior porcentagem de gotas entre 2 a 6 μm de diâmetro comparada a MIV suplementada por ambas as substancias. Além do mais, percebeu-se um aumento do tamanho das gotas ao longo da PIVE independente da suplementação... / The excessive lipid accumulation that occurs during in vitro production of embryos (IVPE) has been described as harmful to cryopreservation. Because fetal bovine serum (FBS) is one of the factors that cause the greatest impact in this accumulation, and because it is an undefined medium supplement, current research is aimed at replacing this supplement in culture media. Among the possible substitutes, there is a semi defined compound, fatty acid free bovine serum albumin (BSA). The present study aimed to evaluate the influence of BSA and/or FBS during IVM on lipid accumulation in oocytes and embryos, and for that, five experiments were performed. The first experiment demonstrated that the medium containing FBS has eighteen times more lipids than the medium containing only BSA as a protein source. In the second experiment, it was confirmed that, unlike in vivo maturation, in vitro maturation (IVM) causes a lipid accumulation, which is more pronounced in the group supplemented only with FBS, compared with BSA group, without showing difference in oocytes droplets sizes between groups. Oocytes matured in the presence of FBS showed better rates of nuclear and cytoplasmic maturation, however, they also showed differences relative to the amount and migration of lipids and mitochondrias in comparison to those obtained after in vivo maturation. In the experiments III and IV, it was observed that the expected decrease in the amount of lipids produced in blastocysts, supplemented solely with BSA, did not take place, and the use of BSA alone in IVM led to lower rates of embryo development. Furthermore, for embryos lipid droplets sizes, a higher percentage of droplets between 2-6μm was observed in IVM supplemented with FBS compared to supplemented with both substances.The last experiment determined the expression of genes involved in lipid synthesis, DGAT2 and PLIN2. Increased expression of PLIN2 and ...